Name: Metoda uszkodzenia nerwu strzałkowego: wiarygodny test do identyfikacji i testowania czynników naprawiających połączenia nerwowo-mięśniowe (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-08-11T15:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 1 s
Description: Poznaj metodę uszkodzenia nerwu strzałkowego u myszy do badania regeneracji połączeń nerwowo-mięśniowych. Technika umożliwia niezawodną ocenę reinnerwacji mięśnia prostownika palców długich.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Autorzy dziękują członkom laboratorium Valdez za intelektualny wkład w eksperymenty i komentarze do manuskryptu.

Wszystkie eksperymenty zostały przeprowadzone zgodnie z wytycznymi NIH i protokołami na zwierzętach zatwierdzonymi przez Virginia Tech Institutional Animal Care and Use Committee.
1. Przygotowanie zwierząt do operacji
<ol>
	<li>Znieczulić myszy mieszaniną ketaminy (90 mg/kg) i ksylazyny (10 mg/kg) poprzez podskórne wstrzyknięcie pachwinowe za pomocą sterylnej strzykawki insulinowej o pojemności 1 ml. Roztwór nośnika zawiera mieszaninę 0,9% soli fizjologicznej, 17,4 mg/ml ketaminy i 2,6 mg/ml ksylazyny. Umieść zwierzęta z powrotem w klatkach w oczekiwaniu na działanie leków. 
	UWAGA: Jeśli dawka nasycająca nie zapewnia wystarczającego znieczulenia na czas trwania zabiegu, można wstrzyknąć dodatkowe 25% dawki nasycającej.</li>
	<li>Monitorować zwierzęta po wstrzyknięciu, aby sprawdzić, czy częstość oddechów jest stabilna i czy poziom pobudzenia jest odpowiedni. Sprawdź poziom pobudzenia za pomocą uszczypnięcia tylnej stopy, które nie powinno wywołać żadnej reakcji, gdy jest odpowiednio znieczulone. 
	UWAGA: Zwykle zajmuje to 3-5 minut w przypadku młodej dorosłej myszy o średniej wadze od 25 do 30 g. Jeśli zwierzę nadal reaguje na leczenie po 10 minutach od wstrzyknięcia, można wstrzyknąć dodatkowe 25% dawki nasycającej środka znieczulającego.</li>
	<li>Nałóż wazelinę i lekką maść okulistyczną z olejem mineralnym na oczy zwierzęcia, aby zapobiec wysuszeniu. Wyjmij zwierzęta z klatki i umieść je na czystej, płaskiej powierzchni. Ogol żądaną kończynę tylną od stopy do miednicy za pomocą elektrycznego trymera do włosów, odsłaniając tylko boczną stronę kończyny.</li>
	<li>Nałóż chemiczny środek do usuwania włosów na ogolone miejsce na 1 minutę. Ręcznie usuń włosy za pomocą chusteczek laboratoryjnych. Oczyść depilowany obszar chusteczką laboratoryjną nasączoną etanolem.</li>
</ol>
2. Zabieg chirurgiczny
<ol>
	<li>Sterylizuj narzędzia chirurgiczne w autoklawie lub inną odpowiednią metodą. Oczyścić pole operacyjne i tablicę chirurgiczną 80% etanolem/H20. Zdezynfekuj miejsce operowane prowiodem. Umieść mysz na desce operacyjnej i wyrównaj z ograniczeniami kończyn. Utrzymuj docelową kończynę tylną w anatomicznie naturalnej pozycji z lekko wyprostowanym stawem kolanowym bez rotacji wewnętrznej lub zewnętrznej.</li>
	<li>Umieść zwierzę i deskę pod mikroskopem operacyjnym. Zorientuj się we właściwym miejscu nacięcia poprzez badanie palpacyjne powierzchownych punktów orientacyjnych, w szczególności kostnego stawu kolanowego i grzbietu między mięśniem piszczelowym przednim a mięśniem brzuchatym łydki.</li>
	<li>Wykonaj około 3 cm nacięcie przez skórę za pomocą skalpela lub nożyczek sprężynowych, używając ogólnych kleszczy do chwytania. Wykonaj nacięcie prostopadłe do leżącego poniżej przebiegu wspólnego nerwu strzałkowego.</li>
	<li>Kontynuuj nacięcie przez powięź powierzchowną, odsłaniając mięśnie dwugłowe udowe i obszerne mięśnie boczne. Oddziel te mięśnie, przecinając łączącą powięź głęboką. Cięcie 1-2 cm powinno wystarczyć.</li>
	<li>Cofnij mięsień dwugłowy uda doogonowo za pomocą mechanicznych zwijaczy, odsłaniając wspólny nerw strzałkowy.</li>
	<li>Śledź nerw proksymalnie, aż zostanie znalezione jego przecięcie ze ścięgnem bocznej głowy mięśnia brzuchatego łydki. Uwaga: Narażenie może wymagać dodatkowej manipulacji cofniętą skórą i mięśniami. To skrzyżowanie służy jako stabilny punkt orientacyjny dla uszkodzenia nerwu.</li>
	<li>Chwyć nerw cienkimi kleszczami, wyrównując końcówki równolegle do bocznej granicy ścięgna brzuchatego łydki. Zmiażdż wspólny nerw strzałkowy, wywierając stały, mocny nacisk przez 5 sekund.</li>
	<li>Potwierdź pełne zmiażdżenie nerwu przez oględziny przez lunetę chirurgiczną. Będzie wyglądał na półprzezroczysty w miejscu urazu. W przypadku używania myszy wykazujących ekspresję białek fluorescencyjnych w aksonach obwodowych, fluorescencja zniknie z miejsca urazu.</li>
	<li>Usuń retraktory i wyrównaj mięśnie w ich anatomicznych pozycjach. Zamknij miejsce nacięcia jedwabnymi szwami 6-0. Wystarczy 1-3 proste szwy przerywane. Umieść regenerującą mysz na poduszce grzewczej w czystej klatce.</li>
	<li>Monitoruj wszystkie zwierzęta przez 2 godziny po operacji, aby sprawdzić oddech i wszelkie niepożądane reakcje na znieczulenie. Początkową dawkę buprenorfiny 0,05-0,10 mg/kg mc. należy podać we wstrzyknięciu podskórnym do pachwiny natychmiast po powrocie do zdrowia po operacji. Podawać 3 dodatkowe dawki co 12 godzin przez następne 48 godzin. Po pełnym wyzdrowieniu zwróć myszy do placówki opieki nad zwierzętami.</li>
</ol>
3. Izolacja i barwienie mięśni prostownika długiego długiego (EDL)
<ol>
	<li>Składanie ofiar ze zwierząt za pomocą izofluranu. Dozuj 0,5 ml płynnego izofluranu do probówki o pojemności 50 ml wypełnionej chłonnymi chusteczkami laboratoryjnymi. Umieść niezakorkowaną rurkę ze zwierzęciem w szczelnie zamkniętej komorze o długości 2 500 cm3. Wystarczające są co najmniej 4 minuty ekspozycji. Przetestuj pod kątem utraty obustronnych odruchów palebowych, szczypania palców u nóg i szczypania ogona, aby upewnić się, że każde zwierzę jest nieprzytomne przed przystąpieniem do perfuzji.</li>
	<li>Perfuzja przezsercowa16 zwierząt najpierw za pomocą 10 ml 0,1 M PBS, a następnie 25 ml 4% paraformaldehydu w 0,1 M PBS (pH 7,4). Heparyna (30 jednostek/20 g masy ciała) może być dodawana do PBS (10 jednostek/ml) w celu zapobiegania krzepnięciu krwi w małych naczyniach włosowatych, poprawiając wyniki perfuzji.</li>
	<li>Usuń skórę pokrywającą kończyny tylne za pomocą nożyczek, aby przeciąć poprzecznie skórę na obwodzie brzucha. Złudź skórę poza tylnymi kończynami i stopami za pomocą kleszczy.</li>
	<li>Usuń powierzchowną powięź kończyn tylnych, chwytając i obierając kleszczami. Jeśli używasz myszy eksprymujących białka fluorescencyjne w aksonach obwodowych, po utrwaleniu całych myszy przez noc w 4% PFA w probówkach o pojemności 50 ml. Spłucz trzykrotnie PBS. 
	UWAGA: Myszy stacjonarne można przechowywać w PBS w temperaturze 4 °C. Jeśli nie, pomiń ten krok i przejdź do kroku 3.6 bez naprawiania zwierząt.</li>
	<li>Wypreparuj mięśnie EDL18 z tylnych kończyn myszy, upewniając się, że ścięgna proksymalne i dystalne są tak nienaruszone, jak to możliwe.</li>
	<li>Inkubować mięśnie EDL w buforze blokującym (1x PBS zawierający 0,5% Triton X-100, 3% BSA i 5% koziej surowicy) przez co najmniej 1 godzinę.</li>
	<li>Aby uwidocznić aksony ruchowe i ich zakończenia nerwowe, umieść mięśnie w rurkach zawierających przeciwciała neurofilamentu (1:1000) i synaptotagminy-2 (1:250) rozcieńczone w buforze blokującym przez 3 dni. Umyj mięśnie trzy razy za pomocą 1x PBS i za każdym razem 10 minut. Uwaga: Pomiń ten krok, jeśli używasz myszy eksprymujących białka fluorescencyjne (XFP) w aksonach obwodowych.</li>
	<li>Zabarwić kontralateralny, nieuszkodzony EDL jako pozytywną kontrolę całkowitego unerwienia NMJ. Kontrole ujemne powinny obejmować EDL uzyskany po 4 dniach od urazu, w momencie, w którym NMJ jest całkowicie odnerwiony, a także EDL wybarwiony wyłącznie przeciwciałami drugorzędowymi.</li>
	<li>Inkubuj mięśnie z odpowiednimi fluorescencyjnie znakowanymi przeciwciałami drugorzędowymi, aby wykryć neurofilament i synaptotagminę-2 przez 1 dzień. Umyj mięśnie trzy razy za pomocą 1x PBS i za każdym razem 10 minut. Uwaga: Ten krok można wykonać razem z krokiem 3.10. Pomiń ten krok, jeśli używasz myszy eksprymujących białka fluorescencyjne w aksonach obwodowych.</li>
	<li>Aby uwidocznić region postsynaptyczny NMJ, inkubuj mięśnie z 5 μg/ml sprzężonej alfa-bungarotoksyny Alexa-555 rozcieńczonej w buforze blokującym przez co najmniej 2 godziny. Umyj mięśnie trzykrotnie 1x PBS i 10 minut za każdym razem.</li>
	<li>Aby zamontować całe mięśnie na dodatnio naładowanych szkiełkach podstawowych, umieść mięsień bezpośrednio na szkiełku, dodaj kilka kropli podłoża montażowego na bazie glicerolu na szkiełko i przykryj szkiełkiem nakrywkowym. Dociśnij szkiełko nakrywkowe do szkiełka, aby spłaszczyć mięsień. Nasącz media montażowe z obwodu szkiełka i szkiełka nakrywkowego za pomocą chusteczek laboratoryjnych. Nałóż lakier do paznokci, aby uszczelnić krawędzie między szkiełkiem nakrywkowym a szkiełkiem.</li>
</ol>
4. Obrazowanie i analiza danych
<ol>
	<li>Aby przeanalizować strukturę NMJ, należy zobrazować mięsień EDL za pomocą konfokalnego laserowego mikroskopu skaningowego wyposażonego w wzbudzenie światła o długości fali 488, 555 i 633 nm oraz wychwycić emitowane światło za pomocą obiektywów 20X i 40X.</li>
	<li>Aby zobrazować całe NMJ, utwórz obrazy projekcyjne o maksymalnej intensywności sekcji optycznych oddalonych od siebie o 1 do 2 μm, rozciągających się od najniższych do najwyższych widocznych obszarów NMJ. Twórz projekcje o maksymalnej intensywności za pomocą dostępnego na rynku oprogramowania do obrazowania.</li>
	<li>Aby określić tempo reinerwacji, skategoryzuj NMJ jako: 1) całkowicie odnerwione = miejsce postsynaptyczne jest całkowicie pozbawione kontaktu z aksonem, mniej niż 5% kolokalizacja między aksonem a AChR. 2) Częściowo unerwiony = akson częściowo zachodzi na postsynapsę, 5-95% kolokalizacja między aksonem a AChRs. 3) Pełne unerwienie = prawie idealne ułożenie między pre- i postsynapsą, większa niż 95% kolokalizacja między aksonem a AChR. Wyklucz NMJ, które leżą prostopadle do płaszczyzny obrazowania lub nie są w pełni uwidocznione na obrazie. Uwaga: We wszystkich tych eksperymentach przebadano co najmniej 3 zwierzęta i 50 NMJ na zwierzę. Wyniki uznano za istotne przy użyciu testu t-studenta o wartości P mniejszej niż 0,05.</li>
	<li>Aby oślepić operatora, oddzielne osoby mogą przeprowadzić operację i analizę obrazu. Bez wiedzy na temat grup leczonych analizator może być obiektywny dzięki punktacji NMJ. Alternatywnie, obrazy mogą być randomizowane i prezentowane operatorowi do analizy bez wiedzy o zwierzęciu źródłowym.</li>
</ol>
5. Ilościowy PCR
<ol>
	<li>Składanie ofiar ze zwierząt za pomocą izofluranu i zwichnięcia szyjki macicy. Usuń skórę i powierzchowną powięź pokrywającą mięśnie nóg zgodnie z krokiem 3.3. Rozciąć mięśnie piszczelowe przednie i EDL zgodnie z krokiem 3.4.</li>
	<li>Błyskawicznie zamroź całe mięśnie piszczelowe przednie i EDL w probówce o pojemności 1,5 ml nad ciekłym azotem. Wyjmij tkankę z probówki i umieść we wstępnie schłodzonej moździerzu częściowo zanurzonej w ciekłym azocie. Zmiel zamrożone mięśnie na drobny proszek za pomocą moździerza i tłuczka.</li>
	<li>Rozpuść zamrożony proszek mięśniowy w dostępnym na rynku odczynniku do ekstrakcji RNA i wykonaj ekstrakcję RNA i usunięcie genomowego DNA za pomocą dostępnego na rynku zestawu zgodnie z instrukcjami producenta.</li>
	<li>Wykonaj odwrotną transkrypcję za pomocą dostępnej na rynku mieszanki odwrotnej transkryptazy zgodnie z instrukcjami producenta.</li>
	<li>Wykonaj qPCR przy użyciu dostępnego na rynku zestawu, używając odpowiednich genów porządkowych (patrz tabela materiałów). Do przeprowadzenia PCR należy użyć dostępnego w handlu ilościowego termocyklera PCR (patrz tabela materiałów).</li>
	<li>Ustawić temperaturę wyżarzania na 58 °C. Dostosuj dodatkowe parametry cykliczne do specyfikacji producenta mieszanki polimerazy taq/zielonej mieszanki SYBR. Uwzględnij końcowy krok krzywej topnienia w programie termocyklera składający się ze stopniowego zwiększania temperatury o 0,5 °C od 65 °C do 95 °C w celu przetestowania specyficzności startera i tworzenia dimerów startera.</li>
	<li>Określ względne poziomy ekspresji mRNA metodą 2-ΔΔCT 21 przy użyciu 18S RNA jako genu kontrolnego.</li>
</ol>

<ol><li>Sanes, J. R., Lichtman, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Induction%2C+assembly%2C+maturation+and+maintenance+of+a+postsynaptic+apparatus%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Rev.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Induction, assembly, maturation and maintenance of a postsynaptic apparatus.</a> Nat. Rev. Neurosci. 2 (11), 791-805 (2001).</li>
<li>Moloney, E. B., de Winter, F., Verhaagen, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ALS+as+a+distal+axonopathy%3A+molecular+mechanisms+affecting+neuromuscular+junction+stability+in+the+presymptomatic+stages+of+the+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Front.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">ALS as a distal axonopathy: molecular mechanisms affecting neuromuscular junction stability in the presymptomatic stages of the disease.</a> Front. Neurosci. 8, 252(2014).</li>
<li>Apel, P. J., Alton, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((How+age+impairs+the+response+of+the+neuromuscular+junction+to+nerve+transection+and+repair%3A+An+experimental+study+in+rats%5BTitle%5D)+AND+%22J+Orthop+Res%22%5BJournal%5D)">How age impairs the response of the neuromuscular junction to nerve transection and repair: An experimental study in rats.</a> J Orthop Res. 27 (3), 385-393 (2009).</li>
<li>Balice-Gordon, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Age-related+changes+in+neuromuscular+innervation%5BTitle%5D)+AND+%22Muscle+Nerve+Suppl%22%5BJournal%5D)">Age-related changes in neuromuscular innervation.</a> Muscle Nerve Suppl. 5, S83-S87 (1997).</li>
<li>Valdez, G., Tapia, J. C., Lichtman, J. W., Fox, M. A., Sanes, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Shared+resistance+to+aging+and+ALS+in+neuromuscular+junctions+of+specific+muscles%5BTitle%5D)+AND+%22PloS+one%22%5BJournal%5D)">Shared resistance to aging and ALS in neuromuscular junctions of specific muscles.</a> PloS one. 7 (4), e34640(2012).</li>
<li>Nguyen, Q. T., Sanes, J. R., Lichtman, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pre-existing+pathways+promote+precise+projection+patterns%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Pre-existing pathways promote precise projection patterns.</a> Nat. Neurosci. 5 (9), 861-867 (2002).</li>
<li>Küry, P., Stoll, G., Müller, H. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+mechanisms+of+cellular+interactions+in+peripheral+nerve+regeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Opin+Neurol%22%5BJournal%5D)">Molecular mechanisms of cellular interactions in peripheral nerve regeneration.</a> Curr Opin Neurol. 14 (5), 635-639 (2001).</li>
<li>Gaudet, A. D., Popovich, P. G., Ramer, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Wallerian+degeneration%3A+gaining+perspective+on+inflammatory+events+after+peripheral+nerve+injury%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neuroinflammation%22%5BJournal%5D)">Wallerian degeneration: gaining perspective on inflammatory events after peripheral nerve injury.</a> J Neuroinflammation. 8, 110(2011).</li>
<li>Chen, P., Piao, X., Bonaldo, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Role+of+macrophages+in+Wallerian+degeneration+and+axonal+regeneration+after+peripheral+nerve+injury%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Neuropathol%22%5BJournal%5D)">Role of macrophages in Wallerian degeneration and axonal regeneration after peripheral nerve injury.</a> Acta Neuropathol. 130 (5), 605-618 (2015).</li>
<li>Chen, Z. -L., Yu, W. -M., Strickland, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Peripheral+regeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Annu+Rev+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Peripheral regeneration.</a> Annu Rev Neurosci. 30, 209-233 (2007).</li>
<li>Darabid, H., Perez-Gonzalez, A. P., Robitaille, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neuromuscular+synaptogenesis%3A+coordinating+partners+with+multiple+functions%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Rev.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Neuromuscular synaptogenesis: coordinating partners with multiple functions.</a> Nat. Rev. Neurosci. 15 (11), 703-718 (2014).</li>
<li>Geuna, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+sciatic+nerve+injury+model+in+pre-clinical+research%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci.+Methods%22%5BJournal%5D)">The sciatic nerve injury model in pre-clinical research.</a> J. Neurosci. Methods. 243, 39-46 (2015).</li>
<li>Batt, J. A. E., Bain, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tibial+nerve+transection+-+a+standardized+model+for+denervation-induced+skeletal+muscle+atrophy+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Tibial nerve transection - a standardized model for denervation-induced skeletal muscle atrophy in mice.</a> J. Vis. Exp. (81), e50657(2013).</li>
<li>Savastano, L. E., Laurito, S. R., Fitt, M. R., Rasmussen, J. A., Gonzalez Polo, V., Patterson, S. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sciatic+nerve+injury%3A+a+simple+and+subtle+model+for+investigating+many+aspects+of+nervous+system+damage+and+recovery%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci.+Methods%22%5BJournal%5D)">Sciatic nerve injury: a simple and subtle model for investigating many aspects of nervous system damage and recovery.</a> J. Neurosci. Methods. 227, 166-180 (2014).</li>
<li>Kang, H., Lichtman, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Motor+axon+regeneration+and+muscle+reinnervation+in+young+adult+and+aged+animals%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Motor axon regeneration and muscle reinnervation in young adult and aged animals.</a> J Neurosci. 33 (50), 19480-19491 (2013).</li>
<li>Gage, G. J., Kipke, D. R., Shain, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Whole+animal+perfusion+fixation+for+rodents%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Whole animal perfusion fixation for rodents.</a> J. Vis. Exp. (65), e3564(2012).</li>
<li>Feng, G., Mellor, R. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+Neuronal+Subsets+in+Transgenic+Mice+Expressing+Multiple+Spectral+Variants+of+GFP%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Imaging Neuronal Subsets in Transgenic Mice Expressing Multiple Spectral Variants of GFP.</a> Neuron. 28 (1), 41-51 (2000).</li>
<li>Sanes, J. R., Lichtman, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+the+vertebrate+neuromuscular+junction%5BTitle%5D)+AND+%22Annu+Rev+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Development of the vertebrate neuromuscular junction.</a> Annu Rev Neurosci. 22, 389-442 (1999).</li>
<li>Bowen, D. C., Park, J. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Localization+and+regulation+of+MuSK+at+the+neuromuscular+junction%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">Localization and regulation of MuSK at the neuromuscular junction.</a> Dev Biol. 199 (2), 309-319 (1998).</li>
<li>Gay, S., Jublanc, E., Bonnieu, A., Bacou, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Myostatin+deficiency+is+associated+with+an+increase+in+number+of+total+axons+and+motor+axons+innervating+mouse+tibialis+anterior+muscle%5BTitle%5D)+AND+%22Muscle+Nerve%22%5BJournal%5D)">Myostatin deficiency is associated with an increase in number of total axons and motor axons innervating mouse tibialis anterior muscle.</a> Muscle Nerve. 45 (5), 698-704 (2012).</li>
<li>Livak, K. J., Schmittgen, T. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+relative+gene+expression+data+using+real-time+quantitative+PCR+and+the+2%28-Delta+Delta+C%28T%29%29+Method%5BTitle%5D)+AND+%22Methods%22%5BJournal%5D)">Analysis of relative gene expression data using real-time quantitative PCR and the 2(-Delta Delta C(T)) Method.</a> Methods. 25 (4), San Diego, Calif. 402-408 (2001).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Metoda przedstawiona w niniejszej pracy daje unikalne możliwości identyfikacji mechanizmów zaangażowanych w naprawę połączeń nerwowo-mięśniowych (NMJ). Metoda ta polega na zmiażdżeniu wspólnego nerwu strzałkowego, gdy przechodzi on przez ścięgno mięśnia brzuchatego łydki w pobliżu kolana. Pokazujemy, że już po 5 sekundach ucisku nerwu kleszczami, całkowite zwyrodnienie obserwuje się w ciągu 4 dni po urazie. U młodych dorosłych myszy aksony motoryczne alfa zaczynają reinerwiać poprzednie miejsca synaptyczne w mięśniu pros...

U młodych dorosłych i zdrowych zwierząt, połączenie nerwowo-mięśniowe (NMJ) jest bardzo stabilnym połączeniem między presynapsą, zakończeniem nerwowym aksonu α-motorycznego, a postsynapsą, wyspecjalizowanym regionem pozafuzyjnego włókna mięśniowego, gdzie nikotynowe receptory acetylocholiny (AChR) selektywnie agregują1. Prawie idealne ułożenie aparatów pre- i postsynaptycznych jest niezbędne do prawidłowego przekaźnictwa nerwowego, przetrwania neuronów α-ruchowych i włókien mięśniowych oraz funkcji motorycznych. Niestety, na funkcjonowanie NMJ niekorzystnie wpływa starzenie się, choroby takie jak stwardnienie zanikowe boczne (ALS), choroby autoimmunologiczne oraz urazy mięśni i nerwów obwodowych2-5. Urazy te często skutkują zwyrodnieniem presynaptycznych zakończeń nerwowych, pozostawiając mięśnie odnerwione i znacząco zmieniając zdolności motoryczne. Z tego powodu identyfikacja cząsteczek, które działają w celu utrzymania i naprawy NMJ, stała się priorytetem. Ponieważ nerwy obwodowe regenerują i unerwiają cele, modele uszkodzeń nerwów obwodowych zostały wykorzystane do identyfikacji zmian molekularnych związanych z regeneracją NMJ. 
Modele uszkodzeń nerwów obwodowych często polegają na całkowitym przecięciu lub zmiażdżeniu określonych gałęzi nerwowych6. Po przecięciu rurka wewnętrzna musi zostać zreformowana, co opóźnia regenerację aksonów i ponowne unerwienie komórek i tkanek docelowych. Dotkliwość tego typu urazu powoduje również, że aksony odchylają się od swojej pierwotnej ścieżki, co powoduje, że nie docierają do pierwotnych celów. Jest to przeciwieństwo nerwów uszkodzonych w wyniku zmiażdżenia, w których endonerium pozostaje przyległe, zapewniając ścieżkę do wydajnego i prawidłowego odrastania regenerujących się aksonów. Pozwala również aksonom znaleźć i unerwić swoich pierwotnych partnerów z włókien mięśniowych. Niezależnie od modelu urazu, istnieje szereg zmian komórkowych i molekularnych, które muszą wystąpić, aby aksony mogły się zregenerować i ponownie unerwić cele. Po urazie segment nerwowy bliższy celowi jest rozbijany i usuwany w procesie zwanym zwyrodnieniem Wallera7. Proces ten polega na przeprogramowaniu i odróżnicowaniu komórek Schwanna w komórki niemielinizujące, które wydzielają czynniki regeneracyjne, oczyszczają mielinę i rekrutują makrofagi do miejsca uszkodzenia8. Makrofagi z kolei uzupełniają usuwanie mieliny i resztek aksonalnych, które w przeciwnym razie utrudniałyby wzrost regenerującego się aksonu9. Równolegle neurony ruchowe i czuciowe aktywują mechanizmy potrzebne do wspomagania regeneracji ich odciętych aksonów. Gdy regenerujący się akson dotrze do celu, musi przekształcić się ze stożka wzrostu w zakończenie nerwowe zdolne do prawidłowego przekazywania (w przypadku aksonów ruchowych) lub odbierania (w przypadku aksonów czuciowych) informacji10. W związku z tym aksony motoryczne alfa przechodzą szereg dobrze zaaranżowanych zmian, których kulminacją jest różnicowanie się ich stożka wzrostu w pełni funkcjonalne zakończenie nerwu presynaptycznego, które prawie idealnie przeciwstawia się miejscu postsynaptycznemu na docelowym włóknie mięśniowym11. 
Nerwy kulszowe, piszczelowe i dodatkowe były głównymi wyborami do badania regeneracji aksonów i NMJ12-14. Istnieje jednak szereg wad związanych z używaniem tych modeli do badania zmian komórkowych i molekularnych związanych z regeneracją NMJ między zwierzętami i w różnych warunkach. Po pierwsze, nerw kulszowy zaopatruje większość mięśni kończyny tylnej, a uraz znacznie ogranicza zarówno ruch, jak i czucie. W związku z tym nie jest możliwe zastosowanie tej metody do badania wpływu ćwiczeń samych lub w połączeniu z innymi czynnikami. Dodatkowo nerw kulszowy jest dość grubą strukturą i dlatego wymaga dużej siły ściskającej, aby w pełni uszkodzić wszystkie aksony. To z kolei może skutkować całkowitą transsekcją bardziej powierzchownych aksonów, pozostawiając nienaruszoną rurkę endoneurialną głębiej leżących aksonów, wprowadzając znaczną zmienność w tempie i wierności regeneracji między tymi aksonami. Całkowita transsekcja tego nerwu jest jeszcze mniej pożądana, biorąc pod uwagę, że wiele aksonów nie będzie w stanie ponownie połączyć się z tymi samymi włóknami mięśniowymi. Sprawę komplikuje fakt, że nerw kulszowy posiada wewnętrzną zmienność anatomiczną, zarówno pod względem liczby, jak i miejsca pochodzenia jego końcowych gałęzi nerwowych. Dlatego bardzo trudno jest zmienić kolor w tym samym miejscu. Chociaż nerw piszczelowy jest mniejszy i bardziej podatny na urazy zmiażdżenia, nie ma również łatwo dostępnego punktu orientacyjnego, który służyłby jako miejsce uszkodzenia tej gałęzi nerwowej. 
Dodatkowa gałąź nerwowa (część nerwu czaszkowego XI), która zaopatruje mięsień mostkowo-obojczykowo-sutkowy, była również wykorzystywana do badania regeneracji NMJ15. Nerw ten jest szczególnie atrakcyjny, ponieważ NMJ w mięśniu mostkowo-obojczykowo-sutkowym można łatwiej zobrazować u żywych zwierząt w porównaniu z NMJ w innych mięśniach. Ale podobnie jak w przypadku nerwu kulszowego i piszczelowego, nie ma konkretnego punktu orientacyjnego, który można by wykorzystać do uszkodzenia tego nerwu w tym samym miejscu, ograniczając go jako model do porównywania regeneracji NMJ wśród poszczególnych zwierząt z kohorty eksperymentalnej. Niespójne miejsce zmiany wprowadza zmienność w tempie reinerwacji NMJ. Ze względu na te niedociągnięcia, przedstawiona tutaj procedura wykorzystuje uszkodzenie innej gałęzi nerwu obwodowego do zbadania regenerujących się NMJ. 
Wspólny nerw strzałkowy, zwany również wspólnym nerwem strzałkowym, zawiera wiele cech, które czynią go niezawodnym nerwem do badania regeneracji NMJ między zwierzętami i w różnych terapiach. Wspólny nerw strzałkowy ma przewidywalny przebieg anatomiczny, ponieważ przebiega przez ścięgno bocznej głowy mięśnia brzuchatego łydki w kolanie, a skrzyżowanie służy jako stabilny punkt orientacyjny dla zmian chorobowych. Dostęp do nerwu odbywa się przez małe i minimalnie inwazyjne nacięcie w pobliżu, ale anatomicznie oddzielone od mięśni będących przedmiotem zainteresowania. Przedstawione tutaj odkrycia pokazują, że regenerujące się aksony ruchowe zaczynają reformować NMJ w mięśniu prostownika długiego palca (EDL) 8 dni po zmiażdżeniu nerwu strzałkowego u 70-dniowych młodych dorosłych samic myszy. Co ważne, wzorzec i tempo reinerwacji są spójne u zwierząt w tym samym wieku i tej samej płci, a zatem zapewniają wiarygodny model urazu, który znacznie przyspieszy nasze zrozumienie zmian komórkowych i molekularnych wymaganych do utrzymania i naprawy NMJ.

<table><tbody><tr><td>Ketamina</td><td>VetOne</td><td>501072</td><td></td></tr><tr><td>Xylazine</td><td>Lloyd Inc.&nbsp;</td><td>003437&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Buprenorfina</td><td>&nbsp; Zoopharm</td><td>1Z-73000-150910&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Chusteczki Nair</td><td>Nair</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Kim</td><td>Kimtech</td><td>34155</td><td></td></tr><tr><td>Elektryczna maszynka do golenia</td><td>Braintree Scientific</td><td>CLP-64800</td><td></td></tr><tr><td>80% EtOH/H20</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>10% Proviodine</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>1 ml Strzykawka</td><td></td><td></td><td></td>insulinowa</tr><tr><td>Nożyczki sprężynowe</td><td>Vannas</td><td>91500-09</td><td></td></tr><tr><td>Skalpel nr 15</td><td>Kleszcze Braintree Scientific</td><td>SSS 15</td><td></td></tr><tr><td>#5 Dumont</td><td></td><td>11252-00</td><td></td></tr><tr><td>6-0 jedwabny szew na odwrotnej igle tnącej</td><td>&nbsp; Szew Ekspresowy</td><td>752B&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Poduszka grzewcza dla gryzoni</td><td>Braintree Scientific</td><td>AP-R-18.5</td><td></td></tr><tr><td>Alexa 555 sprzężone</td><td>sondy molekularne</td> alfa-BTX <td>B35451</td><td></td></tr><tr><td>Vectashield</td><td>Vector Labs</td><td>H-1000</td><td></td></tr><tr><td>Mikroskop stereo zmiennoogniskowy</td><td>Olympus</td><td>562037192</td><td></td></tr><tr><td>Zeiss 700 Mikroskop konfokalny</td><td>Zeiss</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Pompa perfuzyjna perystaltyczna o zmiennym przepływie</td><td>Fisher Scientific</td><td>13-876-3</td><td></td></tr><tr><td>Aurum Total RNA Mini Kit</td><td>Bio-Rad</td><td>7326820</td><td></td></tr><tr><td>Bio-Rad iScript RT Supermix</td><td>Bio-Rad</td><td>1708840</td><td></td></tr><tr><td>SsoFast Evagreen Supermix</td><td>Bio-Rad</td><td>1725200</td><td></td></tr><tr><td>Bio-Rad CFX96</td><td>Bio-Rad</td><td>1855196</td><td></td></tr><tr><td>Puralube Maść weterynaryjna</td><td>Puralube</td><td>1621</td><td></td></tr><tr><td>Przeciwciała Synaptotagmin-2-Online</td><td></td><td>ABIN401605</td><td></td></tr><tr><td>Przeciwciała przeciwko neurofilamentom-Online</td><td>ABIN2475842</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

metoda uszkodzenia nerwu strzałkowego: wiarygodny test do identyfikacji i testowania czynników naprawiających połączenia nerwowo-mięśniowe

The Fibular Nerve Injury Method: A Reliable Assay to Identify and Test Factors That Repair Neuromuscular Junctions

Połączenie nerwowo-mięśniowe (NMJ) ulega szkodliwym zmianom strukturalnym i funkcjonalnym w wyniku starzenia się, urazów i chorób. Dlatego konieczne jest zrozumienie zmian komórkowych i molekularnych związanych z utrzymaniem i naprawą NMJ. W tym celu opracowaliśmy metodę wiarygodnego i spójnego badania regenerujących się NMJ u myszy. Ta metoda uszkodzenia nerwu polega na zmiażdżeniu wspólnego nerwu strzałkowego, gdy przechodzi on przez boczną głowę ścięgna mięśnia brzuchatego łydki w pobliżu kolana. Wykorzystując 70-dniowe samice myszy, wykazaliśmy, że aksony motoryczne zaczynają unerwiać poprzednie cele postsynaptyczne w ciągu 7 dni po zmiażdżeniu. Całkowicie ponownie zajmują swoje poprzednie obszary synaptyczne przez 12 dni. Aby określić wiarygodność tej metody urazu, porównaliśmy wskaźniki reinerwacji między poszczególnymi 70-dniowymi samicami myszy. Odkryliśmy, że liczba zreinerwiowanych miejsc postsynaptycznych była podobna u myszy po 7, 9 i 12 dniach od zmiażdżenia. Aby ustalić, czy ten test uszkodzeń można również wykorzystać do porównania zmian molekularnych w mięśniach, zbadaliśmy poziomy podjednostki gamma mięśniowego receptora nikotynowego (gamma-AChR) i kinazy specyficznej dla mięśni (MuSK). Podjednostka gamma-AChR i MuSK są silnie regulowane w górę po denerwacji i wracają do normalnego poziomu po reinerwacji NMJ. Znaleźliśmy ścisły związek między poziomami transkryptów dla tych genów a stanem unerwienia mięśni. Wierzymy, że ta metoda przyspieszy nasze zrozumienie zmian komórkowych i molekularnych związanych z naprawą NMJ i innych synaps.

Nerw strzałkowy wspólny, nazywany również wspólnym nerwem peronealnym, odgałęzia się od nerwu kulszowego powyżej dołu podkolanowego, gdzie opasuje głowę kości strzałkowej, przechodząc na przednią powierzchnię podudzia (Rycina 1A). Tam dzieli się na nerw strzałkowy powierzchowny i głęboki, które wspólnie unerwiają mięśnie zginacze grzbietowe stopy i palców (mięsień piszczelowy przedni, mięsień prostownik długi i krótki palców oraz mięsień prostownik długi palucha) oraz mię...

Opracowaliśmy metodę uszkodzenia nerwów, aby wiarygodnie badać reinerwację mięśni, a tym samym regenerację połączeń nerwowo-mięśniowych u myszy. Technika ta polega na uszkodzeniu wspólnego nerwu strzałkowego za pomocą prostej i wysoce powtarzalnej operacji. Renerwacja mięśni jest następnie oceniana poprzez całkowite zamontowanie mięśnia prostownika długiego palca.

Metoda uszkodzenia nerwu strzałkowego: wiarygodny test do identyfikacji i testowania czynników naprawiających połączenia nerwowo-mięśniowe

The neuromuscular junction (NMJ) undergoes deleterious structural and functional changes as a result of aging, injury and disease. Thus, it is imperative ...

Ogólnym celem tej metody uszkadzania nerwów obwodowych jest wiarygodne badanie regenerujących się złączy neuromięśniowych u myszy. Metoda ta pomoże nam zidentyfikować zmiany molekularne, komórkowe i funkcjonalne związane z regeneracją złączy neuromięśniowych. Główną zaletą tej procedury jest możliwość wiarygodnego porównania tempa regeneracji złączy neuromięśniowych pomiędzy grupami eksperymentalnymi, w dużej mierze przy braku zmian miogennych.Procedurę zademonstruje William Dalkin, student medycyny pracujący w moim laboratorium. Przed rozpoczęciem procedury należy oczyścić miejsce operacyjne, deskę oraz instrumenty za pomocą 80% ethanol, a następnie zdezynfekować je jodopowidonomem. Następnie należy umieścić mysz na desce chirurgicznej i potwierdzić brak reakcji na uciśnięcie palca.Ustaw kończyny w stabilizatorach tak, aby docelowa kończyna tylna znajdowała się w anatomicznie naturalnej pozycji, a stawy kolanowe były lekko wyprostowane, bez rotacji wewnętrznej lub zewnętrznej. Następnie przenieś zwierzę pod mikroskop chirurgiczny i dostosuj ułożenie deski tak, aby przez obiektyw widoczny był kostny staw kolanowy oraz grzbiet między mięśniem piszczelowym przednim a mięśniem brzuchatym łydki. Za pomocą skalpela i pęsety wykonaj nacięcie skóry o długości około trzech centymetrów, prostopadle do przebiegu leżącego poniżej wspólnego nerwu strzałkowego.Kontynuuj nacięcie przez powięź powierzchowną, odsłaniając mięsień dwugłowy uda oraz mięsień obszerny boczny, a następnie wykonaj nacięcie o długości od jednego do dwóch centymetrów przez łączącą je powięź głęboką, aby rozdzielić mięśnie. Następnie użyj retraktorów mechanicznych, aby odsunąć mięsień dwugłowy uda w kierunku ogonowym, odsłaniając wspólną gałąź nerwu strzałkowego. Śledź nerw proksymalnie, aż do znalezienia miejsca jego przecięcia z ścięgnem głowy bocznej mięśnia brzuchatego łydki.Następnie, za pomocą precyzyjnej pęsety chwyć nerw, ustawiając końcówki równolegle do bocznej krawędzi ścięgna mięśnia brzuchatego łydki, i wywarzyj stały, skoncentrowany nacisk przez pięć sekund, aby zmiażdżyć wspólny nerw strzałkowy. Trzymając pęsetę prostopadle do włókien, chwyć tkankę obszarem znajdującym się tuż za końcówką pęsety i wywarzyj mocny, lecz delikatny nacisk, aby uzyskać czyste, liniowe zmiażdżenie nerwu wzdłuż krawędzi ścięgna. Przeprowadź kontrolę wizualną nerwu pod mikroskopem chirurgicznym, aby potwierdzić całkowite zmiażdżenie tkanki.Nerw w miejscu urazu będzie wyglądał na półprzezroczysty. W przypadku zastosowania myszy wykazujących fluorescencję białek w aksonach obwodowych, fluorescencja w miejscu urazu zniknie. Jeśli nerw został wystarczająco uszkodzony, należy usunąć retraktory i przywrócić mięśnie do ich anatomicznych pozycji.Następnie należy użyć jedwabnych szwów 6-0, aby zamknąć miejsce nacięcia za pomocą od jednego do trzech prostych szwów przerywanych, a mysz umieścić na podkładce grzewczej w czystej klatce i monitorować jej stan aż do pełnego powrotu do zdrowia. Ucisk nerwu przez pięć sekund za pomocą precyzyjnej pęsety powoduje zanik YFP w miejscu urazu. Epineurium pozostaje ciągłe, służąc jako przewód dla precyzyjnej regeneracji aksonów do ich pierwotnych celów.U 70-dniowych samic myszy uraz nerwu jest wystarczający, aby spowodować degenerację wszystkich segmentów aksonalnych dystalnie od somy neuronu w czwartym dniu po zmiażdżeniu. Do siódmego dnia po zmiażdżeniu zakończenia nerwowe aktywnie ponownie zajmują zwolnione miejsca postsynaptyczne. W 12. dniu zakończenia nerwowe nadal różnicują się w miejsca presynaptyczne, a złącza nerwowo-mięśniowe zostają w pełni ponownie zinnerwowane.Występuje niewielka zmienność wśród myszy denerwowane przez ten sam okres czasu, co dowodzi, że zmiażdżenie nerwu strzałkowego może być wykorzystane jako test do porównania reinnerwacji mięśni u zwierząt w tym samym wieku i o tej samej płci. Zgodnie z oczekiwaniami, w aksonach ruchowych alfa zachodzi szereg zmian w miarę, jak reinnerwują one włókna mięśniowe. Stożki wzrostu aksonów rozszerzają się i rozgałęziają w momencie kontaktu z miejscami postsynaptycznymi, rozrastając się nad specyficznymi obszarami postsynapsy, co kulminuje w niemal całkowitym sąsiadowaniu zakończeń aksonalnych z miejscami postsynaptycznymi.Jak wykazano za pomocą ilościowej PCR, ekspresja genów związanych z złączem nerwowo-mięśniowym zwiększa się po denerwacji i maleje w miarę ponownej inerwacji złączy nerwowo-mięśniowych. Po opanowaniu techniki, jej wykonanie zajmuje 15 minut, pod warunkiem prawidłowego przeprowadzenia procedury. Podczas wykonywania tej procedury ważne jest, aby nie spieszyć się, wizualizować wszystkie struktury i dwukrotnie sprawdzić, czy uzyskano pełne zmiażdżenie.Po wykonaniu tej procedury można zastosować inne metody, takie jak QPCR, aby odpowiedzieć na dodatkowe pytania dotyczące tego, które geny ulegają nadekspresji lub supresji. Po opracowaniu ta technika utorowała badaczom w dziedzinie neurobiologii drogę do badania regeneracji synaptycznej u myszy. Po obejrzeniu tego filmu powinni Państwo posiadać gruntowną wiedzę na temat przeprowadzania zmiażdżenia nerwu strzałkowego w celu zbadania tempa reinnerwacji złącza nerwowo-mięśniowego u myszy.

the-fibular-nerve-injury-method-reliable-assay-to-identify-test

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Neuronauka

W niniejszym raporcie opisujemy metodę zmiażdżenia nerwu kulszowego u myszy. Metoda ta wykorzystuje powszechnie dostępne kleszczyki hemostatyczne i pozwala w prosty oraz powtarzalny sposób uzyskać całkowite zmiażdżenie nerwu kulszowego. Ponadto opisujemy metodę przygotowania preparatów całych mięśni, odpowiednich do analizy regeneracji nerwów po zmiażdżeniu nerwu kulszowego.

Powtarzalny model zmiażdżenia nerwu kulszowego myszy i późniejsza ocena regeneracji poprzez analizę całego preparatu mięśnia

Ten film demonstruje metodę oceny funkcjonalnych połączeń nerwowo-mięśniowych. Za pomocą bioreaktora zawierającego tkankę mięśniową i neurony ruchowe, wraz z mikroskopią fluorescencyjną, wrażliwe na światło kanały w neuronach są stymulowane do generowania sygnałów elektrycznych, powodując skurcze włókien mięśniowych.

Ocena funkcjonalnego połączenia nerwowo-mięśniowego za pomocą jednoczesnej stymulacji optycznej i nagrywania wideo

Źródło: Dalkin, W., et al. Metoda uszkodzenia nerwu strzałkowego: wiarygodny test do identyfikacji i testowania czynników naprawiających połączenia nerwowo-mięśniowe. J. Vis. Exp. (2016)Ten film przedstawia zabieg chirurgiczny mający na celu wywołanie uszkodzenia nerwu strzałkowego u myszy w celu zbadania regeneracji połączenia nerwowo-mięśniowego (NMJ). Procedura polega na odsłonięciu nerwu strzałkowego, zastosowaniu kontrolowanego nacisku w celu wywołania urazu i upewnieniu się, że epineurium...

Wywoływanie uszkodzenia nerwu strzałkowego u myszy w celu zbadania regeneracji połączeń nerwowo-mięśniowych

Połączenie nerwowo-mięśniowe (NMJ) jest zmienione w różnych stanach, które czasami mogą prowadzić do niewydolności synaptycznej. W niniejszym raporcie opisano metody oparte na mikroskopie fluorescencyjnym do ilościowego określania takich zmian strukturalnych.

Połączenie nerwowo-mięśniowe: pomiar wielkości synaps, fragmentacji i zmian gęstości białek synaptycznych za pomocą konfokalnej mikroskopii fluorescencyjnej

Ocena funkcjonalna połączenia nerwowo-mięśniowego (NMJ) może dostarczyć istotnych informacji na temat komunikacji między mięśniem a nerwem. W tym miejscu opisujemy protokół kompleksowej oceny zarówno NMJ, jak i funkcjonalności mięśni przy użyciu dwóch różnych preparatów mięśniowo-nerwowych, tj. płaszczkowato-kulszowego i przeponowo-przeponowego.

Pomiar funkcjonalności połączenia nerwowo-mięśniowego

Techniki pobudliwości aksonalnej dostarczają potężnego narzędzia do badania patofizjologii i zmian biofizycznych, które poprzedzają nieodwracalne zdarzenia zwyrodnieniowe. Manuskrypt ten demonstruje zastosowanie tych technik na nerwie łokciowym znieczulonych szczurów.

In vivo (in vivo)Pomiar elektrofizjologiczny nerwu łokciowego szczura z badaniem pobudliwości aksonalnej

Prezentowany jest protokół do wytwarzania różnych typów uszkodzeń nerwu pośrodkowego (MN) i naprawy u szczura. Dodatkowo protokół pokazuje, jak ocenić funkcjonalną regenerację nerwu za pomocą kilku nieinwazyjnych testów behawioralnych i pomiarów fizjologicznych.

Funkcjonalne i fizjologiczne metody oceny regeneracji nerwu pośrodkowego u szczura

Zautomatyzowana analiza chodu jest możliwym narzędziem do oceny funkcjonalnego powrotu do zdrowia w modelach gryzoni z uszkodzeniem nerwów obwodowych i uszkodzeniem rdzenia kręgowego. Chociaż wymaga to tylko jednego zestawu do oceny funkcji lokomotorycznych w różnych modelach eksperymentalnych, bardzo ważne jest skrupulatne dostosowanie i szkolenie zwierząt w sprzęcie i sprzęcie.

Zautomatyzowana analiza chodu w celu oceny powrotu do sprawności funkcjonalnej u gryzoni z uszkodzeniem nerwów obwodowych lub stłuczenia rdzenia kręgowego

Ocena regeneracji motorycznej pozostaje punktem odniesienia w eksperymentalnych badaniach nerwów obwodowych. Izometryczny pomiar siły tężcowej mięśnia piszczelowego przedniego u szczura jest nieocenionym narzędziem do oceny wyników funkcjonalnych po rekonstrukcji wad nerwu kulszowego. Metody i niuanse są szczegółowo opisane w tym artykule.

Maksymalny izometryczny pomiar siły tężcowej mięśnia piszczelowego przedniego u szczura

Zdolność do dokładnego wykrywania komponentów połączenia nerwowo-mięśniowego jest kluczowa w ocenie zmian w jego architekturze spowodowanych procesami patologicznymi lub rozwojowymi. Poniżej przedstawiamy pełny opis prostej metody uzyskiwania wysokiej jakości obrazów całych połączeń nerwowo-mięśniowych, które można wykorzystać do wykonywania pomiarów ilościowych.

Rozwarstwienie pojedynczych włókien mięśni szkieletowych do analiz immunofluorescencyjnych i morfometrycznych połączeń nerwowo-mięśniowych w całości

Poznaj metodę uszkodzenia nerwu strzałkowego u myszy do badania regeneracji połączeń nerwowo-mięśniowych. Technika umożliwia niezawodną ocenę reinnerwacji mięśnia prostownika palców długich.

Metoda uszkodzenia nerwu strzałkowego: wiarygodny test do identyfikacji i testowania czynników naprawiających połączenia nerwowo-mięśniowe (Wideo) | JoVE Journal

Metoda uszkodzenia nerwu strzałkowego: wiarygodny test do identyfikacji i testowania czynników naprawiających połączenia nerwowo-mięśniowe

Przeglądaj więcej filmów