Metoda uszkodzenia nerwu strzałkowego: wiarygodny test do identyfikacji i testowania czynników naprawiających połączenia nerwowo-mięśniowe

Ogólnym celem tej metody uszkodzenia nerwów obwodowych jest wiarygodne zbadanie regenerujących się połączeń nerwowo-mięśniowych u myszy. Metoda ta pomoże nam zidentyfikować zmiany molekularne, komórkowe i funkcjonalne związane z regeneracją połączeń nerwowo-mięśniowych. Główną zaletą tej procedury jest to, że tempo regeneracji połączeń nerwowo-mięśniowych można wiarygodnie porównać między grupami eksperymentalnymi w dużej mierze przy braku zmian miogennych.

Procedurę zademonstruje William Dalkin, student medycyny w moim laboratorium. Przed rozpoczęciem zabiegu należy użyć 80% etanolu do oczyszczenia pola operacyjnego, deski i narzędzi, a następnie zdezynfekować jodonem powidonu. Następnie umieść mysz na tablicy operacyjnej i potwierdź brak reakcji na uszczypnięcie palca.

Ustawić kończyny w obrębie pasów przytrzymujących z docelową kończyną tylną w anatomicznie naturalnej pozycji i stawami kolanowymi nieznacznie wyprostowanymi bez rotacji wewnętrznej lub zewnętrznej. Następnie przenieś zwierzę pod mikroskop chirurgiczny i wyreguluj deskę, aż kostny staw kolanowy i grzbiet między mięśniem piszczelowym przednim a mięśniem brzuchatym łydki będą widoczne przez obiektyw. Za pomocą skalpela i kleszczy wykonaj około trzycentymetrowe nacięcie skóry, prostopadłe do leżącego poniżej przebiegu wspólnego nerwu strzałkowego.

Kontynuuj nacięcie przez powięź powierzchowną, odsłaniając mięsień dwugłowy uda i mięśnie obszerne boczne, a następnie wykonaj jedno- lub dwucentymetrowe nacięcie przez łączącą powięź głęboką w celu oddzielenia mięśni. Następnie użyj mechanicznych zwijaczy, aby doogonowo cofnąć mięsień dwugłowy uda, aby odsłonić wspólny nerw strzałkowy. Śledź nerw proksymalnie, aż zostanie znalezione jego przecięcie ze ścięgnem bocznej głowy mięśnia brzuchatego łydki.

Następnie za pomocą cienkich kleszczy chwyć nerw, wyrównując końcówki równolegle do bocznej granicy ścięgna brzuchatego łydki i wywieraj stały, skoncentrowany nacisk przez pięć sekund, aby zmiażdżyć wspólny nerw strzałkowy. Trzymając kleszcze prostopadle do włókna, chwyć tkankę obszarem tuż za końcówką kleszczy i zastosuj mocny, ale delikatny nacisk, aby uzyskać czyste, liniowe zmiażdżenie nerwu wzdłuż granicy ścięgna. Sprawdź wzrokowo nerw za pomocą mikroskopu chirurgicznego, aby potwierdzić całkowite zmiażdżenie tkanki.

Nerw będzie wyglądał na półprzezroczysty w miejscu urazu. Jeśli użyjesz myszy wyrażających białka fluorescencyjne w aksonach obwodowych, fluorescencja zniknie z miejsca urazu. Jeśli nerw został wystarczająco uszkodzony, usuń zwijacze i ustaw mięśnie w ich anatomicznych pozycjach.

Następnie użyj jedwabnych szwów 6-0, aby zamknąć miejsce nacięcia za pomocą jednego lub trzech prostych przerywanych szwów i umieść mysz na poduszce grzewczej w czystej klatce z monitorowaniem, aż do całkowitego wyzdrowienia. Uciskanie nerwu przez pięć sekund za pomocą cienkich kleszczy powoduje zniknięcie YFP z miejsca urazu. Epineurium pozostaje przyległe, służąc jako kanał do precyzyjnej regeneracji aksonów do ich pierwotnych celów.

U 70-dniowych samic myszy uszkodzenie nerwu jest wystarczające, aby spowodować zwyrodnienie wszystkich segmentów aksonalnych dystalnych od somy neuronalnej, po czterech dniach od zmiażdżenia. Po siedmiu dniach od zmiażdżenia zakończenia nerwowe aktywnie ponownie zajmują opuszczone miejsca postsynaptyczne. W 12 dniu zakończenia nerwowe nadal różnicują się w miejsca presynaptyczne, a połączenia nerwowo-mięśniowe są w pełni wzmocnione.

Istnieje niewielka zmienność wśród myszy odnerwionych przez ten sam czas, co pokazuje, że miażdżenie nerwu strzałkowego może być stosowane jako test do porównania wzmocnienia mięśni między zwierzętami w tym samym wieku i tej samej płci. Zgodnie z oczekiwaniami, w aksonach motorycznych alfa zachodzi szereg zmian, ponieważ reinerwują one włókna mięśniowe. Stożki wzrostu aksonów rozszerzają się i rozgałęziają, gdy stykają się z miejscami postsynaptycznymi, rosnąc nad określonymi regionami postsynapsy i osiągając kulminację w prawie całkowitym zestawieniu zakończeń aksonalnych z miejscami postsynaptycznymi.

Jak wykazano ilościową metodą PCR, geny związane z połączeniami nerwowo-mięśniowymi zwiększają się po odnerwieniu i zmniejszają się wraz ze reinerwacją połączeń nerwowo-mięśniowych. Po opanowaniu tej techniki można ją wykonać w 15 minut, jeśli zostanie wykonana prawidłowo. Próbując wykonać tę procedurę, ważne jest, aby pamiętać, aby nie spieszyć się, zwizualizować wszystkie struktury i dokładnie sprawdzić, czy uzyskano pełne zmiażdżenie.

Po tej procedurze można wykonać inne metody, takie jak QPCR, aby odpowiedzieć na dodatkowe pytania dotyczące tego, które geny są regulowane w górę lub w dół. Po jej opracowaniu technika ta utorowała drogę naukowcom w dziedzinie neurobiologii do badania regeneracji synaps u myszy. Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak wykonać zmiażdżenie nerwu strzałkowego, aby zbadać tempo reinerwacji połączenia nerwowo-mięśniowego u myszy.