Name: Protokół eksperymentalny produkcji biodiesla z izolacją alkenonów jako produktów ubocznych z komercyjnej biomasy glonów Isochrysis (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-06-24T15:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 10 s
Description: Poznaj metodę produkcji biodiesla z mikroalg Isochrysis z jednoczesną izolacją alkenonów jako wartościowych produktów ubocznych. Technika ta wykorzystuje ekstrakcję Soxhleta i transestryfikację, osiągając wydajność powyżej 90%.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Praca ta była wspierana przez National Science Foundation (CHE-1151492), Northwest Advanced Renewables Alliance (stypendium J. Wilsona-Peltiera) oraz poprzez prywatną darowiznę od przyjaciół WHOI. Dziękujemy Kevinowi R. Steidleyowi i Kim Ascherl (USDA / ARS / NCAUR) za doskonałą pomoc techniczną.

1. Przygotowanie mikroalg i biomasy
Uwaga: Mikroalgi morskie Isochrysis sp. "T-iso" użyte w niniejszym badaniu można zakupić (patrz Lista materiałów). Wielokilogramowe ilości Isochrysis można kupić w postaci mrożonej mokrej pasty (Iso-paste) zawierającej około 80% wody i 20% biomasy, o kolorze ciemnozielonym / prawie czarnym z ostrym zapachem pachnącym morzem. Isochrysis można również kupić w postaci suchego (95% suchego) żółto-brązowego proszku (Iso-powder) o podobnym zapachu.
<ol>
	<li>W celu wysuszenia pasty Isochrysis należy otworzyć opakowanie o wadze 1 kg, wycinając nożyczkami otwór o średnicy 1 - 2 cali w rogu plastikowego opakowania.</li>
	<li>Wyciśnij około 300 g tej pasty Isochrysis przez otwór do naczynia krystalizującego o wymiarach 150 mm x 75 mm, aby utworzyć cienką warstwę (~20 mm).</li>
	<li>Pozostaw pastę do wyschnięcia na powietrzu w temperaturze pokojowej, aż stanie się sucha i łuszcząca się (zwykle 48 - 96 godzin). 
	Uwaga: Rzeczywisty czas schnięcia może się różnić i zależy od temperatury. Nie zauważono jednak różnicy w plonach ani jakości produktu przy jeszcze dłuższym czasie schnięcia (do dwóch tygodni). Proces suszenia można również ujednolicić i/lub przyspieszyć, umieszczając naczynie krystalizujące na ciepłym talerzu (30 - 40 °C).</li>
	<li>Zeskrobać suchą biomasę z naczynia krystalizującego za pomocą szpatułki i zebrać do gilzy do ekstrakcji celulozy (długość: 123 mm, średnica wewnętrzna 43 mm). Zapisać masę suchej biomasy Isochrysis.</li>
</ol>
2. Ekstrakcja suchej biomasy izochrysisowej metodą Soxhleta
<ol>
	<li>Załaduj gilzę do ekstrakcji celulozy zawierającą Isochrysis (zwykle 50 - 60 g suchej biomasy) do aparatu do ekstrakcji Soxhleta.</li>
	<li>Napełnij kolbę Soxhleta heksanami (400 ml), włącz wodę i źródło ciepła w skraplaczu, a następnie pozwól Soxhletowi pracować przez 24 - 48 godzin (do momentu, gdy kolor rozpuszczalnika zmieni się z ciemnozielonego na bladożółty</li>).
	<li>Wyłączyć ogrzewanie i pozostawić urządzenie do ostygnięcia do temperatury pokojowej, a następnie odłączyć kolbę od ekstraktora Soxhleta.</li>
	<li>Usunąć heksany za pomocą wyparki obrotowej i zanotować masę materiału ekstrahowanego heksanami ("olej z alg heksanowych" (h-AO)).</li>
</ol>
3. Zmydlenie oleju z alg oraz oddzielenie kwasów tłuszczowych i neutralnych lipidów
<ol>
	<li>Ponownie rozpuścić h-AO w tej samej kolbie okrągłodennej z kroku 2.4 powyżej za pomocą metanolu:dichlorometanu (2:1, objętość = 10 x masa oleju z alg).</li>
	<li>Dodaj mieszadło i podłącz skraplacz zwrotny (cewka: długość 500 mm).</li>
	<li>DodaćH2O(objętość = 2,67 x masa oleju z alg) i KOH (50% w/w oleju z alg) i podgrzewać zawartość, mieszając do 60 °C przez 3 godziny.</li>
	<li>Po schłodzeniu do temperatury pokojowej usunąć rozpuszczalniki organiczne (metanol i dichlorometan) z wyparki obrotowej.</li>
	<li>Pozostałą mieszaninę wodną przenieść, wlewając ją do 1-litrowego lejka separacyjnego. Dodać heksany (równoważne objętościowo roztworowi wodnemu), wstrząsnąć rozdzielaczem i pozostawić warstwy do rozdzielenia.</li>
	<li>Dolną warstwę wody należy odcedzić do kolby Erlenmeyera i odlać górną fazę organiczną do oddzielnej warstwy wody Erlenmeyera.</li>
	<li>Powtarzaj kroki 3.5 i 3.6, aż warstwa organiczna stanie się bezbarwna (zwykle jeszcze 1-2 razy).</li>
	<li>Skoncentrować połączone ekstrakty organiczne na wyparce obrotowej w celu wyizolowania obojętnych lipidów w postaci zielonkawego ciała stałego (mp. ≈ 60 - 70 °C).</li>
	<li>Zakwasić fazę wodną HCl (6 M, aż do pH ~ 2, jak wskazano w papierze pH).</li>
	<li>Ekstrahować wolne kwasy tłuszczowe (FFA) z zakwaszonej fazy wodnej za pomocą heksanów (równa objętość do fazy wodnej) za pomocą rozdzielacza o pojemności 1 l, jak opisano w krokach 3.5 i 3.6.</li>
	<li>Usunąć heksany z wyparki obrotowej, aby otrzymać FFA w postaci ciemnozielonej, prawie czarnej oleistej pozostałości (ciecz w temperaturze >30 °C).</li>
</ol>
4. Katalizowana kwasem estryfikacja wolnych kwasów tłuszczowych i produkcja ekologicznego biodiesla
<ol>
	<li>Przenieść FFA za pomocą metanolu:chloroform (1:1, 6 x objętość oleju z alg), aby najpierw rozpuścić FFA, a następnie wlać do grubościennej wysokociśnieniowej kolby reakcyjnej wyposażonej w mieszadło.</li>
	<li>Dodać skoncentrowany H2SO4 (20% w/w oleju z alg), zamknąć kolbę i podgrzać mieszaninę do temperatury 90 °C, mieszając przez 1 godzinę.</li>
	<li>Po schłodzeniu do temperatury pokojowej przenieść mieszaninę, wlewając ją do rozdzielacza.</li>
	<li>DodaćH2O(2 x objętość oleju z alg), wstrząsnąć rozdzielaczem i odczekać, aż fazy się rozdzielą.</li>
	<li>Odcedź dolną warstwę do wstępnie zważonej kolby okrągłodennej i skoncentruj się na wyparce obrotowej. Zapisać masę powstałego biodiesla.</li>
	<li>Analizować profil kwasów tłuszczowych metodą chromatografii gazowej z detektorem płomieniowo-jonizacyjnym (GC-FID)28 (chromatograf gazowy wyposażony w kolumnę DB-88 [(88% cyjanopropylo)metyloarylopolisiloksanu] (30 m x 0,25 mm ID x 0,20 μm grubości warstwy). 
	Uwaga: Powszechnie stosowane estry metylowe kwasów tłuszczowych są weryfikowane przez porównanie czasu retencji z autentycznymi próbkami uzyskanymi komercyjnie. Dodatkowo, chromatografia gazowa ze spektrometrią mas (GC-MS; chromatograf gazowy sprzężony z detektorem selektywnym masy) jest wykonywana w identycznych warunkach programu temperaturowego i kolumny w celu analizy składników takich jak C18:4, dla których nie są dostępne autentyczne wzorce z wynikami zastosowanymi do oznaczania ilościowego GC.</li>
</ol>
5. Odbarwianie biodiesla
<ol>
	<li>Podgrzać ciemnozielony biodiesel do temperatury 60 °C w kolbie z okrągłym dnem wyposażonej w mieszadło.</li>
	<li>Dodać montmorylonit K 10 (MK10) w proszku (10-20% w/w biodiesla) i mieszać przez 1 godzinę.</li>
	<li>Zdejmij okrągłe dno z ognia i pozwól roztworowi ostygnąć do temperatury pokojowej.</li>
	<li>Przygotować aparat filtracyjny składający się z kolby okrągłodennej i lejka filtracyjnego zawierającego celulozową bibułę filtracyjną (popiół 0,007%).</li>
	<li>Przelać schłodzony, odbarwiony biodiesel przez lejek filtracyjny, używając minimalnej ilości heksanów, aby przepłukać kolbę okrągłodenną.</li>
	<li>Odłączyć lejek filtra od kolby okrągłodennej (która zawiera teraz roztwór heksanów odbarwionego biodiesla) i usunąć heksany za pomocą parownika obrotowego, aby uzyskać pomarańczowo-czerwony biodiesel.</li>
	<li>Próbki należy przechowywać w temperaturze 4 °C, w tym czasie nastąpi pewne osiadanie materiału nierozpuszczalnego (~10% w/w).</li>
	<li>Usunąć nierozpuszczalny materiał przez dekantację lub filtrację, jak opisano w krokach 5.4 i 5.5, w celu uzyskania klarownego, jednorodnego biodiesla do analizy.</li>
</ol>
6. Izolacja i oczyszczanie alkenonów z neutralnych lipidów
<ol>
	<li>Rozpuścić obojętne lipidy (z kroku 3.8) w minimalnej ilości dichlorometanu (około 50 ml na 10 g obojętnych lipidów) i dodać roztwór pipetą do górnej części kolumny chromatograficznej (Odw 60 mm, ID 55 mm, długość 18") zawierającej żel krzemionkowy (230-400 mesh, 100 g).</li>
	<li>Eluować roztwór przez krzemionkę pod ciśnieniem (~5 psi) przy użyciu dichlorometanu (około 150 ml) jako rozpuszczalnika i zebrać eluent w kolbie okrągłodennej o pojemności 250 ml.</li>
	<li>Usunąć dichlorometan za pomocą wyparki obrotowej, aby uzyskać ciało stałe o pomarańczowym zabarwieniu.</li>
	<li>Rekrystalizować ciało stałe za pomocą heksanów, dodając około 100 ml wrzących heksanów, a następnie stopniowo dodawać dodatkowe ilości wrzących heksanów, aż roztwór będzie jednorodny (całkowita objętość ~ 150 ml). Następnie powoli schładzaj roztwór do temperatury pokojowej, aby ułatwić krystalizację.</li>
	<li>Zebrać skrystalizowane alkenony za pomocą aparatu filtracyjnego opisanego w kroku 5.4, używając niewielkiej ilości zimnych (0 °C) heksanów do przepłukania kolby.</li>
</ol>

<ol><li>Ahmad, A. L., Mat Yasin, N. H., Derek, C. J. C., Lim, J. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microalgae+as+a+sustainable+energy+source+for+biodiesel+production%3A+A+review%5BTitle%5D)+AND+%22Renew.+Sustain.+Energy+Rev%22%5BJournal%5D)">Microalgae as a sustainable energy source for biodiesel production: A review.</a> Renew. Sustain. Energy Rev. 15 (1), 584-593 (2011).</li>
<li>Vardona, D. R., Sharmab, B. K., Blazinaa, G. V., Rajagopalanb, K., Strathmann, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Thermochemical+conversion+of+raw+and+defatted+algal+biomass+via+hydrothermal+liquefaction+and+slow+pyrolysis%5BTitle%5D)+AND+%22Bioresour.+Technol%22%5BJournal%5D)">Thermochemical conversion of raw and defatted algal biomass via hydrothermal liquefaction and slow pyrolysis.</a> Bioresour. Technol. 109, 178-187 (2012).</li>
<li>Tenenbaum, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Food+vs+fuel%3A+Diversion+of+crops+could+cause+more+hunger%5BTitle%5D)+AND+%22Environ.+Health+Perspect%22%5BJournal%5D)">Food vs fuel: Diversion of crops could cause more hunger.</a> Environ. Health Perspect. 116, 254-257 (2008).</li>
<li>Pienkos, D. T., Darzins, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+promise+and+challenges+of+microalgal-derived+biofuels%5BTitle%5D)+AND+%22Biofuels%2C+Bioprod.+Biorefin%22%5BJournal%5D)">The promise and challenges of microalgal-derived biofuels.</a> Biofuels, Bioprod. Biorefin. 3 (4), 431-440 (2009).</li>
<li>U.S. First Crude Oil Purchase Price. , U.S Energy Information Administration. Available from: 
 <a target="_blank" href="http://www.eia.gov/dnav/pet/hist/LeafHandler.ashx?n=PET&s=F000000__3&f=A">http://www.eia.gov/dnav/pet/hist/LeafHandler.ashx?n=PET&s=F000000__3&f=A</a> (2015).</li>
<li>Sheehan, J., Dunahay, T., Sheehan, J., Dunahay, T., Benemann, J., Roessler, P. A. A look back at the U.S. Department of Energy's Aquatic Species Program: Biodiesel from algae. , Prepared by the National Renewable Energy Laboratory, report NREL/TP-580-24190. Available from: <a target="_blank" href="www.nrel.gov/docs/legosti/fy98/24190.pdf ">www.nrel.gov/docs/legosti/fy98/24190.pdf </a> (1996).</li>
<li>Petkov, G., Ivanova, A., Iliev, I., Vaseva, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+critical+look+at+the+microalgae+biodiesel%5BTitle%5D)+AND+%22Eur.+J.+Lipid+Sci%22%5BJournal%5D)">A critical look at the microalgae biodiesel.</a> Eur. J. Lipid Sci. 114 (2), 103-111 (2012).</li>
<li>van Beilen, J. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Why+microalgal+biofuels+won%27t+save+the+internal+combustion+engine%5BTitle%5D)+AND+%22Biofuels%2C+Bioprod.+Biorefin%22%5BJournal%5D)">Why microalgal biofuels won't save the internal combustion engine.</a> Biofuels, Bioprod. Biorefin. 4, 41-52 (2010).</li>
<li>Chisti, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biodiesel+from+microalgae%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechnol.+Adv%22%5BJournal%5D)">Biodiesel from microalgae.</a> Biotechnol. Adv. 25 (3), 294-306 (2007).</li>
<li>Wijffles, R. H., Barbosa, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+outlook+on+microalgal+biofuels%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">An outlook on microalgal biofuels.</a> Science. 329, 796-799 (2010).</li>
<li>Ferrell, J., Sarisky-Reed, V. National Algal Biofuels Technology Roadmap. Fishman, D., Majumdar, R., Morello, J., Pate, R., Yang, J. , United States Department of Energy. Available from: <a target="_blank" href="http://www1.eere.energy.gov/bioenergy/pdfs/algal_biofuels_roadmap.pdf">http://www1.eere.energy.gov/bioenergy/pdfs/algal_biofuels_roadmap.pdf</a> (2010).</li>
<li>Patterson, G. W., Tsitsa-Tsardis, E., Wikfors, G. H., Gladu, P. K., Chitwood, D. J., Harrison, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sterols+and+alkenones+of+Isochrysis%5BTitle%5D)+AND+%22Phytochem%22%5BJournal%5D)">Sterols and alkenones of Isochrysis.</a> Phytochem. 35 (5), 1233-1236 (1994).</li>
<li>Volkman, J. K., Eglinton, G., Corner, E. D. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Long-chain+alkenes+and+alkenones+in+the+marine+coccolithophorid+Emiliania+huxleyi%5BTitle%5D)+AND+%22Phytochem%22%5BJournal%5D)">Long-chain alkenes and alkenones in the marine coccolithophorid Emiliania huxleyi.</a> Phytochem. 19, 2619-2622 (1980).</li>
<li>Conte, M. H., Thompson, A., Lesley, D., Harris, R. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetic+and+physiological+influences+on+the+alkenone%2Falkenoate+versus+growth+temperature+relationship+in+Emiliania+huxleyi+and+Gephyrocapsa+Oceanica%5BTitle%5D)+AND+%22Geochim.+Cosmochim.+Acta%22%5BJournal%5D)">Genetic and physiological influences on the alkenone/alkenoate versus growth temperature relationship in Emiliania huxleyi and Gephyrocapsa Oceanica.</a> Geochim. Cosmochim. Acta. 62 (1), 51-68 (1998).</li>
<li>Brassell, S. C., Eglinton, G., Marlowe, I. T., Pflaumann, U., Sarnthein, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+stratigraphy%3A+a+new+tool+for+climatic+assessment%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Molecular stratigraphy: a new tool for climatic assessment.</a> Nature. 320, 129-133 (1986).</li>
<li>Marlowe, I. T., Brassell, S. C., Eglinton, G., Green, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Long+chain+unsaturated+ketones+and+esters+in+living+algae+and+marine+sediments%5BTitle%5D)+AND+%22Org.+Geochem%22%5BJournal%5D)">Long chain unsaturated ketones and esters in living algae and marine sediments.</a> Org. Geochem. 6, 135-141 (1984).</li>
<li>Prahl, F. G., Wakeham, S. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Calibration+of+unsaturation+patterns+in+long-chain+ketone+compositions+for+palaeotemperature+assessment%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Calibration of unsaturation patterns in long-chain ketone compositions for palaeotemperature assessment.</a> Nature. 330, 367-369 (1987).</li>
<li>Eglinton, G., Bradshaw, S. A., Rosell, A., Sarnthein, M., Pflaumann, U., Tiedemann, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+record+of+secular+sea+surface+temperature+changes+on+100-year+timescales+for+glacial+terminations+I%2C+II+and+IV%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Molecular record of secular sea surface temperature changes on 100-year timescales for glacial terminations I, II and IV.</a> Nature. 356, 423-426 (1992).</li>
<li>Müller, P. J., Kirst, G., Ruhland, G., von Storch, I., Rosell-Melé, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Calibration+of+the+alkenone+paleotemperature+index+U37K%E2%80%B2+based+on+core-tops+from+the+eastern+South+Atlantic+and+the+global+ocean+%2860%C2%B0N-60%C2%B0S%29%5BTitle%5D)+AND+%22Geochim.+Cosmochim.+Acta%22%5BJournal%5D)">Calibration of the alkenone paleotemperature index U37K′ based on core-tops from the eastern South Atlantic and the global ocean (60°N-60°S).</a> Geochim. Cosmochim. Acta. 62 (10), 1757-1772 (1998).</li>
<li>Volkman, J. K., Barrerr, S. M., Blackburn, S. I., Sikes, E. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Alkenones+in+Gephyrocapsa+oceanica%3A+Implications+for+studies+of+paleoclimate%5BTitle%5D)+AND+%22Geochim.+Cosmochim.+Acta%22%5BJournal%5D)">Alkenones in Gephyrocapsa oceanica: Implications for studies of paleoclimate.</a> Geochim. Cosmochim. Acta. 59 (3), 513-520 (1995).</li>
<li>Eltgroth, M. L., Watwood, R. L., Wolfe, G. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Production+and+cellular+localization+of+neutral+long-chain+lipids+in+the+haptophyte+algae+Isochrysis+Galbana.+and+Emiliania+Huxleyi%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Phycol%22%5BJournal%5D)">Production and cellular localization of neutral long-chain lipids in the haptophyte algae Isochrysis Galbana. and Emiliania Huxleyi.</a> J. Phycol. 41, 1000-1009 (2005).</li>
<li>Volkman, J. K., Everitt, D. A., Allen, D. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Some+analyses+of+lipid+classes+in+marine+organisms%2C+sediments+and+seawater+using+thin-layer+chromatography-flame+ionisation+detection%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Chromatogr.+A%22%5BJournal%5D)">Some analyses of lipid classes in marine organisms, sediments and seawater using thin-layer chromatography-flame ionisation detection.</a> J. Chromatogr. A. 356, 147-162 (1986).</li>
<li>Epstein, B. L., D'Hondt, S., Quinn, J. G., Zhang, J., Hargraves, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+effect+of+dissolved+nutrient+concentrations+on+alkenone-based+temperature+estimates%5BTitle%5D)+AND+%22Paleoceanography%22%5BJournal%5D)">An effect of dissolved nutrient concentrations on alkenone-based temperature estimates.</a> Paleoceanography. 13 (2), 122-126 (1998).</li>
<li>Prahl, F. G., Sparrow, M. A., Wolfe, G. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Physiological+impacts+on+alkenone+paleothermometry%5BTitle%5D)+AND+%22Paleoceanogaphy%22%5BJournal%5D)">Physiological impacts on alkenone paleothermometry.</a> Paleoceanogaphy. 18 (2), 1025-1031 (2003).</li>
<li>Sachs, D., Sachs, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inverse+relationship+between+D%2FH+fractionation+in+cyanobacterial+lipids+and+salinity+in+Christmas+Island+saline+ponds%5BTitle%5D)+AND+%22Geochim.+Cosmochim.+Acta%22%5BJournal%5D)">Inverse relationship between D/H fractionation in cyanobacterial lipids and salinity in Christmas Island saline ponds.</a> Geochim. Cosmochim. Acta. 72 (25), 793-806 (2008).</li>
<li>O'Neil, G. W., Culler, A. R., Williams, J. R., Burlow, N. P., Gilbert, G. J., Carmichael, C. A., Nelson, R. K., Swarthout, R. F., Reddy, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Production+of+jet+fuel+range+hydrocarbons+as+a+coproduct+of+algal+biodiesel+by+butenolysis+of+long-chain+alkenones%5BTitle%5D)+AND+%22Energy+Fuels%22%5BJournal%5D)">Production of jet fuel range hydrocarbons as a coproduct of algal biodiesel by butenolysis of long-chain alkenones.</a> Energy Fuels. 29 (2), 922-930 (2015).</li>
<li>Foley, P. M., Beach, E. S., Zimmerman, J. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Algae+as+a+source+of+renewable+chemicals%3A+opportunities+and+challenges%5BTitle%5D)+AND+%22Green+Chem%22%5BJournal%5D)">Algae as a source of renewable chemicals: opportunities and challenges.</a> Green Chem. 13, 1399-1405 (2011).</li>
<li>Razon, L. F., Bacani, F. T., Evangelista, R. L., Knothe, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fatty+acid+profile+of+kenaf+seed+oil%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Am.+Oil+Chem.+Soc%22%5BJournal%5D)">Fatty acid profile of kenaf seed oil.</a> J. Am. Oil Chem. Soc. 90 (6), 835-840 (2013).</li>
<li>Issariyakul, T., Dalai, A. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biodiesel+production+from+greenseed+canola+oil%5BTitle%5D)+AND+%22Energy+Fuels%22%5BJournal%5D)">Biodiesel production from greenseed canola oil.</a> Energy Fuels. 24, 4652-4658 (2010).</li>
<li>Nalder, T. D., Miller, M. R., Packer, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Changes+in+lipid+class+content+and+composition+of+Isochrysis.+sp.+%28T-Iso%29+grown+in+batch+culture%5BTitle%5D)+AND+%22Aquacult.+Int%22%5BJournal%5D)">Changes in lipid class content and composition of Isochrysis. sp. (T-Iso) grown in batch culture.</a> Aquacult. Int. 23, 1293-1312 (2015).</li>
<li>Mercer, P., Armenta, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Developments+in+oil+extraction+from+microalgae%5BTitle%5D)+AND+%22Eur.+J.+Lipid+Sci.+Technol%22%5BJournal%5D)">Developments in oil extraction from microalgae.</a> Eur. J. Lipid Sci. Technol. 113 (5), 539-547 (2011).</li>
<li>O'Neil, G. W., Carmichael, C. A., Goepfert, T. J., Fulton, J. M., Knothe, G., Lau, C. P. -L., Lindell, S. R., Mohammady, N. G. -E., Van Mooy, B. A. S., Reddy, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Beyond+fatty+acid+methyl+esters%3A+expanding+the+renewable+carbon+profile+with+alkenones+from+Isochrysis+sp%5BTitle%5D)+AND+%22Energy+Fuels%22%5BJournal%5D)">Beyond fatty acid methyl esters: expanding the renewable carbon profile with alkenones from Isochrysis sp.</a> Energy Fuels. 26, 2434-2441 (2012).</li>
<li>O'Neil, G. W., Knothe, G., Williams, J. R., Burlow, N. P., Culler, A. R., Corliss, J. M., Carmichael, C. A., Reddy, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synthesis+and+analysis+of+an+alkenone-free+biodiesel+from+Isochrysis+sp%5BTitle%5D)+AND+%22Energy+Fuels%22%5BJournal%5D)">Synthesis and analysis of an alkenone-free biodiesel from Isochrysis sp.</a> Energy Fuels. 28 (4), 2677-2683 (2014).</li>
<li>Knothe, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dependence+of+biodiesel+fuel+properties+on+the+structure+of+fatty+acid+alkyl+esters%5BTitle%5D)+AND+%22Fuel+Process.+Technol%22%5BJournal%5D)">Dependence of biodiesel fuel properties on the structure of fatty acid alkyl esters.</a> Fuel Process. Technol. 86, 1059-1070 (2005).</li>
<li>Valenzuela-Espinoza, E., Millán-Núñez, R., Protein Núñez-Cebrero, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protein%2C+carbohydrate%2C+lipid+and+chlorophyll+a+content+in+Isochrysis+aff.+galbana+%28clone+T-Iso%29+cultured+with+a+low+cost+alternative+to+the+f%2F2+medium%5BTitle%5D)+AND+%22Aquacult.+Eng%22%5BJournal%5D)">Protein, carbohydrate, lipid and chlorophyll a content in Isochrysis aff. galbana (clone T-Iso) cultured with a low cost alternative to the f/2 medium.</a> Aquacult. Eng. 25, 207-216 (2002).</li>
<li>Kulkarni, M. G., Dalai, A. K., Bakshi, N. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Utilization+of+green+seed+canola+oil+for+biodiesel+production%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Chem.+Technol.+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Utilization of green seed canola oil for biodiesel production.</a> J. Chem. Technol. Biotechnol. 81, 1886-1893 (2006).</li>
</ol>

Wzmianki o nazwach handlowych lub produktach komercyjnych w tej publikacji służą wyłącznie dostarczeniu konkretnych informacji i nie oznaczają rekomendacji ani poparcia ze strony Departamentu Rolnictwa Stanów Zjednoczonych. USDA jest dostawcą równych szans i pracodawcą.

Isochrysis jest jednym z zaledwie wybranych gatunków glonów hodowanych przemysłowo, zbieranych jako główny składnik paszy dla skorupiaków, a zatem reprezentatywnych dla skali niezbędnej do produkcji biopaliw. Dostępność wykorzystanych glonów i standardowe metody zastosowane w tym badaniu sprawiają, że przedstawiony protokół jest szeroko dostępny dla innych grup w celu dalszych badań. Krytyczne etapy obejmują suszenie glonów na powietrzu (w przeciwieństwie do liofilizacji33), ekstrakcje rozpuszczalnikiem, zmydlanie i estryfikację. Dzięki tym operacjom można zbadać wydajność lipidów i innych produktów ubocznych z różnych dostępnych Isochrysis 30. Przewiduje się, że mogą się one różnić w wyniku różnych szczepów i metod uprawy31, a także mogą mieć na nie wpływ charakter produktu i wszelkie dodatkowe procesy przetwarzania (np. suszenie lub zamrażanie) stosowane przez dostawcę. Jak pokazujemy tutaj, opracowany protokół może być z powodzeniem stosowany do różnych rodzajów produktów Isochrysis, począwszy od mokrej pasty, a skończywszy na suchym mielonym proszku. Uzysk biodiesla był jednak niższy w przypadku biomasy sproszkowanej (7% m/w suchej biomasy vs. 12% m/w z suszonej pasty), co odpowiada mniejszym ilościom ekstrahowanego oleju z alg (h-AO). Może to sugerować, że alternatywny protokół ekstrakcji32 inny niż aparat Soxhleta może być lepiej odpowiedni dla suchych sproszkowanych produktów Isochrysis. Proszek Isochrysis użyty w tym badaniu jest reklamowany jako zawierający 23-25% lipidów, które są podobne do tego, co eksperymentalnie uzyskaliśmy z suszonej pasty Isochrysis. 33,34,26
Pomimo różnych kolorów wyjściowej suchej biomasy, Iso-paste-hAO i Iso-powder-hAO były zasadniczo nie do odróżnienia, oba ciemnozielone/prawie czarne ciała stałe o temperaturze topnienia około 50 °C. Co ciekawe, stosunek FFA do obojętnych lipidów w dwóch ekstraktach heksanu był inny. Po zmydleniu i oddzieleniu obojętnych lipidów otrzymaliśmy 60% (w/w) FFA i 40% (w/w) obojętnych lipidów z Iso-paste-hAO. Iso-powder-hAO wytwarzał średnio 46% (w/w) FFA i 54% (w/w) obojętnych lipidów. Wyniki sugerują, że albo początkowa sproszkowana biomasa może zawierać większe ilości obojętnych lipidów w porównaniu z pochodnymi FA niż pasta Isochrysis, albo że ekstrakcja Soxhleta sproszkowanego Isochrysis jest nieco selektywna dla obojętnych lipidów.
Różniły się nie tylko uzysk produktów uzyskanych z dwóch komercyjnych biomas Isochrysis , ale także profile kwasów tłuszczowych uzyskanego biodiesla. Jest to o tyle istotne, że właściwości paliwowe biodiesla są bezpośrednio zależne od charakteru i zawartości poszczególnych FAME. 35 Aby biodiesel mógł zostać wprowadzony na rynek, musi spełniać normy opisane w dokumentach ASTM D6751 lub EN 14214 odpowiednio w Stanach Zjednoczonych lub Europie. Specyfikacje obejmują zakresy smarności i lepkości kinematycznej oraz minimalne wartości liczby cetanowej i stabilności oksydacyjnej. Inne ważne zalecenia dotyczą właściwości płynięcia na zimno w postaci punktu zmętnienia (CP) lub punktu zablokowania zimnego filtra (CFPP). Wcześniej informowaliśmy o wynikach kompleksowych testów paliwowych biodiesla przygotowanego z pasty Iso. 36 Ponieważ profil FAME biodiesla produkowanego z proszku izodiesla w tym badaniu jest podobny do wcześniej testowanych, możemy przewidzieć, że niektóre właściwości paliwa będą podobne w przypadku obu paliw biodiesla. Na przykład wielonienasycone kwasy tłuszczowe (PuFAME, więcej niż dwa wiązania podwójne) stanowią około 40% obu mieszanin FAME (35,2% i 39,9%, tabela 2). Spowoduje to słabą stabilność oksydacyjną i korzystny przepływ zimna. 35 Istnieją jednak niewielkie różnice w profilach FAME tych dwóch paliw biodiesla. Biodiesel produkowany ze sproszkowanego Isochrysis zawierał większe ilości FAME 14:0 (19,4 mg/g vs. 16,4 mg/g), 18:3 (13,5 mg/g vs. 8,5 mg/g) i 22:6 (11,0 mg/g vs. 6,9 mg/g) FAME, ale mniejsze 18:4 (10,4 mg/g vs. 19,8 mg/g). Zakres wpływu tych różnic na różne właściwości paliw zawarte w normach ASTM pozostaje do zbadania.
Początkowy biodiesel uzyskany z obu komercyjnych alg Isochrysis miał podobnie ciemnozielony kolor, co można wytłumaczyć obecnością chlorofilów. 36 Stwierdzono, że chlorofil i jego pochodne mają negatywny wpływ na stabilność olejów roślinnych i odpowiadających im paliw biodiesla. 36,29 W oparciu o metodę Issariyakula i Dalai do odbarwiania oleju rzepakowego z nasion zielonych w związku z produkcją biodiesla,29 mieszanie naszego zielonego biodiesla ponad 10% (w/w) MK10 w temperaturze 60 °C przez 1 godzinę spowodowało radykalne zmniejszenie zawartości pigmentu w wyniku kontroli wzrokowej (patrz rysunek 2). Odzyski masy z procesu odbarwiania wynosiły średnio 90%.
Wydajność oczyszczonych alkenonów z obojętnych lipidów Iso-paste-hAO i Iso-powder-hAO była porównywalna odpowiednio przy 40% i 46% w/w (Tabela 1). Ponieważ obojętne lipidy stanowią większą część materiału zawartego w Iso-powder-hAO (54% w/w vs. 40% w/w), wydajność alkenonu z Iso-powder-hAO przekracza wydajność alkenonu Iso-paste-hAO o około 10% (25% w/w vs. 16% w/w). Biorąc jednak pod uwagę, że wydajność samego Iso-powder-hAO była niższa niż Iso-paste-hAO (15% vs. 20% w/w), ogólne uzyski alkenonów z obu suchych biomas Isochrysis są bardziej podobne (0,2 x 0,4 x 0,4 = 3,2% w/w z suszonej pasty Isochrysis i 0,15 x 0,54 x 0,46 = 3,7% z proszku Isochrysis).

W ostatnim czasie odnotowano znaczne odrodzenie zainteresowania biopaliwami z alg, w szczególności w kontekście produkcji paliw ciekłych, takich jak biodiesel1 oraz innych olejów pochodzenia biomasowego.2 Do proponowanych korzyści należy uniknięcie pewnych kontrowersji związanych z dylematem „żywność kontra paliwo”3 a także raportowana wyższa produktywność i większe możliwości mitygacji CO2 niż w przypadku tradycyjnych upraw rolniczych.4 Jest to kontynuacja trwającego niemal 20 lat programu Aquatic Species Program (ASP) Departamentu Energii Stanów Zjednoczonych, rozpoczętego w 1978 roku w celu zbadania możliwości pozyskiwania paliw transportowych z alg. Jak wskazano w raporcie Sheehana,5 program zakończył się w 1996 roku przede wszystkim dlatego, że przewidywane koszty nie były wówczas konkurencyjne w stosunku do ropy naftowej (18,46 USD za baryłkę (159 L)). Choć cena ropy naftowej od tego czasu drastycznie wzrosła (87,39 USD za baryłkę w 2014 r.)6, co wiąże się z renesansem badań nad biopaliwami z alg, niektórzy argumentują, że mimo to biopaliwa algowe okażą się zbyt kosztowne.7 Jako jedna ze strategii mających na celu zniwelowanie kosztów produkcji biopaliw, wśród krytyków7,8 i zwolenników9,10 pojawiła się koncepcja produktów współistniejących o dodanej wartości, która stanowi jeden z kluczowych powodów dążenia do rozwoju biopaliw algowych w „Krajowej mapie drogowej technologii biopaliw algowych” (National Algal Biofuels Technology Roadmap) Departamentu Energii (DOE) Stanów Zjednoczonych.1 
W niniejszej pracy opisujemy metodę współprodukcji dwóch oddzielnych strumieni paliw z komercyjnych mikroalg Isochrysis. Skupiliśmy się na Isochrysis częściowo dlatego, że są one już produkowane przemysłowo i pozyskiwane na potrzeby akwakultury morskiej, a także dlatego, że Isochrysis jest jednym z niewielu gatunków alg, które oprócz tradycyjnych lipidów (tj. kwasów tłuszczowych) biosyntetyzują unikalną klasę związków znanych jako wielonienasycone długołańcuchowe alkenony.12 Struktury alkenonów charakteryzują się bardzo długimi łańcuchami węglowodorowymi (36-40 węgli), od dwóch do czterech wiązań podwójnych trans z przerwami nie-metylenowymi oraz ketonem metylowym lub etylowym (Rysunek 1). Nienasycenie alkenonów jest wrażliwe na temperaturę wzrostu alg,13,14 tak że proporcja dinienasyconego metyloalkenonu C37 (tzw. „indeks nienasycenia”) może służyć jako wskaźnik przeszłych temperatur powierzchni morza.15−20 Uważa się, że alkenony znajdują się w cytoplazmatycznych ciałkach lipidowych i mogą występować w większej ilości niż triacyloglicerole (TAG).21,2 W warunkach ograniczonej dostępności azotu lub fosforu, w fazie stacjonarnej od 10 do 20% węgla komórkowego kumuluje się w postaci alkenonów.23,24 Z punktu widzenia ewolucyjnego alkenony mogły zostać preferowane nad TAG, ponieważ geometria ich wiązań podwójnych trans zapewnia bardziej stabilną formę magazynowania energii.21
<img alt="wzór 37:3 metyloalkenonu, struktura ketonu i alkenu trans, schemat chemiczny." src="/files/ftp_upload/54189/54189fig1.jpg" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Rycina 1"> 
Rysunek 1. Struktury wielonienasyconych długołańcuchowych alkenonów. Powszechny alkenon metylowy 37:3 wyizolowany z Isochrysis stanowiące przykład długich łańcuchów węglowodorowych (od 36 do 40 węgli), Proszę podać tekst źródłowy do tłumaczenia. przerwane wiązania podwójne nie-metylenowe, kończące się grupą ketonową metylową lub etylową. Nomenklatura jest podobna do kwasów tłuszczowych, gdzie #:# odnosi się do liczby atomów węgla:liczby wiązań podwójnych. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54189/54189fig1large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić większą wersję tej figury.</a>
Twierdzimy, że alkenony stanowią obiecujący odnawialny surowiec węglowy pozyskiwany ze zwykłych alg o ugruntowanej historii uprawy przemysłowej.25 Biodiesel produkowany bezpośrednio z całkowitego ekstraktu lipidowego Isochrysis zawiera znaczną ilość (10-15% w/w) alkenonów, a zanieczyszczenie tymi związkami o wysokiej temperaturze topnienia skutkuje słabymi właściwościami niskotemperaturowymi paliwa. Jednak stosując opisane tutaj techniki zmydlania/ekstrakcji, alkenony można usunąć i odzyskać, co poprawia jakość biodiesla, tworząc jednocześnie wtórny strumień produktów. Niedawno zademonstrowaliśmy konwersję alkenonów w paliwo ciekłe poprzez metatezę krzyżową z 2-butenem (butenolizę).26 Reakcja butenolizy wykorzystuje komercyjny inicjator metatezy rutenowej, zachodzi szybko w niskiej temperaturze i pozwala na czyste otrzymanie przewidywalnej mieszaniny węglowodorów z zakresu paliw lotniczych. Reakcja ta jest prowadzona równolegle z syntezą biodiesla z kwasów tłuszczowych, co stanowi pierwsze kroki w kierunku podejścia typu „biorafineria”27 w celu komercyjnie opłacalnej produkcji biopaliwa z Isochrysis.

<table><tbody><tr><td>Isochrysis</td><td>Reed Mariculture</td><td>Iso, Surowe, Nieprzetworzone, 20%dw</td><td>Pasta z żywych kultur bakterii, 20% w/w biomasy</td></tr><tr><td>Isochrysis</td><td>Necton, S.A</td><td>AADISS004</td><td>PhytoBloom Prof Isochrysis (liofilizowany)</td></tr><tr><td>Heksany</td><td>Fisher Chemical</td><td>H291-4</td><td>Certyfikowany przez ACS</td></tr><tr><td>metanol</td><td>Fisher Chemical</td><td>A452-4</td><td>HPLC</td></tr><tr><td>Dichlorometan</td><td>Fisher Chemical</td><td>D37-4</td><td>Certyfikowany/stabilizowany</td></tr><tr><td>aparat Soxhleta</td><td>Sigma Aldrich</td><td>64826</td><td></td></tr><tr><td>Naparstek ekstrakcyjny</td><td>Sigma Aldrich</td><td>64842</td><td></td></tr><tr><td>B&uuml; chner Lejek</td><td>Chemglass</td><td>CG-1406-25</td><td></td></tr><tr><td>Wysokociśnieniowe naczynie reakcyjne</td><td>Chemglass</td><td>CG-1880-12</td><td></td></tr><tr><td>Bibuła filtracyjna Whatman</td><td>GE Life Sciences</td><td>1442-042</td><td>Grade 42, popiół 0,007%, okrąg, 42,5 mm</td></tr><tr><td>Biodiesel (B100)</td> <td>Bellingham Shell</td><td></td><td>Biodiesel (B100) w <silny>Rysunek 3</silny> został zakupiony na lokalnej stacji benzynowej: Bellingham Shell, Bellingham, WA 98226</td></tr><tr><td>Isochrysis</td><td>Aquacave</td><td></td><td>Oprócz Reed and Necton, Isochrysis można również kupić w Aquacave (Gurnee, IL) pod adresem: www.aquacave.com (dostęp 30 września 2015 r.).</td></tr><tr><td>Isochrysis</td><td>Brine Shrimp Direct</td><td></td><td>Isochrysis można również kupić w Brine Shrimp Direct (Ogden, UT) pod adresem: www.brineshrimpdirect.com (dostęp 30 września 2015 r.).</td></tr></tbody></table>

protokół eksperymentalny produkcji biodiesla z izolacją alkenonów jako produktów ubocznych z komercyjnej biomasy glonów isochrysis

Experimental Protocol for Biodiesel Production with Isolation of Alkenones as Coproducts from Commercial Isochrysis Algal Biomass

Potrzeba zastąpienia paliw ropopochodnych alternatywnymi źródłami z odnawialnych i bardziej zrównoważonych środowiskowo źródeł nabiera coraz większego znaczenia. Biopaliwa pochodzące z biomasy zyskały w tym względzie duże zainteresowanie, jednak biopaliwa pierwszej generacji z roślin jadalnych, takich jak etanol kukurydziany lub biodiesel sojowy, generalnie wypadły z łask. W związku z tym istnieje duże zainteresowanie rozwojem metod produkcji paliw płynnych z krajowych i lepszych źródeł niejadalnych. Poniżej opisujemy szczegółową procedurę produkcji oczyszczonego biodiesla z morskich mikroalg Isochrysis. Ponadto unikalny zestaw lipidów znany jako wielonienasycone długołańcuchowe alkenony są izolowane równolegle jako potencjalnie cenne produkty uboczne, aby zrównoważyć koszty produkcji biodiesla. Wielokilogramowe ilości Isochrysis są kupowane z dwóch komercyjnych źródeł, z których jeden jest w postaci mokrej pasty (80% wody), która jest najpierw suszona przed przetwarzaniem, a drugi w postaci suchego mielonego proszku (95% suchego). Lipidy są ekstrahowane heksanami w aparacie Soxhleta w celu wytworzenia oleju z alg ("heksanowy olej z alg") zawierającego zarówno tradycyjne tłuszcze (tj. trójglicerydy, 46-60% w/w), jak i alkenony (16-25% w/w). Zmydlenie trójglicerydów w oleju z alg pozwala na oddzielenie powstałych wolnych kwasów tłuszczowych (FFA) od obojętnych lipidów zawierających alkenony. FFA są następnie przekształcane w biodiesel (tj. estry metylowe kwasów tłuszczowych, FAME) przez estryfikację katalizowaną kwasem, podczas gdy alkenony są izolowane i oczyszczane z obojętnych lipidów przez krystalizację. Wykazaliśmy, że biodiesel z obu komercyjnych biomas Isochrysis ma podobne, ale nie identyczne profile FAME, charakteryzujące się podwyższoną zawartością wielonienasyconych kwasów tłuszczowych (ok. 40% w/w). Uzyski biodiesla były konsekwentnie wyższe w przypadku rozpoczęcia od mokrej pasty Isochrysis (12% w/w vs. 7% w/w), co można przypisać mniejszym ilościom oleju z alg heksanowych uzyskanego ze sproszkowanego produktu Isochrysis.

Przed przystąpieniem do przetwarzania, Isochrysis pasta (Iso-pastę) najpierw wysuszono. W większej skali udało się to wygodnie osiągnąć poprzez dodanie Iso– przenieść do dużej szalki krystalizacyjnej i pozostawić materiał do wyschnięcia na powietrzu w temperaturze pokojowej. Podczas suszenia tworzy się nieco zgromadzonej wody (zazwyczaj o czerwonym zabarwieniu), którą można usunąć poprzez zlanie lub odpipetowanie w celu przyspieszenia procesu suszenia. Po około 48–96 godzinach całkowicie wysuszony Isochrysis można było zdrapać z naczynia krystalizacyjnego i uzyskać w formie czarno-zielonego, płatkowego materiału o zapachu przypominającym wodorosty (Rysunek 2). Wydajność suchej biomasy wynosiła zazwyczaj 20% w/w pasty, zgodnie z deklaracją. W przeciwieństwie do tego, sproszkowana Isochrysis produkt (Izo-proszek) był żółto-brązowym, drobno zmielonym, suchym proszkiem (95% suchej masy), który stosowano bezpośrednio bez dalszego przetwarzania (Rycina 2).
<img alt="Proces poprawy właściwości gleby; porównanie popiołu i biowęgla; wyniki eksperymentu; badanie nad poprawą jakości gleby." src="/files/ftp_upload/54189/54189fig2.jpg" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Rysunek 2"> 
Rysunek 2. Porównanie komercyjnych Isochrysis. Isochrysis pastę (80% wilgotności) rozprowadza się po dnie naczynia do krystalizacji i pozostawia do wyschnięcia na powietrzu w temperaturze pokojowej przez 48–96 godz. przed dalszą obróbką. W wyniku tego procesu powstała wysuszona Isochrysis otrzymuje się w postaci ciemnego, płatkowego materiału (po prawej), który różni się wyglądem od komercyjnego proszku Isochrysis (lewa). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54189/54189fig2large.jpg" target="_blank">Prosimy kliknąć tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.</a>
Ekstrakcja Soxhleta za pomocą heksanów z wysuszonej pasty Iso lub proszku Iso- pozwoliła, po odparowaniu heksanów, na otrzymanie olejów algowych (h-AO), które pod względem wyglądu były podobne – stanowiły ciemnozielone/niemal czarne ciała stałe (t.top. ~ 50-60 °C). Wydajność h-AO przy wyjściowej paście („Iso-paste-hAO”) wynosiła zazwyczaj 20% w/w suchej biomasy Isochrysis, co jest zgodne z naszymi poprzednimi wynikami,26 podczas gdy wydajność h-AO przy ekstrakcji Soxhleta z komercyjnego proszku Isochrysis („Iso-powder-hAO”) wyniosła 15% w/w (Tabela 1).
<table fo:keep-together.within-page="1">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Produkt (g)</td>
			<td>Iso-wklej</td>
			<td>Izolacja-proszek-1</td>
			<td>Iso-proszek-2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sucha biomasa </td>
			<td>30</td>
			<td>20</td>
			<td>20</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Olej algowy ekstrahowany heksanem </td>
			<td>5.86</td>
			<td>2.87</td>
			<td>3.11</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>wolne kwasy tłuszczowe </td>
			<td>3.52</td>
			<td>1.34</td>
			<td>1.38</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lipidy obojętne </td>
			<td>2.34</td>
			<td>1.38</td>
			<td>1.61</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alkenony </td>
			<td>0.94</td>
			<td>0.63</td>
			<td>0.74</td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="4">Uwagi: Iso-powder-1 i Iso-powder-2 reprezentują wyniki z dwóch próbek sproszkowanego Isochrysis, które zostały przetworzone równolegle. W przypadku innych raportów dotyczących wydajności tych produktów z pasty Iso (Iso-paste) należy zapoznać się z referencjami 26, 32 i 3.</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
Tabela 1. Wydajność produktów z komercyjnej biomasy Isochrysis.
Acyloglicerole w h-AO przekształcono w odpowiadające im rozpuszczalne w wodzie sole karboksylowe (t.j. mydła) poprzez dodanie wodnego KOH w mieszaninie metanol/CH2Cl2. Następnie lipidy obojętne, w tym alkenony, wyekstrahowano z tej wodnej mieszaniny poprzez selektywne rozdzielanie heksanami. Po usunięciu lipidów obojętnych ponowne zakwaszenie mydeł doprowadziło do powstania odpowiadających im wolnych kwasów tłuszczowych (FFAs), które można było w podobny sposób wyekstrahować z fazy wodnej heksanami. Całkowite odzyski masy połączonych FFAs i lipidów obojętnych zarówno z Iso-paste-hAO, jak i z Iso-powder-hAO były konsekwentnie bliskie ilościowych. Jednak stosunek produktów (t.j. lipidów obojętnych + FFAs) był inny. Z Iso-paste-hAO otrzymano 60% (w/w) FFAs i 40% (w/w) lipidów obojętnych (Tabela 1). Z kolei Iso-powder-hAO okazał się wzbogacony w lipidy obojętne (średnio = 54% lipidów obojętnych + 46% FFAs), zgodnie ze szczegółami w Tabeli 1.
Estryfikacja wolnych kwasów tłuszczowych (FFA) z H2SO4 i metanol, co doprowadziło do powstania estrów metylowych kwasów tłuszczowych (FAME, t.j., biodiesel) w postaci ciemnozielonego, niemal czarnego tłustego płynu z wydajnością przekraczającą 90% (Rycina 3). Odbarwianie poprzez ogrzewanie nad Montmorillonitem K1029 glinka (MK10) dała następnie produkt o żółto-pomarańczowym kolorze, podobny pod względem wyglądu do innych komercyjnych paliw z biodiesla (patrz Lista materiałów) (Rycina 3). Wyniki analizy FAME odbarwionych Isochrysis paliwa biodieslowe przedstawiono w Tabela 2.
<img alt="Układ do analizy chemicznej z fiolkami do chromatografii; proces rozdziału związków organicznych." src="/files/ftp_upload/54189/54189fig3.jpg" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Rycina 3"> 
Rycina 3. Porównanie Isochrysis oraz biopaliwa z soi. Zielony Isochrysis biodiesel (środek) otrzymuje się poprzez estryfikację wyekstrahowanych i oczyszczonych wolnych kwasów tłuszczowych. Odbarwianie pozwala uzyskać produkt (prawo) o właściwościach zbliżonych do komercyjnego biodiesla (lewo). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54189/54189fig3large.jpg" target="_blank">Proszę kliknąć tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.</a>
<table fo:keep-together.within-page="1">
	<tbody >
		<tr >
			<td >FAMEA</td>
			<td >Iso-pasta</td>
			<td >Iso-proszek</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >14:0</td >
			<td >16.4</td >
			<td >19.4</td >
		</tr>
		<tr >
			<td >14:01</td >
			<td >-</td >
			<td >0.3</td >
		</tr>
		<tr >
			<td >15:0</td >
			<td >ślady</td >
			<td >0.3</td >
		</tr>
		<tr >
			<td >16:0</td >
			<td >10.1</td >
			<td >8.8</td >
		</tr>
		<tr >
			<td >16:1 Δ9</td >
			<td >7.6</td >
			<td >5.5</td >
		</tr>
		<tr >
			<td >16:02</td >
			<td >ND</td >
			<td >0.3</td >
		</tr>
		<tr >
			<td >16:03</td >
			<td >ND</td >
			<td >0.5</td >
		</tr>
		<tr >
			<td >18:0</td >
			<td >Ślady</td >
			<td >0.2</td >
		</tr>
		<tr >
			<td >18:1B</td >
			<td >12.1</td >
			<td >14.3</td >
		</tr>
		<tr >
			<td >18:02</td >
			<td >8.1</td >
			<td >7.1</td >
		</tr>
		<tr >
			<td >18:3C</td >
			<td >8.5</td >
			<td >13.5</td >
		</tr>
		<tr >
			<td >18:04</td >
			<td >19.8</td >
			<td >10.4</td >
		</tr>
		<tr >
			<td >18:05</td >
			<td >ND</td >
			<td >3</td >
		</tr>
		<tr >
			<td >20:05</td >
			<td >ND</td >
			<td >-</td >
		</tr>
		<tr >
			<td >22:05</td >
			<td >ND</td >
			<td >2</td >
		</tr>
		<tr >
			<td >2:06</td >
			<td >6.9</td >
			<td >1</td >
		</tr>
		<tr >
			<td >ΣD</td >
			<td >89.8</td >
			<td >96.2</td >
		</tr>
		<tr >
			<td colspan="3">Uwagi: ANomenklatura kwasów tłuszczowych to liczba węgli:#wiązania podwójne cis. BSuma 18:1 Δ9 + 18:1 Δ1. CSuma izomerów Δ6,9,12 oraz Δ9,12,15. DPozostały materiał to w przybliżeniu 50:50 inne FAME oraz komponenty niebędące FAME (łącznie ~95% FAME). ND = nie wykryto.</td >
		</tr>
	</tbody>
</table>
Tabela 2. Skład FAME biodizla otrzymanego z komercyjnej biomasy Iso-past i Iso-powder Isochrysis.
Lipidy obojętne otrzymano w formie zielonej mieszaniny stałej z wydajnością 40% m/m z Iso-paste-hAO oraz średnio 54% z Iso-powder-hAO (Tabela 1). Filtrowanie rozpuszczonych lipidów obojętnych przez krzemionkę przy użyciu DCM, a następnie odparowanie rozpuszczalnika, pozwoliło na otrzymanie czerwonopomarańczowej substancji stałej, którą można było rekrystalizować z heksanami w celu uzyskania analitycznie czystych alkenonów w formie białego proszku. Procedura ta pozwoliła na wyizolowanie alkenonów z wydajnością 16% (m/m) z Iso-paste-hAO oraz 25% z Iso-powder-hAO (Tabela 1).

Przedstawiono szczegółowe metody produkcji biodiesla wraz z koizolacją alkenonów jako cennych produktów ubocznych z komercyjnych mikroalg Isochrysis.

Protokół eksperymentalny produkcji biodiesla z izolacją alkenonów jako produktów ubocznych z komercyjnej biomasy glonów Isochrysis

The need to replace petroleum fuels with alternatives from renewable and more environmentally sustainable sources is of growing importance. ...

Ogólnym celem niniejszej procedury jest produkcja biodiesla z komercyjnie dostępnych alg Isochyrsis, przy jednoczesnej koizolacji długołańcuchowych alkenonów jako wartościowego produktu ubocznego. Metoda ta może pomóc w udzieleniu odpowiedzi na kluczowe pytania w dziedzinie energii odnawialnej, takie jak to, czy biopaliwa algowe stanowią realną alternatywę dla paliw pochodzenia naftowego.Główną zaletą tej techniki jest to, że wykorzystywane przez nas algi są już hodowane przemysłowo i mogą być nabywane w ilościach wielokilogramowych od kilku komercyjnych dostawców. Ponadto te konkretne algi biosyntetyzują unikalny zestaw lipidów, znanych jako długołańcuchowe alkenony, które mogą być izolowane jako produkt uboczny. Procedurę zaprezentuje John Williams, doktorant w moim laboratorium.Aby przygotować dostępną komercyjnie mokrą pastę z isochrysis, należy wyciąć niewielki otwór w opakowaniu o masie jednego kilograma i wycisnąć około 300 g na szalkę krystalizacyjną o wymiarach 150 by 75 mm. Pasta składa się w około 80% z wody, ma ciemnozielony, niemal czarny kolor i ostry zapach. Pastę należy wysuszyć na powietrzu, tworząc warstwę o grubości około 20 mm.Przenieś suchą biomasę do kolumienki do ekstrakcji celulozy o znanej masie. Następnie zapisz masę biomasy Isochrysis. Przenieś około 50–60 g suchej biomasy Isochrysis do aparatu ekstrakcyjnego Soxhleta.Następnie należy napełnić kolbę aparatu Soxhleta 400 mililitrami heksanów. Należy uruchomić dopływ wody do chłodnicy oraz źródło ciepła i pozostawić aparat Soxhleta do pracy w cyklu przez jeden do dwóch dni. Ekstrakcja jest zakończona, gdy kolor rozpuszczalnika zmieni się z ciemnozielonego na bladożółty.Ostudzić do temperatury pokojowej i odparować heksany za pomocą rotacyjnego odparowacza. Na koniec zważyć olej algowy w heksanie. Następnie rozpuścić olej algowy w heksanie w kolbie, dodając 10 objętości mieszaniny metanolu i dichlorometanu w stosunku dwa do jednego.Następnie należy dodać mieszadło magnetyczne oraz wodę w ilości dwa i dwie trzecie objętości oleju, a także wodorotlenek potasu w masie stanowiącej połowę masy oleju. Teraz należy podłączyć kolbę do chłodnicy zwrotnej o długości 500 mm. Mieszaninę należy ogrzewać przy ciągłym mieszaniu w temperaturze 60 °C przez trzy godziny w dygestorium.Po ochłodzeniu mieszaniny reakcyjnej odparuj rozpuszczalniki organiczne za pomocą rotavapora. Następnie przelej pozostałą mieszaninę wodną do rozdzielacza o pojemności jednego litra i dodaj równą objętość heksanów. Przepłucz kolbę heksanami, aby upewnić się, że cały materiał został przeniesiony do rozdzielacza.Wstrząśnij lejkiem i poczekaj, aż warstwy się rozdzielą. Następnie zlej dolną warstwę wodną do kolby, a górną fazę organiczną przelej do drugiej kolby. Zachowaj obie warstwy.Powtarzać ekstrakcję heksanem do momentu, aż warstwa organiczna uzyska bladożółto-zielony kolor. Następnie połączyć zebrane ekstrakty organiczne i odparować je za pomocą wirówki rotacyjnej w celu wyizolowania lipidów neutralnych. Lipidy te występują w postaci zielonkawej substancji stałej i mają temperaturę topnienia w zakresie od 60 do 70 °C.Następnie zakwasz fazę wodną do pH 2, używając sześciomolarnego kwasu solnego. Potem wyekstrahuj wolne kwasy tłuszczowe z zakwaszonej fazy wodnej, wykorzystując heksany i rozdzielacz, analogicznie jak poprzednio. Na koniec odparuj heksany z połączonych ekstraktów organicznych za pomocą wirówki rotacyjnej, aby otrzymać oczyszczone wolne kwasy tłuszczowe.Ciemnozielona, niemal czarna tłusta pozostałość, która topi się nieco powyżej 30 °C. Rozpuścić kwasy tłuszczowe w sześciokrotnej objętości mieszaniny metanolu i chloroformu, a następnie przelać roztwór do grubościennego reaktora wysokociśnieniowego z mieszadłem magnetycznym, przepłukując naczynie, aby zapewnić przeniesienie wszystkich kwasów tłuszczowych do reaktora. Następnie, pod wyciągiem, dodać stężony kwas siarkowy.Uszczelnij kolbę i podgrzewaj mieszaninę do 90 °C, stale mieszając przez godzinę. Po ochłodzeniu mieszaniny reakcyjnej do temperatury pokojowej, przelej ją do rozdzielacza i dodaj dwie objętości wody. Następnie wstrząśnij rozdzielaczem, poczekaj do rozdzielenia się faz i zlej dolną warstwę do wcześniej zważonej kolby okrągłodنnej.Następnie zagęszcz roztwór za pomocą wirówki rotacyjnej i zmierz masę otrzymanego biodiesla; substancja ta może być teraz analizowana przy użyciu chromatografu gazowego. Lipidy obojętne można zebrać ze ścianek kolby okrągłodennej, zważyć i przenieść do kolby w celu puryfikacji. Rozpocznij od rozpuszczenia lipidów obojętnych w minimalnej ilości dichlorometanu.Następnie nanieś roztwór na górną część kolumny chromatograficznej wypełnionej 100 g żelu krzemionkowego. Kolejnie, przy użyciu niewielkiego ciśnienia, wypłucz roztwór przez krzemionkę, używając około 150 ml dichlorometanu. Na górze kolumny należy dodać cienką warstwę piasku, aby zapobiec zmąceniu żelu podczas napełniania rozpuszczalnikiem.Zebrać żółty osad do kolby okrągłodennej o pojemności 250 ml. Następnie odparować dichlorometan za pomocą rotacyjnego odparowacza. Wynikiem powinna być pomarańczowa substancja stała.Przeprowadź ponowną krystalizację ciał stałych w gotujących się heksanach. Najpierw dodaj początkowo 100 milliliters, a następnie kontynuuj dodawanie gotujących się heksanów, aż roztwór stanie się jednorodny. Następnie powoli schłodź roztwór do temperatury pokojowej, aby wspomóc krystalizację, a następnie zbierz skrystalizowane alkenony za pomocą zestawu filtracyjnego.Użyj niewielkiej objętości lodowatego heksanu do wypłukania kolby. Przed przetworzeniem pasta z isochrysis została najpierw wysuszona, aby uzyskać czarny, zielony, łuseczkowaty materiał o zapachu przypominającym wodorosty. Z kolei sproszkowana isochrysis była żółtobrązowym, drobno zmielonym suchym proszkiem, który wykorzystano bez dodatkowej obróbki.Ekstrakcja z obu materiałów za pomocą aparatury Soxhleta z użyciem heksanów pozwoliła na uzyskanie olejów algowych o wydajnościach znacznie wyższych w przypadku pasty niż w przypadku proszku. Acylogliceryle w oleju algowym przekształcono w rozpuszczalne w wodzie karboksylany, z których neutralne lipidy i wolne kwasy tłuszczowe wyekstrahowano w objętościach bliskich ilościowych z obu materiałów wyjściowych. Jednakże stosunek produktów był różny.W wyniku estryfikacji otrzymano metyloestry kwasów tłuszczowych. Są one znane również jako biodiesla, ciemnozielony, niemal czarny, oleisty płyn. Wydajność przekroczyła 90%. Produkt został odbarwiony zgodnie z opisem w protokole tekstowym.Analiza FAME oczyszczonych biopaliw z diesla wykazała podobne, lecz nie identyczne profile dla obu materiałów wyjściowych. Filtrowanie rozpuszczonych lipidów obojętnych przez krzemionkę przy użyciu DCM pozwoliło na otrzymanie czerwonopomarańczowej substancji stałej, która została poddana rekrystalizacji z heksanami w celu uzyskania analitycznie czystych alkenonów. Po obejrzeniu tego filmu powinni Państwo posiadać dobrą wiedzę na temat przetwarzania dostępnych komercyjnie glonów z rodzaju Isochrysis na biodiesla wraz z izolacją czystych alkenonów jako produktu ubocznego.Po opanowaniu technika ta pozwala na systematyczne otrzymywanie znacznych ilości biodiesla z alg oraz alkenonów do dalszych badań. Jej opracowanie utorowało nam drogę do krytycznej oceny właściwości paliwowych biodiesla z alg, dostarczając wystarczających ilości substancji do przeprowadzenia różnych testów paliwowych, zamiast polegania na przewidywaniach lub symulacjach. Należy pamiętać, że praca z silnymi kwasami lub zasadami oraz podgrzewanie zawartości w zamkniętym naczyniu może być niezwykle niebezpieczne.Należy pamiętać o stosowaniu odpowiednich środków ochrony osobistej i pracy w dygestorium podczas wykonywania tych kroków.

experimental-protocol-for-biodiesel-production-with-isolation

Research

JoVE Journal

Environment

Środowisko

Źródło: Ginies, C., et al. Identyfikacja kwasów tłuszczowych w Bacillus cereus. J. Vis. Exp. (2016)Ten film przedstawia proces przygotowania estrów metylowych kwasów tłuszczowych (FAME) z próbek bakteryjnych poprzez traktowanie biomasy roztworem alkalicznym, a następnie separację faz i odparowanie rozpuszczalnika do dalszej analizy.

Otrzymywanie estrów metylowych kwasów tłuszczowych (FAME) z biomasy bakteryjnej

Opisano metodę oznaczania zawartości i składu kwasów tłuszczowych w mikroalgach na podstawie mechanicznego rozbijania komórek, ekstrakcji lipidów na bazie rozpuszczalnika, transestryfikacji oraz kwantyfikacji i identyfikacji kwasów tłuszczowych za pomocą chromatografii gazowej. Wewnętrzny wzorzec tripentadekaniny służy do kompensacji ewentualnych strat podczas ekstrakcji i niepełnej transestryfikacji.

Analiza zawartości i składu kwasów tłuszczowych w mikroalgach

Opisany jest prosty protokół do określania neutralnej zawartości lipidów w komórkach glonów za pomocą procedury barwienia czerwienią Nilu. Ta oszczędzająca czas technika stanowi alternatywę dla tradycyjnych protokołów kwantyfikacji lipidów opartych na grawimetrii. Został zaprojektowany z myślą o konkretnym zastosowaniu monitorowania wydajności bioprocesów.

Prosty i szybki protokół pomiaru neutralnych lipidów w komórkach glonów za pomocą fluorescencji

Integracja hodowli mikroalg z przemysłowymi gazami spalinowymi ostatecznie wprowadzi metale ciężkie i inne związki nieorganiczne do podłoża wzrostowego. W pracy przedstawiono procedurę zastosowaną do określenia końcowego losu i wpływu metali ciężkich i zanieczyszczeń nieorganicznych na wzrost Nannochloropsis salina hodowanych w fotobioreaktorach.

Kwantyfikacja metali ciężkich i innych zanieczyszczeń nieorganicznych na produktywność mikroglonów

Dwuwymiarowa metoda chromatografii gazowej z czasem przelotu jest opisana do charakterystyki wodnej frakcji bioropy powstałej w wyniku hydrotermalnego upłynniania glonów. Protokół ten może być również stosowany do analizy frakcji wodnej produktów ciekłych z szybkiej pirolizy, szybkiej pirolizy katalitycznej, katalitycznego odtleniania i hydrorafinacji.

Charakterystyka jakościowa frakcji wodnej z hydrotermalnego skraplania glonów przy użyciu chromatografii gazowej 2D ze spektrometrią mas czasu przelotu

Ten artykuł opisuje proces montażu i działania laboratoryjnego bioreaktora fotosyntetycznego, który może być użyty, w połączeniu z innymi metodami, do oszacowania odpowiednich parametrów wzrostu kinetycznego. System ten stale monitoruje pH, światło i temperaturę za pomocą czujników, jednostki akwizycji i sterowania danymi oraz oprogramowania do akwizycji danych typu open source.

Budowa i konfiguracja laboratoryjnego bioreaktora fotosyntetycznego glonów z monitorowaniem temperatury, światła i pH do testów wzrostu kinetycznego

Tutaj prezentujemy protokół budowy fotobioreaktorów z bąbelkowymi kolumnami na skalę laboratoryjną i wykorzystania ich do hodowli mikroalg. Dostarcza również metody określania tempa wzrostu kultury i neutralnej zawartości lipidów.

Hodowla zielonych mikroalg w fotobioreaktorach z kolumnami bąbelkowymi i test na obecność obojętnych lipidów

Opisano protokół wykorzystania dwutlenku węgla z gazów spalinowych elektrowni na gaz ziemny do hodowli mikroalg w otwartych stawach torowych. Wtryskiwanie spalin jest kontrolowane za pomocą czujnika pH, a wzrost mikroalg jest monitorowany za pomocą pomiarów gęstości optycznej w czasie rzeczywistym.

Sprzężenie wychwytywania dwutlenku węgla z elektrowni z półautomatycznymi otwartymi stawami torowymi do uprawy mikroalg

Zanieczyszczenie powietrza wpływa na jakość życia wszystkich organizmów. W tym miejscu opisujemy zastosowanie biotechnologii mikroalg do oczyszczania biogazu (jednoczesne usuwanie dwutlenku węgla i siarkowodoru) oraz produkcji biometanu poprzez półprzemysłowe otwarte stawy glonów o wysokiej szybkości, a następnie analizę skuteczności oczyszczania, pH, rozpuszczonego tlenu i wzrostu mikroalg.

Oczyszczanie biogazu poprzez zastosowanie systemu mikroalgo-bakteryjnego w półprzemysłowych stawach z glonami o wysokiej zawartości

Bezpieczna metoda transestryfikacji wspomagana ultradźwiękami dla olejów roślinnych przy użyciu katalizatora alkalicznego jest przedstawiona tutaj. Metoda ta jest szybka i skuteczna w przygotowywaniu czystych produktów biodiesla.

Wspomagane ultradźwiękami przygotowanie produktów biodiesel z olejów roślinnych

Poznaj metodę produkcji biodiesla z mikroalg Isochrysis z jednoczesną izolacją alkenonów jako wartościowych produktów ubocznych. Technika ta wykorzystuje ekstrakcję Soxhleta i transestryfikację, osiągając wydajność powyżej 90%.

Protokół eksperymentalny produkcji biodiesla z izolacją alkenonów jako produktów ubocznych z komercyjnej biomasy glonów Isochrysis (Wideo) | JoVE Journal

Protokół eksperymentalny produkcji biodiesla z izolacją alkenonów jako produktów ubocznych z komercyjnej biomasy glonów Isochrysis

Przeglądaj więcej filmów