Name: Generowanie i identyfikacja makrofagów i komórek dendrytycznych pochodzących z GM-CSF (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-06-25T14:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 5 s
Description: Poznaj metodę generowania makrofagów przypominających pęcherzykowe i komórek dendrytycznych z kości szczury mysiej przy użyciu GM-CSF. Technika ta umożliwia uzyskanie wystarczających ilości komórek do badań immunologicznych.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Ta praca została sfinansowana przez Kanadyjskie Instytuty Badań nad Zdrowiem (CIHR) (Grant MOP-119503) oraz Kanadyjską Radę Nauk Przyrodniczych i Inżynierii (NSERC). NSERC wspierał również letnie stypendia dla Y.D. i A.A. YD jest wspierany przez University of British Columbia (UBC) z 4-letnim stypendium, AA jest wspierany przez CIHR z nagrodą magisterską dla absolwentów (CGS-M). Dziękujemy Calvinowi Roskelleyowi za pomoc przy mikroskopie użytym do wygenerowania obrazów na rysunku 2. Dziękujemy również za wsparcie ze strony Zakładów Cytometrii Zwierząt i Cytometrii Przepływowej UBC.

Myszy zostały poddane eutanazji zgodnie z wytycznymi Kanadyjskiej Rady ds. Opieki nad Zwierzętami dotyczącymi etycznych badań na zwierzętach zgodnie z procedurami zatwierdzonymi przez Komitet Opieki nad Zwierzętami Uniwersytetu Kolumbii Brytyjskiej.
1. Pozyskiwanie jednokomórkowego zawiesiny szpiku kostnego z kości udowej i piszczelowej myszy
<ol>
	<li>Włączyć szafę bezpieczeństwa biologicznego (BSC) 15 minut przed rozpoczęciem procedury, aby oczyścić powietrze z szafy i umożliwić stabilizację przepływu powietrza, a następnie oczyścić/spryskać powierzchnię BSC 70% etanolem. Utrzymuj wszystko tak sterylne, jak to możliwe przez cały czas trwania protokołu. Nie przecinaj kości w niesterylnych warunkach.</li>
	<li>Przygotuj narzędzia do preparacji, mocząc je w 70% etanolu (1 para nożyczek preparacyjnych, 2 pary kleszczy), zbilansowany roztwór soli Hanka z 5% płodową surowicą cielęcą (HBSS-FCS), sterylne szalki Petriego (100 mm x 15 mm), strzykawki 1 ml, igły o rozmiarze 261/2, stożkowe probówki zbiorcze (15 ml lub 50 ml) i ręczniki papierowe w BSC.</li>
	<li>Poddaj mysz eutanazji przy użyciu protokołów zatwierdzonych przez komisję etyczną ds. badań na zwierzętach instytucji. Wnieś do BSC, połóż na jednym lub dwóch ręcznikach papierowych i spryskaj mysz 70% etanolem.</li>
	<li>W BSC otworzyć sterylną szalkę Petriego w sposób aseptyczny, nanieść 10 ml HBSS-FCS na podstawę i 1-2 ml na pokrywkę.</li>
	<li>Połóż mysz na brzuchu tyłem do góry i unieś skórę wokół odcinka piersiowego palcami ręki niedominującej. Użyj nożyczek, aby wykonać nacięcie w miejscu, w którym skóra jest uniesiona.</li>
	<li>Przytrzymaj oba końce cięcia, po jednym końcu każdą ręką i ostrożnie rozsuń skórę wokół myszy od pleców do brzucha, kontynuuj ciągnięcie, aż dwa końce nacięcia spotkają się na brzuchu.</li>
	<li>Odwróć mysz do brzucha do góry i jedną ręką pociągnij dolną połowę skóry w dół w kierunku nogi, odciągaj skórę, aż nogi zostaną odsłonięte.</li>
	<li>Przytrzymaj stopę myszy i przetnij ścięgna Achillesa powyżej stawu skokowego oraz więzadła łączące mięśnie ze stopą na dolnym końcu kości piszczelowej za pomocą nożyczek. To rozluźnia stopę od kości nóg</li>.
	<li>Trzymając nogę za stopę, przetnij mięśnie i więzadła nożycami wokół stawu kolanowego na dolnym końcu kości udowej, aby odciąć mięśnie ud od dolnej części nogi. Użyj kleszczy, aby delikatnie odciągnąć rozluźnione mięśnie od powierzchni strzałkowej i udowej. Należy uważać, aby nie przeciąć tętnicy udowej, aby uniknąć obfitego krwawienia.</li>
	<li>Jedną ręką trzymając się stopy, dociśnij otwarte nożyczki na górnym końcu kości udowej w stawie biodrowym, obróć nogę i delikatnie pociągnij, aby oddzielić kość udową od stawu biodrowego, używając nożyczek, aby wykonać ostatnie cięcie, aby uwolnić nogę od ciała.</li>
	<li>Od tego momentu trzymaj tkankę tylko sterylnymi kleszkami. Z jednej strony chwyć nogę, a z drugiej oderwij stopę. 
	nuta: Nie powinno to wymagać dużej siły, ponieważ więzadła łączące są przecinane w kroku 1.9. Alternatywnie przeciąć kość piszczelową tuż nad kostką, gdzie kość jest zrośnięta.</li>
	<li>Przytrzymaj nogę za dystalny koniec kości udowej jednym zestawem kleszczy, a bliższy koniec kości piszczelowej i strzałkowej drugim, ostrożnie zegnij kość piszczelową i strzałkową w przeciwnym kierunku niż staw kolanowy, aby oddzielić je od kości udowej i rzepki.</li>
	<li>Użyj kleszczy, aby ściągnąć pozostałe więzadła i mięśnie nadal przyczepione do kości podudzi. Tutaj usuń kość strzałkową wraz z tkankami łącznymi za pomocą kleszczy, ponieważ jest zbyt mała, aby można ją było przepłukać dla komórek szpiku kostnego. Umieść oczyszczoną piszczel na odwróconej pokrywie szalki Petriego.</li>
	<li>Przytrzymaj dolny koniec kości udowej jednym zestawem kleszczy, a rzepkę drugim, zegnij rzepkę i otaczające tkanki w przeciwnym kierunku do stawu w celu usunięcia. Następnie oczyść pozostałe tkanki łączne z kości udowej; odciągnij je kleszczami i umieść na odwróconej pokrywie szalki Petriego. Wyrzuć rzepkę.</li>
	<li>W razie potrzeby powtórz 1,7 - 1,13 z drugą nogą. W razie potrzeby przenieść kości do probówek do mikrowirówek o pojemności 1,6 ml zawierających 1 ml sterylnego HBSS-FCS w celu transportu.</li>
	<li>Umieścić kości na odwróconej pokrywie szalki Petriego z 1-2 ml HBSS-FCS, użyć kleszczy do oczyszczenia wszelkich resztek tkanki nadal przyczepionej do kości piszczelowej i udowej, a następnie przenieść kości na podstawę szalki Petriego zawierającej 10 ml HBSS-FCS. Alternatywnie, oczyść kości i usuń przyczepioną tkankę mięśniową za pomocą tkanki nasączonej 70% etanolem.</li>
	<li>Przetnij każdą z kości na pół nożyczkami. Podczas cięcia częściowo przykryj szalkę Petriego sterylną pokrywką, aby upewnić się, że kości pozostaną w naczyniu. Alternatywnie, odetnij koniec każdej kości, aby umożliwić spłukiwanie w następnym kroku.</li>
	<li>Umieścić igłę 261/2 G na strzykawce o pojemności 1 ml i pobrać 1 ml HBSS-FCS z płytki Petriego. Włóż końcówkę igły do końca kawałka kości i wypłucz komórki szpiku kostnego (miękką czerwoną tkankę wewnątrz kości). Włóż igłę w głowę kości i otwarty koniec, aż cały szpik zostanie usunięty w kolorze czerwonym. Obserwuj, że kości są koloru białego.</li>
	<li>Przepuścić kilka razy widoczne grudki szpiku kostnego przez strzykawkę, aby utworzyć zawiesinę jednokomórkową.</li>
	<li>Wyrzuć zaczerwienione kości. Za pomocą pipety o pojemności 10 ml dobrze wymieszać zawiesinę komórek i przenieść do probówki zbiorczej. Przepłukać szalkę Petriego 5 ml HBSS-FCS w celu zebrania resztek komórek w naczyniu. Umieść komórki na lodzie. 
	nuta: Zawiesina komórek szpiku kostnego jest nadal żywotna, jeśli jest przechowywana przez 2 - 3 godziny w temperaturze 4 °C.</li>
</ol>
2. Posiewanie i hodowla komórek szpiku kostnego (BMC)
<ol>
	<li>Przygotuj następujące odczynniki i materiały eksploatacyjne.
	<ol>
		<li>Przygotuj bufor do lizy czerwonych krwinek (RBC), wytwarzając 0,84% chlorku amonu w końcowym roztworze 2 mM Tris pH 7,2, a następnie sterylizuj, filtrując przez filtr 0,2 mikrona.</li>
		<li>Przygotuj pożywkę BMC, dodając 10% FCS, 20 mM HEPES, 1x aminokwas endogenny, 55 μM 2-merkaptoetanolu, 50 U/ml penicyliny i streptomycyny, 1 mM pirogronianu sodu i 2 mM L-glutaminy do pożywki RPMI 1640.</li>
		<li>Uzyskać dostępny w handlu rekombinowany GM-CSF lub użyć supernatantu zawierającego GM-CSF z komórek szpiczaka plazmocytowego AG8.653 transfekowanych genemGM-CSF 20. Oznaczyć stężenie GM-CSF w supernatancie metodą ELISA i dodać równoważnik 20 ng/ml do pożywki BMC.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Obracaj komórki szpiku kostnego w ilości 314 x g przez 5 minut. Osad jest czerwony z powodu erytrocytów. W BSC odessać supernatant za pomocą sterylnej szklanej pipety Pasteura podłączonej do odsysania próżniowego, poluzować osad przez stukanie, a następnie dodać 10 ml buforu do lizy RBC. Wirować w celu ponownego zawieszenia komórek i inkubować w buforze do lizy RBC w temperaturze pokojowej przez 5 minut.</li>
	<li>Dodać 10 ml HBSS-FCS, a następnie wirować komórki w temperaturze 314 x g przez 5 minut i odsysać supernatant. Obserwuj osad komórki w kolorze białym. Zawieś komórki w żądanej objętości nośnika BMC.</li>
	<li>Policz ponownie zawieszone komórki za pomocą hemocytometru po zabarwieniu martwych komórek 0,4% błękitem trypanowym. 
	nuta: Jeśli używany jest szpik kostny z jednej nogi (pojedynczej kości piszczelowej i udowej), ponownie zawiesić w 5 ml pożywki BMC, pobrać 10 μl zawiesiny komórek i rozcieńczyć ją 70 μl 0,4% błękitu trypanowego, dobrze wymieszać i przenieść 10 μl rozcieńczenia 1/8 komórek do komory hemocytometru. Policz żywe komórki w czterech kwadrantach: średnia z czterech kwadrantów liczy x współczynnik rozcieńczenia x 104 = liczba komórek na ml. Kość udowa i piszczelowa z jednej nogi na ogół dają około 2 - 4 x 107 komórek po lizie RBC.</li>
	<li>Oszacuj liczbę 10 ml szalek z kulturami szpiku kostnego potrzebnych do dalszych doświadczeń na podstawie całkowitej liczby komórek potrzebnych do eksperymentów na końcu hodowli. 
	nuta: Każda potrawa wymaga 2 x 106 komórek szpiku kostnego przy początkowym wysiewie i daje 5 - 10 x 106 komórek w 7 dniu.
	<ol>
		<li>Podwielokrotnić całkowitą liczbę komórek do posiewu w nowej probówce, odwirować z prędkością 314 x g przez 5 minut, odessać supernatant i ponownie zawiesić komórki w ilości 4 x 106 komórek/ml w pożywce BMC.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Przygotować nową sterylną szalkę Petriego o wymiarach 100 mm x 15 mm z 9,5 ml pożywki BMC zawierającej 200 ng GM-CSF (rekombinowanego lub z GM-CSF zawierającego supernatant). Dodać 500 μl komórek szpiku kostnego o wymiarach 4 x 106 komórek/ml do środka szalki Petriego, aby uzyskać końcowe stężenie 2 x 105 komórek/ml w 10 ml. 
	UWAGA: Ważne jest, aby używać sterylnej szalki Petriego, a nie szalki do hodowli tkankowych. Ponadto, podczas dodawania komórek, upewnij się, że komórki pozostają skoncentrowane w środku i zminimalizuj zakłócenia szalek po wysiewie i podczas zmiany podłoża. Inkubować komórki w temperaturze 37 °C i 5% CO2 . To jest dzień 0 w kulturze.</li>
	<li>W dniu 3 dodaj 10 ml świeżej pożywki BMC zawierającej 200 ng GM-CSF do każdej szalki z komórkami. Należy zachować ostrożność, aby zminimalizować zakłócenia w działaniu komórek skoncentrowanych w zawiesinie. Całkowita objętość hodowli komórkowej wynosi teraz 20 ml.</li>
	<li>Obserwuj komórki pod mikroskopem świetlnym w 100-krotnym powiększeniu. Obserwuj liczne komórki nieprzylegające (okrągłe) i kilka komórek przylegających (płaskie). Można zobaczyć komórki w grupach po trzy lub cztery przypominające płatki kwiatu, co wskazuje na proliferację.</li>
	<li>W dniu 6 wykonaj połowiczną wymianę nośnika. Ostrożnie wyjąć 10 ml pożywki do sterylnej probówki stożkowej o pojemności 50 ml, odwirowywać do 314 x g przez 5 minut, odessać i odrzucić supernatant.</li>
	<li>Zawiesić osad komórkowy w 10 ml świeżej pożywki BMC zawierającej 20 ng/ml GM-CSF, delikatnie odwirować i dodać do oryginalnego naczynia do hodowli komórkowych na łączną objętość 20 ml. Obserwuj komórki pod mikroskopem. 
	nuta: Hodowla dnia 7 powinna znajdować się w 70% lub więcej w zbiegu z przylegającymi płaskimi komórkami i gęstymi chmurami okrągłych, nieprzylegających komórek.</li>
</ol>
3. Zbieranie i przygotowanie BMDC i BMDM do cytometrii przepływowej
<ol>
	<li>Przechowywać wszystkie w temperaturze 4 °C.</li>
	<li>Zbieraj komórki od 7 do 10 dnia. Aby pobrać komórki, należy najpierw przenieść 10 ml supernatantu do stożkowej probówki zbiorczej o pojemności 50 ml, następnie przechylić naczynie w pionie o około 30 stopni i umyć naczynie, pipetując pozostałe 10 ml kultury od góry naczynia. Powtórz to pranie 5 razy, za każdym razem obracając naczynie o jedną trzecią.</li>
	<li>Przenieść pozostałe 10 ml komórek do tej samej probówki zbiorczej i wyrzucić płytkę oraz przylegające komórki. 
	nuta: Mycie usunie nieprzylegające i luźno przylegające komórki; Płaskie przylegające komórki są odporne na pranie. Zazwyczaj oczekuje się, że od 5 do 10 x 106 nieprzylegających komórek z jednej płytki w 7 dniu i 2 - 5 x 106 komórek w 10 dniu, chociaż Lutz i wsp. zgłoszono 10 x 106 komórek w dniu 10. Przylegające komórki nie są zwykle pobierane. Jeśli jednak komórki te muszą zostać porównane z komórkami nieprzylegającymi, można je usunąć w następujący sposób. Dodać 5 ml 0,7 mM EDTA w 1x PBS o pH 7,4 do naczynia po usunięciu nieprzylegających komórek, inkubować w temperaturze 37 °C przez 5 minut, pipetować w górę i w dół, aby usunąć przylegające komórki i zebrać do oddzielnej probówki.</li>
	<li>Odwirowywać zebrane komórki w temperaturze 314 x g przez 5 minut i odessać supernatant. Zawiesić ponownie w 5 ml sterylnej pożywki BMC w temperaturze 4 °C, delikatnie zmieszać i policzyć za pomocą błękitu trypanowego i hemocytometru. 
	nuta: Z każdej szalki uzyska się 5 - 10 x 106 nieprzylegających komórek z hodowli w dniu 7. Od teraz wszystkie kroki wykonuj w temperaturze 4 °C.</li>
	<li>Do analizy metodą cytometrii przepływowej przenieść 2 x 105 komórek dla każdej próbki do 5 ml polistyrenowych probówek okrągłodennych, dodać 300 μl buforu FACS w temperaturze 4 °C (1x sól fizjologiczna buforowana fosforanami, 2 mM EDTA i 2% albumina surowicy bydlęcej) do każdej próbki.</li>
	<li>Odwiruj komórki w temperaturze 314 x g przez 5 minut i odessaj supernatant. Obserwuj widoczny biały, nieprzezroczysty osad na dnie probówki.</li>
	<li>Zawiesić komórki w 100 μl nieznakowanego receptora Fc Ab w celu zablokowania wiązania receptora Fc (użyć 1/10 supernatantu z linii komórkowej szpiczaka 2,4G2) i inkubować przez 20 minut w temperaturze 4 °C. Następnie dodać 300 μl buforu FACS do każdej próbki, delikatnie odwirować, a następnie odwirować komórki w dół przy 314 x g przez 5 minut i odessać supernatant.</li>
	<li>Ponownie zawieś komórki w 100 μl CD11c-PeCy7 w stężeniu 0,2 μg/ml, Gr1-Pacific Blue w stężeniu 0,25 μg/ml, MHCII-APC w stężeniu 0,05 μg/ml i FL-HA w stężeniu około 2 μg/ml w celu identyfikacji makrofagów i DCs. 
	nuta: FL-HA został przygotowany we własnym zakresie przy użyciu fluoresceiny i soli sodowej kwasu hialuronowego z grzebieniem koguta, jak opisano wcześniej21.</li>
	<li>Inkubować przez 20 minut w temperaturze 4 °C, aby umożliwić związanie się z powierzchnią komórki. Dodać 300 μl buforu FACS do każdej próbki, delikatnie odwirować, a następnie wirować komórki w temperaturze 314 x g przez 5 minut w temperaturze 4 °C i odessać supernatant. UWAGA: Jeśli przeciwciała biotynylowane są używane w 3.8, powtórzyć 3.8 - 9 z fluorescencyjną streptawidyną.</li>
	<li>Umyć komórki kolejnymi 300 μl buforu FACS, delikatnie wirować, aby wymieszać i wirować komórki w temperaturze 314 x g przez 5 minut. Odessać supernatant i ponownie zawiesić komórki w 200 μl buforu FACS zawierającego 0,1 - 0,2 μg na ml jodku propidyny lub DAPI w celu oznakowania komórek niezdolnych do życia. Komórki są teraz gotowe do analizy cytometrycznejprzepływowej 22. 
	nuta: Zobacz wyniki i rysunek 3, aby uzyskać szczegółowe informacje na temat populacji i sposobu bramkowania komórek.</li>
</ol>

<ol><li>Fleetwood, A. J., Lawrence, T., Hamilton, J. A., Cook, A. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Granulocyte-macrophage+colony-stimulating+factor+%28CSF%29+and+macrophage+CSF-dependent+macrophage+phenotypes+display+differences+in+cytokine+profiles+and+transcription+factor+activities%3A+implications+for+CSF+blockade+in+inflammation%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol%22%5BJournal%5D)">Granulocyte-macrophage colony-stimulating factor (CSF) and macrophage CSF-dependent macrophage phenotypes display differences in cytokine profiles and transcription factor activities: implications for CSF blockade in inflammation.</a> J Immunol. 178 (8), 5245-5252 (2007).</li>
<li>Lari, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Macrophage+lineage+phenotypes+and+osteoclastogenesis--complexity+in+the+control+by+GM-CSF+and%5BTitle%5D)+AND+%22Bone%22%5BJournal%5D)">Macrophage lineage phenotypes and osteoclastogenesis--complexity in the control by GM-CSF and.</a> Bone. 40 (2), 323-336 (2007).</li>
<li>Brasel, K., De Smedt, T., Smith, J. L., Maliszewski, C. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+murine+dendritic+cells+from+flt3-ligand-supplemented+bone+marrow+cultures%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Generation of murine dendritic cells from flt3-ligand-supplemented bone marrow cultures.</a> Blood. 96 (9), 3029-3039 (2000).</li>
<li>Angelov, G. S., Tomkowiak, M., Marcais, A., Leverrier, Y., Marvel, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Flt3+ligand-generated+murine+plasmacytoid+and+conventional+dendritic+cells+differ+in+their+capacity+to+prime+naive+CD8+T+cells+and+to+generate+memory+cells+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol%22%5BJournal%5D)">Flt3 ligand-generated murine plasmacytoid and conventional dendritic cells differ in their capacity to prime naive CD8 T cells and to generate memory cells in vivo.</a> J Immunol. 175 (1), 189-195 (2005).</li>
<li>Inaba, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+large+numbers+of+dendritic+cells+from+mouse+bone+marrow+cultures+supplemented+with+granulocyte%2Fmacrophage+colony-stimulating+factor%5BTitle%5D)+AND+%22J+Exp+Med%22%5BJournal%5D)">Generation of large numbers of dendritic cells from mouse bone marrow cultures supplemented with granulocyte/macrophage colony-stimulating factor.</a> J Exp Med. 176 (6), 1693-1702 (1992).</li>
<li>Lutz, M. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+advanced+culture+method+for+generating+large+quantities+of+highly+pure+dendritic+cells+from+mouse+bone+marrow%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol+Methods%22%5BJournal%5D)">An advanced culture method for generating large quantities of highly pure dendritic cells from mouse bone marrow.</a> J Immunol Methods. 223 (1), 77-92 (1999).</li>
<li>Labeur, M. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+tumor+immunity+by+bone+marrow-derived+dendritic+cells+correlates+with+dendritic+cell+maturation+stage%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol%22%5BJournal%5D)">Generation of tumor immunity by bone marrow-derived dendritic cells correlates with dendritic cell maturation stage.</a> J Immunol. 162 (1), 168-175 (1999).</li>
<li>Berthier, R., Martinon-Ego, C., Laharie, A. M., Marche, P. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+two-step+culture+method+starting+with+early+growth+factors+permits+enhanced+production+of+functional+dendritic+cells+from+murine+splenocytes%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol+Methods%22%5BJournal%5D)">A two-step culture method starting with early growth factors permits enhanced production of functional dendritic cells from murine splenocytes.</a> J Immunol Methods. 239 (1-2), 95-107 (2000).</li>
<li>Brasel, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Flt3+ligand+synergizes+with+granulocyte-macrophage+colony-stimulating+factor+or+granulocyte+colony-stimulating+factor+to+mobilize+hematopoietic+progenitor+cells+into+the+peripheral+blood+of+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Flt3 ligand synergizes with granulocyte-macrophage colony-stimulating factor or granulocyte colony-stimulating factor to mobilize hematopoietic progenitor cells into the peripheral blood of mice.</a> Blood. 90 (9), 3781-3788 (1997).</li>
<li>Segura, E., Amigorena, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inflammatory+dendritic+cells+in+mice+and+humans%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Immunol%22%5BJournal%5D)">Inflammatory dendritic cells in mice and humans.</a> Trends Immunol. 34 (9), 440-445 (2013).</li>
<li>West, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enhanced+dendritic+cell+antigen+capture+via+toll-like+receptor-induced+actin+remodeling%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Enhanced dendritic cell antigen capture via toll-like receptor-induced actin remodeling.</a> Science. 305 (5687), 1153-1157 (2004).</li>
<li>Veldhoen, M., Hocking, R. J., Atkins, C. J., Locksley, R. M., Stockinger, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((TGFbeta+in+the+context+of+an+inflammatory+cytokine+milieu+supports+de+novo+differentiation+of+IL-17-producing+T+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Immunity%22%5BJournal%5D)">TGFbeta in the context of an inflammatory cytokine milieu supports de novo differentiation of IL-17-producing T cells.</a> Immunity. 24 (2), 179-189 (2006).</li>
<li>Goodridge, H. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Activation+of+the+innate+immune+receptor+Dectin-1+upon+formation+of+a+%27phagocytic+synapse%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Activation of the innate immune receptor Dectin-1 upon formation of a 'phagocytic synapse.</a> Nature. 472 (7344), 471-475 (2011).</li>
<li>Shalek, A. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-cell+RNA-seq+reveals+dynamic+paracrine+control+of+cellular+variation%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Single-cell RNA-seq reveals dynamic paracrine control of cellular variation.</a> Nature. 510 (7505), 363-369 (2014).</li>
<li>Vander Lugt, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transcriptional+programming+of+dendritic+cells+for+enhanced+MHC+class+II+antigen+presentation%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Immunol%22%5BJournal%5D)">Transcriptional programming of dendritic cells for enhanced MHC class II antigen presentation.</a> Nat Immunol. 15 (2), 161-167 (2014).</li>
<li>Shibata, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((GM-CSF+regulates+alveolar+macrophage+differentiation+and+innate+immunity+in+the+lung+through+PU.1%5BTitle%5D)+AND+%22Immunity%22%5BJournal%5D)">GM-CSF regulates alveolar macrophage differentiation and innate immunity in the lung through PU.1.</a> Immunity. 15 (4), 557-567 (2001).</li>
<li>Lacey, D. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Defining+GM-CSF-+and+Macrophage-CSF+Dependent+Macrophage+Responses+by+In+Vitro+Models%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol%22%5BJournal%5D)">Defining GM-CSF- and Macrophage-CSF Dependent Macrophage Responses by In Vitro Models.</a> J Immunol. 188 (11), 5752-5765 (2012).</li>
<li>Poon, G. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hyaluronan+Binding+Identifies+a+Functionally+Distinct+Alveolar+Macrophage-like+Population+in+Bone+Marrow-Derived+Dendritic+Cell+Cultures%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol%22%5BJournal%5D)">Hyaluronan Binding Identifies a Functionally Distinct Alveolar Macrophage-like Population in Bone Marrow-Derived Dendritic Cell Cultures.</a> J Immunol. 195 (2), 632-642 (2015).</li>
<li>Helft, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((GM-CSF+Mouse+Bone+Marrow+Cultures+Comprise+a+Heterogeneous+Population+of+CD11c%28%2B%29MHCII%28%2B%29+Macrophages+and+Dendritic+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22Immunity%22%5BJournal%5D)">GM-CSF Mouse Bone Marrow Cultures Comprise a Heterogeneous Population of CD11c(+)MHCII(+) Macrophages and Dendritic Cells.</a> Immunity. 42 (6), 1197-1211 (2015).</li>
<li>Stockinger, B., Zal, T., Zal, A., Gray, D. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((cells+solicit+their+own+help+from+T+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Exp.+Med%22%5BJournal%5D)">cells solicit their own help from T cells.</a> J. Exp. Med. 183 (3), 891-899 (1996).</li>
<li>de Belder, A. N., Wik, K. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Preparation+and+properties+of+fluorescein-labelled+hyaluronate%5BTitle%5D)+AND+%22Carbohydr+Res%22%5BJournal%5D)">Preparation and properties of fluorescein-labelled hyaluronate.</a> Carbohydr Res. 44 (2), 251-257 (1975).</li>
<li>Stewart, C. C., Stewart, S. J. Immunophenotyping. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aStewart%2C+CC+%22Current+Protocols+in+Cytometry%22">Current Protocols in Cytometry</a>. , Wiley, J., & Sons, Inc. Champter 6, Unit 6.2 (2001).</li>
<li>Dearman, R. J., Cumberbatch, M., Maxwell, G., Basketter, D. A., Kimber, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Toll-like+receptor+ligand+activation+of+murine+bone+marrow-derived+dendritic+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Immunology%22%5BJournal%5D)">Toll-like receptor ligand activation of murine bone marrow-derived dendritic cells.</a> Immunology. 126 (4), 475-484 (2009).</li>
<li>Abdi, K., Singh, N. J., Matzinger, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lipopolysaccharide-Activated+Dendritic+Cells%3A+%27Exhausted%27+or+Alert+and+Waiting%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol%22%5BJournal%5D)">Lipopolysaccharide-Activated Dendritic Cells: 'Exhausted' or Alert and Waiting.</a> J Immunol. 188 (12), 5981-5989 (2012).</li>
<li>Contreras, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Impact+of+Leishmania+mexicana+Infection+on+Dendritic+Cell+Signaling+and+Functions%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Negl+Trop+Dis%22%5BJournal%5D)">Impact of Leishmania mexicana Infection on Dendritic Cell Signaling and Functions.</a> PLoS Negl Trop Dis. 8 (9), (2014).</li>
<li>Feng, T., Cong, Y. Z., Qin, H. W., Benveniste, E. N., Elson, C. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+Mucosal+Dendritic+Cells+from+Bone+Marrow+Reveals+a+Critical+Role+of+Retinoic+Acid%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol%22%5BJournal%5D)">Generation of Mucosal Dendritic Cells from Bone Marrow Reveals a Critical Role of Retinoic Acid.</a> J Immunol. 185 (10), 5915-5925 (2010).</li>
<li>Grauer, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+maturation+states+of+rat+bone+marrow-derived+dendritic+cells+using+an+improved+culture+technique%5BTitle%5D)+AND+%22Histochem+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Analysis of maturation states of rat bone marrow-derived dendritic cells using an improved culture technique.</a> Histochem Cell Biol. 117 (4), 351-362 (2002).</li>
<li>Suzuki, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pulmonary+macrophage+transplantation+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Pulmonary macrophage transplantation therapy.</a> Nature. 514 (7523), 450-454 (2014).</li>
<li>Happle, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pulmonary+transplantation+of+macrophage+progenitors+as+effective+and+long-lasting+therapy+for+hereditary+pulmonary+alveolar+proteinosis%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Transl+Med%22%5BJournal%5D)">Pulmonary transplantation of macrophage progenitors as effective and long-lasting therapy for hereditary pulmonary alveolar proteinosis.</a> Sci Transl Med. 6 (250), (2014).</li>
</ol>

Autorzy nie pozostają w finansowym konflikcie interesów.

W tym manuskrypcie przedstawiamy metodę generowania makrofagów i DC pochodzących z GM-CSF z pojedynczej hodowli szpiku kostnego myszy, która została zaadaptowana z Lutz i wsp. 6. Ekspresja MHCII i wiązanie FL-HA rozróżnia niedojrzałe DC i makrofagi w tej kulturze (patrz ryc. 3C), co wcześniej było trudne. To, wraz z innym raportem Helfta i wsp. 19, wykazuje heterogeniczność w kulturach BMDC indukowanych przez GM-CSF, które wcześniej uważano tylko za DC. Helft i...

Opisano kilka metod hodowli in vitro w celu generowania makrofagów pochodzących ze szpiku kostnego (BMDM) i DC pochodzących ze szpiku kostnego (BMDC) przy użyciu jednego lub kombinacji czynników wzrostu. BMDM mogą być generowane przez hodowlę komórek szpiku kostnego przy użyciu czynnika stymulującego tworzenie kolonii makrofagów (M-CSF) lub GM-CSF1,2. W przypadku BMDC dodanie liganda FLT3 do hodowli szpiku kostnego powoduje powstanie nieprzylegających klasycznych i plazmocytoidalnych DC (odpowiednio CD11chigh/MHCIIhigh i CD11clo, B220+) po 9 dniach w hodowli3,4. W przeciwieństwie do tego, nieprzylegające komórki wytworzone po 7 do 10 dniach w hodowli z samym GM-CSF5,6, GM-CSF i IL-47 lub GM-CSF i ligandemFLT3 8,9 generują BMDC bardziej przypominające zapalne DC (wysoki CD11c,wysoki MHCII CD11b+)10. Chociaż te kultury in vitro są wykorzystywane do generowania makrofagów lub DC, nie jest jasne, czy każda kultura daje początek czystym populacjom. Na przykład, chociaż komórki przylegające w kulturach GM-CSF są opisywane jako makrofagi5, nieprzylegające komórki z tej samej hodowli są używane jako DC6,11-13, przy założeniu, że są one jednorodne, a wszelka obserwowana zmienność wynika z różnych etapów rozwoju14,15. Ponadto badania wykazały, że GM-CSF jest niezbędnym czynnikiem wzrostu dla rozwoju makrofagów pęcherzykowych in vivo16,17 i może być stosowany in vitro do generowania makrofagów pęcherzykowych16,17,18.
Poza przestrzeganiem zaleceń lekarskich, procedury generowania makrofagów i DC z hodowli szpiku kostnego traktowanych GM-CSF są bardzo podobne, co sugeruje, że w hodowlach szpiku kostnego GM-CSF może istnieć niejednorodność. Wydaje się, że tak właśnie jest, ponieważ dwa artykuły donoszą o obecności BMDM we frakcji nieprzylegającej kultur BMDC. W jednym z artykułów zidentyfikowali populację komórek jako CD11c+, CD11b+, MHCIImid, MerTK+ i CD115+, które wyrażały sygnaturę ekspresji genów, która najbardziej przypominała makrofagi pęcherzykowe i miała zmniejszoną zdolność do aktywacji limfocytów T19. W drugim artykule wykorzystano MHCII i FL-HA do identyfikacji populacji pęcherzykowej makrofagów (CD11c+, MHCIImid/low, FL-HAhigh), która różniła się od niedojrzałych (CD11c+, MHCIImid, FL-HAlow) i dojrzałych DC (CD11c+, MHCIIhigh), zarówno fenotypowo, jak i funkcjonalnie18. Oba te prace ilustrują, że hodowle GM-CSF BMDC są niejednorodne, zawierają zarówno makrofagi, jak i populacje DC, co wskazuje, że należy zachować ostrożność podczas interpretacji danych z kultur BMDC.
Ten protokół opisuje, jak izolować szpik kostny, hodować komórki szpiku kostnego w GM-CSF i identyfikować populację makrofagów pęcherzykowych od niedojrzałych i dojrzałych DC w hodowli szpiku kostnego za pomocą cytometrii przepływowej przy użyciu wiązania FL-HA i ekspresji MHCII. Procedura ta opiera się na ustalonej procedurze Lutza i wsp. 6 i jest w stanie wygenerować 5 - 10 x 106 nieprzylegających komórek w 7 dniu hodowli 10 ml. Hodowla nadaje się do użytku od 7 do 10 dni i daje niejednorodną populację makrofagów, niedojrzałych i dojrzałych DC, a także niektórych przodków w 7 dniu. Zapewnia to prostą metodę hodowli i izolowania in vitro makrofagów pęcherzykowych w dużych ilościach.

<table><tbody><tr><td>Cytometr przepływowy</td><td>BD&nbsp;</td><td>LSR-II</td><td></td></tr><tr><td>Automatyczny mikroskop odwrócony&nbsp;</td><td>Leica&nbsp;</td><td>DMI4000 B</td><td></td></tr><tr><td>Wirówka&nbsp;</td><td>Thermo Fisher</td><td>ST-40R</td><td></td></tr><tr><td>Szafka bezpieczeństwa biologicznego</td><td>Nuaire</td><td>NU-425-600</td><td></td></tr><tr><td>Strzykawka 1 ml</td><td>BD</td><td>309659</td><td></td></tr><tr><td>26 1/2 Gauge Igła</td><td>BD</td><td>305111</td><td></td></tr><tr><td>50 ml Rurka stożkowa&nbsp;</td><td>Corning</td><td>357070</td><td>*</td></tr><tr><td>Probówki Eppendorf marki Falcon (1,5 ml)</td><td>Corning</td><td>MCT-150-C</td><td></td></tr><tr><td>5 ml polistyrenowe probówki z okrągłym dnem</td><td>Corning</td><td>352052</td><td></td></tr><tr><td>Narzędzia do preparowania</td><td>Narzędzia do nauki precyzyjnej&nbsp;</td><td>*Różne&nbsp;</td><td>*Nożyczki preparacyjne, kleszcz Dumont i kleszcz standardowy&nbsp;</td></tr><tr><td>Hemocytometr&nbsp;</td><td>Reichert</td><td>1490</td><td></td></tr><tr><td>Sterylna 100 mm x 15 mm szalka Petriego</td><td>Corning</td><td>351029</td><td>*Marka Falcon</td></tr><tr><td>2-merkaptoetanol</td><td>Thermo Fisher</td><td>21985-023</td><td></td></tr><tr><td>Chlorek amonu</td><td>BDH</td><td>BDH0208-500G</td><td></td></tr><tr><td>Albumina bydlęca</td><td>Bioreagenty Fisher</td><td>BP1600-1</td><td></td></tr><tr><td>Brefeldin A</td><td>Sigma</td><td>B7651-5MG</td><td></td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Sigma</td><td>E5134-1KG</td><td>Kwas etylenodiaminotetraoctowy</td></tr><tr><td>Surowica bydlęca</td><td>płodu Thermo Fisher</td><td>16000-044</td><td></td></tr><tr><td>Zbilansowany roztwór soli Hanka</td><td>Thermo Fisher</td><td>14175-095&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Thermo Fisher</td><td>15630-080</td><td>Kwas 4-(2-hydroksyetylo)-1-piperazynoetanosulfonowy</td></tr><tr><td>L-Glutamina</td><td>Sigma</td><td>G8540-100G</td><td></td></tr><tr><td>LPS Ultrapure</td><td>Invivogen</td><td>tlrl-3pelps</td><td></td></tr><tr><td>MEM Roztwór aminokwasów endogennych&nbsp;</td><td>Thermo Fisher</td><td>11140-050</td><td></td></tr><tr><td>Penicylina/Streptomycyna 100x</td><td>Thermo Fisher</td><td>15140-122</td><td></td></tr><tr><td>Fosforan potasu jednozasadowy</td><td>BDH</td><td>BDH0268-500G</td><td></td></tr><tr><td>Chlorek potasu</td><td>BDH</td><td>BDH9258-500G</td><td></td></tr><tr><td>Rekombinowany GM-CSF</td><td>Peprotech</td><td>315-03-A</td><td></td></tr><tr><td>Kogut Grzebień Hialuronian sodu&nbsp;</td><td>Sigma</td><td>H5388-1G</td><td>*Służy do produkcji fluoresceinowanego hialuronianu</td></tr><tr><td>RPMI-1640&nbsp;</td><td>Thermo Fisher</td><td>21870-076</td><td>Bez pirogronianu sodu, bez glutaminy. Ciepłe media do 37&nbsp; &#176; C przed użyciem.</td></tr><tr><td>Chlorek sodu</td><td>Fisher&nbsp;</td><td>5271-10&nbsp; &nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Fosforan sodu dwuzasadowy</td><td>Sigma</td><td>50876-1 kg</td><td></td></tr><tr><td>Pirogronian sodu</td><td>Sigma</td><td>P5290-100G</td><td></td></tr><tr><td>Tris(hydroksymetylo)aminometan</td><td>Bioodczynniki</td><td>Fishera BP152-5</td><td></td></tr><tr><td>Trypan Blue</td><td>Sigma</td><td>T8154</td><td></td></tr><tr><td>Receptor anty-FC (nieznakowany), supernatant do hodowli tkankowych</td><td>Nie</td><td></td> dotyczy <td>Nie dotyczy Klon: 2.4G2</td></tr><tr><td>Anty-CD11c PeCy7</td><td>eBioscience</td><td>25-0114-82</td><td>Klon: N418</td></tr><tr><td>Anty-Gr-1 efluor450</td><td>eBioscience</td><td>48-5931-82</td><td>Klon: RB6-8C5</td></tr><tr><td>Anty-MHCII APC</td><td>eBioscience</td><td>17-5321-82</td><td>Klon: M5 / 114.15.2</td></tr><tr><td>Biotynylowany anty-MerTK</td><td>Abcam</td><td>BAF591</td><td>Kozia poliklonalna IgG</td></tr><tr><td>Streptawidyna PE</td><td>eBioscience</td><td>12-4317-87</td><td></td></tr><tr><td>Jodek propidium</td><td>Sigma</td><td>P4170-25MG</td><td></td></tr><tr><td>DAPI (4',6-diamidyn-2-fenyloindol)</td><td>Sigma</td><td>D9542-5MG</td><td></td></tr></tbody></table>

generowanie i identyfikacja makrofagów i komórek dendrytycznych pochodzących z gm-csf

Generation and Identification of GM-CSF Derived Alveolar-like Macrophages and Dendritic Cells From Mouse Bone Marrow

Makrofagi i komórki dendrytyczne (DC) to wrodzone komórki odpornościowe występujące w tkankach i narządach limfatycznych, które odgrywają kluczową rolę w obronie przed patogenami. Trudno jest je jednak wyizolować w wystarczającej liczbie, aby można je było szczegółowo zbadać, dlatego opracowano modele in vitro. Hodowle in vitro makrofagów i komórek dendrytycznych pochodzących ze szpiku kostnego są dobrze ugruntowanymi i cennymi metodami badań immunologicznych. W tym miejscu opisano metodę hodowli i identyfikacji zarówno DC, jak i makrofagów z pojedynczej hodowli pierwotnych komórek szpiku kostnego myszy przy użyciu czynnika stymulującego tworzenie kolonii granulocytów granulocytów makrofagów (GM-CSF). Protokół ten opiera się na ustalonej procedurze opracowanej po raz pierwszy przez Lutza i wsp. w 1999 r. dla DC pochodzących ze szpiku kostnego. Hodowla jest niejednorodna, a MHCII i fluoresceinowany hialuronian (FL-HA) są używane do odróżniania makrofagów od niedojrzałych i dojrzałych DC. Te makrofagi pochodzące z GM-CSF stanowią wygodne źródło makrofagów pochodzących z badań in vitro, które bardzo przypominają makrofagi pęcherzykowe zarówno pod względem fenotypu, jak i funkcji.

Schemat blokowy podsumowujący główne etapy tej metody przedstawiono na Rysunku 1. Gęstość i morfologię hodowli szpiku kostnego w różnych odstępach czasu hodowli przedstawiono na Rysunku 2. W 1. dniu komórki są małe i rzadkie, ale do 3. dnia liczba komórek wzrasta, niektóre z nich stają się większe, a kilka zaczyna przylegać. Do 6. dnia widoczna jest wyraźna frakcja adherentna i nieadherentna (Rysunek 2A). Materiał z hodowli można zbierać ...

Komórki szpiku kostnego hodowane za pomocą czynnika stymulującego tworzenie kolonii makrofagów granulocytów (GM-CSF) generują heterogeniczną hodowlę zawierającą makrofagi i komórki dendrytyczne (DC). Metoda ta kładzie nacisk na wykorzystanie wiązania MHCII i hialuronianu (HA) w celu odróżnienia makrofagów od DC w kulturze GM-CSF. Makrofagi w tej kulturze mają wiele podobieństw do makrofagów pęcherzykowych.

Generowanie i identyfikacja makrofagów i komórek dendrytycznych pochodzących z GM-CSF

Macrophages and dendritic cells (DCs) are innate immune cells found in tissues and lymphoid organs that play a key role in the defense against pathogens. ...

Ogólnym celem niniejszej procedury jest generowanie i rozróżnianie makrofagów podobnych do pęcherzykowych od komórek dendrytycznych w hodowlach komórek szpiku kostnego myszy in vitro suplementowanych GM-CSF. Ta metoda in vitro może pomóc w odpowiedzi na kluczowe pytania dotyczące funkcji komórek dendrytycznych lub makrofagów. Główną zaletą tej techniki jest możliwość uzyskania wystarczającej liczby komórek oraz możliwość odróżnienia komórek dendrytycznych od makrofagów podobnych do pęcherzykowych.Implikacje tej techniki mogą rozciągać się na terapię proteinozy płuc, ponieważ ułatwia ona pozyskiwanie makrofagów podobnych do pęcherzykowych, które mogą być wykorzystane w leczeniu tej choroby. Zazwyczaj osoby rozpoczynające pracę z tą metodą będą potrzebowały praktyki w izolowaniu oczyszczonych kości i płukaniu szpiku kostnego. Demonstracja wizualna tej metody jest przydatna, ponieważ nie wszystkie techniki są łatwo zrozumiałe na podstawie samych instrukcji pisemnych.Na 15 minut przed rozpoczęciem sekcji włącz komorę bezpieczeństwa biologicznego, aby oczyścić powietrze wewnątrz urządzenia, ustabilizować przepływ powietrza i zdezynfekować powierzchnię komory 70% ethanol. Gdy komora będzie gotowa, umieść mysz w pozycji brzusznej na jednym lub dwóch ręcznikach papierowych i spryskaj zwierzę 70% ethanol. Następnie, niedominującą ręką unieś skórę w okolicy klatki piersiowej i za pomocą nożyczek wykonaj nacięcie.Chwytając oba końce nacięcia, ostrożnie pociągnij, aż oba brzegi nacięcia złączą się na wysokości żołądka. Następnie ułóż mysz w pozycji grzbietowej i jedną ręką odciągnij dolną połowę skóry w dół, aż odsłonią się kończyny dolne. Trzymając stopę, przetnij ścięgna Achillesa powyżej stawu skokowego oraz więzadła łączące mięśnie ze stopą na dolnym końcu kości piszczelowej, aby oddzielić stopę od kości kończyny.Trzymając nogę uniesioną, usuń mięśnie i więzadła wokół stawu kolanowego na dolnym końcu kości udowej, aby oddzielić mięśnie uda od podudzia. Za pomocą pincety ostrożnie odciągnij poluzowane mięśnie od powierzchni kości strzałkowej i udowej. Następnie, dociskając otwarte nożyczki do stawu biodrowego, obróć nogę i delikatnie pociągnij za kość udową, aby oddzielić kość nogi od stawu biodrowego, wycinając jednocześnie nogę z ciała.Trzymając teraz kończynę za koniec biodrowy za pomocą sterylnej pęsety, użyj drugiej pęsety, aby usunąć stopę z końca kostkowego. Następnie, trzymając jedną pęsetą dystalny koniec kości udowej, a drugą proksymalny koniec kości piszczelowej i strzałkowej, ostrożnie zegnij kość piszczelową i strzałkową w kierunku przeciwnym do stawu kolanowego, aby oddzielić podudzie od kości udowej i rzepki. Użyj pęsety, aby usunąć pozostałe więzadła, mięśnie oraz kość strzałkową z kości podudzia, a następnie umieść oczyszczoną kość piszczelową na odwróconej pokrywce szalki Petriego zawierającej 1-2 mL HBSS/FCS.Trzymając dolny koniec kości udowej jedną pęsetą, a rzepkę drugą, zegnij kolano i otaczające go tkanki w przeciwnym kierunku, aby usunąć staw. Następnie usuń pozostałe tkanki łącznej z kości udowej i umieść kość na odwróconej pokrywce szalki Petriego. Po pobraniu wszystkich kości użyj pęsety, aby oczyścić je z resztek tkanek, a następnie zanurz kości w 10 mililitrach HBSS/FCS w spodzie szalki Petriego.Utrzymując naczynie częściowo osłonięte sterylną pokrywką, przekrój każde z oczyszczonych kości na pół za pomocą nożyczek. Następnie użyj strzykawki o pojemności 1 ml, wyposażonej w igłę o rozmiarze 26,5 G, aby wypłukać 1 ml HBSS/FCS z naczynia do końca każdego fragmentu kości, aż do momentu uwolnienia całego czerwonego szpiku. Przeciągnij wszelkie widoczne grudki szpiku kostnego przez strzykawkę kilka razy, aby uzyskać jednokomórkową suspensję, a następnie dokładnie wymieszaj całość za pomocą pipety 10 ml.Przenieś komórki do probówki zbiorczej i przepłucz jednorazowo szalkę Petriego pięcioma mililitrami HBSS/FCS, aby zebrać pozostałe komórki. Następnie połącz płuczkę w probówce zbiorczej i umieść komórki w lodzie. Aby przygotować hodowlę komórek szpiku kostnego, odwiruj zebrane komórki i odessaj nadsącz za pomocą sterylnej szklanej pipety Pasteura podłączonej do odsysacza próżniowego.Rozluźnić bogaty w erytrocy osad poprzez delikatne opukiwanie. Następnie dodać 10 milliliters buforu do lizy RBC i resuspenderować komórki za pomocą vortexu. Po pięciominutowej inkubacji w temperaturze pokojowej przerwać lizę, dodając 10 milliliters HBSS/FCS, a następnie odwirować komórki, resuspenderując osad w medium do komórek szpiku kostnego.Należy policzyć liczbę żywych komórek metodą wykluczania błękitu trypanu i przenieść wymaganą liczbę komórek do nowej probówki z pożywką do komórek szpiku kostnego. Następnie komórki należy zebrać poprzez wirowanie i resuspender osad do stężenia czterech milionów komórek na mililitr w pożywce do komórek szpiku kostnego z dodatkiem 20 ng/ml GM-CSF. Następnie do każdej sterylnej szalki Petriego przeznaczonej dla jednej hodowli należy dodać 9,5 ml pożywki do komórek szpiku kostnego uzupełnionej o 20 ng/ml GM-CSF, a do centrum każdej szalki nanieść 500 µl zawiesiny komórek.Inkubuj komórki w temperaturze 37 °C i 5% CO2. W trzecim dniu dodaj do każdej kultury 10 mL świeżego medium do szpiku kostnego uzupełnionego o 20 ng/mL GM-CSF, dbając o to, aby zminimalizować wszelkie zakłócenia hodowli komórek. W szóstym dniu ostrożnie przenieś 10 mL supernatantu z hodowli komórkowej do sterylnej probówki stożkowej o pojemności 50 mL.Odwiruj komórki i resuspenduj osad w 10 mililitrach świeżej pożywki do komórek szpiku kostnego, zawierającej 20 nanogramów na mililitr GM-CSF. Następnie delikatnie wymieszaj zawiesinę komórkową w wortexie i przenieś komórki z powrotem do naczynia hodowlanego. W pierwszym dniu komórki szpiku kostnego są małe i nieliczne, ale do trzeciego dnia ich liczba i rozmiar wzrastają, a niektóre z nich zaczynają przylegać.W szóstym dniu liczba komórek wzrasta i obserwuje się zarówno frakcje adherentne, jak i nieadherentne. Hodowlę można zebrać między siódmym a dziesiątym dniem, a następnie poddać bramkowaniu według wielkości i żywotności komórek; wyższy odsetek komórek CD11c-dodatnich uzyskuje się z hodowli z dziesiątego dnia. W siódmym dniu zebrana frakcja nieadherentna jest silnie wzbogacona w komórki o morfologii dendrytycznej.Populacje CD11c-dodatnie i GR1-ujemne, pobrane w siódmym i dziesiątym dniu, można podzielić na trzy główne populacje: makrofagi, niedojrzałe komórki dendrytyczne oraz dojrzałe komórki dendrytyczne, na podstawie ekspresji MHCII i wiązania FL-HA. Co ciekawe, MerTK, mimo że uznawany za marker makrofagów, wykazuje silną ekspresję zarówno w populacjach makrofagów, jak i niedojrzałych komórek dendrytycznych pobranych w siódmym i dziesiątym dniu, podczas gdy w dojrzałych komórkach dendrytycznych obserwuje się niski poziom jego ekspresji.Podczas wykonywania tej procedury ważne jest pamiętanie o stosowaniu technik sterylnych przez cały proces pobierania szpiku kostnego i hodowli komórek. Po przeprowadzeniu tej procedury komórki można również sortować, aby osobno zbadać poszczególne populacje komórkowe, lub można je stymulować czynnikami zapalnymi, a następnie analizować ich produkcję cytokin za pomocą barwienia wewnątrzkomórkowego i cytometrii przepływowej. Po obejrzeniu tego filmu powinni Państwo mieć dobrą wiedzę na temat tego, jak izolować komórki szpiku kostnego i hodować je w GM-CSF w celu wygenerowania zarówno komórek dendrytycznych, jak i makrofagów podobnych do pęcherzykowych.

generation-identification-gm-csf-derived-alveolar-like-macrophages

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologia i infekcje

W niniejszym filmie przedstawiono procedurę różnicowania myeloidnych komórek dendrytycznych z szpiku kostnego myszy. Zaprezentowano izolację kości piszczelowej i udowej myszy oraz przetwarzanie szpiku kostnego. Pokazano zdjęcia obrazujące morfologię komórek przed i po różnicowaniu, a także schematy przedstawiające fenotyp komórek oraz produkcję IL-12 po dojrzewaniu z użyciem CpG.

Hodowla mieloidalnych komórek dendrytycznych z prekursorów szpiku kostnego

Prezentacja antygenu w wtórnych narządach limfatycznych przez komórki dendrytyczne jest kluczowa dla inicjacji adaptacyjnej odpowiedzi immunologicznej pośredniczonej przez limfocyty T. W niniejszej pracy demonstrujemy hodowlę mysich komórek dendrytycznych pochodzących z szpiku kostnego, ich aktywację oraz znakowanie do obrazowania dwufotonowego.

Generowanie mysich komórek dendrytycznych pochodzących z szpiku kostnego do zastosowań w obrazowaniu dwufotonowym

Ten film opisuje protokół generowania komórek dendrytycznych - kluczowych komórek prezentujących antygen, które aktywują limfocyty T - ze szpiku kostnego dorosłej myszy.

Generowanie komórek dendrytycznych pochodzących ze szpiku kostnego: metoda generowania komórek dendrytycznych ze szpiku kostnego myszy

Artykuł opisuje łatwy w użyciu adaptacyjny model in vitro do badania polaryzacji makrofagów. W obecności GM-CSF/M-CSF krwiotwórcze komórki macierzyste/progenitorowe ze szpiku kostnego są kierowane do różnicowania monocytowego, a następnie stymulacji M1 lub M2. Stan aktywacji można śledzić za pomocą zmian w antygenach powierzchniowych komórki, ekspresji genów i szlakach sygnalizacji komórkowej.

Badanie polaryzacji makrofagów przy użyciu makrofagów pochodzących ze szpiku kostnego

Makrofagi od dawna są uznawane za kluczowy składnik wrodzonej i adaptacyjnej odpowiedzi immunologicznej. Niedawna eksplozja wiedzy dotyczącej ewolucyjnych, genetycznych i biochemicznych aspektów interakcji między makrofagami a mikroorganizmami ponownie zwróciła uwagę naukowców na makrofagi. W artykule opisano metodę różnicowania makrofagów od szpiku kostnego myszy.

Produkcja makrofagów pochodzących ze szpiku kostnego

Tutaj udostępniamy metodę identyfikacji i izolowania dużej liczby komórek szpikowych sterowanych przez GM-CSF za pomocą szybkiego sortowania komórek. Na podstawie ekspresji Ly6C i CD115 można zidentyfikować pięć odrębnych populacji (pospolite przodki szpiku, progenitorzy granulocytów/makrofagów, monocyty, makrofagi pochodzące z monocytów i DC pochodzące z monocytów).

Generowanie dużej liczby progenitorów szpiku i prekursorów komórek dendrytycznych z mysiego szpiku kostnego przy użyciu nowej strategii sortowania komórek

Pokazujemy, jak zidentyfikować i wyizolować 6 podzbiorów komórek progenitorowych szpiku myszy za pomocą kombinacji sortowania magnetycznego i fluorescencyjnego (MACS i FACS). Protokół ten może być stosowany do testów hodowli in vitro (hodowle metylocelulozy lub płynów), eksperymentów z transferem adoptywnym in vivo oraz analiz RNA/białka.

Identyfikacja i izolacja oligopotencjalnych i zaangażowanych w linię przodków szpiku szpiku

W tym artykule przedstawiamy szczegółowy protokół ekspresji białek fuzyjnych fluorescencyjnych w komórkach dendrytycznych i makrofagach pochodzących ze szpiku kostnego myszy. Metoda opiera się na transdukcji komórek progenitorowych szpiku kostnego za pomocą konstruktów retrowirusowych, a następnie różnicowaniu do makrofagów i komórek dendrytycznych in vitro.

Ekspresja fluorescencyjnych białek fuzyjnych w mysich komórkach dendrytycznych i makrofagach pochodzących ze szpiku kostnego

Tutaj prezentujemy ekonomiczną i efektywną metodę izolowania i generowania komórek dendrytycznych pochodzących ze szpiku kostnego o wysokiej czystości od myszy po 7 dniach hodowli z 10 ng/mL GM-CSF/IL-4.

Ekonomiczny i wydajny protokół izolacji i hodowli komórek dendrytycznych pochodzących ze szpiku kostnego od myszy

Obecny protokół opisuje izolację i hodowlę makrofagów pochodzących ze szpiku kostnego od myszy.

Izolacja i hodowla makrofagów pochodzących ze szpiku kostnego od myszy

Ten protokół opisuje nieenzymatyczną i prostą metodę izolowania 7-9-dniowych komórek szpiku kostnego myszy noworodków i generowania zróżnicowanych makrofagów przy użyciu supernatantu komórek L929 jako źródła czynnika stymulującego tworzenie kolonii granulocytów (M-CSF). Makrofagi pochodzące ze szpiku kostnego poddano dalszej analizie pod kątem antygenów powierzchniowych F4/80, CD206, CD11b i kompetencji funkcjonalnych.

Izolacja szpiku kostnego noworodków myszy i przygotowanie makrofagów pochodzących ze szpiku kostnego

Poznaj metodę generowania makrofagów przypominających pęcherzykowe i komórek dendrytycznych z kości szczury mysiej przy użyciu GM-CSF. Technika ta umożliwia uzyskanie wystarczających ilości komórek do badań immunologicznych.

Generowanie i identyfikacja makrofagów i komórek dendrytycznych pochodzących z GM-CSF

Przeglądaj więcej filmów