Generowanie i identyfikacja makrofagów i komórek dendrytycznych pochodzących z GM-CSF
25 czerwca 2016
Komórki szpiku kostnego hodowane za pomocą czynnika stymulującego tworzenie kolonii makrofagów granulocytów (GM-CSF) generują heterogeniczną hodowlę zawierającą makrofagi i komórki dendrytyczne (DC). Metoda ta kładzie nacisk na wykorzystanie wiązania MHCII i hialuronianu (HA) w celu odróżnienia makrofagów od DC w kulturze GM-CSF. Makrofagi w tej kulturze mają wiele podobieństw do makrofagów pęcherzykowych.
Ogólnym celem niniejszej procedury jest generowanie i rozróżnianie makrofagów podobnych do pęcherzykowych od komórek dendrytycznych w hodowlach komórek szpiku kostnego myszy in vitro suplementowanych GM-CSF. Ta metoda in vitro może pomóc w odpowiedzi na kluczowe pytania dotyczące funkcji komórek dendrytycznych lub makrofagów. Główną zaletą tej techniki jest możliwość uzyskania wystarczającej liczby komórek oraz możliwość odróżnienia komórek dendrytycznych od makrofagów podobnych do pęcherzykowych.
Implikacje tej techniki mogą rozciągać się na terapię proteinozy płuc, ponieważ ułatwia ona pozyskiwanie makrofagów podobnych do pęcherzykowych, które mogą być wykorzystane w leczeniu tej choroby. Zazwyczaj osoby rozpoczynające pracę z tą metodą będą potrzebowały praktyki w izolowaniu oczyszczonych kości i płukaniu szpiku kostnego. Demonstracja wizualna tej metody jest przydatna, ponieważ nie wszystkie techniki są łatwo zrozumiałe na podstawie samych instrukcji pisemnych.
Na 15 minut przed rozpoczęciem sekcji włącz komorę bezpieczeństwa biologicznego, aby oczyścić powietrze wewnątrz urządzenia, ustabilizować przepływ powietrza i zdezynfekować powierzchnię komory 70% ethanol. Gdy komora będzie gotowa, umieść mysz w pozycji brzusznej na jednym lub dwóch ręcznikach papierowych i spryskaj zwierzę 70% ethanol. Następnie, niedominującą ręką unieś skórę w okolicy klatki piersiowej i za pomocą nożyczek wykonaj nacięcie.
Chwytając oba końce nacięcia, ostrożnie pociągnij, aż oba brzegi nacięcia złączą się na wysokości żołądka. Następnie ułóż mysz w pozycji grzbietowej i jedną ręką odciągnij dolną połowę skóry w dół, aż odsłonią się kończyny dolne. Trzymając stopę, przetnij ścięgna Achillesa powyżej stawu skokowego oraz więzadła łączące mięśnie ze stopą na dolnym końcu kości piszczelowej, aby oddzielić stopę od kości kończyny.
Trzymając nogę uniesioną, usuń mięśnie i więzadła wokół stawu kolanowego na dolnym końcu kości udowej, aby oddzielić mięśnie uda od podudzia. Za pomocą pincety ostrożnie odciągnij poluzowane mięśnie od powierzchni kości strzałkowej i udowej. Następnie, dociskając otwarte nożyczki do stawu biodrowego, obróć nogę i delikatnie pociągnij za kość udową, aby oddzielić kość nogi od stawu biodrowego, wycinając jednocześnie nogę z ciała.
Trzymając teraz kończynę za koniec biodrowy za pomocą sterylnej pęsety, użyj drugiej pęsety, aby usunąć stopę z końca kostkowego. Następnie, trzymając jedną pęsetą dystalny koniec kości udowej, a drugą proksymalny koniec kości piszczelowej i strzałkowej, ostrożnie zegnij kość piszczelową i strzałkową w kierunku przeciwnym do stawu kolanowego, aby oddzielić podudzie od kości udowej i rzepki. Użyj pęsety, aby usunąć pozostałe więzadła, mięśnie oraz kość strzałkową z kości podudzia, a następnie umieść oczyszczoną kość piszczelową na odwróconej pokrywce szalki Petriego zawierającej 1-2 mL HBSS/FCS.
Trzymając dolny koniec kości udowej jedną pęsetą, a rzepkę drugą, zegnij kolano i otaczające go tkanki w przeciwnym kierunku, aby usunąć staw. Następnie usuń pozostałe tkanki łącznej z kości udowej i umieść kość na odwróconej pokrywce szalki Petriego. Po pobraniu wszystkich kości użyj pęsety, aby oczyścić je z resztek tkanek, a następnie zanurz kości w 10 mililitrach HBSS/FCS w spodzie szalki Petriego.
Utrzymując naczynie częściowo osłonięte sterylną pokrywką, przekrój każde z oczyszczonych kości na pół za pomocą nożyczek. Następnie użyj strzykawki o pojemności 1 ml, wyposażonej w igłę o rozmiarze 26,5 G, aby wypłukać 1 ml HBSS/FCS z naczynia do końca każdego fragmentu kości, aż do momentu uwolnienia całego czerwonego szpiku. Przeciągnij wszelkie widoczne grudki szpiku kostnego przez strzykawkę kilka razy, aby uzyskać jednokomórkową suspensję, a następnie dokładnie wymieszaj całość za pomocą pipety 10 ml.
Przenieś komórki do probówki zbiorczej i przepłucz jednorazowo szalkę Petriego pięcioma mililitrami HBSS/FCS, aby zebrać pozostałe komórki. Następnie połącz płuczkę w probówce zbiorczej i umieść komórki w lodzie. Aby przygotować hodowlę komórek szpiku kostnego, odwiruj zebrane komórki i odessaj nadsącz za pomocą sterylnej szklanej pipety Pasteura podłączonej do odsysacza próżniowego.
Rozluźnić bogaty w erytrocy osad poprzez delikatne opukiwanie. Następnie dodać 10 milliliters buforu do lizy RBC i resuspenderować komórki za pomocą vortexu. Po pięciominutowej inkubacji w temperaturze pokojowej przerwać lizę, dodając 10 milliliters HBSS/FCS, a następnie odwirować komórki, resuspenderując osad w medium do komórek szpiku kostnego.
Należy policzyć liczbę żywych komórek metodą wykluczania błękitu trypanu i przenieść wymaganą liczbę komórek do nowej probówki z pożywką do komórek szpiku kostnego. Następnie komórki należy zebrać poprzez wirowanie i resuspender osad do stężenia czterech milionów komórek na mililitr w pożywce do komórek szpiku kostnego z dodatkiem 20 ng/ml GM-CSF. Następnie do każdej sterylnej szalki Petriego przeznaczonej dla jednej hodowli należy dodać 9,5 ml pożywki do komórek szpiku kostnego uzupełnionej o 20 ng/ml GM-CSF, a do centrum każdej szalki nanieść 500 µl zawiesiny komórek.
Inkubuj komórki w temperaturze 37 °C i 5% CO2. W trzecim dniu dodaj do każdej kultury 10 mL świeżego medium do szpiku kostnego uzupełnionego o 20 ng/mL GM-CSF, dbając o to, aby zminimalizować wszelkie zakłócenia hodowli komórek. W szóstym dniu ostrożnie przenieś 10 mL supernatantu z hodowli komórkowej do sterylnej probówki stożkowej o pojemności 50 mL.
Odwiruj komórki i resuspenduj osad w 10 mililitrach świeżej pożywki do komórek szpiku kostnego, zawierającej 20 nanogramów na mililitr GM-CSF. Następnie delikatnie wymieszaj zawiesinę komórkową w wortexie i przenieś komórki z powrotem do naczynia hodowlanego. W pierwszym dniu komórki szpiku kostnego są małe i nieliczne, ale do trzeciego dnia ich liczba i rozmiar wzrastają, a niektóre z nich zaczynają przylegać.
W szóstym dniu liczba komórek wzrasta i obserwuje się zarówno frakcje adherentne, jak i nieadherentne. Hodowlę można zebrać między siódmym a dziesiątym dniem, a następnie poddać bramkowaniu według wielkości i żywotności komórek; wyższy odsetek komórek CD11c-dodatnich uzyskuje się z hodowli z dziesiątego dnia. W siódmym dniu zebrana frakcja nieadherentna jest silnie wzbogacona w komórki o morfologii dendrytycznej.
Populacje CD11c-dodatnie i GR1-ujemne, pobrane w siódmym i dziesiątym dniu, można podzielić na trzy główne populacje: makrofagi, niedojrzałe komórki dendrytyczne oraz dojrzałe komórki dendrytyczne, na podstawie ekspresji MHCII i wiązania FL-HA. Co ciekawe, MerTK, mimo że uznawany za marker makrofagów, wykazuje silną ekspresję zarówno w populacjach makrofagów, jak i niedojrzałych komórek dendrytycznych pobranych w siódmym i dziesiątym dniu, podczas gdy w dojrzałych komórkach dendrytycznych obserwuje się niski poziom jego ekspresji.
Podczas wykonywania tej procedury ważne jest pamiętanie o stosowaniu technik sterylnych przez cały proces pobierania szpiku kostnego i hodowli komórek. Po przeprowadzeniu tej procedury komórki można również sortować, aby osobno zbadać poszczególne populacje komórkowe, lub można je stymulować czynnikami zapalnymi, a następnie analizować ich produkcję cytokin za pomocą barwienia wewnątrzkomórkowego i cytometrii przepływowej. Po obejrzeniu tego filmu powinni Państwo mieć dobrą wiedzę na temat tego, jak izolować komórki szpiku kostnego i hodować je w GM-CSF w celu wygenerowania zarówno komórek dendrytycznych, jak i makrofagów podobnych do pęcherzykowych.
Wyświetl pełny transkrypt i uzyskaj dostęp do tysięcy filmów naukowych
Przegląd
Niniejsza praca koncentruje się na generowaniu i rozróżnianiu makrofagów typu pęcherzykowego od komórek dendrytycznych przy użyciu hodowli in vitro komórek szpiku kostnego myszy suplementowanych GM-CSF. Metoda ta pozwala na uzyskanie wystarczającej liczby komórek i pomaga w zrozumieniu funkcji tych komórek odpornościowych.
Kluczowe elementy badania
Dziedzina nauki
- Immunologia
- Biologia komórki
- Neuronauka
Wstęp
- Komórki szpiku kostnego można hodować z GM-CSF w celu wytworzenia makrofagów i komórek dendrytycznych.
- Makrofagi uzyskane w tej hodowli przypominają makrofagi pęcherzykowe.
- Rozróżnienie między tymi typami komórek jest kluczowe dla prowadzonych badań.
- Technika ta może mieć znaczenie terapeutyczne w przypadku białkomózgowia płuc.
Cel badania
- W celu wygenerowania makrofagów o fenotypie pęcherzykowym z komórek szpiku kostnego.
- W celu odróżnienia tych makrofagów od komórek dendrytycznych.
- W celu ułatwienia badań nad funkcjami tych komórek odpornościowych.
Zastosowane metody
- Kultywowanie komórek szpiku kostnego myszy z GM-CSF.
- Wykorzystanie wiązania MHCII i hialuronianu (HA) do różnicowania.
- Izolacja i płukanie oczyszczonych kości w celu ekstrakcji komórek.
- Demonstracje wizualne ułatwiające zrozumienie metody.
Główne wyniki
- Metoda ta pozwala na pomyślne uzyskanie heterogenicznej kultury makrofagów i komórek dendrytycznych.
- Makrofagi wykazują cechy podobne do makrofagów pęcherzykowych.
- Wyraźne rozróżnienie między typami komórek osiąga się z wykorzystaniem specyficznych markerów.
- Technika ta pozwala na uzyskanie liczby komórek wystarczającej do celów badawczych.
Wnioski
- Ta metoda in vitro jest skuteczna w badaniu makrofagów o fenotypie pęcherzykowym.
- Pozwala ona na lepsze zrozumienie roli makrofagów oraz komórek dendrytycznych.
- Uzyskane wyniki mogą przyczynić się do opracowania strategii terapeutycznych w chorobach płuc.
Najczęściej zadawane pytania
Znaczenie dla przemysłu
Metoda ta umożliwia skalowalną generację makrofagów pęcherzykowych oraz komórek dendrytycznych z szpiku kostnego myszy, rozwiązując kluczowy problem w badaniach immunologicznych: ograniczoną dostępność pierwotnych komórek. Dzięki zapewnieniu powtarzalnego systemu in vitro, który fenotypowo i funkcjonalnie naśladuje tkankowe makrofagi pęcherzykowe, metoda ta wspiera redukcję ryzyka mechanistycznego w walidacji celów oraz w przedklinicznym modelowaniu odpowiedzi immunologicznych w płucach. Podejście to zwiększa pewność predykcyjną we wczesnej fazie odkrywania leków, umożliwiając spójną analizę roli makrofagów i komórek dendrytycznych w obronie organizmu oraz w szlakach zapalnych.
Strategiczne zastosowania w badaniach i rozwoju biofarmaceutycznym
Wczesne etapy odkrywania i walidacja celu
- Wartość naukowa: Umożliwia badanie hipotez terapeutycznych dotyczących funkcji makrofagów pęcherzykowych w odporności i zapaleniu płuc.
- Wartość operacyjna: Zapewnia odnawialne źródło fenotypowo zdefiniowanych makrofagów i komórek dendrytycznych do analizy angażowania celu oraz szlaków sygnałowych.
- Wartość prognostyczna: Wspiera ograniczanie ryzyka biologicznego poprzez modelowanie odpowiedzi ludzkich makrofagów typu pęcherzykowego w kontrolowanym systemie in vitro.
Przesiewy i opracowywanie testów
- Wartość naukowa: Pozwala na generowanie zestandaryzowanych populacji komórek odpowiednich do wysokoprzepustowego screeningu związków immunomodulujących.
- Wartość operacyjna: Umożliwia powtarzalność testów poprzez spójną dyferencjację z wykorzystaniem markerów MHCII i FL-HA do wyodrębniania subpopulacji makrofagów i komórek dendrytycznych.
- Skalowalność: Wspiera produkcję wystarczającej liczby komórek do optymalizacji testów oraz screeningu bibliotek związków.
Badania translacyjne i przedkliniczne
- Znaczenie translacyjne: Modeluje biologię makrofagów pęcherzykowych w kontekście chorób płuc, takich jak proteinoza, ułatwiając przedkliniczne badania skuteczności.
- Ciągłość mechanistyczna: Łączy wyniki badań podstawowych z walidacją przedkliniczną poprzez zachowanie wierności fenotypowej makrofagów tkankowych.
- Postęp z uwzględnieniem ryzyka: Wspiera decyzje typu go/no-go, umożliwiając mechanistyczną ocenę wpływu związków na funkcje komórek odporności wrodzonej.
Integracja potoku i przepływu pracy
Metoda ta wpisuje się w kontinuum procesów odkrywczych – od walidacji celu po ocenę przedkliniczną – stanowiąc odnawialną platformę dla programów skoncentrowanych na immunologii. Wspiera ona iteracyjne cykle testowania, w których fenotypy makrofagów i komórek dendrytycznych mogą być przesiewane, walidowane i przenoszone do modeli istotnych dla danej jednostki chorobowej.
- Biologia odkryć: Ułatwia testowanie hipotez dotyczących mechanizmów odporności wrodzonej z wykorzystaniem genetycznie modyfikowalnych komórek mysich pochodzących z szpiku kostnego.
- Przesiewanie: Dostarcza ustandaryzowane populacje komórek gotowe do analizy, z mierzalnymi wynikami uzyskiwanymi za pomocą cytometrii przepływowej z wykorzystaniem markerów CD11c, MHCII i FL-HA.
- Analityka: Umożliwia ilościowe porównanie odpowiedzi podzbiorów komórek poprzez zdefiniowane strategie bramkowania i profilowanie ekspresji markerów.
- Badania translacyjne: Modeluje fenotypy makrofagów pęcherzykowych w celu zapewnienia ciągłości w badaniach nad odpornością płuc oraz w przesiewaniu terapeutycznym.
- Wykorzystanie w skali przedsiębiorstwa: Tworzy wielokrotnego użytku, skalowalną możliwość dla zespołów immunologicznych badających funkcje komórek mieloidalnych w wielu projektach.
Wpływ operacyjny i przedsiębiorstwowy
- Wartość naukowa: Zwiększa pewność predykcyjną walidacji celu poprzez zmniejszenie zależności od deficytowych pierwotnych makrofagów pęcherzykowych.
- Wartość operacyjna: Zapewnia powtarzalność dzięki standaryzowanym protokołom różnicowania indukowanego cytokinami oraz immunofenotypowania.
- Wartość strategiczna: Poprawia efektywność zasobów i zmniejsza zmienność w kampaniach przesiewowych z zakresu immunologii.
- Wpływ na portfolio: Umożliwia priorytetyzację kandydatów immunomodulujących w oparciu o dane dotyczące efektów mechanistycznych w modelach komórkowych istotnych dla człowieka.
Uwagi dotyczące implementacji
- Wymagana jest wiedza z zakresu pobierania szpiku kostnego myszy, sterylnej hodowli komórkowej oraz cytometrii przepływowej.
- Konieczny jest dostęp do komór laminarnych, wirówek oraz sprzętu do fluorescencyjnego sortowania komórek (FACS).
- W celu uzyskania powtarzalnych wyników niezbędna jest standaryzacja stężenia GM-CSF oraz czasu hodowli we wszystkich ośrodkach.
- Adaptacja do systemów ludzkich lub modeli chorobowych może wymagać walidacji konserwacji markerów i równoważności funkcjonalnej.
- Heterogenność hodowli wymaga zastosowania rygorystycznych strategii bramkowania w celu wyizolowania czystych subpopulacji makrofagów i komórek dendrytycznych do dalszych zastosowań.
