Generowanie i identyfikacja makrofagów i komórek dendrytycznych pochodzących z GM-CSF
June 25th, 2016
Komórki szpiku kostnego hodowane za pomocą czynnika stymulującego tworzenie kolonii makrofagów granulocytów (GM-CSF) generują heterogeniczną hodowlę zawierającą makrofagi i komórki dendrytyczne (DC). Metoda ta kładzie nacisk na wykorzystanie wiązania MHCII i hialuronianu (HA) w celu odróżnienia makrofagów od DC w kulturze GM-CSF. Makrofagi w tej kulturze mają wiele podobieństw do makrofagów pęcherzykowych.
Ogólnym celem tej procedury jest wygenerowanie i odróżnienie makrofagów pęcherzykowych od komórek dendrytycznych w hodowlach in vitro mysich komórek szpiku kostnego uzupełnionych GM-CSF. Ta metoda in vitro może pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytania dotyczące funkcji komórek dendrytycznych lub makrofagów. Główną zaletą tej techniki jest to, że może generować wystarczającą liczbę komórek i potrafi odróżnić komórki dendrytyczne od makrofagów pęcherzykowych.
Implikacje tej techniki mogą rozciągać się w kierunku terapii proteinozy płucnej, ponieważ ułatwia ona pozyskiwanie makrofagów pęcherzykowych, które mogą być stosowane w leczeniu tej choroby. Ogólnie rzecz biorąc, osoby, które dopiero zaczynają korzystać z tej metody, będą potrzebowały praktyki w izolowaniu oczyszczonych kości i płukaniu szpiku kostnego. Wizualna demonstracja tej metody jest przydatna, ponieważ nie wszystkie stosowane techniki są łatwe do zrozumienia za pomocą samych pisemnych instrukcji.
Na 15 minut przed rozpoczęciem sekcji włącz szafę bezpieczeństwa biologicznego, aby oczyścić powietrze z szafki i ustabilizować przepływ powietrza, a także wyczyść powierzchnię szafki 70% etanolem. Gdy szafka będzie gotowa, umieść mysz na jednym lub dwóch ręcznikach papierowych w pozycji leżącej i spryskaj zwierzę 70% etanolem. Następnie ręką niedominującą unieś skórę wokół klatki piersiowej i użyj nożyczek, aby wykonać nacięcie.
Chwytając oba końce nacięcia, ostrożnie pociągnij, aż oba końce nacięcia spotkają się na brzuchu. Następnie umieść mysz w pozycji leżącej na plecach i jedną ręką pociągnij dolną połowę skóry w dół, aż nogi zostaną odsłonięte. Trzymając stopę, przetnij ścięgna Achillesa powyżej stawu skokowego i więzadła łączące mięśnie ze stopą na dolnym końcu kości piszczelowej, aby rozluźnić stopę od kości nóg.
Trzymając nogę uniesioną, usuń mięśnie i więzadła wokół stawu kolanowego na dolnym końcu kości udowej, aby obciąć mięśnie ud z dolnej części nogi. Za pomocą kleszczy delikatnie odciągnij rozluźnione mięśnie od powierzchni strzałkowej i udowej. Następnie naciskając nożyczki w pozycji otwartej na staw biodrowy, obróć nogę i delikatnie pociągnij za kość udową, aby oddzielić kość nogi od stawu biodrowego, jednocześnie odcinając nogę od ciała.
Teraz trzymając nogę na końcu biodra sterylnymi kleszczami, użyj innych kleszczy, aby usunąć stopę z końca kostki. Następnie, trzymając dystalny koniec kości udowej jednym kleszczem, a bliższy koniec kości piszczelowej i strzałkowej drugim, ostrożnie zegnij kość piszczelową i strzałkową w przeciwnym kierunku niż staw kolanowy, aby oddzielić dolną część nogi od kości udowej i rzepki. Użyj kleszczy, aby usunąć pozostałe więzadła, mięśnie i kości strzałkowe z kości podudzia i umieść oczyszczoną kość piszczelową na odwróconej pokrywie szalki Petriego, zawierającej od jednego do dwóch mililitrów HBSS / FCS.
Trzymając dolny koniec kości udowej jednym zestawem kleszczy, a rzepkę drugim, zegnij kolano i otaczające tkanki w przeciwnym kierunku, aby usunąć staw. Następnie usuń pozostałą tkankę łączną z kości udowej i umieść kość na odwróconej pokrywie szalki Petriego. Po pobraniu wszystkich kości należy użyć kleszczy, aby oczyścić wszelkie resztki tkanki nadal przyczepione do kości i zanurzyć kości w 10 mililitrach HBSS/FCS w podstawie szalki Petriego.
Trzymając naczynie częściowo osłonięte sterylną pokrywką, przetnij nożyczkami każdą z oczyszczonych kości na pół. Następnie użyj strzykawki o pojemności jednego mililitra, wyposażonej w igłę o rozmiarze 26,5, aby przepłukać jeden mililitr HBSS / FCS z naczynia na koniec każdego kawałka kości, aż cały czerwony szpik zostanie uwolniony. Przepuść wszystkie widoczne grudki szpiku kostnego przez strzykawkę kilka razy, aby utworzyć zawiesinę jednokomórkową, a następnie dokładnie wymieszaj za pomocą 10-mililitrowej pipety.
Przenieść komórki do probówki zbiorczej i przepłukać szalkę Petriego jeden raz pięcioma mililitrami HBSS/FCS, aby zebrać wszelkie resztki komórek. Następnie zbierz popłucz płyn w probówce zbiorczej i umieść komórki na lodzie. Aby założyć hodowlę komórek szpiku kostnego, odwirować zebrane komórki i odessać supernatant za pomocą sterylnej szklanej pipety Pasteura podłączonej do odsysania próżniowego.
Poluzuj osad bogaty w czerwone krwinki, stukając. Następnie dodaj 10 mililitrów buforu do lizy RBC i ponownie zawieś komórki za pomocą wirowania. Po pięciominutowej inkubacji w temperaturze pokojowej zatrzymaj lizę za pomocą 10 mililitrów HBSS / FCS i odwiruj komórki, ponownie zawieszając osad w pożywce dla komórek szpiku kostnego.
Policz liczbę żywotnych komórek przez wykluczenie błękitu trypanowego i przenieś potrzebne komórki do nowej probówki z pożywką komórkową szpiku kostnego. Następnie zbierz komórki przez odwirowanie i ponownie zawieś osad w rozcieńczeniu czterech milionów komórek na mililitr w pożywce dla komórek szpiku kostnego z 20 nanogramami na mililitr GM-CSF. Następnie dodaj 9,5 mililitra pożywki z komórkami szpiku kostnego uzupełnioną 20 nanogramami na mililitr GM-CSF do jednej sterylnej bakteryjnej szalki Petriego na kulturę i dodaj 500 mikrolitrów komórek do środka każdej płytki.
Inkubuj komórki w temperaturze 37 stopni Celsjusza i pięciu procentach CO2. Trzeciego dnia dodaj 10 mililitrów świeżej pożywki ze szpiku kostnego uzupełnionej 20 nanogramami na mililitr GM-CSF do każdej hodowli, uważając, aby zminimalizować wszelkie zakłócenia w komórkach. Szóstego dnia ostrożnie przenieś 10 mililitrów supernatantu do hodowli komórkowej do sterylnej stożkowej probówki o pojemności 50 mililitrów.
Odwirować komórki i ponownie zawiesić osad w 10 mililitrach świeżej pożywki z komórek szpiku kostnego, zawierającej 20 nanogramów na mililitr GM-CSF. Następnie delikatnie zwiruj zawiesinę komórkową i włóż komórki z powrotem do naczynia hodowlanego. Pierwszego dnia komórki szpiku kostnego są małe i rzadkie, ale w trzecim dniu komórki zwiększyły się pod względem liczby i rozmiaru, a niektóre zaczęły przylegać.
Do szóstego dnia jest więcej komórek i obserwuje się zarówno frakcje przylegające, jak i nieprzylegające. Hodowlę można zbierać od siódmego do 10 dnia i bramkować według wielkości i żywych komórek z wyższym procentem komórek CD11c-dodatnich uzyskanych z hodowli w dniu 10. W siódmym dniu zebrana frakcja nieprzylegająca jest znacznie wzbogacona o komórki o morfologii dendrytycznej.
Populacje CD11c-dodatnie, GR1-ujemne, zebrane w siódmym i dziesiątym dniu, można podzielić na trzy główne populacje. Makrofagi, niedojrzałe komórki dendrytyczne i dojrzałe komórki dendrytyczne przez ekspresję MHCII i wiązanie FL-HA. Co ciekawe, MerTK, choć uważany za marker makrofagów, wykazuje silną ekspresję zarówno w populacjach makrofagów, jak i niedojrzałych komórek dendrytycznych, zebranych w siódmym i dziesiątym dniu, z niskim poziomem ekspresji obserwowanym na dojrzałych komórkach dendrytycznych.
Podejmując tę procedurę, należy pamiętać o stosowaniu sterylnych technik podczas pobierania szpiku kostnego i hodowli komórek. Po tej procedurze komórki można również sortować w celu osobnego zbadania populacji komórek lub stymulować je czynnikami zapalnymi, a następnie analizować pod kątem produkcji cytokin za pomocą barwienia wewnątrzkomórkowego i cytometrii przepływowej. Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak izolować komórki szpiku kostnego i hodować je w GM-CSF, aby wygenerować zarówno komórki dendrytyczne, jak i makrofagi pęcherzykowe.
View the full transcript and gain access to thousands of scientific videos
Przegląd
To badanie koncentruje się na generowaniu i rozróżnianiu makrofagów przypominających pęcherzykowe z komórek dendrytycznych za pomocą hodowli komórek szpiku kostnego myszy in vitro uzupełnionych o GM-CSF. Metoda ta pozwala na uzyskanie wystarczającej liczby komórek i pomaga w zrozumieniu funkcji tych komórek układu odpornościowego.
Kluczowe elementy badania
Dziedzina nauki
- Immunologia
- Biologia komórki
- Neuronauki
Tło
- Komórki szpiku kostnego mogą być hodowane z GM-CSF w celu produkcji makrofagów i komórek dendrytycznych.
- Makrofagi wygenerowane w tej hodowli przypominają makrofagi pęcherzykowe.
- Rozróżnianie między tymi typami komórek jest kluczowe dla badań.
- Technika ta może mieć zastosowanie terapeutyczne w przypadku proteinozy płucnej.
Cel badania
- Generowanie makrofagów przypominających pęcherzykowe z komórek szpiku kostnego.
- Rozróżnianie tych makrofagów od komórek dendrytycznych.
- Ułatwienie badań nad funkcjami tych komórek układu odpornościowego.
Zastosowane metody
- Hodowla komórek szpiku kostnego myszy z GM-CSF.
- Zastosowanie wiązania MHCII i kwasu hialuronowego (HA) do różnicowania.
- Izolacja i spłukiwanie oczyszczonych kości w celu ekstrakcji komórek.
- Demonstracje wizualne w celu ułatwienia zrozumienia metody.
Główne wyniki
- Metoda z powodzeniem generuje heterogeniczną hodowlę makrofagów i komórek dendrytycznych.
- Makrofagi wykazują cechy podobne do makrofagów pęcherzykowych.
- Wyraźne rozróżnienie między typami komórek jest osiągane za pomocą określonych markerów.
- Technika ta może wyprodukować wystarczającą liczbę komórek do celów badawczych.
Wnioski
- Ta metoda in vitro jest skuteczna w badaniu makrofagów przypominających pęcherzykowe.
- Dostarcza informacji na temat ról makrofagów i komórek dendrytycznych.
- Wyniki te mogą przyczynić się do strategii terapeutycznych w przypadku chorób płuc.
Często zadawane pytania
Executive Industry Relevance
This method enables scalable generation of alveolar-like macrophages and dendritic cells from murine bone marrow, addressing a key bottleneck in immunology research: limited primary cell availability. By providing a reproducible in vitro system that phenotypically and functionally mimics tissue-resident alveolar macrophages, it supports mechanistic de-risking in target validation and preclinical modeling of pulmonary immune responses. The approach enhances predictive confidence in early discovery by enabling consistent interrogation of macrophage and dendritic cell roles in host defense and inflammatory pathways.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of therapeutic hypotheses involving alveolar macrophage function in lung immunity and inflammation.
- Operational Value: Provides a renewable source of phenotypically defined macrophages and dendritic cells for target engagement and pathway analysis.
- Predictive Value: Supports biological de-risking by modeling human alveolar-like macrophage responses in a controlled in vitro system.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Generates standardized cell populations suitable for high-content screening of immunomodulatory compounds.
- Operational Value: Enables assay reproducibility through consistent differentiation using MHCII and FL-HA markers to gate macrophage vs. dendritic cell subsets.
- Scalability: Supports production of sufficient cell numbers for assay optimization and compound library screening.
Translational & Preclinical Research
- Translational Relevance: Models alveolar macrophage biology relevant to pulmonary diseases such as proteinosis, facilitating preclinical efficacy testing.
- Mechanistic Continuity: Bridges discovery findings to preclinical validation by maintaining phenotypic fidelity to tissue-resident macrophages.
- Risk-Adjusted Advancement: Informs go/no-go decisions by enabling mechanistic assessment of compound effects on innate immune cell function.
Pipeline & Workflow Integration
The method fits within the discovery continuum from target validation through preclinical evaluation, offering a renewable platform for immunology-focused programs. It supports iterative testing cycles where macrophage and dendritic cell phenotypes can be screened, validated, and translated into disease-relevant models.
- Discovery Biology: Facilitates hypothesis testing on innate immune mechanisms using genetically tractable murine bone marrow-derived cells.
- Screening: Delivers assay-ready, standardized cell populations with quantifiable outputs via flow cytometry using CD11c, MHCII, and FL-HA markers.
- Analytics: Enables quantitative comparison of cell subset responses through defined gating strategies and marker expression profiling.
- Translational Research: Models alveolar macrophage phenotypes to support continuity in pulmonary immune research and therapeutic screening.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable, scalable capability for immunology teams studying myeloid cell function across multiple projects.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence in target validation by reducing reliance on scarce primary alveolar macrophages.
- Operational Value: Ensures reproducibility through standardized cytokine-driven differentiation and immunophenotyping protocols.
- Strategic Value: Improves resource efficiency and reduces variability in immunological screening campaigns.
- Portfolio Impact: Enables data-driven prioritization of immunomodulatory candidates based on mechanistic effects in human-relevant cell models.
Implementation Considerations
- Requires expertise in murine bone marrow harvest, sterile cell culture, and flow cytometry.
- Dependent on access to biological safety cabinets, centrifuges, and fluorescence-activated cell sorting equipment.
- Necessitates standardization of GM-CSF concentration and culture duration across sites for reproducible outcomes.
- Adaptation to human or disease-model systems may require validation of marker conservation and functional equivalence.
- Culture heterogeneity necessitates robust gating strategies to isolate pure macrophage and dendritic cell subsets for downstream applications.
