Name: Szybka, wysokoprzepustowa identyfikacja gatunków materiału botanicznego za pomocą bezpośredniej analizy w czasie rzeczywistym Spektrometria mas o wysokiej rozdzielczości (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-10-02T13:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 14 s
Description: Poznaj szybką identyfikację gatunków roślin za pomocą spektrometrii masowej DART-HRMS z analizą wielowymiarową. Ta metoda umożliwia badanie odcisków chemicznych i bioaktywnych związków w tkankach roślinnych.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Autorzy dziękują RAM za grant Uniwersytetu w Albany-SUNY Presidential Initiatives Fund na badania i stypendia w dziedzinie kryminalistyki i cyberbezpieczeństwa, grant National Science Foundation (Grant #1310350) oraz grant National Institute of Justice (Grant #2015-DN-BX-K057). Dziękujemy również Justine E. Giffen za wykonanie zdjęć materiałów roślinnych.

1. Przygotowanie materiałów roślinnych
<ol>
	<li>Kratom świeży materiał liści
	<ol>
		<li>Użyj dziurkacza o średnicy 6 mm, aby stworzyć jednolite kawałki materiału z liści Kratom z rośliny M. speciosa. Powtórz 5 razy.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Ekstrakcja proszku kratom
	<ol>
		<li>Zmieszać 5 ml etanolu i 5 ml wody destylowanej, aby uzyskać mieszaninę rozpuszczalników 1:1 do ekstrakcji.</li>
		<li>W probówce do mikrowirówek o pojemności 1,5 ml zawiesić niewielką ilość (~ 5 mg) proszku Kratom Bali w 1 ml mieszaniny rozpuszczalnika 1:1 EtOH:H 2O. Powtórz 5 razy.</li>
		<li>Sonikować próbki ekstraktu z proszku Kratom Bali w kąpieli ultradźwiękowej przez 30 minut w temperaturze otoczenia.</li>
		<li>Odwirować próbki ekstraktu w proszku Kratom Bali przez 2 minuty przy 750 x g w temperaturze otoczenia.</li>
		<li>Zdekantować rozpuszczalnik z pozostałości proszku do dalszej analizy.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Przygotowanie nasion datury
	<ol>
		<li>Pokrój nasiona D. stramonium na pół w poprzek płaszczyzny poprzecznej za pomocą żyletki. Powtórz przy użyciu 5 różnych nasion.</li>
		<li>Powtórz dla nasion D. inoxia i D. ferox.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. Bezpośrednia analiza parametrów źródła jonów w czasie rzeczywistym
<ol>
	<li>Temperatura nagrzewnicy gazowej
	<ol>
		<li>Ustaw temperaturę nagrzewnicy gazowej źródła jonów na 350 °C.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Tryb jonowy
	<ol>
		<li>Analizę należy przeprowadzić w trybie jonów dodatnich przy napięciu sieciowym 250 V.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Natężenie przepływu helu gazowego
	<ol>
		<li>Ustaw natężenie przepływu helu gazowego na 2.0 l/sek.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
3. Parametry spektrometru masowego czasu przelotu
<ol>
	<li>Napięcia kryzy
	<ol>
		<li>Ustaw napięcie kryzy 1 na 20 V, a napięcie kryzy 2 na 5 V.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Soczewka pierścieniowa i napięcie szczytowe
	<ol>
		<li>Ustaw napięcie soczewki pierścieniowej na 5 V i zmień napięcie szczytowe na 600 V.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Akwizycja widma mas
	<ol>
		<li>Ustaw szybkość akwizycji widma masowego na 1 widmo na sekundę w zakresie mas m/z 60-800.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Zdolność rozdzielcza spektrometru mas
	<ol>
		<li>Ustaw zdolność rozdzielczą spektrometru mas na 6000 FWHM.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
4. Analiza materiałów roślinnych
<ol>
	<li>Analiza liścia kratomu
	<ol>
		<li>Naciśnij "Start Run" w oprogramowaniu sterującym spektrometrem mas. Zawiesić czad materiału roślinnego między źródłem jonów a wlotem spektrometru mas (około 2 cm od wlotu) za pomocą pęsety, aż do uzyskania widma. Powtórz 5 razy z oddzielnymi kawałkami materiału roślinnego.</li>
		<li>Skalibruj widmo za pomocą glikolu polietylenowego 600 (PEG).
		<ol>
			<li>Zanurz zamknięty koniec rurki kapilarnej do pomiaru temperatury topnienia w wzorcu PEG. Zawiesić powlekaną kapilarnę między źródłem jonów a wlotem spektrometru masowego.</li>
		</ol>
		</li>
		<li>Po przeanalizowaniu standardu PEG należy wybrać przycisk "Stop", aby zakończyć przebieg analityczny.</li>
		<li>Naciśnij "Start Run" w oprogramowaniu sterującym spektrometrem mas. Zawiesić niewielką ilość wysuszonego materiału liściowego między źródłem jonów a wlotem spektrometru mas za pomocą pęsety, aż do uzyskania widma. Powtórz 5 razy, za każdym razem analizując nowy materiał roślinny.</li>
		<li>Skalibruj widmo za pomocą PEG.
		<ol>
			<li>Zanurz zamknięty koniec kapilary w standardzie PEG. Zawiesić powlekaną kapilarnę między źródłem jonów a wlotem spektrometru masowego.</li>
		</ol>
		</li>
		<li>Po przeanalizowaniu standardu PEG należy wybrać przycisk "Stop", aby zakończyć przebieg analityczny.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Analiza proszku Kratom
	<ol>
		<li>Naciśnij "Start Run" w oprogramowaniu sterującym spektrometrem mas. Zanurz zamknięty koniec kapilary o temperaturze topnienia w proszku Kratom.</li>
		<li>Zawiesić powlekaną kapilarnę między źródłem jonów a wlotem spektrometru masowego do momentu uzyskania widma. Powtórz analizę 5 razy z nową kapilarą za każdym razem.</li>
		<li>Skalibruj widmo za pomocą PEG.
		<ol>
			<li>Zanurz zamknięty koniec kapilary w standardzie PEG. Zawiesić powlekaną kapilarnę między źródłem jonów a wlotem spektrometru masowego.</li>
		</ol>
		</li>
		<li>Po przeanalizowaniu standardu PEG należy wybrać przycisk "Stop", aby zakończyć przebieg analityczny.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Analiza ekstraktu z kratomu
	<ol>
		<li>Zanurz zamknięty koniec rurki kapilarnej w ekstrakcie.</li>
		<li>Zawiesić rurkę kapilarną w uchwycie na 12 próbek na szynie liniowej przymocowanej do spektrometru mas. Powtórz 5 razy z innym ekstraktem za każdym razem.</li>
		<li>Naciśnij "Start Run" w oprogramowaniu sterującym spektrometrem mas. Korzystając z panelu sterowania, wybierz przycisk ">", aby przesuwać szynę liniową przez strumień jonów z prędkością 1 mm/s w celu zebrania widm.</li>
		<li>Skalibruj widmo za pomocą PEG.
		<ol>
			<li>Zanurz zamknięty koniec kapilary w standardzie PEG. Zawiesić powlekaną kapilarnę między źródłem jonów a wlotem spektrometru masowego.</li>
		</ol>
		</li>
		<li>Po przeanalizowaniu standardu PEG należy wybrać przycisk "Stop", aby zakończyć przebieg analityczny.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Analiza nasion Datura
	<ol>
		<li>Naciśnij "Start Run" w oprogramowaniu sterującym spektrometrem mas. Zawiesić połówkę nasion Datury między źródłem jonów a wlotem spektrometru mas za pomocą pęsety, aż do zebrania widma. Upewnij się, że strona cięcia jest zorientowana w stronę źródła jonów. Powtórz 5 razy, za każdym razem analizując nową połówkę nasion.</li>
		<li>Skalibruj widmo za pomocą PEG.
		<ol>
			<li>Zanurz zamknięty koniec kapilary w standardzie PEG. Zawiesić powlekaną kapilarnę między źródłem jonów a wlotem spektrometru masowego.</li>
		</ol>
		</li>
		<li>Po przeanalizowaniu standardu PEG należy wybrać przycisk "Stop", aby zakończyć przebieg analityczny.</li>
		<li>Powtórzyć kroki 4.4.1–4.4.3 dla każdego gatunku datury.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
5. Przetwarzanie danych
<ol>
	<li>Tłumaczenie plików danych
	<ol>
		<li>W oprogramowaniu do przetwarzania danych wybierz Plik, "Przetłumacz pliki DART" z włączoną "automatyczną kalibracją", aby utworzyć skalibrowane pliki danych.</li>
		<li>Kliknij lewym przyciskiem myszy i przeciągnij ramkę wokół pierwszego piku na chromatogramie i wybierz "Średnia", aby utworzyć uśrednione widmo.</li>
		<li>Kliknij prawym przyciskiem myszy i przeciągnij ramkę wokół obszaru, w którym nie pobrano próbki, a następnie wybierz "Uśrednij całe pole jako tło", aby odjąć tło od uśrednionego spektrum.</li>
		<li>Zapisz widmo masowe jako plik .txt.</li>
		<li>Powtórzyć kroki 5.1.1-5.1.4 dla każdego piku na chromatogramie, aby utworzyć uśrednione widmo dla każdej kontrpróby w pliku.</li>
		<li>Powtórz kroki 5.1.2-5.1.5 dla każdego zebranego pliku.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
6. Analiza statystyczna
<ol>
	<li>Analiza głównych składowych
	<ol>
		<li>W sekcji Klasyfikacja oprogramowania do analizy spektralnej (patrz Lista materiałów), w zakładce "Konfiguracja" utwórz klasy do przetwarzania danych, wybierając opcję "Dodaj klasę".</li>
		<li>Zaimportuj pliki tekstowe z danymi, wybierając opcję "Dodaj plik(i)".</li>
		<li>Przypisz pliki danych do odpowiedniej klasy zakładu, wybierając pliki tekstowe i "Ustaw klasę dla wybranych plików".</li>
		<li>Wybierz masy elementów do dyskryminacji z MS z zestawu treningowego i ustaw próg % na 1%.</li>
		<li>Ustaw tolerancję masy (mmu) na 10 i wybierz opcję "Buduj wektory z plików danych".</li>
		<li>W sekcji "Obliczenia" przeprowadź analizę składowych głównych, zaznaczając pole Wykres 3D PCA i wybierz opcję "Oblicz".</li>
		<li>Wykonaj krzyżową walidację typu leave-one-out, wybierając pozycję "Weryfikuj (WOLNO!"). "</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Generuj mapę cieplną
	<ol>
		<li>Na karcie Wykres częstotliwości w oprogramowaniu do analizy spektralnej wygeneruj mapę cieplną danych, wybierając opcję "Mapa ciepła".</li>
		<li>Wybierz "Próg zapisanych danych", aby ustawić próg obfitości na 1%.</li>
		<li>Wyeksportuj mapę skupień do arkusza kalkulacyjnego, wybierając opcję "Zapisz mapę skupień w programie Excel".</li>
		<li>W programie arkusza kalkulacyjnego zapisz wyeksportowaną mapę skupień jako plik .txt.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Hierarchiczna analiza grupowania
	<ol>
		<li>Zaimportuj mapę skupień jako plik .txt do oprogramowania Cluster 3.0.</li>
		<li>Na karcie hierarchicznej Klastra 3.0, w obszarze Geny i tablice, zaznacz pola "Klaster" i "Oblicz wagi". Ustaw wartość odcięcia na 0,1 i wykładnik na 1. Wybierz grupowanie z pojedynczym połączeniem, aby przeprowadzić analizę.</li>
		<li>Wyświetl wygenerowany plik danych .cdt w widoku drzewa Java.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

<ol><li>Authority, E.F.S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((EFSA+Compendium+of+botanicals+that+have+been+reported+to+contain+toxic%2C+addictive%2C+psychotropic+or+other+substances+of+concern+onrequest+of+EFSA%5BTitle%5D)+AND+%22EFSA+Journal%22%5BJournal%5D)">EFSA Compendium of botanicals that have been reported to contain toxic, addictive, psychotropic or other substances of concern onrequest of EFSA.</a> EFSA Journal. 7, 1-100 (2009).</li>
<li><a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%22The+challenge+of+new+psychoactive+substances%3A+list+of+plant-based+substances+%2820+Substances%29%22">The challenge of new psychoactive substances: list of plant-based substances (20 Substances)</a>. , UNODC. 101-102 (2013).</li>
<li>Kratom (Mitragyna speciosa Korth). , US Drug Enforcement Administration. Available from: 
 <a target="_blank" href="http://www.deadiversion.usdoj.gov/drug_chem_info/kratom.pdf">http://www.deadiversion.usdoj.gov/drug_chem_info/kratom.pdf</a> (2013).</li>
<li>Jimson Weed (Datura stramonium). , US Drug Enforcement Administration. Available from: 
 <a target="_blank" href="http://www.deadiversion.usdoj.gov/drug_chem_info/jimson_w.pdf">http://www.deadiversion.usdoj.gov/drug_chem_info/jimson_w.pdf</a> (2013).</li>
<li>Jansen, K., Prast, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ehtnopharmacology+of+Kratom+and+the+Mitragyna+alkaloids%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Ethnopharmacol%22%5BJournal%5D)">Ehtnopharmacology of Kratom and the Mitragyna alkaloids.</a> J. Ethnopharmacol. 23, 115-119 (1988).</li>
<li>Matsumoto, K. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aMatsumoto%2C+K+%22Pharmacological+Studies+on+7-Hydroxymitragynine%2C+Isolated+from+the+Thai+Herbal+Medicine+Mitragyna+speciosa%3A+Discovery+of+an+Orally+Active+Opioid+Analgesic%22">Pharmacological Studies on 7-Hydroxymitragynine, Isolated from the Thai Herbal Medicine Mitragyna speciosa: Discovery of an Orally Active Opioid Analgesic</a>. , Chiba University. (2006).</li>
<li>Matsumoto, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Involvement+of+%C2%B5-opioid+receptors+in+antinociception+and+inhibition+of+gastrointestinal+transit+induced+by+7-hydroxymitragynine%2C+isolated+from+Thai+herbal+medicine+Mitragyna+speciosa%5BTitle%5D)+AND+%22Eur.+J.+Pharmacol%22%5BJournal%5D)">Involvement of µ-opioid receptors in antinociception and inhibition of gastrointestinal transit induced by 7-hydroxymitragynine, isolated from Thai herbal medicine Mitragyna speciosa.</a> Eur. J. Pharmacol. 549, (2006).</li>
<li>Matsumoto, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Antinociceptive+effect+of+7-hydroxymitragynine+in+mice%3A+Discovery+of+an+orally+active+opioid+analgesic+from+the+Thai+medicinal+herb+Mitragyna+speciosa%5BTitle%5D)+AND+%22Life+Sciences%22%5BJournal%5D)">Antinociceptive effect of 7-hydroxymitragynine in mice: Discovery of an orally active opioid analgesic from the Thai medicinal herb Mitragyna speciosa.</a> Life Sciences. 74, 2143-2155 (2004).</li>
<li>El Bazaoui, A., Stambouli, H., Bellimam, M. A., Soulaymani, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Determination+of+tropane+alkaloids+in+seeds+of+Datura+stramonium+L.+by+GC%2FMS+and+LC%2FMS%5BTitle%5D)+AND+%22Ann.+Toxicol.+Anal%22%5BJournal%5D)">Determination of tropane alkaloids in seeds of Datura stramonium L. by GC/MS and LC/MS.</a> Ann. Toxicol. Anal. 21, 183-188 (2009).</li>
<li>Friedman, M., Levin, C. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Composition+of+Jimson+Weed+%28Datura+stramonium%29+seeds%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Agr.+Food+Chem%22%5BJournal%5D)">Composition of Jimson Weed (Datura stramonium) seeds.</a> J. Agr. Food Chem. 37, 998-1005 (1989).</li>
<li>Philipof, S., Berkhov, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((GC-MS+Investigation+of+tropane+alkaloids+in+Datura+stramonium%5BTitle%5D)+AND+%22Z+Naturforsch%22%5BJournal%5D)">GC-MS Investigation of tropane alkaloids in Datura stramonium.</a> Z Naturforsch. 57, 559-561 (2002).</li>
<li>Preissel, U., Preissel, H. -G. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aPreissel%2C+U+%22Brugmansia+and+Datura%3A+Angel%27s+Trumpets+and+Thorn+Apples%22">Brugmansia and Datura: Angel's Trumpets and Thorn Apples</a>. , Firefly Books. (2002).</li>
<li>Boumba, V. A., Mitselou, A., Vougiouklakis, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fatal+poisoning+from+ingestion+of+Datura+stramonium+seeds%5BTitle%5D)+AND+%22Vet.+Hum.+Toxicol%22%5BJournal%5D)">Fatal poisoning from ingestion of Datura stramonium seeds.</a> Vet. Hum. Toxicol. 46, 81-82 (2004).</li>
<li>Kronstrand, R., Roman, M., Thelander, G., Eriksson, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Unintentional+Fatal+Intoxications+with+Mitragynine+and+O-Desmethyltramadol+from+the+Herbal+Blend+Krypton%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Anal.+Toxicol%22%5BJournal%5D)">Unintentional Fatal Intoxications with Mitragynine and O-Desmethyltramadol from the Herbal Blend Krypton.</a> J. Anal. Toxicol. 35, 242-247 (2011).</li>
<li>Neerman, M., Frost, R., Deking, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+drug+fatality+involving+Kratom%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Forensic+Sci%22%5BJournal%5D)">A drug fatality involving Kratom.</a> J. Forensic Sci. 58, 278-279 (2013).</li>
<li>Steenkamp, P. A., Harding, N. M., Van Heerden, F. R., Van Wyk, B. -E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fatal+Datura+poisoning%3A+Identification+of+atropine+and+scopolamine+by+high+performance+liquid+chromatography+%2F+photodiode+array+%2F+mass+spectrometry%5BTitle%5D)+AND+%22Forensic+Sci.+Int%22%5BJournal%5D)">Fatal Datura poisoning: Identification of atropine and scopolamine by high performance liquid chromatography / photodiode array / mass spectrometry.</a> Forensic Sci. Int. 145, 31-39 (2004).</li>
<li><a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%22Scientific+Working+Group+for+the+Analysis+of+Seized+Drug+Recommendations%22">Scientific Working Group for the Analysis of Seized Drug Recommendations</a>. , Scientific Working Group for the Analysis of Seized Drugs. (2014).</li>
<li>Kikura-Hanajiri, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Simultaneous+analysis+of+mitragynine%2C+7-hydroxymitragynine%2C+and+other+alkaloids+in+the+psychotropic+plant+%22Kratom%22+%28Mitragyna+speciosa%29+by+LC-ESI-MS%5BTitle%5D)+AND+%22Forensic+Toxicol%22%5BJournal%5D)">Simultaneous analysis of mitragynine, 7-hydroxymitragynine, and other alkaloids in the psychotropic plant "Kratom" (Mitragyna speciosa) by LC-ESI-MS.</a> Forensic Toxicol. 27, 67-74 (2009).</li>
<li>Wang, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparison+of+three+chromatographic+techniques+for+the+detection+of+mitragynine+and+other+indole+and+oxindole+alkaloids+in+Mitragyna+speciosa+%28Kratom%29+plants%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Separation+Sci%22%5BJournal%5D)">Comparison of three chromatographic techniques for the detection of mitragynine and other indole and oxindole alkaloids in Mitragyna speciosa (Kratom) plants.</a> J. Separation Sci. , (2014).</li>
<li>Cody, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Observation+of+molecular+ions+and+analysis+of+nonpolar+compounds+with+the+Direct+Analysis+in+Real+Time+ion+source%5BTitle%5D)+AND+%22Anal.+Chem%22%5BJournal%5D)">Observation of molecular ions and analysis of nonpolar compounds with the Direct Analysis in Real Time ion source.</a> Anal. Chem. 81, 1101-1107 (2009).</li>
<li>Cody, R., Laramee, J., Durst, H. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Versatile+new+ion+source+for+the+analysis+of+materials+in+open+air+under+ambient+conditions%5BTitle%5D)+AND+%22Anal.+Chem%22%5BJournal%5D)">Versatile new ion source for the analysis of materials in open air under ambient conditions.</a> Anal. Chem. 77, 2297-2302 (2005).</li>
<li>Musah, R. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+High+Throughput+Ambient+Mass+Spectrometric+Approach+to+Species+Identification+and+Classification+from+Chemical+Fingerprint+Signatures%5BTitle%5D)+AND+%22Sci.+Rep%22%5BJournal%5D)">A High Throughput Ambient Mass Spectrometric Approach to Species Identification and Classification from Chemical Fingerprint Signatures.</a> Sci. Rep. 5, (2015).</li>
<li>Lesiak, A. D., Cody, R. B., Dane, A. J., Musah, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+detection+by+direct+analysis+in+real+time-mass+spectrometry+%28DART-MS%29+of+psychoactive+plant+drugs+of+abuse%3A+The+case+of+Mitragyna+speciosa+aka+%22Kratom%22%5BTitle%5D)+AND+%22Forensic+Sci.+Int%22%5BJournal%5D)">Rapid detection by direct analysis in real time-mass spectrometry (DART-MS) of psychoactive plant drugs of abuse: The case of Mitragyna speciosa aka "Kratom".</a> Forensic Sci. Int. 242, 210-218 (2014).</li>
<li>Lesiak, A. D., Cody, R. B., Dane, A. J., Musah, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Plant+Seed+Species+Identification+from+Chemical+Fingerprints%3A+A+High-Throughput+Application+of+Direct+Analysis+in+Real+Time+Mass+Spectrometry%5BTitle%5D)+AND+%22Anal.+Chem%22%5BJournal%5D)">Plant Seed Species Identification from Chemical Fingerprints: A High-Throughput Application of Direct Analysis in Real Time Mass Spectrometry.</a> Anal. Chem. , (2015).</li>
<li>Espinoza, E. O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Distinguishing+wild+from+cultivated+agarwood+%28Aquilaria+spp.%29+using+direct+analysis+in+real+time+and+time+of-flight+mass+spectrometry%5BTitle%5D)+AND+%22Rapid+Commun.+Mass+Spectrom%22%5BJournal%5D)">Distinguishing wild from cultivated agarwood (Aquilaria spp.) using direct analysis in real time and time of-flight mass spectrometry.</a> Rapid Commun. Mass Spectrom. 28, 281-289 (2014).</li>
<li>Lancaster, C., Espinoza, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evaluating+agarwood+products+for+2-%282-phenylethyl%29chromones+using+direct+analysis+in+real+time+time-of-flight+mass+spectrometry%5BTitle%5D)+AND+%22Rapid+Commun.+Mass+Spectrom%22%5BJournal%5D)">Evaluating agarwood products for 2-(2-phenylethyl)chromones using direct analysis in real time time-of-flight mass spectrometry.</a> Rapid Commun. Mass Spectrom. 26, 2649-2656 (2012).</li>
<li>Sisco, E., Dake, J., Bridge, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((%22Screening+for+trace+explosives+by+AccuTOF%E2%84%A2-DART%C2%AE%3A+An+in-depth+validation+study.%22%5BTitle%5D)+AND+%22Forensic+Sci.+Int%22%5BJournal%5D)">"Screening for trace explosives by AccuTOF™-DART®: An in-depth validation study.".</a> Forensic Sci. Int. 232, 160-168 (2013).</li>
<li>Fernandez, F. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterizatoin+of+solid+counterfeit+drug+samples+by+desorption+electrospray+ionization+and+direct+analysis+in+real+time+coupld+to+time-of-flight+mass+spectrometry%5BTitle%5D)+AND+%22Chem.+Med.+Chem%22%5BJournal%5D)">Characterizatoin of solid counterfeit drug samples by desorption electrospray ionization and direct analysis in real time coupld to time-of-flight mass spectrometry.</a> Chem. Med. Chem. 1, 702-705 (2006).</li>
</ol>

Autorzy nie ujawnili żadnych informacji.

Zdolność do identyfikacji narkotyków pochodzenia roślinnego jest coraz bardziej potrzebna ze względu na dramatyczny wzrost marketingu, sprzedaży i konsumpcji nieplanowanych substancji psychoaktywnych. 2 Tradycyjne metody identyfikacji materiału botanicznego zwykle obejmują charakterystykę cech fizycznych połączoną z analizą składników chemicznych metodami chromatografii i spektrometrii mas z łącznikiem. Oba te podejścia stanowią jednak wyzwanie dla usprawnionej analizy. Cechy fizyczne roślin są często niszczone, gdy rośliny są suszone, proszkowane lub ekstrahowane podczas procesu produkcyjnego i w związku z tym często trudno jest odróżnić jeden rodzaj produktu psychotropowego pochodzenia roślinnego od innego na podstawie samych cech fizycznych. 23 Analiza metodami chromatograficzno-spektrometrycznymi mas może umożliwić identyfikację związków psychoaktywnych w matrycach roślinnych, ale przygotowanie próbki i opracowanie metody jest czasochłonne i zasobochłonne, a tworzenie nowych protokołów dla każdej klasy lub gatunku nadużywanego narkotyku pochodzenia roślinnego jest niepraktyczne w wielu laboratoriach chemii sądowej.
Bezpośrednia analiza w spektrometrii mas o wysokiej rozdzielczości w czasie rzeczywistym pozwala ominąć niektóre z tych wyzwań, ponieważ złożone matryce, takie jak liście, proszki, ekstrakty i nasiona, mogą być analizowane przy niewielkim przygotowaniu próbki. Pomimo złożonych matryc pobranych tu materiałów, składniki psychoaktywne były łatwe do zidentyfikowania, nawet przy stężeniach nanogramów,21 ze względu na wysoką czułość spektrometru masowego. Wykazano, że nasiona, liście i proszki są łatwo analizowane przez bezpośrednią analizę w spektrometrii mas o wysokiej rozdzielczości w czasie rzeczywistym, a w ten sam sposób można również pobierać próbki z wielu innych rodzajów materiałów, w tym płytek TLC, waluty, tabletek, kwiatów, włókien mikroekstrakcji do fazy stałej (SPME), a nawet osłonek pęcherzykowych owadów. 21-22 Dzięki dokładnej analizie masy, określeniu składu pierwiastkowego i dopasowaniu izotopów, można zidentyfikować biomarkery i związki będące przedmiotem zainteresowania, niezależnie od tego, czy związki te są zawarte w liściu, nakrapiane na płytce TLC czy pokryte rurką kapilarną.
Bezpośrednia analiza w metodologii spektrometrii mas o wysokiej rozdzielczości w czasie rzeczywistym może być wykorzystana do usprawnionej analizy, ponieważ istnieje bardzo niewiele parametrów, które muszą być modyfikowane z eksperymentu na eksperyment. Analiza może być przeprowadzana w trybie jonów dodatnich lub jonów ujemnych, a w obu przypadkach można wykryć cząsteczki o wielkości do 3,000 amu. Jonizacja w trybie jonów dodatnich zachodzi przez transfer protonów z aktywowanych klastrów wody,21 a każdy związek o powinowactwie do protonów wyższym niż woda zostanie zjonizowany. Tutaj zastosowano tryb jonów dodatnich ze względu na wysokie powinowactwo protonów alkaloidów, co powoduje, że są one łatwo jonizowane przez protonowanie. Analiza w trybie jonów ujemnych może być wykorzystana do skutecznego wykrywania węglowodorów (jako adduktówO2 )21, materiałów wybuchowych27 i kwasów organicznych, takich jak artesunat, w lekach na malarię. 28 Ze względu na metodę jonizacji transferu protonów i niemożność wytworzenia wielokrotnie naładowanych jonów, bezpośrednia analiza w spektrometrii mas o wysokiej rozdzielczości w czasie rzeczywistym jest ograniczona głównie do analizy małych cząsteczek o mocy do 3000 amu.
Poza trybem jonizacji ważnym parametrem jest temperatura źródła jonów, a odpowiednia temperatura w dużej mierze zależy od analizowanej próbki. Na przykład ważne jest, aby używać niższych temperatur (~250 °C) do analizy włókien SPME, aby zapobiec zniszczeniu materiału powłokowego na włóknie, podczas gdy wyższe temperatury (~500 °C) powinny być używane do analizy aminokwasów w celu desorpcji i późniejszej jonizacji. W tym przypadku przeprowadzono analizy materiału roślinnego w temperaturze 350 °C, ponieważ pozwala to na jonizację alkaloidów i innych interesujących związków bez powodowania pirolizy związków w matrycy roślinnej.
Bezpośrednia analiza w analizie spektrometrii mas o wysokiej rozdzielczości w czasie rzeczywistym nie tylko umożliwia identyfikację składników psychoaktywnych materiału roślinnego w oparciu o dokładne masy, określenie składu pierwiastkowego i dopasowanie izotopów, ale także tworzy unikalne chemiczne odciski palców, które można wykorzystać do identyfikacji gatunków za pomocą wielowymiarowej analizy statystycznej z wysoce powtarzalnymi wynikami, nawet w przypadku mniejszych zbiorów danych. Wielowymiarowa analiza statystyczna została zastosowana do szerokiej gamy bezpośrednich analiz danych spektrometrii mas o wysokiej rozdzielczości w czasie rzeczywistym, w tym danych pochodzących z drewna, osłonek mlecznych, nasion, materiału liściowego i zapasów paliwa biodiesel, co pokazuje wszechstronność i odtwarzalność metody. 22-26 Wysoka przepustowość bezpośredniej analizy w spektrometrii mas o wysokiej rozdzielczości w czasie rzeczywistym umożliwia pozyskiwanie dużych ilości danych widma masowego w krótkim czasie, a przy użyciu tej metody można łatwo uzyskać dużą liczbę powtórzeń potrzebnych do analizy statystycznej. Bezpośrednia analiza w zestawie danych spektrometrii mas spektrometrii mas o wysokiej rozdzielczości w czasie rzeczywistym Datura i Kratom składała się z ponad 100 indywidualnych widm, które zostały zebrane przy całkowitej inwestycji czasu w czasie krótszym niż godzina. Uzyskanie tej samej liczby widm przy użyciu GC-MS z programem temperatury pieca wynoszącym 30 minut zajęłoby około 50 godzin, bez uwzględnienia dodatkowego czasu na etapy przygotowania próbki, takie jak ekstrakcja lub derywatyzacja.
Analiza głównych składowych może być wykorzystana do podkreślenia różnic między zestawami substancji roślinnych w oparciu o obecność i intensywność wybranych mas cech. Przetwarzanie analizy statystycznej zapewnia identyfikację gatunków, a także informacje o odmianach. Inne metody analizy statystycznej, takie jak hierarchiczna analiza skupień (HCA), mogą być również stosowane bez apriorycznego wyboru mas cech. Wyniki HCA kompleksowych chemicznych odcisków palców pokazują, że nienadzorowana analiza statystyczna może być z powodzeniem stosowana do identyfikacji gatunkowej nadużywanych narkotyków pochodzenia roślinnego. 25
Dyskryminację gatunkową materiału botanicznego w kryminalistyce poprzez bezpośrednią analizę w spektrometrii mas o wysokiej rozdzielczości w czasie rzeczywistym wykazano przy użyciu identyfikacji związków psychotropowych i innych biomarkerów w widmach mas miękkojonizacyjnych oraz zastosowaniu wielowymiarowej analizy statystycznej. Zastosowanie dwóch rodzajów analiz statystycznych ujawniło nie tylko, że można zidentyfikować klasę nadużywanego narkotyku pochodzenia roślinnego, ale także, że różnorodność i gatunek tego narkotyku można określić na podstawie unikalnych chemicznych odcisków palców zaobserwowanych w wyniku bezpośredniej analizy w spektrometrii mas o wysokiej rozdzielczości w czasie rzeczywistym. Przedstawiona tutaj metoda umożliwia szybką, wysokoprzepustową identyfikację substancji zmieniających umysł w sposób, który pozwala obejść wyzwania napotykane w konwencjonalnych metodach analitycznych i zapewnia laboratoriom kryminalistycznym środki do charakteryzowania i identyfikacji psychoaktywnego materiału roślinnego bez konieczności opracowywania metod wymagających dużego czasu i zasobów. Protokół ten można rozszerzyć na zróżnicowanie gatunkowe wielu innych materiałów pochodzenia roślinnego. 22-26

Przez tysiąclecia, naturalne produkty psychoaktywne były używane w szamańskich rytuałach, nadużywane ze względu na ich właściwości zmieniające umysł i spożywane ze względu na ich właściwości lecznicze. Spożycie tych roślin i pokrewnych substancji pochodzenia roślinnego może mieć znaczenie na obszarach, na których są one endemiczne, a także mają znaczenie społeczne i gospodarcze. Ostatnio jednak nastąpił dramatyczny wzrost stosowania tych "naturalnych" narkotyków ze względu na łatwość dostępu do nich za pośrednictwem handlu internetowego. Przekonanie, że substancje te są bezpieczne w użyciu, w połączeniu ze zwiększonymi represjami wobec posiadania i używania bardziej tradycyjnych narkotyków i substancji syntetycznych, przyczyniło się do gwałtownego wzrostu nadużywania narkotyków pochodzenia roślinnego. Na ogół trudno jest odróżnić te produkty od nieszkodliwego materiału roślinnego za pomocą wizualizacji, dlatego istnieje zainteresowanie opracowaniem metod, które można zastosować do identyfikacji tych produktów. Jednak konwencjonalne metody analityczne do identyfikacji gatunków roślin są czasochłonne i niepraktyczne do wykonania. Co więcej, proces opracowywania metod jest czasochłonny i zasobożerny. Czynniki te sprawiły, że tworzenie przepisów mających na celu ograniczenie stosowania tych substancji pozostaje daleko w tyle za tempem eskalacji ich nadużywania. W związku z tym istnieje niewiele praw, które regulują produkcję, wytwarzanie, sprzedaż i konsumpcję wielu z tych naturalnych substancji psychoaktywnych, w związku z czym istnieją setki roślin nadużywania dostępnych dla użytkowników w tysiącach różnych form. 1,2
Dwa takie roślinne narkotyki to Mitragyna speciosa, powszechnie znana jako Kratom, oraz rośliny z rodzaju Datura, a mianowicie D. stramonium, D. ferox i D. inoxia. Kratom i Datura są nieplanowane w Stanach Zjednoczonych, ale Drug Enforcement Administration umieścił oba jako leki budzące obawy. 3,4 Kratom charakteryzuje się obecnością związków psychoaktywnych mitragyniny i 7-hydroksymitragyniny, a także innych niepsychoaktywnych alkaloidów, w tym mitrafiliny, paynantheiny, korynokseiny i rynchofiliny. 4-8 Właściwości psychoaktywne Datura spp. przypisuje się atropinie i skopolaminie, ale w roślinach zidentyfikowano wiele innych alkaloidów tropanowych. Zarówno Kratom, jak i Datura były zamieszane w zatrucia i zgony, a ich identyfikacja jest coraz bardziej konieczna zarówno w kontekście sądowym, jak i toksykologicznym, ponieważ nadużywanie tych produktów rośnie. 13-16
Ogólnie rzecz biorąc, tradycyjne metody używane do analizy materiału kryminalistycznego narkotyków, takie jak testy kolorów, mikroskopia oraz spektroskopia Ramana i podczerwieni, są używane w charakterze domniemanego reguły/wykluczenia. Techniki z łącznikami, takie jak GC-MS i chromatografia cieczowa ze spektrometrią mas (LC-MS), są metodami analizy konfirmacyjnej opartymi na porównaniu profili wykrytych analitów ze standardami bibliotecznymi Naukowej Grupy Roboczej ds. Analizy Skonfiskowanych Narkotyków (SWGDRUG). 17 Etapy obróbki próbki, które są wykonywane przed analizą, w tym sproszkowanie, ekstrakcja, derywatyzacja i odparowanie, mogą wydłużyć czas pracy i zafałszować próbkę,9,11,18,19 sprawiając, że analiza leków botanicznych jest mniej niż prosta w porównaniu z innymi tradycyjnymi narkotykami, takimi jak kokaina lub heroina. Co więcej, dla każdego produktu będącego przedmiotem zainteresowania należy opracować indywidualne programy chromatograficzne, co sprawia, że implementacja standardowych protokołów operacyjnych dla każdego gatunku lub odmiany nadużywanego narkotyku roślinnego jest wysoce niepraktyczna w rutynowych badaniach.
Bezpośrednia analiza w spektrometrii mas o wysokiej rozdzielczości w czasie rzeczywistym to technika spektrometrii mas z jonizacją otoczenia, która pozwala obejść niektóre wyzwania związane z konwencjonalnymi metodami analitycznymi. Gazy, ciecze, ciała stałe, proszki, płytki TLC i materiał roślinny mogą być analizowane bezpośrednio za pomocą bezpośredniej analizy w spektrometrii mas o wysokiej rozdzielczości w czasie rzeczywistym, a zarówno związki polarne, jak i niepolarne można łatwo wykryć w złożonych matrycach. 20-22 Ponadto badania wykazały, że związki psychoaktywne można szybko zidentyfikować w materiale roślinnym poprzez bezpośrednią analizę w spektrometrii mas o wysokiej rozdzielczości w czasie rzeczywistym, a informacje dotyczące poszczególnych gatunków można uzyskać dzięki statystycznemu przetwarzaniu danych widma masowego. 22-26
Tutaj pokazujemy, że bezpośrednia analiza w spektrometrii mas o wysokiej rozdzielczości w czasie rzeczywistym może być wykorzystana do szybkiej oceny różnych materiałów roślinnych (np. roślin, proszków, ekstraktów i nasion) pod kątem ich składników psychoaktywnych, oraz że gatunki i odmiany produktów pochodzenia roślinnego mogą być określane w szybki i wysokoprzepustowy sposób. Przedstawiono analizę materiału botanicznego istotnego z punktu widzenia kryminalistyki bez konieczności przeprowadzania etapów przygotowania próbki lub długiego czasu trwania analizy chromatograficznej, a także identyfikację gatunków roślin.

<table><tbody><tr><td>Spektrometr masowy AccuTOF</td><td>JEOL USA, Inc.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>DART-SVP Źródło jonów</td><td>IonSense, Inc.</td>System szyn liniowych <td>DART-SVP</td><td></td></tr><tr><td></td><td>IonSense, Inc.</td><td>HW-10029</td><td></td></tr><tr><td>Dziurkacz (6 mm)</td><td>Swingline</td><td>A7074005</td><td></td></tr><tr><td>Jednolitrowa kompaktowa myjka ultradźwiękowa</td><td>Cole-Palmer</td><td>EQ-08849-00</td><td></td></tr><tr><td>1,5 ml probówki do mikrowirówek Eppendorf</td><td>Fisher Scientific</td><td>02-682-550</td><td></td></tr><tr><td>Wirówka AccuSpin Micro 17R</td><td>Fisher Scientific</td><td>13-100676</td><td></td></tr><tr><td>#9 Żyletka ze stali nierdzewnej</td><td>Stanley</td><td>11-515</td><td></td></tr><tr><td>Uchwyt na końcówkę zanurzeniową</td><td>IonSense, Inc.</td><td>SCT-70003</td><td></td></tr><tr><td>Końcówki do zanurzania</td><td>IonSense, Inc.</td><td>DPT-110</td><td></td></tr><tr><td>Kapilarna temperatura topnienia</td><td>Krackeler Scientific</td><td>1-9530-3</td><td></td></tr><tr><td>Glikol polietylenowy (600)</td> <td>Sigma Aldrich</td><td>81180</td><td></td></tr><tr><td>Rifat Kratom Live Plant World</td><td>Dostawa nasion Kolekcja Kratom</td><td>LIVEKRATOMPLANT</td><td></td></tr><tr><td>Bali Kratom Suszony liść</td><td>Król Kratom</td><td>OZKRAPCOM</td><td></td></tr><tr><td>Bali Kratom w proszku</td><td>Kratom Nasiona King</td><td>OZKRAPCOMPOW</td><td></td></tr><<tr><td>em>Datura stramonium</td><td>Horizon Herbs LLC</td><td>PDATUJ</td><td></td></tr><<tr><td>em>Datura inoxia nasiona</td><td>Horizon Herbs LLC</td><td>PDATUM</td><td></td></tr><tr><td>Datura ferox nasiona</td><td>Georgia Vines</td><td>255/737</td><td></td></tr><tr><td>Etanol, bezwodny</td><td>Krackeler Scientific</td><td>1328-E402-4L</td><td></td></tr><tr><td>Oprogramowanie do analizy spektralnej Mass Mountaineer</td><td>mass-spec-software.com</td><td>MM-20030-PCA-DVD</td><td></td></tr><tr><td>TSSPro3 Oprogramowanie do przetwarzania/redukcji danych</td><td>Shrader Labs</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Cluster 3.0</td><td>http://bonsai.hgc.jp/~mdehoon/software/cluster/software.htm</td><td>Open Source Oprogramowanie</td><td></td></tr><tr><td>Java</td><td>Treeview http://jtreeview.sourceforge.net/</td><td></td> <td>Open Source Oprogramowanie</td></tr></tbody></table>

szybka, wysokoprzepustowa identyfikacja gatunków materiału botanicznego za pomocą bezpośredniej analizy w czasie rzeczywistym spektrometria mas o wysokiej rozdzielczości

Rapid High-throughput Species Identification of Botanical Material Using Direct Analysis in Real Time High Resolution Mass Spectrometry

Pokazujemy, że bezpośrednia analiza w spektrometrii mas o wysokiej rozdzielczości w czasie rzeczywistym może być wykorzystana do tworzenia masowych profili spektralnych materiału botanicznego, i że te chemiczne odciski palców mogą być używane do identyfikacji gatunków roślin. Dane spektralne mas mogą być pozyskiwane szybko i w sposób wysokoprzepustowy bez konieczności ekstrakcji próbki, derywatyzacji lub etapów regulacji pH. Zastosowanie tej techniki pozwala uniknąć wyzwań związanych z bardziej konwencjonalnymi technikami, w tym długiego czasu analizy chromatograficznej i metod wymagających dużej ilości zasobów. Wysoka przepustowość bezpośredniej analizy w protokole spektrometrii mas o wysokiej rozdzielczości w czasie rzeczywistym, w połączeniu z wielowymiarowym przetwarzaniem danych w ramach analizy statystycznej, zapewnia nie tylko charakterystykę klas roślin, ale także informacje o gatunkach i odmianach. W tym przypadku technika ta została zademonstrowana na dwóch psychoaktywnych produktach roślinnych, Mitragyna speciosa (Kratom) i Datura (Jimsonweed), które poddano bezpośredniej analizie w spektrometrii mas o wysokiej rozdzielczości w czasie rzeczywistym, a następnie analizie statystycznej przetwarzania danych widma masowego. Zastosowanie tych narzędzi w połączeniu umożliwiło szybką identyfikację materiałów roślinnych na poziomie różnorodności i gatunków.

Przedstawiono reprezentatywne dane spektrometrii mas wysokiej rozdzielczości z jonizacją miękką w trybie jonów dodatnich metodą analizy w czasie rzeczywistym produktów kratomu oraz nasion Datura, pokazane na ryc. 2 i 3. Wykryto różne związki wyizolowane wcześniej z M. speciosa, w tym mitragyninę (C23H30N2O4 + H+, m/z 399.2284) oraz 7-hydroksymitragyninę (C23H30N2O5 + H+, m/z 415.2233) we wszystkich czterech próbkach; odpowiadające im dane pomiaru masy przedstawiono w tabeli 1.4-8 Przykładowe dane dla Datura pokazano na ryc. 3, a charakterystyczne biomarkery, w tym atropina (C17H23NO3 + H+, m/z 290.1756) i skopolamina (C17H21NO4 + H+, m/z 304.1549), wykryto w trzech gatunkach. Dane pomiaru masy powiązane z ryc. 3 przedstawiono w tabeli 2.9-12 Tożsamość związków potwierdzono poprzez określenie składu elementarnego, dopasowanie izotopów oraz porównania z danymi literaturowymi.23-24
Wyniki analizy bezpośredniej w czasie rzeczywistym – spektrometria mas wysokiej rozdzielczości substancji Kratom i Datura przedstawiono na Rycina 4. Przedstawione dane zostały wykorzystane w analizie głównych składowych (PCA) w celu różnicowania między dwoma klasami roślinnych środków odurzającychRycina 5). Wykres PCA został skonstruowany przy użyciu dziesięciu mas charakterystycznych (wymienionych w Tabela 3), gdzie niebieskie kółka reprezentują dane dotyczące Kratom, a czerwone kwadraty Datura danych. Wybrane masy charakterystyczne odpowiadały różnym alkaloidom obecnym w Datura lub Mitragyna spp., w tym związki psychoaktywne: atropinę, skopolaminę, mitragyninę i 7-hydroksymitragyninę.23-24 Trzy główne składowe wyjaśniały 75,26% wariancji, a walidacja krzyżowa z pominięciem pojedynczych obserwacji (LOOCV) wyniosła 100%. Wykres PCA wyraźnie pokazuje, że dane dotyczące Kratom i Datura dane są dobrze od siebie rozdzielone. Analiza PCA ujawniła również indywidualne odmiany kratomu oraz różne gatunki Datura mogły być identyfikowane i odróżniane od siebie (Rysunek 6). Walidacja krzyżowa metodą „jeden pomijany” wyniosła 94,29% przy trzech głównych składowych objaśniających 75,26% wariancji. Oba odmiany Kratom (Bali w niebieskich okręgach i Rifat w czerwonych kwadratach) grupują się razem, co wskazuje na przynależność do tego samego gatunku M. speciosa, ale są od siebie odrębne, co pokazuje, że reprezentują różne odmiany. Ponadto Datura gatunki pogrupowane razem i oddzielone od pozostałych M. speciosa dane, ale każdy z osobnych gatunków Datura (D. inoxia w zielonych trójkątach D. stramonium w różowych kwadratach i D. ferox w turkusowe okręgi) są wyraźnie zróżnicowane. Pomimo punktu danych dla D. stramonium wydawałoby się być wartością odstającą, nasienie jest poprawnie klasyfikowane jako D. stramonium i nie D. inoxia wykorzystując PCA. Najważniejsze jest różnice w kolorze nasion między D. stramonium i D. inoxia potwierdza, że są to różne gatunki i że badany punkt danych nie może być D. inoxia.
Klasteryzacja hierarchiczna (Rycina 7) przeprowadzono bez wcześniejszego doboru mas cech. Zamiast tego wykorzystano pełen zestaw danych spektralnych obejmujących zakres mas m/z 60-800 został zaimportowany do otwartego oprogramowania do klasteryzacji genomowej, a następnie wygenerowano dendrogram zawierający te dane. Wyniki analizy HCA ujawniły również różnicowanie na poziomie klas, gatunków i odmian wyłącznie na podstawie bezpośredniej analizy danych pochodzących z wysokorozdzielczej spektrometrii mas w czasie rzeczywistym, potwierdzając wyniki analizy PCA. Dwie klasy roślinnych środków odurzających, Kratom i Daturazostały rozdzielone na oddzielne klady dendrogramu. Ponadto odmiany Kratom Rifat i Bali zostały wyodrębnione do osobnych podkladów w obrębie klasy Kratom. Podobnie D. inoxia, D. ferox i D. stramonium zostały rozdzielone na własne klady według gatunków w obrębu Datura klasa.
<img alt="Rysunek 1" src="/files/ftp_upload/54197/54197fig1.jpg" /> 
Rycina 1. Obrazy M. speciosa produkty (kratomu) oraz Datura spp. nasiona a: Bali Kratom suszone liście; b: Bali Kratom, proszek c: Żywa roślina Rifat Kratom; d: D. stramonium nasiona; e: D. inoxia nasiona; f: D. ferox nasiona <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54197/54197fig1large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić większą wersję tego rysunku.</a>
<img alt="Rycina 2" src="/files/ftp_upload/54197/54197fig2.jpg" /> 
Rycina 2. Bezpośrednia analiza w czasie rzeczywistym&#160;czas-wysoki&#160;spektrometria mas z rozdzielczością, widma w jonizacji w fazie dodatniej M. speciosa produkty (kratom) a: świeże liście Rifat; b: Bali suszone liście; c: proszek Bali; d: wyciąg w postaci proszku z Bali. Dane pomiaru masy powiązane z tymi widmami przedstawiono w Tabela 1. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54197/54197fig2large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić większą wersję tego rysunku.</a>
<img alt="Rycina 3" src="/files/ftp_upload/54197/54197fig3.jpg" /> 
Rysunek 3. Analiza bezpośrednia w rzeczywisty&#160;czas-wysoki&#160;rozdzielczość&#160;spektrometria mas, widma jonów dodatnich Datura nasiona gatunków spp. a: D. ferox; b: D. inoxia; c: D. stramonium Dane pomiarowe masy powiązane z tymi widmami przedstawiono w Tabela 2. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54197/54197fig3large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić większą wersję tego rysunku.</a>
<img alt="Rycina 4" src="/files/ftp_upload/54197/54197fig4.jpg" /> 
Rycina 4. Mapy cieplne widm analizy w czasie rzeczywistym z użyciem spektrometrii mas wysokiej rozdzielczości materiałów roślinnych Kratom i Datura. Piki o dużej intensywności przedstawione są ciemnoczerwonym kolorem, a piki o niższej intensywności – jaśniejszymi odcieniami. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54197/54197fig4large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić większą wersję tego rysunku.</a>
<img alt="Rycina 5" src="/files/ftp_upload/54197/54197fig5.jpg" /> 
Rycina 5. Wykres analizy składowych głównych (PCA) produktów z kradu i Datura, wykonany na podstawie danych pochodzących z bezpośredniej analizy w warunkach rzeczywistego czasu i wysokorozdzielczej spektrometrii mas. Trzy główne składowe (PC) wyjaśniały 75,26% zmienności, a walidacja krzyżowa metodą „zostaw jedno” (LOOCV) wyniosła 100%. Masy cech wykorzystane do analizy PCA zamieszczono w tabeli 3. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54197/54197fig5large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.</a>
<img alt="Rycina 6" src="/files/ftp_upload/54197/54197fig6.jpg" /> 
Rycina 6. Wykres analizy składowych głównych (PCA) produktów Kratom i Datura na podstawie danych uzyskanych metodą bezpośredniej analizy w czasie rzeczywistym z użyciem spektrometrii mas wysokiej rozdzielczości. Przyporządkowanie klas oparto na odmianie (Kratom) lub gatunku (Datura) materiału roślinnego. Trzy główne składowe (PC) wyjaśniały 75,26% zmienności, a walidacja krzyżowa metodą „zostaw jedno” (LOOCV) wyniosła 94,29%. Masy cech wykorzystane do analizy PCA podano w Tabeli 3. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54197/54197fig6large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.</a>
<img alt="Rycina 7" src="/files/ftp_upload/54197/54197fig7.jpg" /> 
Rycina 7. Wyniki grupowania hierarchicznego uzyskane przy użyciu danych pochodzących z analizy w czasie rzeczywistym z wysoką rozdzielczością spektrometrii masowej z analizy materiału roślinnego Kratom i Datura. Dwie klasy roślin są wyraźnie podzielone na dwa oddzielne odnogi na dendrogramie (pokazane odpowiednio w niebieskich i czerwonych nawiasach dla Kratom i Datura). Gatunki nasion Datura są również od siebie rozróżnialne (pokazane w zielonych, turkusowych i różowych przerywanych ramkach odpowiednio dla D. inoxia, D. ferox i D. stramonium). Materiały roślinne Kratom są podzielone według odmiany (pokazane w czerwonych i niebieskich przerywanych ramkach odpowiednio dla Rifat i Bali). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54197/54197fig7large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić większą wersję tego rysunku.</a>
<img alt="Tabela 1" src="/files/ftp_upload/54197/54197tbl1.jpg" /> 
Tabela 1. Dane pomiaru masy związane ze spektrami miękkiej jonizacji produktów Kratom przedstawionymi na rysunku 2. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54197/54197tbl1large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić większą wersję tej tabeli.</a>
<img alt="Tabela 2" src="/files/ftp_upload/54197/54197tbl2.jpg" /> 
Tabela 2. Dane pomiaru masy powiązane ze spektrami miękkiej jonizacji nasion Datura przedstawionymi na ryc. 3. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54197/54197tbl2large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić większą wersję tej tabeli.</a>
<img alt="Tabela 3" src="/files/ftp_upload/54197/54197tbl3.jpg" /> 
Tabela 3. Masy cech wykorzystane w analizie głównych składowych wykresu produktów kratek i Datura pokazanych na rysunek 5 i 6.

Przedstawiono metodę identyfikacji gatunków materiału botanicznego poprzez bezpośrednią analizę w czasie rzeczywistym - spektrometria mas o wysokiej rozdzielczości i wielowymiarowa analiza statystyczna.

Szybka, wysokoprzepustowa identyfikacja gatunków materiału botanicznego za pomocą bezpośredniej analizy w czasie rzeczywistym Spektrometria mas o wysokiej rozdzielczości

We demonstrate that direct analysis in real time-high resolution mass spectrometry can be used to produce mass spectral profiles of botanical material, ...

Ogólnym celem niniejszego eksperymentu jest identyfikacja gatunków materiału botanicznego przy użyciu spektrometrii mas z jonizacją w fazie otoczenia, w połączeniu z wielowymiarową analizą statystyczną. Metoda ta może pomóc w uzyskaniu odpowiedzi na kluczowe pytania z zakresu chemii i biologii, na przykład w kwestii określenia gatunku rośliny na podstawie jej profilu chemicznego.Można również uzyskać informacje o cząsteczkach bioaktywnych znajdujących się w tkance roślinnej. Główną zaletą tej techniki jest to, że analiza wymaga minimalnego przygotowania próbek, a dane można pozyskać w ciągu kilku minut. Metoda ta może być również wykorzystywana do rozwiązywania innych problemów w dziedzinie chemii.Na przykład do śledzenia produktów i produktów pośrednich reakcji w syntezie organicznej, analizy złożonych macierzy różnych typów oraz analizy headspace. Aby przygotować świeży materiał z liści kratom, należy użyć dziurkacza o średnicy sześciu milimetrów, aby stworzyć jednorodne wycinki z liści rośliny M.speciosa. Powtórz ten proces pięć razy.Aby wyekstrahować proszek z kratom, należy pracować w probówce do mikrowirówki o pojemności 1,5 ml i zawiesić niewielką ilość proszku kratom Bali w 1 ml mieszaniny rozpuszczalnika etanolu i wody w stosunku jeden do jednego. Powtórz ten proces pięciokrotnie. Próbki ekstraktu z proszku kratom Bali poddaj sonikacji w kąpieli ultradźwiękowej przez 30 minut w temperaturze pokojowej.Następnie próbki ekstraktu z proszku kratom Bali należy wirować przez dwie minuty przy 750 ×g w temperaturze otoczenia. Odlać rozpuszczalnik od pozostałego proszku do dalszej analizy. Aby przygotować nasiona bielunia, przekroić nasiono D.stramonium na pół w płaszczyźnie poprzecznej za pomocą żyletki.Powtórz ten proces, używając pięciu różnych ziarn. Po ustawieniu parametrów spektrometru masowego (MS) zgodnie z opisem w protokole tekstowym, naciśnij Start Run w oprogramowaniu sterującym spektrometrem masowym, aby przeanalizować liść kratom. Za pomocą pęsety zawieś pozostałości roślinnego materiału z liści kratom pomiędzy źródłem jonów a wlotem spektrometru masowego, aż do uzyskania widma.Powtórz tę procedurę pięć razy, używając oddzielnych wycinków materiału roślinnego. Aby skalibrować widmo za pomocą glikolu polietylenowego 600 (w skrócie PEG), zanurz zamknięty koniec kapilary do pomiaru temperatury topnienia w standardzie PEG. Zawieś pokrytą kapilarę pomiędzy źródłem jonów a wlotem spektrometru mas.Wybierz przycisk Stop, aby zakończyć bieg analityczny. Naciśnij Start Run w oprogramowaniu sterującym spektrometrem mas, aby przeanalizować wysuszone liście kratomu. Za pomocą pęsety zawieś niewielką ilość materiału z wysuszonych liści między źródłem jonów a wlotem spektrometru mas, aż do uzyskania widma.Powtórz pomiar pięciokrotnie, analizując za każdym razem nowy materiał roślinny. Przeskaluj widmo za pomocą PEG, tak jak wcześniej, a następnie naciśnij przycisk Stop, aby zakończyć przebieg analityczny. Aby przeanalizować proszek kratom, naciśnij Start Run w oprogramowaniu sterującym spektrometrem mas.Zanurz zamknięty koniec kapilary do pomiaru temperatury topnienia w proszku kratom. Zawieś pokrytą kapilarę pomiędzy źródłem jonów a wlotem spektrometru mas, aż do uzyskania widma. Powtórz analizę pięć razy, używając za każdym razem nowej kapilary, a następnie przeprowadź kalibrację za pomocą PEG.Aby przeanalizować ekstrakt z kratomu, zanurz koniec kapilary w ekstrakcie. Umieść kapilarę w uchwycie na 12 próbek na szynie liniowej spektrometru mas. Powtórz czynność pięciokrotnie, za każdym razem używając innego ekstraktu.Naciśnij Start Run w oprogramowaniu sterującym spektrometrem mas. Za pomocą panelu sterowania wybierz przycisk przesuwu do przodu, aby przesuwać szynę liniową przez strumień jonów z prędkością 1 mm/s w celu zebrania widm. Skalibruj widmo za pomocą PEG, tak jak wcześniej, a następnie naciśnij Stop, aby zakończyć pomiar analityczny.Aby przeanalizować nasiona bielunia, należy nacisnąć Start Run w oprogramowaniu sterującym spektrometrem mas. Za pomocą pęsety należy zawiesić połówkę nasiona bielunia pomiędzy źródłem jonów a wlotem spektrometru mas do momentu zebrania widma. Należy upewnić się, że strona przecięta jest skierowana w stronę źródła jonów.Powtórz tę procedurę pięciokrotnie, analizując za każdym razem nową połówkę nasiona. Zakończ analizę kalibracją PEG i naciśnij Stop, aby zakończyć pomiar analityczny. Po przeprowadzeniu przetwarzania danych zgodnie z opisem w protokole tekstowym, wykonaj analizę głównych składowych, przechodząc do sekcji Classify oprogramowania do analizy widm w karcie Setup i tworząc klasy do przetwarzania danych poprzez wybranie opcji Add Class.Zaimportuj pliki tekstowe z danymi, wybierając opcję Add Files. Przypisz pliki danych do odpowiedniej klasy roślin, wybierając Text Files, a następnie Set Class for Selected Files. Wybierz masy cech do dyskryminacji z MS z zestawu treningowego i ustaw wartość threshold percent na 1%. Następnie ustaw tolerancję masy na 10 i wybierz Build Vectors from Data Files.W sekcji Compute przeprowadź analizę głównych składowych, zaznaczając pole 3D PCA Graph, a następnie wybierz Calculate. Przeprowadź walidację krzyżową z pominięciem jednego elementu (leave-one-out cross validation), wybierając Validate. Następnie wygeneruj mapę ciepła danych, przechodząc do karty Frequency Plot oprogramowania do analizy widmowej i wybierając Heat Map.Wybierz opcję Threshold saved data, aby ustawić próg obfitości na 1%. Wyeksportuj mapę ciepła do arkusza kalkulacyjnego, wybierając Save Heat Map to Excel. W programie do arkuszy kalkulacyjnych zapisz wyeksportowaną mapę ciepła jako plik tekstowy. Następnie, aby przeprowadzić analizę klasteryzacji hierarchicznej, zaimportuj mapę ciepła jako plik tekstowy do oprogramowania Cluster 3.0.W zakładce Hierarchical programu Cluster 3.0, w sekcji Genes and Arrays, zaznacz pola Cluster oraz Calculate weights. Ustaw wartość odcięcia (cutoff) na 0,1, a wykładnik (exponent) na jeden. Do przeprowadzenia analizy wybierz metodę klasteryzacji pojedynczego wiązania (single linkage clustering).Na koniec wyświetl wygenerowany plik danych cdt w widoku drzewa Java. Przedstawiono tutaj reprezentatywne widma produktów kratomu uzyskane w trybie jonów dodatnich podczas miękkiej jonizacji. Zidentyfikowano związki wcześniej wyizolowane z M.speciosa.W tym zestawieniu uwzględniono psychoaktywne biomarkery: mitragyninę oraz 7-hydroksymitragyninę. Przedstawiono reprezentatywne spektra nasion bielunia uzyskane metodą miękkiej jonizacji w trybie jonów dodatnich. Zidentyfikowano związki wcześniej wyizolowane z bielunia, w tym psychoaktywne biomarkery: atropinę i skopolaminę.Tutaj przedstawiono wizualizacje w formie map ciepła danych z spektrometrii mas. Pokazano wykres analizy głównych składowych (PCA) dla danych dotyczących kratomu i datury. Wykres PCA wyraźnie pokazuje, że dane dotyczące kratomu i datury są od siebie dobrze odseparowane.Analiza PCA wykazała również, że poszczególne odmiany kratom oraz różne gatunki datury można zidentyfikować i odróżnić od siebie. Przedstawiono wyniki hierarchicznej analizy skupień (HCA) dla danych spektrometrii mas kratomu i datury. Wyniki HCA ujawniły różnicowanie klas, gatunków i odmian wyłącznie na podstawie danych pochodzących z bezpośredniej analizy w czasie rzeczywistym przy użyciu wysokorozdzielczej spektrometrii mas i potwierdziły wyniki analizy PCA.Po opanowaniu tej techniki, przy prawidłowym wykonaniu, można ją przeprowadzić w czasie krótszym niż godzina, w zależności od liczby próbek. Po obejrzeniu tego filmu powinni Państwo posiadać dobrą wiedzę na temat wykorzystania bezpośredniej analizy oraz spektrometrii mas w czasie rzeczywistym do analizy złożonych próbek, a także stosowania statystycznego przetwarzania danych w celu uzyskania informacji o gatunkach. Podczas wykonywania tej procedury ważne jest utrzymywanie próbki w strumieniu jonów przez odpowiedni czas, aby uzyskać pełne widmo masowe próbki.Technika ta pozwoliła badaczom z wielu dziedzin, w tym z zakresu omiki roślin, kryminalistyki oraz chemii organicznej i analitycznej, na badanie analizy substancji lotnych emitowanych przez rośliny, identyfikację legalnych alternatyw dla narkotyków oraz monitorowanie produktów reakcji w czasie rzeczywistym.

rapid-high-throughput-species-identification-botanical-material-using

Research

JoVE Journal

Chemistry

Chemia

Profilowanie metabolitów nieukierunkowanych za pomocą ultra wydajnej chromatografii cieczowej w połączeniu ze spektrometrią mas (UPLC-MS) jest potężną techniką badania metabolizmu.  W tym artykule przedstawiono typowy przepływ pracy wykorzystywany do nieukierunkowanego profilowania metabolitów w surowicy, w tym organizację i przygotowanie próbki, pozyskiwanie danych, analizę danych, kontrolę jakości i identyfikację metabolitów.

Wielkoskalowe, nieukierunkowane profilowanie metabolomiczne surowicy za pomocą ultrasprawnej chromatografii cieczowej ze spektrometrią mas (UPLC-MS)

Zastosowanie spektrometrii mas (MS) z laserową desorpcją/jonizacją (MALDI-TOF) bezpośrednio do bulionu z hodowli krwi przyspiesza identyfikację bakterii. Przedstawiona metoda jest szybką i wiarygodną metodą identyfikacji bakterii Gram-ujemnych bezpośrednio z bulionu z posiewów krwi.

Szybka identyfikacja bakterii Gram-ujemnych w bulionie z posiewu krwi przy użyciu spektrometrii mas MALDI-TOF

Struktura ściany komórkowej roślin i cechy chemiczne są oceniane w celu zidentyfikowania idealnych surowców do produkcji biopaliw i biomateriałów. Standardowe metody mają ograniczenia, gdy są stosowane do dużych zestawów danych. Te wysokoprzepustowe metody obróbki wstępnej, scukrzania enzymatycznego i pirolizy ze spektrometrią mas wiązki molekularnej porównują dużą liczbę próbek biomasy przy skróconym czasie i kosztach eksperymentu.

Wysokoprzepustowe badania przesiewowe zmian oporności biomasy lignocelulozowej: lignina całkowita, monomery ligniny i enzymatyczne uwalnianie cukru

Czas reakcji transferu protonów w locie Spektrometria mas umożliwia bardzo czułą, szybką i nieinwazyjną analizę lotnych związków organicznych. Aby pokazać jej potencjał, podajemy trzy przykłady: fermentację mlekową jogurtu (monitorowanie bioprocesów on-line), różne genotypy jabłek (badania przesiewowe na dużą skalę) oraz przestrzeń zanosową po wypiciu kawy (analiza przestrzeni nosowej).

PTR-ToF-MS w połączeniu ze zautomatyzowanym systemem pobierania próbek i dostosowaną analizą danych do badań żywności: monitorowanie bioprocesów, badania przesiewowe i analiza przestrzeni nosowej

Spektrometria mas w sprayu z liści to technika bezpośredniej analizy chemicznej, która minimalizuje przygotowanie próbki i eliminuje chromatografię, pozwalając na szybkie wykrywanie małych cząsteczek z tkanek roślinnych.

Spektrometria mas oprysków liściowych: technika szybkiej jonizacji otoczenia do bezpośredniej oceny metabolitów z tkanek roślinnych

Ten protokół opisuje pojedynczą przepustowość dla uzupełniających technik analitycznych i omicznych, której kulminacją jest w pełni sparowana charakterystyka naturalnej materii organicznej i proteomiki mikrobiologicznej w różnych ekosystemach. Podejście to pozwala na solidne porównania w celu identyfikacji szlaków i przemian metabolicznych ważnych dla opisu produkcji gazów cieplarnianych i przewidywania reakcji na zmiany środowiskowe.

Jednoprzepustowe komplementarne techniki analityczne o wysokiej rozdzielczości do charakteryzowania złożonych mieszanin naturalnej materii organicznej

Prezentowany tutaj jest protokół do terenowej identyfikacji Matricaria chamomilla za pomocą przenośnego systemu qPCR. Ten łatwy do wykonania protokół jest idealny jako metoda potwierdzania tożsamości gatunku botanicznego w miejscach, w których dostęp do sprzętu laboratoryjnego i wiedzy specjalistycznej jest ograniczony, takich jak gospodarstwa rolne i magazyny.

Identyfikacja terenowa Matricaria chamomilla za pomocą przenośnego systemu qPCR

Szybka multidyscyplinarna strategia wczesnego wykrywania zakwitów sinic i związanych z nimi cyjanotoksyn jest opisana tutaj. Pozwala na wykrycie cyjanobakterii i pokrewnych sinic w próbkach wody oraz w matrycach organicznych, takich jak próbki małży, w ciągu 24 godzin.

Wczesne wykrywanie zakwitów sinic i związanych z nimi cyjanotoksyn przy użyciu strategii szybkiego wykrywania

Opisujemy ogólny protokół, który integruje analizę spektrometrii mas o wysokiej rozdzielczości i dokowanie molekularne w badaniach tradycyjnej medycyny chińskiej.

Tandemowa spektrometria mas o wysokiej rozdzielczości do badania składników chemicznych Gynura bicolor DC

Prezentujemy metodę szybkiej spektrometrii mas (MS)/spektrometrii mas (MS) opartej na adnotacji i klasyfikacji alkaloidów tropanowych, przydatną zarówno do wstępnej dereplikacji próbek zawierających tropan jak i odkrywania nowych alkaloidów do izolacji.

Zastosowania tandemowej spektrometrii mas chromatografii cieczowej w badaniach nad produktami naturalnymi: alkaloidy tropanowe jako studium przypadku

Poznaj szybką identyfikację gatunków roślin za pomocą spektrometrii masowej DART-HRMS z analizą wielowymiarową. Ta metoda umożliwia badanie odcisków chemicznych i bioaktywnych związków w tkankach roślinnych.

Szybka, wysokoprzepustowa identyfikacja gatunków materiału botanicznego za pomocą bezpośredniej analizy w czasie rzeczywistym Spektrometria mas o wysokiej rozdzielczości (Wideo) | JoVE Journal

Szybka, wysokoprzepustowa identyfikacja gatunków materiału botanicznego za pomocą bezpośredniej analizy w czasie rzeczywistym Spektrometria mas o wysokiej rozdzielczości

Przeglądaj więcej filmów