Szybka, wysokoprzepustowa identyfikacja gatunków materiału botanicznego za pomocą bezpośredniej analizy w czasie rzeczywistym Spektrometria mas o wysokiej rozdzielczości

Ogólnym celem niniejszego eksperymentu jest identyfikacja gatunków materiału botanicznego przy użyciu spektrometrii mas z jonizacją w fazie otoczenia, w połączeniu z wielowymiarową analizą statystyczną. Metoda ta może pomóc w uzyskaniu odpowiedzi na kluczowe pytania z zakresu chemii i biologii, na przykład w kwestii określenia gatunku rośliny na podstawie jej profilu chemicznego.

Można również uzyskać informacje o cząsteczkach bioaktywnych znajdujących się w tkance roślinnej. Główną zaletą tej techniki jest to, że analiza wymaga minimalnego przygotowania próbek, a dane można pozyskać w ciągu kilku minut. Metoda ta może być również wykorzystywana do rozwiązywania innych problemów w dziedzinie chemii.

Na przykład do śledzenia produktów i produktów pośrednich reakcji w syntezie organicznej, analizy złożonych macierzy różnych typów oraz analizy headspace. Aby przygotować świeży materiał z liści kratom, należy użyć dziurkacza o średnicy sześciu milimetrów, aby stworzyć jednorodne wycinki z liści rośliny M.speciosa. Powtórz ten proces pięć razy.

Aby wyekstrahować proszek z kratom, należy pracować w probówce do mikrowirówki o pojemności 1,5 ml i zawiesić niewielką ilość proszku kratom Bali w 1 ml mieszaniny rozpuszczalnika etanolu i wody w stosunku jeden do jednego. Powtórz ten proces pięciokrotnie. Próbki ekstraktu z proszku kratom Bali poddaj sonikacji w kąpieli ultradźwiękowej przez 30 minut w temperaturze pokojowej.

Następnie próbki ekstraktu z proszku kratom Bali należy wirować przez dwie minuty przy 750 ×g w temperaturze otoczenia. Odlać rozpuszczalnik od pozostałego proszku do dalszej analizy. Aby przygotować nasiona bielunia, przekroić nasiono D.stramonium na pół w płaszczyźnie poprzecznej za pomocą żyletki.

Powtórz ten proces, używając pięciu różnych ziarn. Po ustawieniu parametrów spektrometru masowego (MS) zgodnie z opisem w protokole tekstowym, naciśnij Start Run w oprogramowaniu sterującym spektrometrem masowym, aby przeanalizować liść kratom. Za pomocą pęsety zawieś pozostałości roślinnego materiału z liści kratom pomiędzy źródłem jonów a wlotem spektrometru masowego, aż do uzyskania widma.

Powtórz tę procedurę pięć razy, używając oddzielnych wycinków materiału roślinnego. Aby skalibrować widmo za pomocą glikolu polietylenowego 600 (w skrócie PEG), zanurz zamknięty koniec kapilary do pomiaru temperatury topnienia w standardzie PEG. Zawieś pokrytą kapilarę pomiędzy źródłem jonów a wlotem spektrometru mas.

Wybierz przycisk Stop, aby zakończyć bieg analityczny. Naciśnij Start Run w oprogramowaniu sterującym spektrometrem mas, aby przeanalizować wysuszone liście kratomu. Za pomocą pęsety zawieś niewielką ilość materiału z wysuszonych liści między źródłem jonów a wlotem spektrometru mas, aż do uzyskania widma.

Powtórz pomiar pięciokrotnie, analizując za każdym razem nowy materiał roślinny. Przeskaluj widmo za pomocą PEG, tak jak wcześniej, a następnie naciśnij przycisk Stop, aby zakończyć przebieg analityczny. Aby przeanalizować proszek kratom, naciśnij Start Run w oprogramowaniu sterującym spektrometrem mas.

Zanurz zamknięty koniec kapilary do pomiaru temperatury topnienia w proszku kratom. Zawieś pokrytą kapilarę pomiędzy źródłem jonów a wlotem spektrometru mas, aż do uzyskania widma. Powtórz analizę pięć razy, używając za każdym razem nowej kapilary, a następnie przeprowadź kalibrację za pomocą PEG.

Aby przeanalizować ekstrakt z kratomu, zanurz koniec kapilary w ekstrakcie. Umieść kapilarę w uchwycie na 12 próbek na szynie liniowej spektrometru mas. Powtórz czynność pięciokrotnie, za każdym razem używając innego ekstraktu.

Naciśnij Start Run w oprogramowaniu sterującym spektrometrem mas. Za pomocą panelu sterowania wybierz przycisk przesuwu do przodu, aby przesuwać szynę liniową przez strumień jonów z prędkością 1 mm/s w celu zebrania widm. Skalibruj widmo za pomocą PEG, tak jak wcześniej, a następnie naciśnij Stop, aby zakończyć pomiar analityczny.

Aby przeanalizować nasiona bielunia, należy nacisnąć Start Run w oprogramowaniu sterującym spektrometrem mas. Za pomocą pęsety należy zawiesić połówkę nasiona bielunia pomiędzy źródłem jonów a wlotem spektrometru mas do momentu zebrania widma. Należy upewnić się, że strona przecięta jest skierowana w stronę źródła jonów.

Powtórz tę procedurę pięciokrotnie, analizując za każdym razem nową połówkę nasiona. Zakończ analizę kalibracją PEG i naciśnij Stop, aby zakończyć pomiar analityczny. Po przeprowadzeniu przetwarzania danych zgodnie z opisem w protokole tekstowym, wykonaj analizę głównych składowych, przechodząc do sekcji Classify oprogramowania do analizy widm w karcie Setup i tworząc klasy do przetwarzania danych poprzez wybranie opcji Add Class.

Zaimportuj pliki tekstowe z danymi, wybierając opcję Add Files. Przypisz pliki danych do odpowiedniej klasy roślin, wybierając Text Files, a następnie Set Class for Selected Files. Wybierz masy cech do dyskryminacji z MS z zestawu treningowego i ustaw wartość threshold percent na 1%. Następnie ustaw tolerancję masy na 10 i wybierz Build Vectors from Data Files.

W sekcji Compute przeprowadź analizę głównych składowych, zaznaczając pole 3D PCA Graph, a następnie wybierz Calculate. Przeprowadź walidację krzyżową z pominięciem jednego elementu (leave-one-out cross validation), wybierając Validate. Następnie wygeneruj mapę ciepła danych, przechodząc do karty Frequency Plot oprogramowania do analizy widmowej i wybierając Heat Map.

Wybierz opcję Threshold saved data, aby ustawić próg obfitości na 1%. Wyeksportuj mapę ciepła do arkusza kalkulacyjnego, wybierając Save Heat Map to Excel. W programie do arkuszy kalkulacyjnych zapisz wyeksportowaną mapę ciepła jako plik tekstowy. Następnie, aby przeprowadzić analizę klasteryzacji hierarchicznej, zaimportuj mapę ciepła jako plik tekstowy do oprogramowania Cluster 3.0.

W zakładce Hierarchical programu Cluster 3.0, w sekcji Genes and Arrays, zaznacz pola Cluster oraz Calculate weights. Ustaw wartość odcięcia (cutoff) na 0,1, a wykładnik (exponent) na jeden. Do przeprowadzenia analizy wybierz metodę klasteryzacji pojedynczego wiązania (single linkage clustering).

Na koniec wyświetl wygenerowany plik danych cdt w widoku drzewa Java. Przedstawiono tutaj reprezentatywne widma produktów kratomu uzyskane w trybie jonów dodatnich podczas miękkiej jonizacji. Zidentyfikowano związki wcześniej wyizolowane z M.speciosa.

W tym zestawieniu uwzględniono psychoaktywne biomarkery: mitragyninę oraz 7-hydroksymitragyninę. Przedstawiono reprezentatywne spektra nasion bielunia uzyskane metodą miękkiej jonizacji w trybie jonów dodatnich. Zidentyfikowano związki wcześniej wyizolowane z bielunia, w tym psychoaktywne biomarkery: atropinę i skopolaminę.

Tutaj przedstawiono wizualizacje w formie map ciepła danych z spektrometrii mas. Pokazano wykres analizy głównych składowych (PCA) dla danych dotyczących kratomu i datury. Wykres PCA wyraźnie pokazuje, że dane dotyczące kratomu i datury są od siebie dobrze odseparowane.

Analiza PCA wykazała również, że poszczególne odmiany kratom oraz różne gatunki datury można zidentyfikować i odróżnić od siebie. Przedstawiono wyniki hierarchicznej analizy skupień (HCA) dla danych spektrometrii mas kratomu i datury. Wyniki HCA ujawniły różnicowanie klas, gatunków i odmian wyłącznie na podstawie danych pochodzących z bezpośredniej analizy w czasie rzeczywistym przy użyciu wysokorozdzielczej spektrometrii mas i potwierdziły wyniki analizy PCA.

Po opanowaniu tej techniki, przy prawidłowym wykonaniu, można ją przeprowadzić w czasie krótszym niż godzina, w zależności od liczby próbek. Po obejrzeniu tego filmu powinni Państwo posiadać dobrą wiedzę na temat wykorzystania bezpośredniej analizy oraz spektrometrii mas w czasie rzeczywistym do analizy złożonych próbek, a także stosowania statystycznego przetwarzania danych w celu uzyskania informacji o gatunkach. Podczas wykonywania tej procedury ważne jest utrzymywanie próbki w strumieniu jonów przez odpowiedni czas, aby uzyskać pełne widmo masowe próbki.

Technika ta pozwoliła badaczom z wielu dziedzin, w tym z zakresu omiki roślin, kryminalistyki oraz chemii organicznej i analitycznej, na badanie analizy substancji lotnych emitowanych przez rośliny, identyfikację legalnych alternatyw dla narkotyków oraz monitorowanie produktów reakcji w czasie rzeczywistym.