Name: Kompleks polielektrolitowy do dostarczania osteogennego czynnika wzrostu w domenie wiążącej heparynę (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-08-22T14:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 27 s
Description: Poznaj metodę tworzenia kompleksów polielektrolitowych z heparyną i protaminą do kontrolowanego uwalniania czynników wzrostu. Technika ta zmniejsza dawkę BMP-2 dwudziestokrotnie w zastosowaniach chirurgii ortopedycznej.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Te badania zostały sfinansowane przez National Medical Research Council Clinician Scientist - Individual Research Grant (CS-IRG) NMRC/CIRG/1372/2013 i NMRC EDG/0022/2008.

1. Przygotowanie roztworu alginianu
<ol>
	<li>Rozpuścić 20 mg alginianu sodu (nienaświetlanego) lub 40 mg alginianu sodu naświetlanego dawką 8 MRad w 10 ml wody podwójnie destylowanej i mieszać przez 1 h w przypadku alginianu nienaświetlanego oraz przez 15 min w przypadku alginianu naświetlanego. Roztwór alginianu przechowywać przez noc w temperaturze 4 °C. Przed wytwarzaniem alginianowych mikrokulek przefiltrować roztwór alginianu za pomocą sterylnego filtra strzykawkowego 0,2 µm.</li>
</ol>
2. Wytwarzanie alginianowych mikrokulek
<ol>
	<li>Zdezynfekować generator elektrostatycznych kulek i pompę strzykawkową 70% etanolem, a następnie umieścić je w komorze bezpieczeństwa biologicznego klasy II (Rysunek 1).</li>
	<li>Wewnątrz generatora kulek umieścić szklaną kuwetę z magnetycznym mieszadłem.</li>
	<li>Ustawić elektrodę ramienia generatora kulek 9 cm nad kuwetą.</li>
	<li>Podłączyć kabel elektrody generatora kulek do śruby rzymskiej 2 elektrody ramienia, a następnie wlać do kuwety 80 ml roztworu SrCl2.</li>
	<li>Napełnić strzykawkę i gumową rurkę 5 ml przefiltrowanego przez membranę 0,2 µm roztworu alginianu. Po podłączeniu gumowej rurki do elektrody ramienia włączyć pompę strzykawkową z prędkością 5 ml/hr na 2 min, aby usunąć powietrze z rurek i doprowadzić roztwór alginianu do końcówki dyszy. Wyłączyć pompę strzykawkową.</li>
	<li>Następnie włączyć enkapsulator, a potem pompę strzykawkową, aby rozpocząć generowanie mikrokulek. Ustawić prędkość przepływu alginianu na 5 ml/hr oraz napięcie 5,8 kV na enkapsulatorze. Odrzucić mikrokulki wytworzone w ciągu pierwszych dwóch minut (lub początkowe 0,5 ml roztworu alginianu wypompowanego ze strzykawki), ponieważ mikrokulki te mają zazwyczaj nieregularny rozmiar i kształt.</li>
	<li>Kolejne mikrokulki zbierać w 0,2 M roztworze chlorku stronu. Po wpompowaniu zaplanowanej objętości roztworu alginianu wyłączyć pompę strzykawkową, a następnie enkapsulator (w tej kolejności). Powtórzyć tę procedurę dla kolejnych partii mikrokulek. Po zakończeniu prac najpierw wyłączyć pompę strzykawkową, a następnie enkapsulator.</li>
	<li>Przechowywać mikrokulki w 20 ml 0,2 M roztworu chlorku stronu w temperaturze 4 °C przez noc, aby dokończyć proces sieciowania i ustabilizować żel.</li>
</ol>
3. Pomiar wielkości alginianowych mikrokulek
<ol>
	<li>Pobrać 0,5 ml mikrokulek alginianowych za pomocą plastikowej pipety i umieścić je na szkiełku przedmiotowym. Obejrzeć mikrokulki pod mikroskopem optycznym przy powiększeniu 10X. Wykonać dziesięć zdjęć mikrokulek za pomocą kamery CCD mikroskopu. Zapisać obrazy z paskiem skali (50 µm) w formacie TIFF przy rozdzielczości 2 048 x 1 536.</li>
	<li>Za pomocą narzędzi pomiarowych w programie ImageJ zmierzyć rozmiar mikrokulek oraz paska skali (Ryc. 2). Przeliczyć długość mikrokulek z pikseli na mikrometry.
	<ol>
		<li>Kliknąć narzędzia liniowe i narysować linię przechodzącą przez środek kulki alginianowej.</li>
		<li>Kliknąć „Analyze” na pasku menu i wybrać „Measure”. Pojawi się okno wyskakujące.</li>
		<li>Powtórzyć kroki 3.2.1-3.2.2, aby zmierzyć wszystkie kulki alginianowe na obrazie. Zmierzyć pasek skali na obrazie.</li>
		<li>Przeliczyć średnicę kulki alginianowej na rzeczywistą długość, korzystając ze wzoru: długość kulki alginianowej / długość paska skali x 50 µm. Na przykład: 1,420 (średnica zmierzona w ImageJ) / 2,657 (długość paska skali zmierzona w ImageJ) * 50 µm = 267 µm.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Przyjąć średnią wielkość 10 mikrokulek (średnia ± odchylenie standardowe) jako reprezentatywny rozmiar każdej partii mikrokulek.</li>
</ol>
4. Sterylizacja
<ol>
	<li>Zebrać mikrokulki za pomocą nylonowego sita o oczkach 100 µm i przemyć je wodą dwukrotnie destylowaną.</li>
	<li>Za pomocą szpatułki przenieść wszystkie mikrokulki przygotowane z 0,1 ml roztworu alginianu do probówki do mikrocentryfugi o pojemności 2 ml i przykryć gazą, aby zapobiec wysychaniu.</li>
	<li>Na koniec wysterylizować mikrokulki w autoklawie, korzystając z trybu dla cieczy (115 °C, 15 min) lub zgodnie ze specyfikacją producenta. Do komory dodać 1,5 L wody destylowanej, aby zapobiec wysychaniu kulek.</li>
</ol>
5. Powlekanie protaminą i heparyną
<ol>
	<li>W komorze BSL-2 inkubować sterylne mikrokulki w 1 ml roztworu protaminy o stężeniu 2 mg/ml (sterylizowanego za pomocą filtra strzykawkowego 0,2 µm) przez 1 h w temperaturze pokojowej.</li>
	<li>Po 1 h inkubacji mikrokulek (krok 5.1), pobrać 150 µl roztworu protaminy do testu mikro-kwasu bicinchoniniowego (microBCA) (sekcja 6).</li>
	<li>Przemyć mikrokulki pokryte protaminą dwukrotnie wodą dwukrotnie destylowaną. Odwirować za pomocą wirówki stołowej przy 20 x g przez 3 min w temperaturze pokojowej. Po wirowaniu odessać wodę za pomocą strzykawki.</li>
	<li>Inkubować mikrokulki pokryte protaminą w 1 ml roztworu heparyny o stężeniu 0,5 mg/ml (sterylizowanego za pomocą filtra strzykawkowego 0,2 µm) przez 30 min w celu utworzenia kompleksu polielektrolitowego (PEC).</li>
	<li>Po 30 min inkubacji mikrokulek pokrytych protaminą (krok 5.4), pobrać 40 µl roztworu heparyny w celu oznaczenia zawartości heparyny (sekcja 7).</li>
	<li>Po inkubacji usunąć niezwiązaną heparynę z kompleksów PEC, przemywając je dwukrotnie wodą dwukrotnie destylowaną.</li>
</ol>
6. Zawartość protaminy
<ol>
	<li>Przeprowadzić test microBCA zgodnie z instrukcjami producenta. W skrócie: do płytki 96-dołkowej dodać 150 µl roztworu protaminy (pobranego przed i po inkubacji z mikrokulkami). Dodać 150 µl roztworu roboczego microBCA.</li>
	<li>W charakterze standardów kalibracyjnych zastosować roztwór albuminy (0, 0,5, 1, 2, 5, 10, 20, 40 i 20 µg/ml).</li>
	<li>Mieszaninę inkubować przez 60 min w temperaturze 60 °C. Absorbancję zmierzyć za pomocą spektrofotometru przy 562 nm.</li>
	<li>Wykorzystać krzywą standardową do oznaczenia stężenia protaminy w każdej nieznanej próbce zgodnie z instrukcjami producenta.</li>
	<li>Wyznaczyć zawartość protaminy w mikrokulkach, odejmując całkowitą ilość protaminy w roztworze powlekającym (przed inkubacją z mikrokulkami) od ilości protaminy pozostałej w roztworze powlekającym (po inkubacji z mikrokulkami).</li>
</ol>
7. Zawartość heparyny
<ol>
	<li>Przygotować 10 ml roztworu roboczego, rozpuszczając 4 mg błękitu toluidynowego i 20 mg chlorku sodu w 0,01 N kwasie solnym.</li>
	<li>Dodać 40 µl próbki (z kroku 5.5) do roztworu roboczego w stosunku 2:3 i mieszać wortexie przez 30 s.</li>
	<li>Dodać 60 µl n-heksanu (objętość równą objętości roztworu odczynnika roboczego) i wymieszać wortexie, aby wyekstrahować kompleks błękitu toluidynowego z heparyną.</li>
	<li>Po rozdzieleniu faz pobrać strzykawką 20 µl fazy wodnej.</li>
	<li>Zmierzyć ilość niewyekstrahowanego błękitu toluidynowego w fazie wodnej za pomocą spektrofotometru przy 631 nm.</li>
	<li>Przygotować roztwory standardowe heparyny o stężeniu 0-20 µg/ml.</li>
	<li>Wykreślić zależność odczytu przy 631 nm dla każdego standardu heparyny od stężenia heparyny w µg/ml. Wykorzystać krzywą wzorcową do oznaczenia stężenia heparyny w każdej próbce.</li>
</ol>
8. Obraz konfokalny struktury warstwa po warstwie
<ol>
	<li>Przygotować protaminę, heparynę oraz analogi fluorescencyjne NELL-1/BMP-2: protaminę CF-405 (niebieską), heparynę CF 594 (czerwoną) oraz znakowane FITC NELL-1/znakowane FITC (zielone) BMP-2 + heparynę + protaminę zgodnie z techniczną kartą charakterystyki producenta.</li>
	<li>Pokryć 10 µg mikrokulek 30 µl analogu fluorescencyjnego (metoda pokrywania opisana w punktach 5.3-5.6): protaminy CF-405 (niebieskiej) (2 mg/ml, inkubacja przez 1 h), heparyny CF 594 (czerwonej) (0,5 mg/ml, 30 min) oraz znakowanego FITC NELL-1/znakowanego FITC (zielonego) BMP-2 (1,5 mg/ml, przez noc). Przemyć mikrokulki dwukrotnie wodą destylowaną, aby usunąć niezwiązaną fluorescencyjną protaminę, heparynę oraz NELL-1/BMP-2.</li>
	<li>Obserwować strukturę warstwa-po-warstwie (Rysunek 3) za pomocą mikroskopu konfokalnego przy powiększeniu 10X.7</li>
</ol>
9. Pobieranie i uwalnianie BMP-2 oraz NELL-1
<ol>
	<li>Nanieś 13,3 µl roztworu BMP-2 lub NELL-1 o stężeniu 1,5 mg/ml na 10 µg PEC. Inkubuj PEC w temperaturze 4 °C przy wstrząsaniu z prędkością 30 rpm przez 10 h.</li>
	<li>Zanurz mikrokulki w 1 ml soli fizjologicznej w buforze fosforanowym (PBS) w temperaturze 37 °C przy ciągłym wstrząsaniu (30 rpm).</li>
	<li>Pobieraj 1 ml supernatantu i zastępuj go 1 ml PBS po 1, 3, 6, 10 i 14 dniach.</li>
	<li>Oceń wydajność pobierania i uwalniania BMP-2 metodą ELISA zgodnie z protokołem producenta. Oceń wydajność pobierania i uwalniania NELL-1 metodą analizy białek z użyciem karboksybenzoylokinolino-2-karboksaldehydu (CBQCA) zgodnie z protokołem producenta.</li>
	<li>Wyznacz skumulowane uwalnianie w czasie (t): 
	Skumulowane uwalnianie w czasie (t) = Uwalnianie w czasie (t) + Poprzednie uwalnianie w czasie (t-1).</li>
	<li>Przedstaw na wykresie skumulowane uwalnianie BMP-2 i NELL-1 w funkcji czasu.</li>
</ol>
10. Bioaktywność in vitro NELL-1
Uwaga: Bioaktywność NELL-1 uwalnianego z PEC oceniono poprzez pomiar jego zdolności do zwiększania ekspresji fosfatazy alkalicznej (ALP) w komórkach macierzystych szpiku kostnego królika (rBMSC).
<ol>
	<li>Zasiać 20 00 rBMSCs na studzienkę w płytce 24-dołkowej i hodować przez jeden dzień w 1 ml pożywki DMEM (Dulbecco's Modified Eagle's Medium) z dodatkiem 10% FBS (Fetal bovine serum) w temperaturze 37 °C i przy 5% CO2.</li>
	<li>Po 24 h wymienić pożywkę na 1 ml pożywki osteogennej (DMEM uzupełnione o 10% FBS, 2% penicyliny i streptomycyny, 50 µg/ml kwasu askorbinowego, 10 mmol/L beta-glicerynfosforanu oraz 10-8 mol/L deksametazonu) na 7 dni w temperaturze 37 °C i przy 5% CO2.</li>
	<li>Umieścić 30 µg PEC-NELL-1 (z kroku 8.2) oraz PEC w insertach do hodowli komórkowej (insert TC), aby oddzielić PEC od komórek (zapobiega to wypłukaniu mikrokulek PEC podczas wymiany pożywki osteogennej). Wstawić insert TC do płytki 24-dołkowej na 14 dni.</li>
	<li>Raz na trzy dni odessać 1 ml pożywki osteogennej, umieszczając igłę poza insertem TC, i zastąpić ją 1 ml świeżej pożywki osteogennej.</li>
	<li>Po 7 i 14 dniach inkubacji oznaczyć aktywność ALP za pomocą zestawu do analizy ALP zgodnie z protokołem producenta zestawu.
	<ol>
		<li>Zlizować komórki buforem do analizy zawierającym 0,1% TritonX-10 w temperaturze 4 °C przez 10 min. Zebrać przytwierdzone komórki za pomocą skrobaka komórkowego. Inkubować zawiesinę komórkową w temperaturze 4 °C podczas mieszania przez co najmniej 60 min.</li>
		<li>Odwirować zawiesinę komórkową przy 2 50 x g w temperaturze 4 °C przez 10 min. Zebrać nadsącz do analizy ALP.</li>
		<li>Do studzienek płytki 96-dołkowej dodać po 50 µl seryjnie rozcieńczonego roztworu standardu fosfatazy alkalicznej w zakresie od 200 do 0 ng/ml. Końcowe ilości standardu fosfatazy alkalicznej wynoszą odpowiednio 10, 5, 2,5, 1,2, 0,6, 0,3, 0,15 i 0 ng/studzienkę.</li>
		<li>Dodać nadsącz z kroku 10.5.2 (50 µl/studzienkę) i rozcieńczyć buforem do rozcieńczania.</li>
		<li>Do każdej studzienki dodać 50 µl roztworu substratu p-nitrofenylofosforanu (pNPP). Wymieszać odczynniki, delikatnie wstrząsając płytką przez 30 s. Inkubować mieszaninę przez 30 min w ciemności. Zmierzyć absorbancję przy 405 nm za pomocą czytnika płytek.</li>
		<li>Obliczyć aktywność ALP, korzystając z krzywej kalibracyjnej.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Oznaczyć zawartość białka za pomocą zestawu do mikroanalizy białek BCA zgodnie z instrukcją producenta. Znormalizować aktywność ALP, dzieląc wartość aktywności ALP przez zawartość białka.</li>
</ol>
1. Żywotność komórek
<ol>
	<li>Inkubować 20 mg PEC-NELL-1 w 1 ml DMEM z dodatkiem 10% FBS w temperaturze 37 °C przez 24 h w celu przeprowadzenia testu MTT (bromek 3-(4,5-dimetylotiazol-2-yl)-2,5-difenylotetrazoliu).</li>
	<li>Zasiać 20 rBMSC na studzienkę (w 100 µl DMEM z 10% FBS) na płytce 96-dołkowej i inkubować przez 1 dzień w 37 °C, 5% CO22.</li>
	<li>Zastąp DMEM + 10% FBS przez 100 µl wyciągu PEC-NELL-1/PEC i inkubować w 37 °C, 5% CO22.</li>
	<li>Po 1 lub 3 dniach inkubacji dodać 10 µl roztworu MTT o stężeniu 5 mg/ml, a następnie inkubować w 37 °C, 5% CO22 przez 4 h w ciemności.</li>
	<li>Dodaj 100 µl roztwór DMSO do każdego dołka w celu rozpuszczenia kryształów formazanu.</li>
	<li>Wyznacz absorbancję przy 570 nm za pomocą czytnika mikropłytek.</li>
	<li>Oblicz względny wskaźnik wzrostu: 
	<img alt="Wzór na względną szybkość wzrostu, stosunek absorbancji, analiza ekspozycji komórek, eksperyment biologiczny." src="/files/ftp_upload/54202/54202eq1.jpg" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Równanie 1"></li>
</ol>
12. Pakowanie do rusztowania oraz ładowanie BMP-2 i NELL-1
<ol>
	<li>Wprowadzić PEC do porów biodegradowalnego rusztowania z polikaprolaktonu i fosforanu trójwapniowego klasy medycznej (mPCL-TCP), używając wysterylizowanej szpatułki w komorze BSL-2.</li>
	<li>Nanieść roztwór BMP-2 lub NELL-1 o stężeniu 1,5 mg/ml na rusztowanie mPCL-TCP wypełnione PEC i inkubować przez noc w temperaturze 4 °C.</li>
</ol>

<ol><li>Yuan, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((NELL-1+based+demineralized+bone+graft+promotes+rat+spine+fusion+as+compared+to+commercially+available+BMP-2+product%5BTitle%5D)+AND+%22Orthop+Sci%22%5BJournal%5D)">NELL-1 based demineralized bone graft promotes rat spine fusion as compared to commercially available BMP-2 product.</a> Orthop Sci. 18, 646-657 (2013).</li>
<li>Anderson, C. L., Whitaker, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Heterotopic+ossification+associated+with+recombinant+human+bone+morphogenetic+protein-2+%28infuse%29+in+posterolateral+lumbar+spine+fusion%3A+a+case+report%5BTitle%5D)+AND+%22Spine%22%5BJournal%5D)">Heterotopic ossification associated with recombinant human bone morphogenetic protein-2 (infuse) in posterolateral lumbar spine fusion: a case report.</a> Spine. 37, 502-506 (2012).</li>
<li>Glassman, S. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RhBMP-2+versus+iliac+crest+bone+graft+for+lumbar+spine+fusion%3A+a+randomized%2C+controlled+trial+in+patients+over+sixty+years+of+age%5BTitle%5D)+AND+%22Spine%22%5BJournal%5D)">RhBMP-2 versus iliac crest bone graft for lumbar spine fusion: a randomized, controlled trial in patients over sixty years of age.</a> Spine. 33, 2843-2849 (2008).</li>
<li>Tannoury, C. A., An, H. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Complications+with+the+use+of+bone+morphogenetic+protein+2+%28BMP-2%29+in+spine+surgery%5BTitle%5D)+AND+%22Spine+J%22%5BJournal%5D)">Complications with the use of bone morphogenetic protein 2 (BMP-2) in spine surgery.</a> Spine J. 14, 552-559 (2014).</li>
<li>Carragee, E. J., Hurwitz, E. L., Weiner, B. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+critical+review+of+recombinant+human+bone+morphogenetic+protein-2+trials+in+spinal+surgery%3A+emerging+safety+concerns+and+lessons+learned%5BTitle%5D)+AND+%22Spine+J%22%5BJournal%5D)">A critical review of recombinant human bone morphogenetic protein-2 trials in spinal surgery: emerging safety concerns and lessons learned.</a> Spine J. 11, 471-491 (2011).</li>
<li>Abbah, S. A., Lam, C. X., Hutmacher, D. W., Goh, J. C., Wong, H. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biological+performance+of+a+polycaprolactone-based+scaffold+used+as+fusion+cage+device+in+a+large+animal+model+of+spinal+reconstructive+surgery%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">Biological performance of a polycaprolactone-based scaffold used as fusion cage device in a large animal model of spinal reconstructive surgery.</a> Biomaterials. 30, 5086-5093 (2009).</li>
<li>Abbah, S. A., Liu, J., Lam, R. W., Goh, J. C., Wong, H. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+bioactivity+of+rhBMP-2+delivered+with+novel+polyelectrolyte+complexation+shells+assembled+on+an+alginate+microbead+core+template%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Control.+Release%22%5BJournal%5D)">In vivo bioactivity of rhBMP-2 delivered with novel polyelectrolyte complexation shells assembled on an alginate microbead core template.</a> J. Control. Release. 162, 364-372 (2012).</li>
<li>Wang, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Polyelectrolyte+Complex+Carrier+Enhances+Therapeutic+Efficiency+and+Safety+Profile+of+Bone+Morphogenetic+Protein-2+in+Porcine+Lumbar+Interbody+Fusion+Model%5BTitle%5D)+AND+%22Spine%22%5BJournal%5D)">Polyelectrolyte Complex Carrier Enhances Therapeutic Efficiency and Safety Profile of Bone Morphogenetic Protein-2 in Porcine Lumbar Interbody Fusion Model.</a> Spine. 40, 964-973 (2015).</li>
<li>Abbah, S. A., Lam, W. M., Hu, T., Goh, J., Wong, H. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sequestration+of+rhBMP-2+into+self-assembled+polyelectrolyte+complexes+promotes+anatomic+localization+of+new+bone+in+a+porcine+model+of+spinal+reconstructive+surgery%5BTitle%5D)+AND+%22Tissue+Eng.+Part+A%22%5BJournal%5D)">Sequestration of rhBMP-2 into self-assembled polyelectrolyte complexes promotes anatomic localization of new bone in a porcine model of spinal reconstructive surgery.</a> Tissue Eng. Part A. 20, 1679-1688 (2014).</li>
<li>Hu, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Novel+Protamine-Based+Polyelectrolyte+Carrier+Enhances+Low-Dose+rhBMP-2+in+Posterolateral+Spinal+Fusion%5BTitle%5D)+AND+%22Spine%22%5BJournal%5D)">Novel Protamine-Based Polyelectrolyte Carrier Enhances Low-Dose rhBMP-2 in Posterolateral Spinal Fusion.</a> Spine. 40, 613-621 (2015).</li>
<li>Hu, J., Hou, Y., Park, H., Lee, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Beta-tricalcium+phosphate+particles+as+a+controlled+release+carrier+of+osteogenic+proteins+for+bone+tissue+engineering%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biomed+Mater+Res+A%22%5BJournal%5D)">Beta-tricalcium phosphate particles as a controlled release carrier of osteogenic proteins for bone tissue engineering.</a> J Biomed Mater Res A. 100, 1680-1686 (2012).</li>
<li>Darrabie, M. D., Kendall, W. F., Opara, E. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characteristics+of+Poly-L-Ornithine-coated+alginate+microcapsules%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">Characteristics of Poly-L-Ornithine-coated alginate microcapsules.</a> Biomaterials. 26, 6846-6852 (2005).</li>
<li>Li, X., Min, S., Zhao, X., Lu, Z., Jin, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optimization+of+entrapping+conditions+to+improve+the+release+of+BMP-2+from+PELA+carriers+by+response+surface+methodology%5BTitle%5D)+AND+%22Biomed+Mater%22%5BJournal%5D)">Optimization of entrapping conditions to improve the release of BMP-2 from PELA carriers by response surface methodology.</a> Biomed Mater. 10, 015002(2015).</li>
</ol>

Nie mamy konfliktu interesów.

W protokole tym przedstawiono metodę otrzymywania PEC poprzez samoorganizację warstwa po warstwie. Struktura warstwa po warstwie jest wizualizowana za pomocą fluorescencyjnych analogów protaminy, heparyny, BMP-2 i NELL-1 oraz mikroskopii konfokalnej. Testy wychwytu i uwalniania pokazują, że heparyna na PEC pośredniczy w wychwytywaniu i uwalnianiu osteogennego czynnika wzrostu. Skuteczność absorpcji metodą PEC wynosi: NELL-1: 86,7 ± 2,7%, BMP-2: 70,5 ± 3,1%. Nośnik PEC ma lepszą modulację uwalniania NELL-1 (20%) w porówna...

Częstość występowania rzekomej choroby zwyrodnieniowej stawów wynosi od 10 do 45% w zwyrodnieniowych zrostach kręgosłupa i rewizyjnych operacjach kręgosłupa1. Aby zmniejszyć częstość występowania choroby zwyrodnieniowej kości łamiennej kości podczas zespolenia kręgosłupa i innych operacji rekonstrukcyjnych kości, wprowadzono osteogenne czynniki wzrostu, takie jak BMP-2,Nell-1 1 i płytkowy czynnik wzrostu (PDGF), w celu promowania osteogenezy de novo. Wśród nich BMP-2 jest popularnym wyborem do zespolenia kręgosłupa2. Chociaż siła działania BMP-2 w indukowaniu i ułatwianiu tworzenia nowych kości została dobrze ugruntowana3; Klinicznie istotne powikłania, takie jak heterotopowe tworzenie kości, tworzenie się surowicy i krwiaka, reakcja zapalna, zapalenie korzonków nerwowych, osteoliza trzonów kręgów i wytrysk wsteczny nadal stanowią problem ze względu na stosowane suprafizjologiczne ilości4,5.
Dlatego obniżenie dawki BMP-2 pozostaje istotną strategią w próbach zminimalizowania skutków ubocznych. Poza tym potrzebne są wydajne systemy nośników, aby stłumić początkowe uwalnianie BMP-2 obserwowane we współczesnych systemach nośników gąbek kolagenowych i jeszcze bardziej zwiększyć przedłużone i miejscowe dostarczanie tej silnej cytokiny. Samoorganizacja naprzemiennych kationowych i anionowych polielektrolitów warstwa po warstwie może być stosowana jako przestrajalna metoda do budowania kompleksów polielektrolitowych na powierzchni matryc rusztowań lub materiałów do implantacji6. Pod tym względem uznano, że heparyna (znana z najwyższej gęstości ładunku ujemnego ze wszystkich czynników biologicznych) chętnie wiąże się z różnymi czynnikami wzrostu za pośrednictwem domen wiążących elektrostatyki i heparynę. Rzeczywiście, wykazano, że heparyna przedłuża okres półtrwania, a tym samym nasila bioaktywność kilku czynników wzrostu.
Na tej podstawie, nasza grupa dostosowała protokół samoorganizacji warstwa po warstwie, aby wytworzyć kompleks polielektrolitowy na bazie heparyny (PEC), który ładuje i zachowuje bioaktywność osteogennych czynników wzrostu podczas unieruchomienia7,8. Rdzeń mikrokulek alginianowych wytworzono przez sieciowanie reszt α-L-guluronianu (G) alginianu z dwuwartościowymi jonami kationu wapnia lub strontu. Rdzeń alginianowy jest biodegradowalną matrycą rusztowania; który po implantacji ulega resorpcji w łożu fuzyjnym, zapewniając miejsce na wrastanie kości. Poli-L-lizyna (PLL) lub protamina jest używana jako warstwa kationowa do przeplatania się zarówno z matrycą rusztowania (w tym przypadku rdzeniem nośnym mikrokulek alginianowych), jak i ujemnie naładowaną heparyną; podczas gdy warstwa heparyny anionowej działa stabilizująco i lokalizując obciążone czynniki wzrostu. Wykazano, że trójwarstwowy PEC zwiększa nośność czynnika wzrostu w modeluświni 9. Ostatnio wykazano, że nosiciele PEC skutecznie zmniejszają skuteczną dawkę BMP-2 co najmniej 20-krotnie w modelach zrostu rdzeniowego u szczurów10 i świń8.
Tutaj przedstawiamy metody wytwarzania PEC w celu zwiększenia dostarczania czynnika wzrostu w zespoleniu kręgosłupa i innych operacjach rekonstrukcyjnych kości przy użyciu BMP-2 jako modelowego osteogennego czynnika wzrostu.

<table><tbody><tr><td>Targi Acrodisc 25 w dziedzinie nauk przyrodniczych&nbsp; mm Filtr strzykawkowy z 0,2&nbsp; &mikro; m Membrana Supor</td><td>PALL&nbsp;</td><td>PN4612</td><td>Sterylny roztwór protaminy, heparyny metodą ultrafiltracji</td></tr><tr><td>24-dołkowa płytka</td><td>Cell Star&nbsp;</td><td>662160</td><td></td></tr><tr><td>96-dołkowa płytka Nuclon Delta Surface</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>167008</td><td></td></tr><tr><td>(3-(4,5-dimetylotiazol-2-ylo)-2,5-difenylotetrazolowy bromek), MTT</td><td>Sigma Aldrich</td><td>M5655</td><td>Pomiar cytotoksyczności PEC-NELL-1</td></tr><tr><td>Aceton</td><td>Fisher Scientific</td><td>A/0600/17</td><td>Osad CF-405 Oznakowany protamin</td></tr><tr><td>Alamar Blue</td><td>Invitrogen, Life Technologies</td><td>DAL 1025</td><td>Pomiar cytotoksyczności zestawu do</td></tr><tr><td>oznaczania fosfatazy alkalicznej PEC-BMP-2 (ALP)</td><td>Anaspec</td><td>AS-72146</td><td></td></tr><tr><td>Chlorek amonu</td><td>Merck</td><td>Art 1145</td><td>Odczynnik Stop w znakowaniu FITC</td></tr><tr><td>Bezwodny dimetylosulfotlenek (DMSO)</td><td>Invitrogen, Life Technologies</td><td>D12345</td><td>Rozpuszczalnik do fluorescencyjnego izotiocyjanianu I</td></tr><tr><td>Dimetylosulfotlenek ( DMSO)</td><td>Sigma Aldrich</td><td></td><td>Rozpuszczać&nbsp; formazan&nbsp;</td></tr><tr><td>Autoklaw</td><td>Hirayama</td><td>HU-110</td><td>Sterylizuj kulki alginianowe parą</td></tr><tr><td>Beta-glicerofosforan</td><td>Sigma Aldrich</td><td>G9422</td><td></td></tr><tr><td>BMP-2 (zestaw do nawożenia przeszczepu kości duży II)&nbsp;</td><td>Medtronic Sofarmor Danek, Memphis TN, USA</td><td>7510800</td><td>Osteogenny czynnik wzrostu, dializa jest potrzebna do usunięcia składnika stabilizującego, który zakłóca sprzężenie FITC</td></tr><tr><td>Karboksybenzoilochinolino-2-karboksyaldehyd (CBQCA)&nbsp;</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>A-6222</td><td>Do ilościowego oznaczania sitka komórkowego białka NELL-1</td></tr><tr><td>(100&nbsp; &mikro; m)</td> <td>BD Science</td><td>352360</td><td>Trzymaj PEC do testu ALP</td></tr><tr><td>Skrobak do komórek 290&nbsp; mm Szerokość ostrza 20&nbsp; mm</td><td>SPL Life Science</td><td>90030</td><td>Odłącz komórkę od płytki 24-dołkowej</td></tr><tr><td>CF 405S, Succinimidyl Ester</td><td>Sigma Aldrich</td><td>SCJ4600013</td><td>Niebieski barwnik fluorescencyjny do znakowania protaminy</td></tr><tr><td>CF 594, Hydrazide</td><td>Sigma Aldrich</td><td>SCJ4600031</td><td>Ciemnoczerwony barwnik fluorescencyjny do znakowania heparyny</td></tr><tr><td>Wirówka</td> Mikroskop konfokalny <td>Beckman Coulter</td><td>Microfuge 22R</td><td></td></tr><tr><td></td><td>Olimpia&nbsp;</td><td>FV1000</td><td></td></tr><tr><td>Deksametazon</td><td>Sigma Aldrich</td><td>D4902</td><td>Składnik osteogennej pożywki wzrostowej</td></tr><tr><td>Kolumny odsalające dekstran</td><td>Pierce (Thermo Scientific)&nbsp;</td><td>43230</td><td></td></tr><tr><td></td><td>DMEM Gibco&nbsp;</td><td>12320</td><td></td></tr><tr><td>BMP-2 Zestaw Quantikine ELISA R</td><td>& D System</td><td>DBP200</td><td>Określ uwalnianie BMP-2</td></tr><tr><td>Płodowa surowica bydlęca FBS</td><td>Hyclon</td><td>SV30160.03</td><td></td></tr><tr><td>Izotiocyjanian fluoesceiny, izomer I</td><td>Sigma Aldrich</td><td>F7250</td><td>Zielony barwnik fluorescencyjny do znakowania NELL-1 i BMP-2</td></tr><tr><td>Wkładki do hodowli komórkowych ThinCert, Do płytek 24-dołkowych, sterylny</td><td>Greiner&nbsp;</td><td>662630</td><td>Zapobiega wypłukiwaniu PEC podczas wymiany podłoża osteogennego</td></tr><tr><td>Pompa strzykawkowa Havard Appartus (11 plus)</td><td>Aparat Havarda</td><td>70-2208</td><td></td></tr><tr><td>n-heksan (>99%)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>139386</td><td></td></tr><tr><td>Heparyna</td><td>Sigma Aldrich</td><td>H3149</td><td>Wiąże się z czynnikiem wzrostu osteogennym z domeną wiążącą heparynę</td></tr><tr><td>Kwas solny (37%)</td><td>Merck</td><td>100317</td><td>Silnie</td></tr><tr><td>inkubator</td><td>Binder</td><td>C8150</td><td></td></tr><tr><td>MicroBCA Zestaw do oznaczania białek</td><td>Thermoscientific</td><td>23235</td><td></td></tr><tr><td>Czytnik mikropłytek</td><td>Tecan</td><td>Infinite M200</td><td>Do testów ALP i mikroBCA</td></tr><tr><td>Enkapsulator komórek</td><td>Nisco Nisco Engineering Inc</td><td>Jednostka do enkapsulacji VAR V1</td><td></td></tr><tr><td>Mikroskop fluorescencyjny</td><td>Olympus</td><td>Rusztowanie IX71</td><td></td></tr><tr><td>mPCL-TCP (wielkość porów wynosi 1,3&nbsp; mm)</td><td>Osteopore</td><td>PCL-TCP 0/90</td><td>Hold PEC dla in vivo badanie</td></tr><tr><td>Penicylina-Streptomycyna 10 000 jednostek/ml, 100&nbsp; ml</td><td>Hodowla komórek hyklonu</td><td>SV30010</td><td>antybiotyk</td></tr><tr><td>10x sól fizjologiczna buforowana fosforanami (PBS)</td><td>Vivantis</td><td>PB0344-1L</td><td>10x Roztwór, ultra czysty</td></tr><tr><td>poli-L-lizyna MW 15 000-30 000</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P2568</td><td></td></tr><tr><td>Sól siarczanu protaminy polikacji, z łososia</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P4020</td><td>Wytrząsarka do polikacji</td></tr><tr><td></td><td>Labnet</td><td>S2025</td><td></td></tr><tr><td>Wężowa rurka do dializy 3,500 MWCO 22&nbsp; mm x 35 stóp</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>68035</td><td>Usuń nieprzereagowany FITC przez dializę</td></tr><tr><td>Chlorek sodu</td><td>Merck</td><td>1.06404.1000</td><td></td></tr><tr><td>Wodorotlenek sodu</td><td>Qrec</td><td>S5158</td><td></td></tr><tr><td>Wodorowęglan sodu</td><td>US Biologiczny</td><td>bufor</td><td>S4000</td></tr><tr><td>Węglan sodu</td><td>Sigma Aldrich</td><td>S7795-500G</td><td>Bufor</td></tr><tr><td>Chlorek strontu Hexahydrate</td><td>Sigma Aldrich</td><td>255521</td><td>Crosslinker do alginianu</td></tr><tr><td>Szpatułka</td><td>3dia</td> 5 ml strzykawka Terumo 140425R Średnica strzykawki wpływa na szybkość przepływu 75 cm2 Kolba do hodowli <td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>komórkowych z przechyloną szyjką</td><td>Corning</td><td>730720</td><td></td></tr><tr><td>Toluidyna Blue</td><td>Sigma Aldrich</td><td>52040</td><td>Test</td></tr> <tr>heparyny<td>Trypsyna 1x</td><td>Hodowla komórek hyklonowych</td><td>SH30042.01</td><td></td></tr><tr><td>Alginian sodu</td><td>Novamatrix (FMC Biopolimer, Princeton, NJ)</td><td>Pronova UPMVG</td><td>Materiał rdzenia z mikrogranulek</td></tr></tbody></table>

kompleks polielektrolitowy do dostarczania osteogennego czynnika wzrostu w domenie wiążącej heparynę

Polyelectrolyte Complex for Heparin Binding Domain Osteogenic Growth Factor Delivery

Podczas operacji rekonstrukcyjnych kości, suprafizjologiczne ilości czynników wzrostu są empirycznie ładowane na rusztowania, aby ułatwić udaną fuzję kostną. Duże dawki bardzo silnych czynników biologicznych są wymagane ze względu na niestabilność czynnika wzrostu w wyniku szybkiej degradacji enzymatycznej, a także nieefektywność nośnika w lokalizacji wystarczającej ilości czynnika wzrostu w miejscach implantacji. W związku z tym strategie, które przedłużają stabilność czynników wzrostu, takich jak BMP-2/NELL-1, i kontrolują ich uwalnianie, mogą w rzeczywistości obniżyć ich skuteczną dawkę, a tym samym zmniejszyć zapotrzebowanie na większe dawki podczas przyszłych operacji regeneracji kości. To z kolei zmniejszy skutki uboczne i koszty czynnika wzrostu. Samoorganizujące się PEC zostały wyprodukowane, aby zapewnić lepszą kontrolę dostarczania BMP-2/NELL-1 poprzez wiązanie heparyny i dodatkowo wzmocnić bioaktywność czynnika wzrostu poprzez zwiększenie stabilności in vivo. Poniżej ilustrujemy prostotę wytwarzania PEC, która pomaga w dostarczaniu różnych czynników wzrostu podczas operacji rekonstrukcyjnych kości.

W naszym nośniku jako zamiennik poli-L-lizyny wybrano protaminę, ponieważ posiada ona podobne właściwości chemiczne i jest zatwierdzona przez FDA jako odtrutka na heparynę. Wyniki badania pod mikroskopem optycznym wykazały, że nienaświetlane mikrokulki miały kształt sferyczny o średnicy 267 ± 14 µm (dysza 0,35 mm, szybkość przepływu 5 ml/hr i 6 kV). Większość naświetlonych mikrokulek ma kształt kropli. Średnica mierzona w zaokrąglonej części naświetlonych mikrokulek wynosiła 212 ± 30 µm (...

Samoorganizujące się kompleksy polielektrolitowe (PEC) wykonane z heparyny i protaminy zostały osadzone na kulkach alginianowych, aby uwięzić i regulować uwalnianie osteogennych czynników wzrostu. Ta strategia dostarczania umożliwia 20-krotne zmniejszenie dawki BMP-2 w zastosowaniach związanych z usztywnieniem kręgosłupa. Niniejszy artykuł ilustruje korzyści płynące z zastosowania PEC i jego wytwarzanie.

Kompleks polielektrolitowy do dostarczania osteogennego czynnika wzrostu w domenie wiążącej heparynę

During reconstructive bone surgeries, supraphysiological amounts of growth factors are empirically loaded onto scaffolds to promote successful bone ...

Ogólnym celem niniejszej procedury jest wytworzenie powłoki z kompleksu polielektrolitu. Jest to nośnik, który może więzić i regulować uwalnianie szerokiego zakresu czynników wzrostu posiadających domenę wiążącą heparynę. Metoda ta może przynieść odpowiedzi na kluczowe pytania w dziedzinie inżynierii tkanki ortopedycznej w zakresie efektywnego więzienia i dostarczania specyficznych czynników wzrostu.Główną zaletą tej techniki jest to, że często nie wymaga ona stosowania rozpuszczalników organicznych, o których wiadomo, że wpływają na aktywność biologiczną czynników wzrostu. Rozpuś 200 mg nienaświetlanego alginianu sodu lub 400 mg alginianu sodu naświetlonego dawką 8 Mrad w 10 ml podwójnie destylowanej wody.Następnie wstrząsać przez jedną godzinę. Roztwór alginianu przechowywać w temperaturze 4 °C przez noc. Przed przygotowaniem alginianowych mikrokulek przefiltrować roztwór alginianu za pomocą sterylnego filtra strzykawkowego o wielkości oczek 0,2 µm.Zdezynfekuj generator elektrostatyczny BE oraz pompę strzykawkową 70% etanolem i umieść je w komorze bezpieczeństwa biologicznego klasy drugiej. Następnie wewnątrz generatora BE umieść szklaną miednicę z magnetycznym mieszadłem. Ustaw elektrodę ramienia generatora BE dziewięć centymetrów nad miednicą.Podłącz kabel elektrody generatora BE do drugiej śruby neuronowej elektrody ramienia. Następnie wlej 80 ml roztworu chlorku strontu do miednicy. W kolejnym kroku pobierz 5 ml przefiltrowanego przez filtr 0,2 µm roztworu alginianu do strzykawki w gumowym przewodzie.Po podłączeniu gumowej rurki do elektrody ramionowej, włącz pompę strzykawkową z prędkością pięciu mililitrów na godzinę. Przez dwie minuty. Aby usunąć powietrze z wnętrza rurki i dostarczyć roztwór alginianu do końcówki dyszy.Następnie wyłącz pompę strzykawkową. Aby rozpocząć generowanie mikrokulek, ustaw enkapsulator na 5,8 kV. Następnie ustaw pompę strzykawkową na szybkość przepływu alginianu wynoszącą 5 mL/h.Mikrokulki wytworzone w ciągu pierwszych dwóch minut należy odrzucić, ponieważ mają one tendencję do nieregularnych rozmiarów i kształtów. Kolejne mikrokulki należy zbierać w 0,2 molarnym roztworze chlorku strontu. Wyłączyć pompę strzykawkową, a następnie enkapsulator.Po wpompowaniu zaplanowanej objętości roztworu alginianu powtórz tę czynność dla kolejnych partii mikrokulek. Przechowuj mikrokulki w 20 ml 0,2 M roztworu chlorku strontu w temperaturze 4°C przez noc, aby dopełnić proces sieciowania i ustabilizować żel.Pobierz 0,5 ml mikrokulek alginianowych za pomocą plastikowej pipety. Umieść je na szkiełku przedmiotowym. Obejrzyj mikrokulki pod mikroskopem optycznym przy powiększeniu 10x.Wykonaj 10 zdjęć mikrokulek przy użyciu kamery CCD mikroskopu. Zapisz obrazy z paskiem skali 500 micron w formacie TIFF przy rozdzielczości 2048 na 1536. Używając narzędzi pomiaru długości w programie ImageJ, zmierz rozmiar mikrokulek.Oraz pasek skali. Następnie przelicz długość mikrokulek z pikseli na mikrometry. Kliknij narzędzia liniowe i narysuj linię przez środek kuleczki alginianowej.Kliknij „Analyze” (analiza) na pasku menu i wybierz „Measure” (pomiar). Pojawi się okno pop-up. Powtórz te kroki, aby zmierzyć wszystkie kulki alginianowe na obrazie.Zmierz pasek skali na obrazie. Zbierz mikrokulki za pomocą nylonowego sita o oczkach 100 micron. Następnie przemyj kulki dwukrotnie destylowaną wodą.Za pomocą szpatułki przenieś wszystkie mikrokulki przygotowane z 0,1 milliliters roztworu alginianu do probówki do mikrocentryfugi o pojemności dwóch mililitrów i przykryj gazą, aby zapobiec wysychaniu. Na koniec wysterylizuj mikrokulki w autoklawie, korzystając z trybu dla cieczy lub zgodnie z wytycznymi producenta. Do komory dodaj 1,5 liters wody destylowanej, aby zapobiec wysychaniu kulek.Wewnątrz komory z laminarnym przepływem powietrza klasy BSL2 inkubować sterylne mikrokulki w 1 mL wysterylizowanego roztworu protaminy o stężeniu 2 mg/mL przez jedną godzinę w temperaturze pokojowej. Przemyć powlekane protaminą mikrokulki dwukrotnie wodą dwukrotnie destylowaną. Następnie odwirować próbkę w wirówce laboratoryjnej przy 200 ×g przez trzy minuty w temperaturze pokojowej.Po wirowaniu odessać wodę za pomocą strzykawki. Inkubować mikrokulki pokryte protaminą w 1 ml sterylnego roztworu heparyny o stężeniu 0,5 mg/ml przez 30 minut. Tworzy to powłokę z kompleksu polielektrolitowego o wysokim powinowactwie do wiązania czynników wzrostu przez heparynę.Po inkubacji odessać heparynę za pomocą strzykawki. Następnie usunąć niezwiązaną heparynę z kompleksów polielektrolitowych, płucząc je dwukrotnie dwukrotnie destylowaną wodą. Nanieść 13,3 µL roztworu białka morfogenetycznego kości 2 lub cząsteczki podobnej do NELL 1 o stężeniu 1,5 mg/mL na 100 µg kompleksu polielektrolitowego.Inkubować kompleks polielektrolitowy w temperaturze 4 °C przy 30 RPM, wstrząsając przez 10 godzin. Następnie zanurzyć mikrokulki w 1 ml soli fizjologicznej fosforanowej (PBS) w temperaturze 37 °C przy ciągłym wstrząsaniu. Pobierać 1 ml supernatantu i zastępować go 1 ml PBS po 1, 3, 6, 10 i 14 dniach.Ocenić wydajność pobierania i uwalniania cząsteczki NELL-like molecule one, stosując metodę analizy białek CBQCA zgodnie z protokołem producenta. Alternatywnie można przeprowadzić analizę ELISA. Bioaktywność cząsteczki NELL-like molecule one uwolnionej z kompleksu polielektrolitowego ocenia się poprzez pomiar jej zdolności do zwiększenia ekspresji fosfatazy alkalicznej w komórkach macierzystych szpiku kostnego królika.Wysiać 20 000 komórek macierzystych szpiku kostnego królika na dołek w płytce 24-dołkowej. Pozostawić je do wzrostu przez jeden dzień w 1 ml pożywki DMEM z dodatkiem 10% płodowej surowicy bydlęcej w temperaturze 37 °C i 5% CO2. Po 24 godzinach zastąpić pożywkę 1 ml pożywki osteogennej na siedem dni w temperaturze 37 °C.oraz 5%CO2. Umieść 300 mikrogramów kompleksu polielektrolitowego oraz cząsteczki podobnej do NELL z kompleksu polielektrolitowego w insertach do hodowli komórkowej, aby oddzielić kompleksy od komórek. Umieść insert w płytce 24-dołkowej, aby zapobiec wypłukaniu mikrokulek kompleksu polielektrolitowego podczas wymiany pożywki osteogennej.Co trzy dni odessij jeden mililitr medium osteogennego, umieszczając igłę na zewnątrz insertu, a następnie zastąp go jednym mililitrem świeżego medium osteogennego. Po 7 i 14 dniach inkubacji określ aktywność fosfatazy alkalicznej za pomocą zestawu do oznaczania fosfatazy alkalicznej.Zgodnie z protokołem producenta zestawu. Umieścić kompleksy polielektrolitowe w porach bioresorbowanego rusztowania z polikaprolaktonu i fosforanu trójwapniowego klasy medycznej. Procedurę należy przeprowadzić za pomocą sterylnej szpatułki w komorze BSL2.Nanieść 1,5 mg lub ml roztworu białka morfogenetycznego kości 2 (bone morphogenetic protein two) lub cząsteczki podobnej do NELL 1 (NELL like molecule one) na rusztowanie wypełnione kompleksem polielektrolitowym. Następnie inkubować przez noc w temperaturze 4 °C. Mikrokule alginianowe są sprawdzane pod mikroskopem w celu monitorowania ich wielkości i morfologii.Nienaświetlane mikrokulki alginianowe mają kształt sferyczny, natomiast ich naświetlone odpowiedniki mają kształt kropli. Rozkład wielkości jest istotnym czynnikiem wpływającym na pobieranie czynników wzrostu. Ponadto zmniejszenie rozmiaru zwiększa stosunek powierzchni do objętości.Podczas pomiaru alginianowych mikrokulek za pomocą oprogramowania Image J, średnia z 100 mikrokulek zapewnia dobrą ocenę rozkładu wielkości w każdej partii mikrokulek. Ponieważ pobór czynników wzrostu zależy od prawidłowej techniki powlekania, grubość każdej warstwy powłoki jest badana przy użyciu mikroskopii konfokalnej. Poniżej przedstawiono obrazy z konfokalnego skaningowego mikroskopu laserowego mikrokulek alginianowych inkubowanych z fluorescencyjnymi analogami protaminy, heparyny, cząsteczki NELL-like 1 oraz białka morfogenetycznego kości 2.Aktywność fosfatazy alkalicznej jest wykorzystywana do pomiaru bioaktywności uwalnianego czynnika wzrostu. Po 14 dniach inkubacji z kompleksem polielektrolitowym z cząsteczką podobną do NELL zaobserwowano 2,2-krotny wzrost aktywności fosfatazy alkalicznej. Po opanowaniu techniki, przy jej prawidłowym wykonaniu, badanie to można przeprowadzić w ciągu pięciu godzin.Podczas wykonywania tej procedury należy pamiętać, że stężenia alginianu wpływają na stabilność mikrokulek. W przypadku alginianów napromieniowanych wymagane było stężenie 4% wag., natomiast dla ich nienapromieniowanych odpowiedników wymagane było stężenie 2% wag.Postępując zgodnie z tymi procedurami, można dodatkowo zwiększyć ładunek czynników wzrostu poprzez powlekanie wielowarstwowe. Technika ta pozwala badaczom w dziedzinie inżynierii tkankowej badać dostarczanie czynników wzrostu w innych modelach chorób. Po obejrzeniu tego filmu będą Państwo w stanie wytworzyć kompleks polielektrolitowy o wąskim rozkładzie wielkości.

polyelectrolyte-complex-for-heparin-binding-domain-osteogenic-growth

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Bioinżynieria

W następnych sekcjach przedstawiamy procedury przygotowania mikrosfer alginianowych do zastosowań biomedycznych. W szczególności ilustrujemy technikę tworzenia wielowarstwowych mikrosfer alginianowych w celu jednoczesnej enkapsulacji komórek i białek jako potencjalnej metody leczenia cukrzycy typu 1.

Wytwarzanie mikrosfer alginianowych do zastosowań biomedycznych

Opisujemy metodę skutecznego unieruchamiania BMP-2 na powierzchniach. Nasze podejście opiera się na tworzeniu samoorganizującej się monowarstwy w celu uzyskania kowalencyjnego wiązania BMP-2 poprzez jego wolne reszty aminowe. Ta metoda jest użytecznym narzędziem do badania sygnalizacji na błonie komórkowej.

Kowalencyjne wiązanie BMP-2 na powierzchniach przy użyciu samoorganizującego się podejścia monowarstwowego

Ten protokół łączy elektroprzędzenie i mikrosfery w celu opracowania rusztowań inżynierii tkankowej do kierowania neuronami. Czynnik wzrostu nerwów zamknięto w mikrosferach PLGA i elektroprzędzono w rusztowania włókniste z kwasem hialuronowym (HA).  Bioaktywność białka badano poprzez wysiewanie rusztowań pierwotnymi zwojami korzenia grzbietowego piskląt i hodowlę przez 4-6 dni.

Elektroprzędzenie Czynnik wzrostu uwalniający mikrosfery do włóknistych rusztowań

Przedstawiono ogólny proces tworzenia krok po kroku szablonu przypominającego kość z zaprojektowanymi mikrokanałami. Wysokie zdolności absorpcyjne i retencyjne matrycy wykazują działanie kapilarne za pośrednictwem mikrokanałów.

Charakterystyczne działanie kapilarne przez mikrokanały w matrycach przypominających kości może poprawić rekrutację komórek w celu przywrócenia dużego ubytku kostnego

Rusztowania dla inżynierii tkankowej muszą podsumować złożone biochemiczne i biofizyczne mikrośrodowisko niszy komórkowej. W tym miejscu pokazujemy zastosowanie międzyfazowych włókien kompleksowania polielektrolitów jako platformy do tworzenia kompozytowych, wieloskładnikowych rusztowań polimerowych o przedłużonym uwalnianiu biochemicznym.

Rusztowania kompozytowe z międzyfazowych włókien polielektrolitowych do czasowo kontrolowanego uwalniania biomolekuł

Ten film demonstruje protokół wzbogacania komórek nabłonka grasicy (TEC) o gradient gęstości do izolacji FACS. Pokazuje również zastosowanie peptydów EAK16-II/EAKIIH6 do promowania tworzenia agregatów TEC. Mikrośrodowiska hydrożelu EAK16-II/EAKIIH6 zapewniają konfigurację 3D niezbędną do utrzymania przetrwania i funkcji TEC.

Promowanie agregacji 3D oczyszczonych komórek nabłonka grasicy FACS za pomocą samoorganizującego się hydrożelu EAK 16-II/EAKIIH6

Tutaj prezentujemy protokół wizualizacji tworzenia naczyń krwionośnych in vivo i w czasie rzeczywistym na rusztowaniach 3D za pomocą mikroskopii wielofotonowej. Angiogenezę w genetycznie zmodyfikowanych rusztowaniach badano w mysim modelu krytycznego ubytku kości kalwarycznej. W grupie leczonej wykryto więcej nowych naczyń krwionośnych niż w grupie kontrolnej.

Wizualizacja angiogenezy za pomocą mikroskopii wielofotonowej in vivo w genetycznie zmodyfikowanym rusztowaniu 3D-PLGA/nHAp do naprawy krytycznego ubytku kości calowej

Biomateriały domieszkowane białkiem morfogenetycznym kości 2 (BMP2) zostały użyte jako nowa strategia terapeutyczna do leczenia złamań kostnych bez zrostu. Aby przezwyciężyć skutki uboczne wynikające z niekontrolowanego uwalniania czynnika, proponujemy nową strategię bezpośredniego unieruchomienia czynnika, tworząc w ten sposób materiały o ulepszonych zdolnościach osteogennych.

Ukierunkowane na miejsce unieruchomienie białka morfogenetycznego kości 2 na powierzchniach stałych za pomocą chemii kliknięć

Model in vitro niszy naczyniowej szpiku kostnego jest tworzony przez wysiewanie komórek mezenchymalnych i śródbłonka na prefabrykowane hydrożele PEG 3D. Sieci śródbłonka, komponenty ECM i aktywność ALP w niszach różnią się w zależności od zastosowanego czynnika wzrostu. Platforma może być wykorzystywana do zaawansowanych modeli nowotworów.

Proste utworzenie unaczynionej niszy osteogennej szpiku kostnego za pomocą prefabrykowanych hydrożeli z poli(glikolu etylenowego) (PEG) w mikropłytce do obrazowania

Terapia kości poprzez kostnienie śródchrzęstne poprzez wszczepienie sztucznej tkanki chrzęstnej wyprodukowanej z mezenchymalnych komórek macierzystych ma potencjał do obejścia wad konwencjonalnych terapii. Hydrożele kwasu hialuronowego są skuteczne w zwiększaniu skali jednolicie zróżnicowanych przeszczepów chrząstki, a także w tworzeniu zintegrowanej kości z unaczynieniem między zrośniętymi przeszczepami in vivo.

Zintegrowane tworzenie kości poprzez kostnienie endochrzęstne in vivo przy użyciu mezenchymalnych komórek macierzystych

Protokół ten szczegółowo opisuje syntezę, enkapsulację hemoglobiny oraz powierzchniową PEGylację hierarchicznie porowatych nanocząstek UiO-66 zaprojektowanych do dostarczania tlenu. Procedura łączy inżynierię defektów z koniugacją biortogonalną wspieraną przez odkształcenie, aby uzyskać wysoce przepuszczalne i fizjologicznie stabilne nośniki odpowiednie do zastosowań biomedycznych.

Synteza, enkapsulacja hemoglobiny i biortogonalna PEGylacja w hierarchicznie porowatych nanocząstkach UiO-66 do zastosowań dostarczania tlenu

Poznaj metodę tworzenia kompleksów polielektrolitowych z heparyną i protaminą do kontrolowanego uwalniania czynników wzrostu. Technika ta zmniejsza dawkę BMP-2 dwudziestokrotnie w zastosowaniach chirurgii ortopedycznej.

Kompleks polielektrolitowy do dostarczania osteogennego czynnika wzrostu w domenie wiążącej heparynę

Przeglądaj więcej filmów