Kompleks polielektrolitowy do dostarczania osteogennego czynnika wzrostu w domenie wiążącej heparynę

Ogólnym celem tej procedury jest wytworzenie powłoki kompleksującej polielektrolit. Nośnik, który może uwięzić i regulować uwalnianie szerokiej gamy czynników wzrostu z domeną wiążącą heparynę. Metoda ta może odpowiedzieć na kluczowe pytania w dziedzinie ortopedycznej inżynierii tkankowej w celu skutecznego uwięzienia i dostarczania czynników wzrostu.

Główną zaletą tej techniki jest to, że nie wymaga częstego stosowania substancji organicznych. O którym wiadomo, że wpływa na aktywność biologiczną czynników wzrostu. Rozpuścić 200 miligramów nienapromieniowanego alginianu sodu lub 400 miligramów ośmiu megaradów napromieniowanych alginianu sodu w 10 mililitrach podwójnie destylowanej wody.

I trząść przez godzinę. Roztwór alginianu należy przechowywać przez noc w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Przefiltrować roztwór alginianu sterylnym filtrem strzykawkowym 0,2 mikrona przed wytworzeniem mikrogranulek alginianowych.

Zdezynfekuj elektrostatyczny generator BE i pompę strzykawkową 70% etanolem i umieść je w komorze bezpieczeństwa biologicznego klasy drugiej. Następnie umieść szklaną miskę z mieszadłem magnetycznym wewnątrz generatora BE. Ustaw elektrodę ramienia generatora BE dziewięć centymetrów nad basenem.

Podłącz elektrody generatora BE do neurologicznej drugiej elektrody ramienia. I wlej 80 mililitrów roztworu chlorku strontu do miski. Następnie załaduj pięć mililitrów przefiltrowanego roztworu alginianu o grubości 0,2 mikrona do strzykawki w gumowej rurce.

Po podłączeniu gumowej rurki do elektrody ramienia włącz pompę strzykawkową z prędkością pięciu mililitrów na godzinę. Przez dwie minuty. Aby usunąć powietrze z wnętrza rurki i dostarczyć roztwór alginianu do końcówki dyszy.

Następnie wyłącz pompę strzykawkową. Aby rozpocząć wytwarzanie mikrogranulek, ustaw enkapsulator na 5,8 kilowolta. Następnie pompa strzykawkowa o natężeniu przepływu alginianu wynoszącym pięć mililitrów na godzinę.

Wyrzuć mikrogranulki powstałe w ciągu pierwszych dwóch minut, ponieważ mają one zwykle nieregularne rozmiary i kształty. Zebrać kolejne mikrogranulki w 0,2-molowym roztworze chlorku strontu. Wyłączyć pompę strzykawkową, a następnie enkapsulator.

Po przepompowaniu zaplanowanej objętości roztworu alginianu. Powtórz to dla kolejnych partii wytwarzania mikrogranulek. Przechowuj mikrogranulki w 20 mililitrach 0,2-molowego roztworu chlorku strontu w temperaturze czterech stopni Celsjusza przez noc, aby zakończyć sieciowanie i ustabilizować żel.

Zbierz 0,5 mililitra mikrogranulek alginianowych za pomocą plastikowej pipety. I umieść go na szklanym szkiełku. Zobacz mikrogranulki pod mikroskopem optycznym w 10-krotnym powiększeniu.

Wykonaj 10 zdjęć mikrokulek za pomocą mikroskopowej kamery CCD. Zapisz obrazy za pomocą paska skali 500 mikronów w formacie TIFF w rozdzielczości 2048 na 1536. Korzystając z narzędzi do pomiaru długości na obrazie J, zmierz rozmiar mikrokulek.

I pasek skali. Następnie przelicz długość mikrokulek z pikseli na mikrometry. Kliknij narzędzia linii i narysuj linię w poprzek środka koralika alginianowego.

Kliknij przycisk Analizuj na pasku menu i wybierz opcję Zmierz. Pojawi się wyskakujące okienko. Powtórz te kroki, aby zmierzyć wszystkie kulki alginianowe na obrazie.

Zmierz podziałkę liniową na obrazie. Zbierz mikrogranulki za pomocą nylonowego sitka o grubości 100 mikronów. I umyj koraliki wodą podwójnie destylowaną.

Za pomocą szpatułki przenieś wszystkie mikrogranulki wykonane z 0,1 mililitra roztworu alginianu do dwumililitrowej probówki wirówkowej i przykryj gazą, aby zapobiec wysuszeniu. Na koniec wysterylizuj mikrogranulki przez automatyczne rozszczepianie w trybie płynnym lub zgodnie ze specyfikacjami producenta. Dodaj 1,5 litra wody destylowanej do komory, aby zapobiec wysychaniu kulek.

Wewnątrz kaptura BSL2 inkubuj sterylne mikrogranulki z jednym mililitrem wysterylizowanych dwóch miligramów na mililitr roztworu protaminy przez jedną godzinę w temperaturze pokojowej. Umyj mikrogranulki pokryte protaminą dwukrotnie wodą podwójnie destylowaną. Następnie odwiruj w dół, używając wirówki stołowej o sile 200 razy G przez trzy minuty w temperaturze pokojowej.

Po odwirowaniu odessać wodę za pomocą strzykawki. Inkubuj mikrogranulki pokryte protaminą z jednym mililitrem wysterylizowanego 0,5 miligrama na mililitr roztworu heparyny przez 30 minut. W ten sposób powstaje powłoka kompleksująca polielektrolit o dużym powinowactwie do czynników wzrostu wiążących heparynę.

Po inkubacji odessać heprainę za pomocą strzykawki. I zmyć niezwiązaną heparynę z kompleksów polielektrolitowych, przemłukując dwukrotnie wodą podwójnie destylowaną. Załaduj 13,3 mikrolitra 1,5 miligrama na mililitr roztworu białka morfogenetycznego kości 2 lub cząsteczki podobnej do NELL 1 na 100 mikrogramów kompleksu polielektrolitowego.

Inkubować kompleks polielektrolitów w temperaturze czterech stopni Celsjusza poniżej 30 obr./min, wstrząsając przez 10 godzin. Następnie zanurz mikrogranulki w jednym mililitrze soli fizjologicznej buforowanej fosforanem lub PBS w temperaturze 37 stopni Celsjusza przy ciągłym wstrząsaniu. Zebrać jeden mililitr supernatantu i zastąpić go jednym mililitrem PBS po jednym, trzech, sześciu, 10 i 14 dniach.

Oceń skuteczność wychwytu i uwalniania cząsteczki pierwszej podobnej do NELL przy użyciu metody oznaczania białek CBQCA zgodnie z protokołem producenta. Alternatywnie wykonaj test elisa. Bioaktywność cząsteczki podobnej do NELL uwolnionej z kompleksu polielektrolitu ocenia się, mierząc jej zdolność do zwiększania ekspresji fosfatazy alkalicznej w komórkach macierzystych szpiku kostnego królika.

Wysiewaj 20 000 komórek macierzystych szpiku kostnego królika na studzienkę na płytce 24-dołkowej. I pozwól im rosnąć przez jeden dzień z jednym mililitrem zmodyfikowanej pożywki orła dulbecco plus 10% płodowej surowicy bydlęcej w temperaturze 37 stopni Celsjusza i 5% CO2. Po 24 godzinach zastąp pożywkę jednym mililitrem pożywki osteogennej na siedem dni w temperaturze 37 stopni Celsjusza.

I 5% CO2. Umieść 300 mikrogramów kompleksu polielektrolitowego i kompleksu polielektrolitowego NELL podobnego do cząsteczki pierwszej we wkładkach do hodowli komórkowych, aby utrzymać kompleksy oddzielnie od komórek. Umieść wkładkę w płytce 24-dołkowej, aby uniknąć wypłukiwania mikrogranulek kompleksu polielektrolitu podczas zmiany podłoża osteogennego.

Raz na trzy dni odsysać jeden mililitr pożywki osteogennej, umieszczając igłę na zewnątrz wkładki. I zastąp jednym mililitrem świeżej pożywki osteogennej. Po siedmiu i 14 dniach inkubacji oznaczyć aktywność fosfatazy alkalicznej za pomocą zestawu do oznaczania fosfatazy alkalicznej.

Zgodnie z protokołem producenta zestawu. Umieść kompleksy polielektrolitów w porach bioresorbowalnego rusztowania polikaprolaktonu tri wapniowego klasy medycznej. Za pomocą wysterylizowanej szpatułki w komorze BSL2.

Dodaj 1,5 miligrama lub mililitra roztworu białka morfogenetycznego kości dwa lub cząsteczki podobnej do NELL jeden na rusztowanie wypełnione kompleksem polielektrolitów. I inkubować przez noc w temperaturze 4 stopni Celsjusza. Mikrogranulki alginianowe są badane pod mikroskopem w celu monitorowania ich wielkości i morfologii.

Nienapromieniowane mikrogranulki alginianowe są kuliste, a napromieniowany odpowiednik ma kształt łzy. Rozkład wielkości jest ważnym czynnikiem absorpcji czynnika wzrostu. A zmniejszenie rozmiaru zwiększa stosunek powierzchni do powierzchni.

Podczas pomiaru mikrogranulek alginianowych za pomocą oprogramowania do obrazowania J, średnio 100 mikrogranulek zapewnia dobre oszacowanie rozkładu wielkości w każdym dopasowaniu mikrogranulek. Ponieważ absorpcja czynnika wzrostu zależy od właściwej techniki powlekania, grubość warstwy każdej powłoki jest obserwowana za pomocą mikroskopii konfokalnej. Tutaj pokazano konfokalne obrazy z laserowego skaningu mikrogranulek alginianowych inkubowanych z fluorescencyjnymi analogami protaminy, heparyny, pierwszej cząsteczki podobnej do NELL i drugiego białka morfogenetycznego kości.

Aktywność fosfatazy alkalicznej służy do pomiaru bioaktywności uwolnionego czynnika wzrostu. 2,2-krotny wzrost aktywności fosfatazy alkalicznej zaobserwowano po inkubacji z cząsteczką podobną do kompleksu polielektrolitu NELL w dniu 14. Po opanowaniu tej techniki można ją wykonać w ciągu pięciu godzin, jeśli zostanie wykonana prawidłowo.

Podczas wykonywania tej procedury należy pamiętać, że stężenia alginianów wpływają na stabilność mikrogranulek. W przypadku napromieniowanych alginianów wymagaliśmy czterech procent. W przypadku nienapromieniowanych odpowiedników wymagaliśmy dwukierunkowego procentu.

Postępując zgodnie z tymi procedurami, możemy jeszcze bardziej zwiększyć obciążenie czynnikiem wzrostu poprzez wielowarstwową powłokę. Technika ta pozwala naukowcom zajmującym się inżynierią tkankową badać dostarczanie czynników wzrostu w innych modelach chorób. Po obejrzeniu tego filmu jesteś w stanie wytworzyć kompleks polielektrolitowy o wąskim rozkładzie rozmiarów.