Test adhezji pod wpływem naprężenia ścinającego do badania oddziaływań cząsteczki adhezyjnej limfocytów T

Ogólnym celem niniejszego analizy jest określenie wpływu badanych preparatów na adhezję komórkową w warunkach stresu ścinającego. Metoda ta może pomóc w odpowiedzi na kluczowe pytania z dziedziny sygnalizacji komórek odpornościowych, takie jak czynniki pośredniczące w aktywacji integryn. Główną zaletą tej techniki jest możliwość badania pojedynczych par cząsteczek adhezyjnych integryn w łatwo replikowalnym systemie przepływowym.

Chociaż metoda ta pozwala uzyskać wgląd w aktywację LFA1, można ją również zastosować do badania innych integryn. Zazwyczaj osoby początkujące w tej metodzie mogą napotkać trudności, ponieważ konfiguracja techniczna musi zostać przeprowadzona precyzyjnie. Aby zebrać komórki CHO-ICAM, poddaj kulturę działaniu 0,5% trypsyny EDTA przez jedną minutę w temperaturze pokojowej, delikatnie potrząsając naczyniem.

Gdy komórki zaczną się odklejać, zneutralizuj trypsynę za pomocą czterech mililitrów świeżej pożywki i policz liczbę dysocjowanych komórek. Rozcieńcz komórki do stężenia 0,75 × 10⁵ komórek na komorę i odwiruj je w wirówce. Następnie zawieś osad w 30 µL pełnej pożywki do hodowli CHO-ICAM na jedną komorę przepływową i powoli nanieś 30 µL aliquotów komórek do każdego zbiornika komory przepływowej.

Pozostaw komórki w inkubatorze w temperaturze 37 °C z 5% carbon dioxide przez pięć minut. Następnie dodaj 200 µL pełnej pożywki hodowlanej do obu zbiorników każdej komory i przenieś płytkę z powrotem do inkubatora na nocną inkubację. Po zbiorze limfocytów T, policz i rozcieńcz zawiesinę komórkową do stężenia 2 × 10⁶ komórek na komorę.

Następnie odwirować komórki i resuspendować osad w jednym mililitrze PBS, uzupełnionego o 1% glucose na każde 2×10⁶ limfocytów T. Następnie znakować limfocyty T w rozcieńczeniu 1:1000 CFSE, chroniąc przed światłem przez osiem minut w temperaturze pokojowej. Po zakończeniu inkubacji odwirować komórki i resuspendować osad w 240 µl medium RPMI bez surowicy na każdą komorę.

Następnie podzielić komórki do probówek o pojemności 1,5 ml (jedna probówka na każdą komorę) i przechowywać je w bloku grzewczym w temperaturze 37 °C do momentu załadunku. Przed obrazowaniem rozgrzać komorę do obrazowania na żywo mikroskopu do 37 °C i napełnić 500 ml szklaną butelkę wodą. Wykonać w zakrętce dwa otwory oznaczone jako „wejście” (in) i „wyjście” (out), a następnie przeprowadzić wąż łączący strzykawkę przez otwór wejściowy, a wąż łączący zbiornik wejściowy przez otwór wyjściowy.

Użyj strzykawki o pojemności 60 ml, aby przepłukać wlotowy wąż 60 ml wody, a następnie 60 ml pożywki bez surowicy o temperaturze 37 °C, aby usunąć z układu wszelkie pęcherzyki powietrza. Po przygotowaniu węża przenieś cały układ wlotowy do komory do obrazowania żywych komórek mikroskopu, aby utrzymać system w temperaturze 37 °C. Wyprowadź wąż i strzykawkę poza komorę, a następnie umieść strzykawkę w pompie strzykawkowej.

Następnie w pokrywce butelki o pojemności 250 ml, która będzie służyć jako pojemnik na odpady, wykonaj otwór i przejdź przez niego rurkę odpływową do wnętrza butelki. Następnie lekko zakręć pokrywkę butelki z odpływem i umieść cały zestaw odpływowy w komorze do obrazowania na żywo. Teraz umieść szkiełko z komorą przepływową na stoliku mikroskopu i użyj obiektywu 20X, aby ustawić płaszczyznę ogniskowania na monowarstwie CHO ICAM.

Następnie, zaczynając od kontroli niestymulowanej, odrzuć trzy objętości po 70 µL z zbiornika wylotowego pierwszej komory i dodaj trzy objętości po 70 µL limfocytów T znakowanych CFSE do zbiornika wlotowego. Podczas przemieszczania się limfocytów T z wlotu do wylotu, wykonaj obrazowanie pięciu losowych pól limfocytów T pozytywnych pod kątem CFSE w każdej komorze, aby uzyskać liczbę komórek przed przepływem. Następnie jednocześnie podłącz węże wlotowe i wylotowe do zbiorników komory przepływowej, dbając o to, aby nie wprowadzić pęcherzyków powietrza, i rozpocznij przepływ wywołujący naprężenie ścinające z prędkością 0,3 ml/min, kontynuując obserwację limfocytów T barwionych CFSE.

Gdy tylko zaobserwowany zostanie ruch limfocytów T, należy uruchomić stoper na pięć minut i zakończyć przepływ po upływie tego czasu. Następnie należy obrazować pięć pól z komórkami pozytywnymi pod kątem CFSE w każdej komorze, wybierając pola losowo w celu uzyskania liczby komórek po przepływie. W przypadku stymulacji PMA, jedną probę limfocytów T należy stymulować PMA w celu uzyskania kontroli pozytywnej bezpośrednio przed załadowaniem limfocytów T do drugiej komory przepływowej do obrazowania, zgodnie z powyższą demonstracją.

W celu stymulacji SDF-1 alfa, najpierw należy pobrać trzy 70 µl aliquoty medium z zbiornika wyjściowego trzeciej komory, a następnie dodać 70 µl SDF-1 alfa do zbiornika wejściowego. Po pięciu minutach należy usunąć trzy 70 µl aliquoty ze zbiornika wyjściowego i dodać pozostałą probówkę z limfocytami T do obrazowania, zgodnie z wcześniejszą demonstracją. Na tych reprezentatywnych obrazach przed rozpoczęciem przepływu obserwuje się podobną liczbę limfocytów T w różnych warunkach stymulacji.

Po pięciu minutach ciągłego naprężenia ścinającego liczba adherentnych limfocytów T wzrasta w warunkach stymulacji PMA oraz SDF-1 alpha, podczas gdy niewielka liczba niestymulowanych limfocytów T pozostaje przytwierdzona. Rzeczywiście, aktywacja limfocytów T za pomocą SDF-1 alpha powoduje niemal dwukrotny wzrost adhezji limfocytów T w porównaniu z niestymulowanymi komórkami kontrolnymi. Ponadto, po obliczeniu procentowej adhezji pierwotnych ludzkich limfocytów T CD3-dodatnich w obecności lub w nieobecności SDF-1 alpha, stwierdzono, że w warunkach naprężenia ścinającego adhezję wykazuje 15% niestymulowanych limfocytów T, w porównaniu do 50% limfocytów T w warunkach aktywacji SDF-1 alpha.

Po opanowaniu tej techniki można ją z powodzeniem rozszerzyć na sześć komór eksperymentalnych w jednym badaniu. Podczas wykonywania tej procedury należy pamiętać, aby pracować wyłącznie z konfluencyjną monowarstwą ICAM. Po zakończeniu tej procedury na uzyskanych obrazach można przeprowadzić inne analizy, takie jak analiza kształtu komórek, w celu udzielenia odpowiedzi na dodatkowe pytania.

Po obejrzeniu tego filmu powinni Państwo posiadać gruntowną wiedzę na temat tego, jak ilościowo określić adhezję komórek w warunkach stresu ścinającego. Dziękujemy za obejrzenie tego filmu i życzymy powodzenia w przeprowadzaniu eksperymentów.