Name: Test adhezji pod wpływem naprężenia ścinającego do badania oddziaływań cząsteczki adhezyjnej limfocytów T (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-06-29T16:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 40 s
Description: Poznaj test adhezji pod wpływem naprężenia ścinającego do badania interakcji limfocytów T z komórkami nabłonkowymi. Ta metoda umożliwia ilościową analizę adhezji komórek T i aktywacji integrin.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Fundacja Badań Reumatologicznych i Hirschil Trust wsparły tę pracę.

1. Posiewanie komórek CHO-ICAM
Uwaga: Celem tego etapu jest umieszczenie komórek CHO-ICAM w komorach przepływowych w celu wzrostu przez noc w celu wytworzenia zlewającej się monowarstwy.
<ol>
	<li>Komórki CHO-ICAM należy utrzymywać w 10-centymetrowych szalkach hodowlanych poddanych kulturze tkankowej w 10 ml pożywki RPMI uzupełnionej 10% płodową surowicą bydlęcą (FBS) i 1% penicyliną/streptomycyną (kompletne pożywki hodowlane CHO-ICAM) w temperaturze 37 °C przy 5% CO2 .</li>
	<li>Aby zebrać komórki, dodaj 1 ml 0,5% trypsyny-EDTA i inkubuj w temperaturze pokojowej przez 1 minutę z delikatnym wstrząsaniem. Zneutralizuj trypsynę za pomocą 4 ml pożywki.</li>
	<li>Policz komórki CHO-ICAM za pomocą hemacytometru i oblicz 0,75 x 105 komórek na komorę. Uwaga: W tym eksperymencie: 2,25 x 105 komórek będzie potrzebnych do zasiania 3 komór.</li>
	<li>Odwirować 0,75 x 105 komórek CHO-ICAM w komorze przez 5 minut przy 500 x g, temperaturze pokojowej i ponownie zawiesić osad komórkowy w 30 μl na komorę kompletnej pożywki hodowlanej CHO-ICAM. 
	Uwaga: W tym eksperymencie 90 μl będzie potrzebne do zasiania 3 komór.</li>
	<li>Powoli wsypuj ogniwa do jednego zbiornika komory przepływowej. Pozostawić komórki na 5 minut w inkubatorze o temperaturze 37 °C z 5% CO2 .</li>
	<li>Dodać 200 μl kompletnych pożywek hodowlanych do dwóch zbiorników każdej komory. Naprzemiennie dodawaj między nimi, aby uniknąć ruchu komórek w miarę równowagi systemu.</li>
	<li>Inkubować komórki przez noc w inkubatorze o temperaturze 37 °C z 5% CO2 .</li>
</ol>
2. Przygotowanie limfocytów T
Uwaga: Ten test można wykonać na pierwotnych ludzkich limfocytach T lub linii komórek T. Protokół izolacji limfocytów T z krwi został opisany wcześniej. 10 Jeśli używasz pierwotnych ludzkich limfocytów T, użyj świeżo wyizolowanych komórek, aby uzyskać najlepsze wyniki. Jeśli używasz linii komórek T, postępuj zgodnie z protokołem hodowli określonym przez źródło komórek. W celu wykrycia komórek pod mikroskopem fluorescencyjnym, limfocyty T znakuje się estrem sukcynimidylu karboksylowo-fluoresceinowym (CFSE).
<ol>
	<li>Policz limfocyty T za pomocą hemacytometru i oblicz 2 x 106 komórek na komorę. Uwaga: W tym eksperymencie 6 x 106 komórek będzie potrzebnych na 3 komory.</li>
	<li>Odwirować 2 x 106 limfocytów T na komorę przez 5 minut w temperaturze 500 x g i ponownie zawiesić komórki w 1 ml soli fizjologicznej buforowanej fosforanami (PBS) zawierającej 1% glukozy lub 2% FBS.</li>
	<li>Dodać CFSE w rozcieńczeniu 1:1,000 (zapas do 5 mM). Przykryć przed światłem i inkubować przez 8 minut w temperaturze pokojowej</li>
	<li>Wirować z prędkością 500 x g przez 5 minut, RT.</li>
	<li>Zawiesić osad komórkowy z 240 μl na warunek (patrz sekcja 4 "Uwaga") pożywki RPMI pozbawionej surowicy. W tym eksperymencie ponownie zawieś osad ogniwa w 720 μl zwykłego RPMI. Podziel komórki na puste probówki o pojemności 1,5 ml oznaczone dla każdej komory, po 240 μl na probówkę. Przechowuj komórki w bloku grzewczym o temperaturze 37 °C do czasu użycia.</li>
</ol>
3. Konfiguracja pompy przewożącej i strzykawkowej wejścia/wyjścia
<ol>
	<li>Ogrzać komorę obrazowania na żywo mikroskopu do 37 °C.</li>
	<li>Przygotuj wąż wejściowy:
	<ol>
		<li>Napełnij szklaną butelkę o pojemności 500 ml wodą i zrób 2 otwory w pokrywce. Oznacz otwory "do wewnątrz" i "na zewnątrz". Będzie to działać jak łaźnia wodna do podgrzewania dla mediów wejściowych.</li>
		<li>Przeprowadź wąż wejściowy przez otwory w pokrywie i do łaźni wodnej. Upewnij się, że strona węża, która łączy się ze strzykawką, przechodzi przez otwór "wejściowy", a strona, która będzie łączyć się ze zbiornikiem wejściowym, przechodzi przez otwór "wyjściowy".</li>
		<li>Przepłukać wąż wejściowy 60 ml wody, aby usunąć powietrze z systemu.</li>
		<li>Zalać wąż wejściowy pożywką RPMI bez surowicy podgrzanej do 37 °C. Napełnić strzykawkę o pojemności 60 ml i przepchnąć przez nią pożywkę, aż wąż zostanie całkowicie zalany i nie będzie w nim pęcherzyków powietrza. 
		Uwaga: W zależności od długości użytych przewodów, objętość wymagana do zalania będzie się różnić.
		<ol>
			<li>Oblicz objętość pożywki potrzebną do eksperymentu, mnożąc natężenie przepływu (tutaj 0,3 ml/min) przez liczbę minut (5 min) przez liczbę komór w doświadczeniu (tutaj 3); w tym doświadczeniu użyj pożywki o objętości 4,5 ml. Uwaga: Zalecamy, aby po zalaniu w strzykawce pozostało 5 ml dodatkowej objętości (w tym przypadku łącznie 9,5 ml).</li>
		</ol>
		</li>
		<li>Umieść cały zestaw wejściowy w obudowie mikroskopu do obrazowania na żywo, aby utrzymać temperaturę 37 °C. Wyprowadzić wąż i strzykawkę z obudowy i załadować strzykawkę do pompy strzykawkowej.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Przygotuj wąż wyjściowy:
	<ol>
		<li>Zrób otwór w wieczku butelki o pojemności 250 ml, aby wykorzystać go jako odpad wyjściowy.</li>
		<li>Przeprowadź rurkę wyjściową przez otwór i do butelki. Luźno zabezpiecz pokrywę, nie zamykając się do końca.</li>
		<li>Umieść zestaw wyjściowy w obudowie do obrazowania na żywo mikroskopu.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Obliczyć natężenie przepływu (ml/min) niezbędne do wytworzenia pożądanego naprężenia ścinającego (dyn/cm2). Naprężenie ścinające różni się w różnych przedziałach naczyniowych, dlatego przy podejmowaniu decyzji o poziomie naprężenia ścinającego należy wziąć pod uwagę ogólny model, w tym typy komórek, które mają być badane, oraz metody leczenia. 
	Uwaga: Eksperymenty te przeprowadza się przy 0,4 dyn/cm2, aby ściśle naśladować ustawienie małej żyły.
	<ol>
		<li>Przy obliczaniu naprężenia ścinającego należy uwzględnić wymiary komory. Dla zastosowanych tutaj komór przepływowych należy zastosować następujący wzór (dostarczony przez producenta11) (patrz tabela materiałów): T = η * 176,1 * ø, gdzie T = naprężenie ścinające, η = lepkość dynamiczna, ø = natężenie przepływu. Uwaga: Lepkość dynamiczna mediów RPMI w temperaturze 37 °C wynosi 0,007.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
4. Ładowanie komór przepływowych i stymulacja komórek
Uwaga: Aby zainicjować adhezję, limfocyty T muszą być stymulowane. W poniższym eksperymencie komórki albo pozostaną niestymulowane, albo są stymulowane SDF-1α12 lub octanem mirystynianu forbolu (PMA; kontrola pozytywna)13. W celu prawidłowej prezentacji chemokiny limfocytom T, komórki CHO-ICAM są wstępnie inkubowane z SDF-1α (po czym następuje seryjne płukanie), co pozwala na prezentację na powierzchni komórki. PMA jest estrem forbolu, który jest strukturalnie podobny do drugiego przekaźnika diacyloglicerolu (DAG); Tutaj jest używany jako kontrola pozytywna. Limfocyty T są bezpośrednio traktowane PMA przed załadowaniem do komory przepływowej.
<ol>
	<li>Umieść szkiełko z komorą przepływową na mikroskopie i ustaw płaszczyznę ogniskową na monowarstwie CHO-ICAM za pomocą obiektywu 20X.</li>
	<li>Utrzymuj limfocyty T barwione CFSE dla wszystkich innych warunków w bloku grzewczym o temperaturze 37 °C. Przygotować limfocyty CHO-ICAM lub T w następujący sposób bezpośrednio przed testem dla tego stanu:
	<ol>
		<li>W stanie niestymulowanym (komora 1) należy trzymać jedną rurkę/komorę przepływową nieleczoną, aby służyła jako negatywna kontrola stymulacji.</li>
		<li>W przypadku stymulacji PMA (komora 2) należy stymulować jedną rurkę limfocytów T PMA (10 ng / ml), aby służyła jako kontrola pozytywna; leczyć bezpośrednio przed załadowaniem do komory przepływowej.</li>
		<li>W przypadku stymulacji SDF-1α (komora 3) należy stymulować trzecią komorę przepływu SDF-1α (100 ng / ml), usuwając jednorazowo 70 μl 3 razy z górnego zbiornika (zbiornika wyjściowego), a następnie dodając 70 μl SDF-1α (100 ng / ml) do dolnego zbiornika (zbiornika wejściowego). Inkubować przez 5 minut.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Wyjąć i wyrzucić jednorazowo 30 μl ze zbiornika wyjściowego jednej komory.</li>
	<li>Dodać 70 μl wstępnie poddanej obróbce (w stosownych przypadkach) zawiesiny limfocytów T do zbiornika wejściowego 3 razy. Odczekaj 5 minut, aby komórki mogły przesunąć się z wlotu komory ("In") i dotrzeć do bliższego wylotu ("Out") komory.</li>
	<li>W tym czasie zobrazuj 5 pól dla limfocytów T barwionych CFSE. Wybierz pola, które są rozproszone po środku komory (Rysunek 1). Stosować następujące warunki wzbudzenia/emisji: długość fali lasera wzbudzenia: 488 nm; Filtr zbierający emisje: 500 - 540 nm. Obrazy te będą służyć jako zliczanie komórek przed przepływem.</li>
	<li>Podłącz jednocześnie rurkę wejściową i wyjściową do zbiorników komory przepływowej. 
	Uwaga: Jednoczesne podłączenie rurki ma kluczowe znaczenie, aby nie wprowadzać pęcherzyków powietrza do komory i utrzymać ogólną równowagę w komorze.</li>
	<li>Rozpocznij przepływ od 0,3 ml/min (0,4 dyn/cm2), wizualizując limfocyty T barwione CFSE. Gdy zaczyna się przepływ, zwłaszcza w pierwszej komorze, często występuje opóźnienie między zainicjowaniem przepływu a obserwacją toczenia się limfocytów T, dlatego rozpocznij czas 5 minut na początku ruchu limfocytów T.</li>
	<li>Zakończ przepływ po 5 minutach i zobrazuj 5 pól w kanale CFSE. Wybierz pola losowo rozproszone w środku komory przepływowej (rysunek 1). Obrazy te będą służyć jako zliczanie komórek po przepływie.</li>
</ol>
5. Określanie procentu przylegających komórek
Uwaga: Określenie liczby komórek w pozyskanych obrazach odbywa się obiektywnie za pomocą zautomatyzowanego oprogramowania. Do naszych badań użyliśmy oprogramowania Volocity (wersja 6.2.1), ale zastosowanie ma również inne oprogramowanie, takie jak ImageJ (wersja 1.48V).
<ol>
	<li>Określ liczbę komórek na pole przepływu wstępnego dla każdego warunku. Średnia z 5 pól to "średnia liczba komórek przed przepływem". 7</li>
	<li>Określ liczbę komórek na pole po przepływie dla każdego warunku. Średnia z 5 pól to "średnia liczba komórek po przepływie"7</li>.
	<li>Oblicz procent przylegających komórek, korzystając z następującego wzoru: Procent przylegających komórek = (średnia liczba komórek po przepływie)/(średnia liczba komórek przed przepływem) x 100%.</li>
</ol>

<ol><li>Alon, R., Ley, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cells+on+the+run%3A+shear-regulated+integrin+activation+in+leukocyte+rolling+and+arrest+on+endothelial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Opin+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Cells on the run: shear-regulated integrin activation in leukocyte rolling and arrest on endothelial cells.</a> Curr Opin Cell Biol. 20 (5), 525-532 (2008).</li>
<li>Ley, K., Laudanna, C., Cybulsky, M. I., Nourshargh, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Getting+to+the+site+of+inflammation%3A+the+leukocyte+adhesion+cascade+updated%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Immunol%22%5BJournal%5D)">Getting to the site of inflammation: the leukocyte adhesion cascade updated.</a> Nat Rev Immunol. 7 (9), 678-689 (2007).</li>
<li>Dustin, M. L., Bivona, T. G., Philips, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Membranes+as+messengers+in+T+cell+adhesion+signaling%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Immunol%22%5BJournal%5D)">Membranes as messengers in T cell adhesion signaling.</a> Nat Immunol. 5 (4), 363-372 (2004).</li>
<li>Mor, A., Dustin, M. L., Philips, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Small+GTPases+and+LFA-1+reciprocally+modulate+adhesion+and+signaling%5BTitle%5D)+AND+%22Immunol+Rev%22%5BJournal%5D)">Small GTPases and LFA-1 reciprocally modulate adhesion and signaling.</a> Immunol Rev. 218, 114-125 (2007).</li>
<li>Rose, D. M., Alon, R., Ginsberg, M. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Integrin+modulation+and+signaling+in+leukocyte+adhesion+and+migration%5BTitle%5D)+AND+%22Immunol+Rev%22%5BJournal%5D)">Integrin modulation and signaling in leukocyte adhesion and migration.</a> Immunol Rev. 218, 126-134 (2007).</li>
<li>Alon, R., Feigelson, S. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chemokine-triggered+leukocyte+arrest%3A+force-regulated+bi-directional+integrin+activation+in+quantal+adhesive+contacts%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Opin+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Chemokine-triggered leukocyte arrest: force-regulated bi-directional integrin activation in quantal adhesive contacts.</a> Curr Opin Cell Biol. 24 (5), 670-676 (2012).</li>
<li>Su, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rap1+and+its+effector+RIAM+are+required+for+lymphocyte+trafficking%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Rap1 and its effector RIAM are required for lymphocyte trafficking.</a> Blood. 126 (25), 2695-2703 (2015).</li>
<li>Judokusumo, E., Tabdanov, E., Kumari, S., Dustin, M. L., Kam, L. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanosensing+in+T+lymphocyte+activation%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys+J%22%5BJournal%5D)">Mechanosensing in T lymphocyte activation.</a> Biophys J. 102 (2), L5-L7 (2012).</li>
<li>Zeltzer, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Diminished+adhesion+of+CD4%2B+T+cells+from+dialysis+patients+to+extracellular+matrix+and+its+components+fibronectin+and+laminin%5BTitle%5D)+AND+%22Nephrol+Dial+Transplant%22%5BJournal%5D)">Diminished adhesion of CD4+ T cells from dialysis patients to extracellular matrix and its components fibronectin and laminin.</a> Nephrol Dial Transplant. 12 (12), 2618-2622 (1997).</li>
<li>Strazza, M., Azoulay-Alfaguter, I., Pedoeem, A., Mor, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Static+adhesion+assay+for+the+study+of+integrin+activation+in+T+lymphocytes%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Static adhesion assay for the study of integrin activation in T lymphocytes.</a> J Vis Exp. (88), (2014).</li>
<li>Ibidi GmbH. Shear stress and shear rates for ibidi μ-Slides - based on numerical calculations. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%22Application+Note+11%22">Application Note 11</a>. , Available from: 
 <a target="_blank" href="http://ibidi.com/fileadmin/support/application_notes/AN11_Shear_stress.pdf">http://ibidi.com/fileadmin/support/application_notes/AN11_Shear_stress.pdf</a> (2014).</li>
<li>van Gijsel-Bonnello, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pantethine+Alters+Lipid+Composition+and+Cholesterol+Content+of+Membrane+Rafts%2C+With+Down-Regulation+of+CXCL12-Induced+T+Cell+Migration%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Physiol%22%5BJournal%5D)">Pantethine Alters Lipid Composition and Cholesterol Content of Membrane Rafts, With Down-Regulation of CXCL12-Induced T Cell Migration.</a> J Cell Physiol. 230 (10), 2415-2425 (2015).</li>
<li>Tozeren, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Micromanipulation+of+adhesion+of+phorbol+12-myristate-13-acetate-stimulated+T+lymphocytes+to+planar+membranes+containing+intercellular+adhesion+molecule-1%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys+J%22%5BJournal%5D)">Micromanipulation of adhesion of phorbol 12-myristate-13-acetate-stimulated T lymphocytes to planar membranes containing intercellular adhesion molecule-1.</a> Biophys J. 63 (1), 247-258 (1992).</li>
<li>Mortier, A., Van Damme, J., Proost, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Overview+of+the+mechanisms+regulating+chemokine+activity+and+availability%5BTitle%5D)+AND+%22Immunol+Lett%22%5BJournal%5D)">Overview of the mechanisms regulating chemokine activity and availability.</a> Immunol Lett. 145 (1-2), 2-9 (2012).</li>
<li>Rot, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+situ+binding+assay+for+studying+chemokine+interactions+with+endothelial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol+Methods%22%5BJournal%5D)">In situ binding assay for studying chemokine interactions with endothelial cells.</a> J Immunol Methods. 273 (1-2), 63-71 (2003).</li>
<li>Yang, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ICAM-1+regulates+neutrophil+adhesion+and+transcellular+migration+of+TNF-alpha-activated+vascular+endothelium+under+flow%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">ICAM-1 regulates neutrophil adhesion and transcellular migration of TNF-alpha-activated vascular endothelium under flow.</a> Blood. 106 (2), 584-592 (2005).</li>
<li>Long, E. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ICAM-1%3A+getting+a+grip+on+leukocyte+adhesion%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol%22%5BJournal%5D)">ICAM-1: getting a grip on leukocyte adhesion.</a> J Immunol. 186 (9), 5021-5023 (2011).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Aby prawidłowo przeanalizować adhezję limfocytów T, przy wyborze metody in vitro należy wziąć pod uwagę stymulant, który ma zostać włączony do badania. Chociaż istnieje kilka testów do badania sygnałów prowadzących do aktywacji LFA-1 i wiązania ICAM-1, wszystkie metody nie są wymienne. Statyczny test adhezji10 najlepiej nadaje się do badania interakcji limfocytów T z APC; alternatywnie, opisana tutaj metoda naprężeń ścinających jest idealna do modelowania interakcji komórek T - komórek nabłonkowych. <...

T pośredniczy w wielu różnych procesach w zdrowym układzie odpornościowym,3 odgrywając kluczową rolę w transporcie limfocytów T i prezentacji antygenu. Niezależnie od tego, czy chodzi o nadzór immunologiczny, czy aktywną odpowiedź immunologiczną, te dwie szerokie role adhezji mają kluczowe znaczenie. 4 Fizjologiczne zdarzenia sygnalizacyjne interakcji limfocytów T ze śródbłonkiem różnią się od interakcji limfocytów T z komórkami prezentującymi antygen (APC) i dlatego wymagają odrębnych metod badań, aby jak najlepiej zrozumieć zaangażowane kaskady sygnałowe. Mocne przyleganie limfocytów T do ściany naczynia krwionośnego podczas wynaczynienia limfocytów wymaga szybkiej i dynamicznej aktywacji integryny. Ścisła interakcja między integryną w stanie aktywnym a cząsteczkami adhezyjnymi wzdłuż śródbłonka prowadzi do adhezji odpornej na przepływ krwi, umożliwiając limfocytom T czołganie się po powierzchni w poszukiwaniu obszaru umożliwiającego przejście komórek. 5 Pełzanie limfocytu T dwukierunkowo wzdłuż ściany naczynia krwionośnego zależy od spolaryzowanej adhezji, z wyraźnym adhezyjnym przednim końcem limfocytu T. 6 Co najważniejsze, mocne przyleganie i transmigracja wymagają odporności na siłę ścinającą generowaną przez krążący przepływ krwi.
Podczas projektowania eksperymentów do badania adhezji limfocytów, należy zwrócić uwagę na konkretny bodziec, który nas interesuje. Podczas gdy aktywacja integryny jest powszechnym i krytycznym składnikiem wszystkich form adhezji limfocytów T, kaskady aktywacji mogą być unikalne za poszczególnymi receptorami i koreceptorami. Podobnie pary cząsteczek integryny i adhezji funkcjonują w wyspecjalizowanych mikrośrodowiskach i w określonych subpopulacjach. W ten sposób pary te mogą być regulowane w zupełnie inny sposób. Przedstawiony model idealnie nadaje się do badania kaskad sygnalizacyjnych prowadzących do aktywacji integryny zachodzącej w warunkach naprężeń ścinających. 7 Oddziaływania te nie mogą być odpowiednio zrozumiane w statycznym systemie adhezyjnym ze względu na wpływ, jaki siły te mają bezpośrednio na zachowanie limfocytów T. 8 Chociaż przedstawiono tutaj limfocyty T i komórki CHO (jajnik chomika chińskiego) zmodyfikowane do ekspresji ludzkiego ICAM-1 (komórki CHO-ICAM), system można łatwo zmodyfikować w celu badania różnych populacji leukocytów lub cząsteczek adhezyjnych.
Ten test dostarcza metody ilościowego określania adhezji limfocytów T i aktywacji integryny za pomocą naprężenia ścinającego, dostarczając model dla etapu mocnej adhezji wynaczynienia leukocytów. Dzięki zastosowaniu komórek CHO-ICAM można badać powinowactwo LFA-1 do jego liganda w żywych komórkach w czasie rzeczywistym w odpowiedzi na różne bodźce będące przedmiotem zainteresowania. Technika ta wymaga łatwo dostępnych, dostępnych na rynku komór mikroprzepływowych w połączeniu z pompą strzykawkową, co znacznie upraszcza sprzęt niezbędny do modelowania przepływu krwi i naprężeń ścinających w porównaniu z innymi modelami. 9 Kolejną ważną zaletą tego testu jest to, że specyficzne kaskady sygnałowe i wynikający z nich stan aktywacji poszczególnych integryn można czysto badać za pomocą zmodyfikowanych komórek CHO wyrażających interesujące nas ludzkie cząsteczki adhezyjne. Dodatkowo istotną zaletą tej metody jest połączenie danych ilościowych z obrazowaniem żywych komórek. Ogólnie rzecz biorąc, chociaż opisano szereg testów statycznej adhezji limfocytów T, które ładnie modelują interakcje limfocytów T z APC, modele te są niewystarczające do uchwycenia dynamicznego procesu adhezji nabłonka limfocytów T. Z tego powodu przy wyborze testu adhezyjnego należy wziąć pod uwagę dany bodziec.

<table><tbody><tr><td>Próbki limfocytów T (linia komórkowa lub pierwotna)</td><td>ATCC</td><td>TIB-152</td><td>Obwodowe ludzkie limfocyty T</td></tr><tr><td>Komórki CHO-ICAM-1</td><td>ATCC</td><td>CRL-2093</td><td></td></tr><tr><td>&micro;-Slide VI 0,4 ibiTreat</td><td>ibidi</td><td>80606</td><td></td></tr><tr><td>500 ml szklana butelka</td><td>Fisher</td><td>FB800500</td><td></td></tr><tr><td>250 ml</td><td>Fisher</td><td>FB800250</td><td></td></tr><tr><td>Silikon rurka 0,8 mm</td><td>ibidi</td><td>10841</td><td></td></tr><tr><td>Mikroskop konfokalny z komorą inkubatora</td><td>Ziess</td><td>700</td><td>Dowolny mikroskop fluorescencyjny o szerokim polu</td></tr><tr><td>widzenia Pompa strzykawkowa</td><td>New Era Pump Systems</td><td>NE-300</td><td></td></tr><tr><td>60 ml strzykawka</td><td>BD</td><td>309653</td><td></td></tr><tr><td>CFSE</td><td>eBioscience</td><td>65-0850</td><td></td></tr><tr><td>SDF-1&alpha;</td><td>R& D</td><td>350-NS-010/CF</td><td></td></tr><tr><td>RPMI</td><td>Lonza</td><td>12-702F/12</td><td></td></tr><tr><td>PBS&nbsp;</td><td>Wirówka mikrowirowa Lonza</td><td>17-516F</td><td></td></tr><tr><td></td><td>Eppendorf&nbsp;</td><td>5424</td><td></td></tr><tr><td>D-Glucose</td><td>Sigma Aldrich</td><td>G8270&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>PMA</td><td>Sigma Aldrich</td><td>16561-29-8</td><td></td></tr><tr><td>Oprogramowanie Volocity</td><td>Perkin Elmer</td><td>Wersja 6.2.1</td><td></td></tr><tr><td>Oprogramowanie ImageJ</td><td></td><td>NIH Wersja 1.48V</td><td></td></tr><tr><td>Naczynia hodowlane poddane kulturom tkankowym</td><td>Falcon</td><td>353003</td><td></td></tr><tr><td>Trypsin-EDTA (0,25%) Czerwień fenolowa</td><td>Gibco</td><td>25200114</td><td></td></tr><tr><td>Inaktywowany termicznie FBS</td><td>Denville</td><td>FB5001-H</td><td></td></tr><tr><td>Penicylina/Streptomycyna</td><td>Fisher BP295950</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

test adhezji pod wpływem naprężenia ścinającego do badania oddziaływań cząsteczki adhezyjnej limfocytów t

Assay of Adhesion Under Shear Stress for the Study of T Lymphocyte-Adhesion Molecule Interactions

Ogólnie rzecz biorąc, adhezja limfocytów T jest kluczowym składnikiem funkcji, przyczyniając się do odrębnych procesów rekrutacji komórek do miejsc zapalenia i interakcji z komórkami prezentującymi antygen (APC) w tworzeniu synaps immunologicznych. Te dwa konteksty adhezji limfocytów T różnią się tym, że interakcje limfocytów T z APC można uznać za statyczne, podczas gdy interakcje limfocytów T z naczyniami krwionośnymi są kwestionowane przez naprężenie ścinające generowane przez samą cyrkulację. Interakcje limfocytów T-APC są klasyfikowane jako statyczne, ponieważ dwaj partnerzy komórkowi są statyczni względem siebie. Zwykle ta interakcja zachodzi w węzłach chłonnych. Gdy limfocyt T oddziałuje ze ścianą naczynia krwionośnego, komórki zatrzymują się i muszą oprzeć się generowanemu naprężeniu ścinającemu. 1,2 Różnice te podkreślają potrzebę lepszego zrozumienia adhezji statycznej i adhezji w warunkach przepływu jako dwóch odrębnych procesów regulacyjnych. Regulację adhezji limfocytów T można najzwięźlej opisać jako kontrolowanie stanu powinowactwa cząsteczek integryny wyrażanych na powierzchni komórki, a tym samym regulowanie interakcji integryn z ligandami cząsteczek adhezyjnych wyrażonymi na powierzchni oddziałującej komórki. Nasza obecna wiedza na temat regulacji stanów powinowactwa integryny wywodzi się z często uproszczonych systemów modelowych in vitro. Opisany tutaj test adhezji przy użyciu warunków przepływu pozwala na wizualizację i dokładne określenie ilościowe interakcji limfocytów T z komórkami nabłonkowymi w czasie rzeczywistym po bodźcu. Test adhezji pod przepływem można zastosować do badań sygnalizacji adhezji w limfocytach T po leczeniu substancjami hamującymi lub stymulującymi. Ponadto test ten można rozszerzyć poza sygnalizację limfocytów T na dowolną populację leukocytów adhezyjnych i dowolną parę cząsteczek adhezyjnych integryny.

Przedstawiono reprezentatywne wyniki testu adhezji w przepływie z użyciem komórek Jurkat oraz pierwotnych ludzkich limfocytów T CD3+, zgodnie z oznaczeniami, stymulowanych SDF-1α. Kontrolami negatywnymi we wszystkich pokazanych eksperymentach są komórki niestymulowane. Próg podstawowego procentu adhezji komórek niestymulowanych wynosi od 5 do 10%; adhezja bazowa znacząco przekraczająca ten zakres wskazuje na problem z eksperymentem i sugeruje, że populacja wyjściowa limfocytów ...

Ten test adhezji przepływu dostarcza prostego, bardzo efektownego modelu interakcji limfocytów T z komórkami nabłonkowymi. Pompa strzykawkowa służy do generowania naprężeń ścinających, a mikroskopia konfokalna rejestruje obrazy w celu określenia ilościowego. Celem tych badań jest skuteczne ilościowe określenie adhezji limfocytów T przy użyciu warunków przepływu.

Test adhezji pod wpływem naprężenia ścinającego do badania oddziaływań cząsteczki adhezyjnej limfocytów T

Overall, T cell adhesion is a critical component of function, contributing to the distinct processes of cellular recruitment to sites of inflammation and ...

Ogólnym celem niniejszego analizy jest określenie wpływu badanych preparatów na adhezję komórkową w warunkach stresu ścinającego. Metoda ta może pomóc w odpowiedzi na kluczowe pytania z dziedziny sygnalizacji komórek odpornościowych, takie jak czynniki pośredniczące w aktywacji integryn. Główną zaletą tej techniki jest możliwość badania pojedynczych par cząsteczek adhezyjnych integryn w łatwo replikowalnym systemie przepływowym.Chociaż metoda ta pozwala uzyskać wgląd w aktywację LFA1, można ją również zastosować do badania innych integryn. Zazwyczaj osoby początkujące w tej metodzie mogą napotkać trudności, ponieważ konfiguracja techniczna musi zostać przeprowadzona precyzyjnie. Aby zebrać komórki CHO-ICAM, poddaj kulturę działaniu 0,5% trypsyny EDTA przez jedną minutę w temperaturze pokojowej, delikatnie potrząsając naczyniem.Gdy komórki zaczną się odklejać, zneutralizuj trypsynę za pomocą czterech mililitrów świeżej pożywki i policz liczbę dysocjowanych komórek. Rozcieńcz komórki do stężenia 0,75 × 10⁵ komórek na komorę i odwiruj je w wirówce. Następnie zawieś osad w 30 µL pełnej pożywki do hodowli CHO-ICAM na jedną komorę przepływową i powoli nanieś 30 µL aliquotów komórek do ka

assay-adhesion-under-shear-stress-for-study-t-lymphocyte-adhesion

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologia i infekcje

Podczas procesu infekcji kluczowym etapem jest adhezja patogenów do komórek gospodarza. W większości przypadków etap adhezji ten zachodzi w obecności stresu mechanicznego generowanego przez przepływającą ciecz. Opisujemy technikę, która wprowadza naprężenie ścinające jako istotny parametr w badaniu adhezji bakteryjnej.

Wprowadzenie naprężenia ścinającego w badaniach nad adhezją bakteryjną

Opisano test częstotliwości adhezji służący do pomiaru kinetyki oddziaływań receptor-ligand w sytuacjach, gdy obie cząsteczki są zakotwiczone na powierzchniach oddziałujących komórek. Ten oparty na mechanice test został zilustrowany z wykorzystaniem ludzkiego erytrocyta poddanego ciśnieniu za pomocą mikropipety jako sensora adhezji oraz integryny αLβ2 i cząsteczki adhezyjnej międzykomórkowej 1 jako oddziałujących receptorów i ligandów.

Analiza częstotliwości adhezji w celu badania kinetyki in situ międzykomórkowych oddziaływań molekularnych w obrębie złączy komórkowych

Rekrutacja leukocytów do wątroby odbywa się w wyspecjalizowanych kanałach sinusoid wątrobowych, które są wyściełane unikalnymi komórkami śródbłonka sinusoidalnego wątroby.  Mikroskopia z kontrastem fazowym rekrutacji leukocytów przez ludzki śródbłonek sinusoidalny wątroby w warunkach fizjologicznego naprężenia ścinającego może ułatwić wyjaśnienie mechanizmów molekularnych, które leżą u podstaw tego procesu.

Test adhezji przepływowej do badania rekrutacji leukocytów do ludzkiego śródbłonka sinusoidalnego wątroby w warunkach naprężeń ścinających

Statyczny test adhezji to potężne narzędzie, które może być użyte do modelowania interakcji między limfocytami T a innymi typami komórek. Interakcje są generowane przez wstrzykiwanie znakowanych limfocytów T do studzienek pokrytych cząsteczkami adhezyjnymi, podczas gdy czytnik płytek służy do ilościowego określania liczby przylegających komórek po seryjnym płukaniu.

Statyczny test adhezyjny do badania aktywacji integryny w limfocytach T

Opisujemy metodę in vitro, która pozwala na ilościowe określenie rzeczywistej liczby komórek adhezyjnych w monowarstwie komórek śródbłonka.

Kwantyfikacja adhezji komórek śródbłonka in vitro

Zrosty powierzchniowe komórek są kluczowe w mechanotransdukcji, ponieważ przenoszą napięcie mechaniczne i inicjują szlaki sygnałowe zaangażowane w homeostazę i rozwój tkanek. W tym miejscu przedstawiamy protokół preparowania szlaków biochemicznych, które są aktywowane w odpowiedzi na napięcie, przy użyciu mikrokulek magnetycznych pokrytych ligandem i przyłożenia siły do receptorów adhezyjnych.

Analiza remodelingu adhezji powierzchni komórek w odpowiedzi na naprężenia mechaniczne za pomocą kulek magnetycznych

Leukocyty chętnie oddziałują z komórkami naczyniowymi i płytkami krwi po uszkodzeniu ściany naczynia lub podczas stanu zapalnego. W tym miejscu opisujemy prosty test oparty na przepływie laminarnym, aby scharakteryzować mechanizmy molekularne, które leżą u podstaw interakcji między leukocytami a ich partnerami komórkowymi.

Testy oparte na przepływie laminarnym w celu zbadania rekrutacji leukocytów na hodowanych komórkach naczyniowych i przylegających płytkach krwi

Dynamiczne przyleganie komórek odpornościowych do ściany naczynia jest warunkiem wstępnym dla naprowadzania jelit. W tym miejscu przedstawiamy protokół funkcjonalnego testu in vitro do analizy wpływu przeciwciał antyintegrynowych, chemokin lub innych czynników na dynamiczną adhezję komórek ludzkich za pomocą naczyń włosowatych pokrytych adresiną.

Dynamiczny test adhezyjny do analizy funkcjonalnej terapii przeciwadhezyjnych w nieswoistych zapaleniach jelit

Opisujemy metodę w roztworze, polegającą na zastosowaniu równomiernego ścinania do receptorów powierzchni płytek krwi za pomocą wiskozymetrii stożko-płytkowej. Metoda ta może być również stosowana w szerszym zakresie do stosowania ścinania do innych typów komórek i fragmentów komórek i nie musi być ukierunkowana na określoną parę ligand-receptor.

Jednolity test ścinania dla ludzkich receptorów płytkowych i komórkowych za pomocą wiskozymetrii stożkowo-płytkowej

Ta metoda jest przydatna do ilościowego określania wczesnej dynamiki adhezji komórkowej i rozprzestrzeniania się komórek zależnych od zakotwiczenia na fibronektynie. Ponadto test ten może być wykorzystany do zbadania wpływu zmienionej homeostazy redoks na rozprzestrzenianie się komórek i/lub wewnątrzkomórkowe szlaki sygnałowe związane z adhezją komórek.

Badanie dynamiki adhezji komórkowej i rozprzestrzeniania się komórek nabłonka na fibronektynie podczas stresu oksydacyjnego

Ten protokół przedstawia eksperymentalne procedury przeprowadzania testu śladu adhezyjnego w celu zobrazowania zdarzeń adhezji podczas szybkiej adhezji toczenia komórek.

Obrazowanie adhezji molekularnej w walcowaniu komórek za pomocą testu śladu adhezyjnego

Poznaj test adhezji pod wpływem naprężenia ścinającego do badania interakcji limfocytów T z komórkami nabłonkowymi. Ta metoda umożliwia ilościową analizę adhezji komórek T i aktywacji integrin.

Test adhezji pod wpływem naprężenia ścinającego do badania oddziaływań cząsteczki adhezyjnej limfocytów T

Przeglądaj więcej filmów