Name: Izolacja i ekspansja mezenchymalnych komórek macierzystych/zrębowych pochodzących z ludzkiej tkanki łożyska (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-06-06T14:10:00.000+00:00
Duration: 12 min 40 s
Description: Naucz się izolować i ekspandować mezenchymalne komórki macierzyste z ludzkiej tkanki łożyska. Procedura obejmuje manualną dyssekcję, trawienie enzymatyczne oraz hodowlę opartą na adherencji do plastiku.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

RP był wspierany przez National Health and Medical Research Council (NHMRC) Postdoctoral Training Fellowship. VS był wspierany przez stypendium University of Queensland International Postgraduate Student. MRD było wspierane przez NHMRC i Inner Wheel Australia.
Dziękujemy personelowi klinicznemu i pielęgniarskiemu za pomoc w wyrażeniu zgody pacjenta i pobraniu próbek. Dziękujemy prof. Nickolas Fisk, prof. Kerry Atkinson i dr Rohanowi Lourie za wnikliwe dyskusje na temat położnictwa, rozwoju płodu i łożyska oraz anatomii łożyska.

<ol><li>Brooke, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Therapeutic+applications+of+mesenchymal+stromal+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Semin+Cell+dev+Biol%22%5BJournal%5D)">Therapeutic applications of mesenchymal stromal cells.</a> Semin Cell dev Biol. 18, 846-858 (2007).</li>
<li>Wei, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mesenchymal+stem+cells%3A+a+new+trend+for+cell+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Phamacol+Sin%22%5BJournal%5D)">Mesenchymal stem cells: a new trend for cell therapy.</a> Acta Phamacol Sin. 34, 747-754 (2013).</li>
<li>Ma, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immunobiology+of+mesenchymal+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Death+Differ%22%5BJournal%5D)">Immunobiology of mesenchymal stem cells.</a> Cell Death Differ. 21, 216-225 (2014).</li>
<li>Timmins, N. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Closed+system+isolation+and+scalable+expansion+of+human+placental+mesenchymal+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechnol+Bioeng%22%5BJournal%5D)">Closed system isolation and scalable expansion of human placental mesenchymal stem cells.</a> Biotechnol Bioeng. 109, 1817-1826 (2012).</li>
<li>Barlow, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparison+of+human+placenta-+and+bone+marrow-derived+multipotent+mesenchymal+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cell+Dev%22%5BJournal%5D)">Comparison of human placenta- and bone marrow-derived multipotent mesenchymal stem cells.</a> Stem Cell Dev. 17, 1095-1107 (2008).</li>
<li>Jones, B. J., Brooke, G., Atkinson, K., McTaggart, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immunosuppression+by+placental+indoleamine+2%2C3-dioxygenase%3A+a+role+for+mesenchymal+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Placenta%22%5BJournal%5D)">Immunosuppression by placental indoleamine 2,3-dioxygenase: a role for mesenchymal stem cells.</a> Placenta. 28, 1174-1181 (2007).</li>
<li>Parolini, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Toward+cell+therapy+using+placenta-derived+cells%3A+disease+mechanisms%2C+cell+biology%2C+preclinical+studies%2C+and+regulatory+aspects+at+the+round+table%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cell+Dev%22%5BJournal%5D)">Toward cell therapy using placenta-derived cells: disease mechanisms, cell biology, preclinical studies, and regulatory aspects at the round table.</a> Stem Cell Dev. 19, 143-154 (2010).</li>
<li>Benirschke, K., Burton, G. J., Baergen, R. N. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aBenirschke%2C+K+%22Pathology+of+the+Human+Placenta%22">Pathology of the Human Placenta</a>. , 6 edn (2012).</li>
<li>Moore, K., Persaud, T., Torchia, M. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aMoore%2C+K+%22The+developing+human%3A+clinically+oriented+embryology%22">The developing human: clinically oriented embryology</a>. , Elsevier/ Saunders. (2013).</li>
<li>Parolini, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Concise+review%3A+isolation+and+characterization+of+cells+from+human+term+placenta%3A+outcome+of+the+first+international+Workshop+on+Placenta+Derived+Stem+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+cells%22%5BJournal%5D)">Concise review: isolation and characterization of cells from human term placenta: outcome of the first international Workshop on Placenta Derived Stem Cells.</a> Stem cells. 26, 300-311 (2008).</li>
<li>Brooke, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Manufacturing+of+human+placenta-derived+mesenchymal+stem+cells+for+clinical+trials%5BTitle%5D)+AND+%22Brit+J+Haematol%22%5BJournal%5D)">Manufacturing of human placenta-derived mesenchymal stem cells for clinical trials.</a> Brit J Haematol. 144, 571-579 (2009).</li>
<li>Pelekanos, R. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intracellular+trafficking+and+endocytosis+of+CXCR4+in+fetal+mesenchymal+stem%2Fstromal+cells%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+cell+biology%22%5BJournal%5D)">Intracellular trafficking and endocytosis of CXCR4 in fetal mesenchymal stem/stromal cells.</a> BMC cell biology. 15, 15(2014).</li>
<li>Chen, Y. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Small+molecule+mesengenic+induction+of+human+induced+pluripotent+stem+cells+to+generate+mesenchymal+stem%2Fstromal+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells+Transl+Med%22%5BJournal%5D)">Small molecule mesengenic induction of human induced pluripotent stem cells to generate mesenchymal stem/stromal cells.</a> Stem Cells Transl Med. 1, 83-95 (2012).</li>
<li>Heazlewood, C. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High+incidence+of+contaminating+maternal+cell+overgrowth+in+human+placental+mesenchymal+stem%2Fstromal+cell+cultures%3A+a+systematic+review%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells+Transl+Med%22%5BJournal%5D)">High incidence of contaminating maternal cell overgrowth in human placental mesenchymal stem/stromal cell cultures: a systematic review.</a> Stem Cells Transl Med. 3, 1305-1311 (2014).</li>
<li>Horn, P., Bork, S., Wagner, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Standardized+isolation+of+human+mesenchymal+stromal+cells+with+red+blood+cell+lysis%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Standardized isolation of human mesenchymal stromal cells with red blood cell lysis.</a> Methods Mol Biol. 698, 23-35 (2011).</li>
<li>Dominici, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Minimal+criteria+for+defining+multipotent+mesenchymal+stromal+cells.+The+International+Society+for+Cellular+Therapy+position+statement%5BTitle%5D)+AND+%22Cytotherapy%22%5BJournal%5D)">Minimal criteria for defining multipotent mesenchymal stromal cells. The International Society for Cellular Therapy position statement.</a> Cytotherapy. 8, 315-317 (2006).</li>
<li>Friedenstein, A. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Precursors+for+fibroblasts+in+different+populations+of+hematopoietic+cells+as+detected+by+the+in+vitro+colony+assay+method%5BTitle%5D)+AND+%22Exp+Hematol%22%5BJournal%5D)">Precursors for fibroblasts in different populations of hematopoietic cells as detected by the in vitro colony assay method.</a> Exp Hematol. 2, 83-92 (1974).</li>
<li>Caplan, A. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mesenchymal+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Orthop+Res%22%5BJournal%5D)">Mesenchymal stem cells.</a> J Orthop Res. 9, 641-650 (1991).</li>
<li>Futrega, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+microwell-mesh%3A+A+novel+device+and+protocol+for+the+high+throughput+manufacturing+of+cartilage+microtissues%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">The microwell-mesh: A novel device and protocol for the high throughput manufacturing of cartilage microtissues.</a> Biomaterials. 62, 1-12 (2015).</li>
<li>Liu, Y., Goldberg, A. J., Dennis, J. E., Gronowicz, G. A., Kuhn, L. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((One-step+derivation+of+mesenchymal+stem+cell+%28MSC%29-like+cells+from+human+pluripotent+stem+cells+on+a+fibrillar+collagen+coating%5BTitle%5D)+AND+%22PloS+one%22%5BJournal%5D)">One-step derivation of mesenchymal stem cell (MSC)-like cells from human pluripotent stem cells on a fibrillar collagen coating.</a> PloS one. 7, 33225(2012).</li>
<li>Maleki, M., Ghanbarvand, F., Reza Behvarz, M., Ejtemaei, M., Ghadirkhomi, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparison+of+mesenchymal+stem+cell+markers+in+multiple+human+adult+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Int+J+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Comparison of mesenchymal stem cell markers in multiple human adult stem cells.</a> Int J Stem Cell. 7, 118-126 (2014).</li>
<li>Hass, R., Kasper, C., Bohm, S., Jacobs, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Different+populations+and+sources+of+human+mesenchymal+stem+cells+%28MSC%29%3A+A+comparison+of+adult+and+neonatal+tissue-derived+MSC%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Commun+Signal%22%5BJournal%5D)">Different populations and sources of human mesenchymal stem cells (MSC): A comparison of adult and neonatal tissue-derived MSC.</a> Cell Commun Signal. 9, 12(2011).</li>
<li>Bianco, P., Robey, P. G., Simmons, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mesenchymal+stem+cells%3A+revisiting+history%2C+concepts%2C+and+assays%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+stem+cell%22%5BJournal%5D)">Mesenchymal stem cells: revisiting history, concepts, and assays.</a> Cell stem cell. 2, 313-319 (2008).</li>
<li>Bianco, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+meaning%2C+the+sense+and+the+significance%3A+translating+the+science+of+mesenchymal+stem+cells+into+medicine%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+med%22%5BJournal%5D)">The meaning, the sense and the significance: translating the science of mesenchymal stem cells into medicine.</a> Nature med. 19, 35-42 (2013).</li>
<li>Da Silva Meirelles, L., Caplan, A. I., Nardi, N. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+search+of+the+in+vivo+identity+of+mesenchymal+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+cells%22%5BJournal%5D)">In search of the in vivo identity of mesenchymal stem cells.</a> Stem cells. 26, 2287-2299 (2008).</li>
<li>Caplan, A. I., Correa, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+MSC%3A+an+injury+drugstore%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">The MSC: an injury drugstore.</a> Cell Stem Cell. 9, 11-15 (2011).</li>
<li>Wegmeyer, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mesenchymal+Stromal+Cell+Characteristics+Vary+Depending+on+Their+Origin%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cell+Dev%22%5BJournal%5D)">Mesenchymal Stromal Cell Characteristics Vary Depending on Their Origin.</a> Stem Cell Dev. , (2013).</li>
<li>Guillot, P. V., Gotherstrom, C., Chan, J., Kurata, H., Fisk, N. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+first-trimester+fetal+MSC+express+pluripotency+markers+and+grow+faster+and+have+longer+telomeres+than+adult+MSC%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+cells%22%5BJournal%5D)">Human first-trimester fetal MSC express pluripotency markers and grow faster and have longer telomeres than adult MSC.</a> Stem cells. 25, 646-654 (2007).</li>
<li>Covas, D. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multipotent+mesenchymal+stromal+cells+obtained+from+diverse+human+tissues+share+functional+properties+and+gene-expression+profile+with+CD146%2B+perivascular+cells+and+fibroblasts%5BTitle%5D)+AND+%22Exp+Hemol%22%5BJournal%5D)">Multipotent mesenchymal stromal cells obtained from diverse human tissues share functional properties and gene-expression profile with CD146+ perivascular cells and fibroblasts.</a> Exp Hemol. 36, 642-654 (2008).</li>
<li>Crisan, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+perivascular+origin+for+mesenchymal+stem+cells+in+multiple+human+organs%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+stem+cell%22%5BJournal%5D)">A perivascular origin for mesenchymal stem cells in multiple human organs.</a> Cell stem cell. 3, 301-313 (2008).</li>
<li>Pelekanos, R. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comprehensive+transcriptome+and+immunophenotype+analysis+of+renal+and+cardiac+MSC-like+populations+supports+strong+congruence+with+bone+marrow+MSC+despite+maintenance+of+distinct+identities%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+cell+res%22%5BJournal%5D)">Comprehensive transcriptome and immunophenotype analysis of renal and cardiac MSC-like populations supports strong congruence with bone marrow MSC despite maintenance of distinct identities.</a> Stem cell res. 8, 58-73 (2012).</li>
<li>da Silva Meirelles, L., Chagastelles, P. C., Nardi, N. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mesenchymal+stem+cells+reside+in+virtually+all+post-natal+organs+and+tissues%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Sci%22%5BJournal%5D)">Mesenchymal stem cells reside in virtually all post-natal organs and tissues.</a> J Cell Sci. 119, 2204-2213 (2006).</li>
<li>James, A. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Review+of+Signaling+Pathways+Governing+MSC+Osteogenic+and+Adipogenic+Differentiation%5BTitle%5D)+AND+%22Scientifica+%28Cairo%29%22%5BJournal%5D)">Review of Signaling Pathways Governing MSC Osteogenic and Adipogenic Differentiation.</a> Scientifica (Cairo). 2013, 684736(2013).</li>
<li>Xu, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cross-Talking+between+PPAR+and+WNT+Signaling+and+Its+Regulation+in+Mesenchymal+Stem+Cell+Differentiation%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Stem+Cell+Res+Ther%22%5BJournal%5D)">Cross-Talking between PPAR and WNT Signaling and Its Regulation in Mesenchymal Stem Cell Differentiation.</a> Curr Stem Cell Res Ther. , (2015).</li>
<li>Zhuang, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+Mechanisms+of+PPAR-gamma+Governing+MSC+Osteogenic+and+Adipogenic+Differentiation%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Stem+Cell+Res+Ther%22%5BJournal%5D)">Molecular Mechanisms of PPAR-gamma Governing MSC Osteogenic and Adipogenic Differentiation.</a> Curr Stem Cell Res Ther. , (2015).</li>
<li>Moore, K., Persaud, T., Torchia, M. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aMoore%2C+K+%22Before+We+Are+Born%3A+Essentials+of+Embryology+and+Birth+Defects%22">Before We Are Born: Essentials of Embryology and Birth Defects</a>. , Elsevier Health Sciences. 8 edn (2011).</li>
<li>Zhu, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Placental+mesenchymal+stem+cells+of+fetal+and+maternal+origins+demonstrate+different+therapeutic+potentials%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cell+Res+Ther%22%5BJournal%5D)">Placental mesenchymal stem cells of fetal and maternal origins demonstrate different therapeutic potentials.</a> Stem Cell Res Ther. 5, 48(2014).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Łożysko jest fizycznie dużym narządem płodu-matki, z którego można wyizolować płód lub matkę MSC 22. W tym artykule przedstawiliśmy szczegółowy przegląd anatomii łożyska i instrukcje, jak dokładnie wypreparować tkankę decidua (matczyną), kosmówkę kosmówkową (płodową) i płytkę kosmówkową (płodową) (krok 2.2-2.4). Następnie nakreśliliśmy solidny protokół, który umożliwia izolację MSC z każdej z tych trzech tkanek (Krok 2.5-2.6). Ekspansja MSC łożyska jest wydajna, a posiewy wyglądają podobnie do kultur MSC pochodzących ze szpiku kostnego (ryc. 3 i 4). Różnicowanie osteogenne jest wiarygodne (ryc. 5B), podczas gdy różnicowanie adipogenne jest na ogół mniej efektywne (ryc. 5C) 5.
Wielu nowicjuszy w tej dziedzinie zakłada, że posiewy pochodzące z kosmków kosmówkowych płodu lub tkanek płytki kosmówkowej zostaną wzbogacone o MSC płodu. Jednak w naszych rękach wzbogacanie komórek płodowych jest przejściowe tylko wtedy, gdy stosuje się standardowe podłoże ekspandujące MSC, takie jak DMEM-LG + 10% FBS 5. W tym miejscu przedstawiamy reprezentatywne wyniki przy użyciu tkanek łożyska pochodzących od dziecka płci męskiej. Wykorzystując tkankę łożyska od dziecka płci męskiej, komórki płodu można łatwo zidentyfikować jako posiadające chromosomy XY, podczas gdy komórki matczyne można zidentyfikować jako posiadające chromosomy XX. Rysunek 6 przedstawia wyniki XY FISH dla reprezentatywnej hodowli. Podczas gdy płodowe MSC (XY) są wzbogacone (do 80%) w początkowych hodowlach pochodzących z płodowych kosmków kosmówkowych lub tkanek płytki kosmówkowej, te same kultury są szybko wyprzedzane (~100%) przez matczyne (XX) MSC w ciągu pierwszych dwóch pasaży. W standardowej pożywce, składającej się z DMEM-LG + 10% FBS, kilka MSC pochodzących od matki, które zanieczyszczają tkanki płodu, konkuruje z komórkami pochodzącymi od płodu w hodowli.
Kluczowym krokiem nakreślonym w tym protokole jest docenienie anatomii łożyska i miejsca, z którego można najskuteczniej pobrać tkanki płodowe i matczyne. Jak opisano w sekcji dotyczącej reprezentatywnych wyników, rozwarstwienie tkanki płodu umożliwia przejściowe wzbogacenie MSC pochodzącego z płodu. Ulepszenia w formułowaniu pożywek ekspandujących, poprzez suplementację specyficznymi pożywkami egzogennych czynników wzrostu, powinny pozwolić na selektywną ekspansję populacji MSC pochodzących od płodu i wytwarzanie produktu komórkowego, który jest wzbogacony o komórki płodu, a nie matki (nasza grupa opracowuje obecnie takie preparaty pożywki). Wytwarzanie płodowych populacji MSC może mieć wiele zalet, ponieważ uważa się, że płodowe MSC mają większe właściwości angiogenezę i immunosupresję niż równoważne populacje MSC matki 37.
W każdym z opisanych protokołów izolacji użyliśmy około 10 g tkanki. Całe łożysko waży zwykle 500-750 g, a w poprzednich pracach wykazaliśmy, że dzięki zautomatyzowanemu trawieniu tkanek i procesom bioreaktora do ekspansji komórek, powinno być możliwe wyprodukowanie ponad 7000 klinicznych dawek komórek z jednego łożyska 4. Liczby te podkreślają potencjalną przydatność MSC pochodzącego z łożyska w allogenicznych terapiach MSC oraz znaczenie tej metody niezależnie od pochodzenia MSC (płodowego lub matczynego). Z terapeutycznego punktu widzenia niezwykle ważne jest, aby użytkownicy mieli pełne zrozumienie produktu komórkowego i zdolność do niezawodnego wytwarzania tego produktu komórkowego. Mamy nadzieję, że nasz film pomoże naukowcom zrozumieć anatomię łożyska, wyizolować MSC z łożyska i przewidzieć prawdopodobny skład komórek płodu lub matki w ich hodowlach.

Mezenchymalne komórki macierzyste/zrębowe (MSC) stają się obiecującym kandydatem do zastosowania w terapiach komórkowych 1. Wydaje się, że większość aplikacji jest ukierunkowana na naprawę tkanek za pośrednictwem MSC lub regulację immunologiczną 2. W wielu z tych zastosowań allogeniczny MSC może być równie skuteczny jak autologiczny MSC 3. Zastosowanie allogenicznego MSC ma tę zaletę ekonomiczną, że jest kompatybilne z produkcją na dużą skalę wielu dawek komórkowych z jednej tkanki źródłowej 4 w celu leczenia wielu pacjentów.
Historycznie, badania przedkliniczne i kliniczne wykorzystywały MSC pochodzące ze szpiku kostnego 4. Szpik kostny jest zwykle pobierany z grzebienia biodrowego dawcy ochotnika. Proces ten jest inwazyjny i tylko niewielka objętość szpiku (~20 ml) jest pobierana przez pojedyncze nakłucie. Wygenerowanie klinicznie znaczącej liczby MSC wymaga rozległej ekspansji in vitro. Potencja komórek zmniejsza się wraz z pasażem numer 3, tworząc paradoks, w którym teoretyczna liczba komórek wymagana do skuteczności klinicznej jest tym większa, im bardziej rozszerza się populacja komórek. W przeciwieństwie do aspiratów szpiku kostnego, łożysko donoszone jest fizycznie dużą tkanką wyjściową (zwykle 500-750 g 4), którą można pobrać w sposób aseptyczny podczas cesarskiego cięcia bez ryzyka dla dawcy. MSC pochodzące z łożyska mają długotrwałą proliferację 5 i zdolność immunomodulacyjną 6, przewyższając MSC pochodzące ze szpiku kostnego. W poprzednim badaniu wykazaliśmy, że łożysko z pojedynczą terminologią zawierało wystarczającą ilość MSC do wytworzenia do 7 000 dawek klinicznych 4. Te cechy sprawiają, że łożysko jest idealną tkanką źródłową do produkcji allogenicznego MSC.
Łożysko to narząd płodowo-matczyny składający się zarówno z tkanki płodu, jak i matki7, a zatem MSC pochodzenia płodowego lub matczynego może być teoretycznie izolowany. Poniższe piśmiennictwo zawiera szczegółowe informacje na temat rozwoju i patologii, a także badania mikroskopowego i makroskopowego ludzkiego łożyska i przydatków 8,9. Łożysko właściwe składa się głównie z naczyń krwionośnych płodu oraz komórek wydzielniczych i podporowych zwanych trofoblastami, tworzących kosmki kosmówkowe pokryte kosmówką czołową (płytką) 8. Rozgałęzione kosmki łożyskowe są skąpane w matczynej krwi dostarczanej ze spiralnych tętnic macicy, umożliwiając wymianę składników odżywczych, hormonów i gazów między płodem a matką. Łożysko jest zakotwiczone w błonie śluzowej macicy za pośrednictwem matczynych komórek zrębu liściastego, a trofoblasty zewnątrzkosmkowe płodu są przeplatane w macierzy zewnątrzkomórkowej 8. Kosmki zbiegają się na płytce kosmówkowej płodu, gdzie tworzą pępowinę 8.
Wynikiem pierwszych Międzynarodowych Warsztatów na temat Komórek Macierzystych pochodzących z Łożyska (2008) było docenienie potrzeby standaryzacji izolacji i charakterystyki komórek z ludzkiego łożyska 10. Ze względu na anatomię łożyska, rozwarstwienie różnych tkanek, izolacja MSC i przewidywane wyniki hodowli mogą być przytłaczające dla nowicjuszy w tej dziedzinie. W tym protokole pobieranie tkanek kosmówkowych łożyska, a następnie izolacja i ekspansja MSC jest szczegółowo opisane. Charakterystyka MSC za pomocą cytometrii przepływowej i różnicowania in vitro jest uważana za rutynową 5,11-13, a zatem tylko pokrótce opisana tutaj.
Jak podkreślono w niedawnym systematycznym przeglądzie literatury 14, MSC uzyskane z łożyskowych kosmków kosmówkowych są ogólnie uważane za płodowe. Chociaż tylko 18% badań dotyczyło pochodzenia uzyskanego MSC, a spośród nich tylko połowa badań dotyczyła MSC płodu, a druga połowa zgłaszała populacje matczyne lub mieszane MSC. Każdy z trzech opisanych tutaj składników tkankowych (kosmki kosmówkowe, płytka kosmówkowa i decidua basalis) składa się głównie z błony/kosmków płodu i niewielkiej części komórek matczynych pochodzących z macicy, które pozostają przyczepione do dostarczonego łożyska. Przedstawiamy dane wskazujące, że wyizolowanie MSC od matczynej strony łożyska, a nie od strony płodu łożyska, jak wcześniej informowaliśmy 5,11, jest bardziej odpowiednim materiałem wyjściowym, jeśli pożądane jest MSC matki. Protokół ten opisuje również zastosowanie XY FISH do walidacji wkładu płodu lub matki w hodowle komórkowe. Chociaż jest to standardowy protokół producenta, analiza ta jest często zaniedbywana, a jej znaczenie niedoceniane 14.

<table><tbody><tr><td>Reodczynniki</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>HBSS</td><td>Gibco/Invitrogen</td><td>14185-052</td><td>Długa nazwa: Hanks Zrównoważony roztwór soli</td></tr><tr><td>FBS</td><td>Gibco/Invitrogen</td><td></td><td>Długa nazwa: Substytut trypsyny w surowicy bydlęcej płodu</td></tr><tr><td></td><td>Gibco/Invitrogen</td><td>12563-029</td><td>Długa nazwa: TrypLE Select</td></tr><tr><td>DMEM-LG</td><td>Gibco/Invitrogen</td><td>11885-092</td><td>Długa nazwa: Dulbecco' s Modified Eagles Medium-Low Glucose</td></tr><tr><td>DMEM-HG</td><td>Gibco/Invitrogen</td><td>11965118</td><td>Długa nazwa: Dulbecco' s Zmodyfikowana glukoza Eagles Medium-HIgh (4,5 g/L)</td></tr><tr><td>PBS (bez Mg+Ca+)</td><td>Gibco/Invitrogen</td><td>14190-250</td><td>Długa nazwa: Dulbecco's Sól fizjologiczna buforowana fosforanem, bez magnezu i wapnia</td></tr><tr><td>Anti-anti-anti-Gibco</td><td>/Invitrogen</td><td>15240-062</td><td>Długa nazwa: roztwór antybiotykowo-przeciwgrzybiczy x100</td></tr><tr><td>proszek paraformaldehydu lub 4% roztwór</td><td>dowolny&nbsp;</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Collagenase I</td><td>Invitrogen</td><td>17100-017&nbsp;</td><td>2 500 U/ml</td></tr><tr><td>Dnaza I</td><td>Sigma</td><td>D5025</td><td>10 mg/ml w&nbsp; 0,15 M NaCl</td></tr><tr><td>Dispase</td><td>Invitrogen</td><td>17105-041&nbsp;</td><td>10 mg/ml w wodzie (20 000 U/ml).</td></tr><tr><td><mocny>Materiał< / mocny></td><td><silny>Firma</mocny></td><td><silny>Numer katalogowy</mocny></td><td><silny>Komentarze</mocny></td></tr><tr><td><silny>Jednorazowe:</mocny></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>50 ml probówki wirówkowe</td><td>Falcon lub dowolnej marki</td><td></td><td></td></tr><tr><td>, szalki Petriego, sterylne placyki (średnica 25 cm i 10 cm)</td><td>Nunc</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Sitka do komórek (100 &mu; m)</td> <td>Becton Dickinson</td><td>352340</td><td></td></tr><tr><td>175 i 75 cm2 (T175 i T75) kolby do hodowli tkankowych</td><td>Nunc</td><td></td><td></td></tr><tr><td>5 ml, 10 ml, 25 ml sterylne pipety serolgiczne</td><td>dowolnej marki</td><td></td><td></td></tr><tr><td><silny>Materiał<<</td><td>silny>silny>Firma</silny></td><td><silny>Numer katalogowy</td><td>Uwagi</td></tr><tr><td>< mocny>Sprzęt:< / mocny></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>&nbsp; Wirówka&nbsp; &nbsp;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>&nbsp; Inkubator do hodowli tkankowych 37 & Deg; C, 5% CO2</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Szafa</td><td></td><td></td><td></td> bezpieczeństwa biologicznego</tr><tr><td>&nbsp; Sterylne nożyczki i pęsety</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Stojaki na probówki&nbsp;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Pipetery typu Gilson lub równoważne</td><td></td><td></td><td></td></tr> z <tr><td>sterylnymi końcówkami 1 000 i mikro; l, 200 i mikro; l, 20 &mikro;l.</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>inkubator kołyszący lub wstrząsający (37 & C)</td><td></td><td></td><td></td></tr> środki <tr><td>ochrony</td><td></td><td></td><td></td>indywidualnej</tr>, <tr><td>roztwory czyszczące (odpowiednie do krwi),</td><td></td><td></td><td></td></tr> <tr><td>pojemniki na odpady, odpowiednie pojemniki na tkanki/krew</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td><silne>odczynniki do charakterystyki MSC</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>przeciwciało (identyfikator klonu)</td><td>Producent</td><td>Nr katalogowy</td><td>Isotype</td></tr><tr><td>CD73 (AD2)</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-095-183</td><td>Mysz IgG1</td></tr><tr><td>CD105 (43A4E1)</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-094-941</td><td>Mysz IgG1</td></tr><tr><td>CD90/Thy-1 (AC122)</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-095-403</td><td>Mysz IgG1</td></tr><tr><td>CD45 (5B1)</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-080-202</td><td>Mysz IgG2a</td></tr><tr><td>CD34 (AC136)</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-090-954</td><td>Mysz IgG2a</td></tr><tr><td>HLA-DR (AC122)</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-095-298</td><td>Mysz IgG2a</td></tr><tr><td>CD31 (PECAM-1)</td><td>BD Pharmingen</td><td>555446</td><td>Mysz IgG1</td></tr><tr><td>CD146 (541-10B2)</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-092-849</td><td>Mysz IgG1</td></tr><tr><td>CD44 (DB105)</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-095-180</td><td>Mysz IgG1</td></tr><tr><td>Isotype Controls (Clone ID)</td><td>Producent</td><td>Nr katalogowy</td><td></td></tr><tr><td>Izotyp myszy IgG1 (IS5-21F5)</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-092-214</td><td></td></tr><tr><td>Izotyp myszy IgG1 (IS5-21F5)</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-092-212</td><td></td></tr><tr><td>Izotyp myszy IgG1 (IS5-21F5)</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-092-213</td><td></td></tr><tr><td>Mysz IgG2a (S43.10)</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-091-837</td><td></td></tr><tr><td>Mysz IgG2a (S43.10)</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-098-849</td><td></td></tr><tr><td>Bufor MACS</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-091-221</td><td></td></tr><tr><td><silny>Różnicowanie osteogenne</td><td>Producent</td><td>Numer katalogowy </td><td></td></tr><tr><td>DMEM-HG</td><td>Gibco/Invitrogen</td><td>11965118</td><td>Długa nazwa: Dulbecco' s Modified Eagles Medium-HIgh Glucose (4,5 g / L)</td></tr> <tr><td>FBS</td><td>Gibco/Invitrogen</td><td></td><td>Długa nazwa: Płodowa surowica bydlęca</td></tr><tr><td>Anti-anti-anti-Gibco</td><td>/Invitrogen</td><td>15240-062</td><td>Długa nazwa: roztwór antybiotykowo-przeciwgrzybiczy x100</td></tr><tr><td>Deksametazon</td><td>Sigma</td><td>D4902</td><td></td></tr><tr><td>&beta;-Glycerol Phophate</td><td>Sigma</td><td>50020</td><td></td></tr><tr><td>Kwas L-askorbinowy 2-fosforan</td><td>Sigma</td><td>A8960-5G</td><td></td></tr><tr><td>Alizarin Red S</td><td>Sigma</td><td>A5533-25G</td><td>Do barwienia matrycy wapniowej</td></tr> <tr><td><silne>Dyferencjacja adipogeniczna</mocne></td><td><mocne>Producent</td><td>Nr katalogowy</td><td></td></tr><tr><td>DMEM-HG</td><td>Gibco/Invitrogen</td><td>11965118</td><td>Długie imię: Dulbecco' s Modified Eagles Medium-HIgh Glucose (4,5 g / L)</td></tr><tr><td>FBS</td><td>Gibco/Invitrogen</td><td></td><td>Długa nazwa: Płodowa surowica bydlęca</td></tr><tr><td>Anti-anti-anti-Gibco</td><td>/Invitrogen</td><td>15240-062</td><td>Długa nazwa: roztwór antybiotykowo-przeciwgrzybiczy x100</td></tr><tr><td>insulina</td><td>Sigma</td><td>I2643</td><td></td></tr><tr><td>Deksametazon</td><td>Sigma</td><td>D4902</td><td></td></tr><tr><td>Indometacyna</td><td>Sigma</td><td>I7378</td><td></td></tr><tr><td>3-izobutylo-1-metyloksantyna</td><td>Sigma</td><td>I5879</td><td></td></tr><tr><td>Olej Czerwony roztwór O</td><td>Sigma</td><td>O1391-250ML</td><td>Do barwienia wakuoli lipidowej</td></tr> zestaw <tr><td>XY FISH do określania płodowego lub matczynego pochodzenia komórek</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>XY chomosomu zestaw FISH</td><td>Vysis (Abbott Molecular)</td><td>07J20-050</td><td>Długa nazwa: X SpectrumOrange/Y SpectrumGreen Zestaw sondy fluorescencyjnej DNA znakowanej bezpośrednio</td></tr></tbody></table>

izolacja i ekspansja mezenchymalnych komórek macierzystych/zrębowych pochodzących z ludzkiej tkanki łożyska

Isolation and Expansion of Mesenchymal Stem/Stromal Cells Derived from Human Placenta Tissue

Mezenchymalne komórki macierzyste/zrębowe (MSC) są obiecującymi kandydatami do zastosowania w terapiach komórkowych. W większości przypadków odpowiedź terapeutyczna wydaje się być zależna od dawki komórkowej. Ludzkie łożysko donoszone jest bogate w MSC i jest fizycznie dużą tkanką, która jest zwykle wyrzucana po urodzeniu. Łożysko jest idealnym materiałem wyjściowym do produkcji na dużą skalę wielokomórkowych dawek allogenicznego MSC. Łożysko jest narządem płodu-matki, z którego można wyizolować tkankę płodową lub matczyną. W tym artykule opisano anatomię łożyska i procedurę rozwarstwiania tkanki decidua (matczynej), kosmków kosmówkowych (płodowych) i płytki kosmówkowej (płodowej). Protokół następnie określa, w jaki sposób wyizolować MSC z każdego wypreparowanego regionu tkanki i zapewnia reprezentatywną analizę rozszerzonego MSC pochodzącego z odpowiednich typów tkanek. Metody te są przeznaczone do przedklinicznej izolacji MSC, ale zostały również przystosowane do klinicznego wytwarzania łożyskowego MSC do stosowania terapeutycznego u ludzi.

Tutaj opisujemy metody preparowania tkanek płodowych i matczynych z ludzkiego łożyska, a następnie izolacji i ekspansji mezenchymalnych komórek macierzystych/zrębowych (MSC) z tych tkanek.

Izolacja i ekspansja mezenchymalnych komórek macierzystych/zrębowych pochodzących z ludzkiej tkanki łożyska

Mesenchymal stem/stromal cells (MSC) are promising candidates for use in cell-based therapies. In most cases, therapeutic response appears to be cell-dose ...

Ogólnym celem niniejszej procedury jest izolacja i namnażanie mezenchymalnych komórek macierzystych pochodzących z tkanki łożyska ludzkiego. Cześć, jestem Mike Doran. Jestem liderem grupy na Queensland University of Technology w Translational Research Institute w Brisbane w Australii.Witam, nazywam się Rebecca Pelekanos i jestem badaczką w Centrum Badań Klinicznych Uniwersytetu w Queensland. Dzisiaj zaprezentuję procedurę izolacji MSC. Łożyska są zazwyczaj utylizowane po porodzie.Ze względu na to, że tkanka ta waży od 5 do 700 gramów, stanowi wyjątkowo bogate źródło allogenicznych mezenchymalnych komórek macierzystych. Zazwyczaj osoby rozpoczynające izolację MSC z łożyska napotykają trudności z powodu braku znajomości anatomii łożyska, nieznajomości metod przetwarzania tkanki oraz braku wiedzy na temat tego, jaki typ komórek – matczyne czy płodowe – będzie zasiedlać końcową kulturę MSC. Aby pomóc badaczom, w tym filmie omawiamy te istotne szczegóły.Pierwszym krokiem w tej procedurze jest zapoznanie się z anatomią łożyska. Drugim krokiem jest ręczne wycięcie 10 g tkanki z błony jamaczej, kosmków chorionu lub blaszki chorionicznej za pomocą nożyczek. Te dwa pierwsze kroki zostały tutaj ponownie przedstawione schematycznie.W kroku trzecim tkanki błony basalnej, kosmki pozapłodowe lub tkanki płytki chorialnej są dalej rozdrabniane nożyczkami na drobne fragmenty. W kroku czwartym komórki są uwalniane z małych fragmentów tkanek poprzez jedno- do dwugodzinne trawienie w dyspazie i kolagenazie I. W kroku piątym komórki są oddzielane od tkanki włóknistej poprzez przemycie ich przez sitko komórkowe. Następnie komórki są zbierane, resuspenderowane w medium hodowlanym i przenoszone do kolb hodowlanych.Mezenchymalne komórki macierzyste (MSCs) zostaną wyselekcjonowane na podstawie ich zdolności do przylegania do tworzywa sztucznego oraz zdolności do przeżycia i proliferacji w pożywce hodowlanej. W sekcji wyników namnożone MSC mogą zostać scharakteryzowane i zamrożone do wykorzystania w przyszłych eksperymentach. Łożysko jest narządem tymczasowym, który umożliwia wymianę składników odżywczych i produktów przemiany materii między płodem a matką podczas ciąży.Łożysko można łatwo pobrać aseptycznie po cesarskim cięciu i bezpiecznym urodzeniu dziecka. Łożysko składa się głównie z naczyń krwionośnych i błon pochodzenia płodowego. Zawiera ono jednak również niektóre komórki macierzyńskie.Łożysko jest połączone z macicą zarówno za pomocą macierzyńskich komórek decydualnych pochodzących z macicy, jak i płodowych, naciekających trofoblastów. Zazwyczaj nie jest możliwe rozróżnienie gołym okiem dokładnej granicy między tkankami macierzyńskimi a płodowymi. Jednak stronę płodową łożyska można łatwo zidentyfikować jako stronę, po której znajduje się pępowina.Po urodzeniu dziecka do łożyska przylega jedynie cienka warstwa tkanki decydualnej. Dzięki orientacji anatomicznej łożyska możliwe jest zlokalizowanie trzech tkanek, które pobierzemy dzisiaj. Pierwszą pobieraną tkanką będzie decidua macierzysta.Zielony znacznik wskazuje na tkankę decydualną, która pozostaje na powierzchni po oddzieleniu łożyska od ściany macicy. Drugą tkanką, która zostanie pobrana z wnętrza łożyska, są płodowe kosmki błonowe. Zostały one zaznaczone na schematach niebieskimi okręgami.Trzecią pobieraną tkanką będzie płodowa płytka kosmiczna. Tkanka ta jest oznaczona czerwonymi markerami na schematach. Dobrze, zacznijmy.Umieść łożysko w komorze bezpieczeństwa biologicznego. Rozwiń błony płodowe i zapoznaj się z budową łożyska. Strona płodowa z miejscem przyczepu pępowiny, błona chorioamniotyka lub worek owodniowy.Powierzchnia płodowa łożyska posiada wyraźne duże naczynia krwionośne w płytce chorionowej, przykryte błoną amniotyczną, którą również można łatwo oddzielić mechanicznie. Strona macierzysta znajduje się naprzeciwko strony płodowej i charakteryzuje się wyraźnymi kotyledonami lub płatami. Należy upewnić się, że powierzchnia macierzysta jest skierowana do góry.Wytnij kawałki o grubości 0,5 cm z macicznej strony łożyska lub z decidua. Podczas sekcji umieść fragmenty tkanek w szalce Petriego zawierającej zrównoważony roztwór soli Hanksa (HBSS), aby utrzymać ich wilgotność. Wymieszaj tkanki w naczyniach z HBSS, aby usunąć nadmiar krwi.Przenieś wystarczającą ilość tkanki, aby wypełnić probówkę do poziomu 10 mililitrów w probówce o pojemności 50 mililitrów, co odpowiada w przybliżeniu 10 gramom. Należy pamiętać, że na tym etapie można wyizolować więcej tkanki, jeśli pod koniec procedury wymagana będzie większa liczba komórek. Upewnij się, że powierzchnia płodowa jest skierowana do góry.Mechanicznie usuń błonę płodową z powierzchni płodowej łożyska, pozostawiając nienaruszoną płytkę choryoniczną. Potnij płytkę choryoniczną na pasy, wcinając się w tkankę kosmkową na głębokość około połowy centymetra. Następnie wyciąć tkankę kosmków choryonicznych na głębokość około jednego centymetra w głąb łożyska z miejsca, z którego usunięto płytkę choryoniczną.Umieść tkanki w HBSS i odmierz około 10 mililitrów tkanki, analogicznie do poprzedniego etapu. Przenieś fragmenty tkanki, ograniczając do minimum transfer cieczy, do 10-centymetrowej szalki Petriego i posiekaj nożyczkami na drobne kawałki o objętości około jednego milimetra sześciennego. Przenieś posiekaną tkankę z powrotem do probówki 50 ml.Powtórz procedurę dla wszystkich pozostałych próbek tkanek. Dodaj świeżo przygotowane medium do trawienia w stosunku co najmniej jeden do jednego w stosunku do tkanki. Kilkakrotnie odwróć probówkę, aby wymieszać zawartość.Inkubować tkanki w probówce z pożywką do trawienia przez jedną do dwóch godzin w temperaturze 37°C w inkubatorze wytrząsowym. Gdy roztwór do trawienia tkanek stanie się mętny, a w roztworze pojawią się wyraźne białe naczynia krwionośne, dodać 15 ml HBSS, aby rozcieńczyć enzymy w pożywce do trawienia. Próbki poddać krótkiemu wirowaniu pulsacyjnemu tylko do momentu osiągnięcia przez wirówkę 340 g przez pięć sekund, a następnie zatrzymać urządzenie.Dzięki temu duże zanieczyszczenia zbiorą się na dnie probówki. Przenieś próbki z powrotem do komory bezpieczeństwa biologicznego. Umieść sitko do oddzielania komórek w nowej probówce o pojemności 50 ml.Przenieś pipetą supernatant zawierający komórki mononuklearne do sita, zbierając eluat do nowej probówki. Pozostaw pozostałości tkanki łożyska w pierwszej probówce. Dodaj 15 milliliters HBSS do pozostałości łożyska, energicznie wstrząśnij w celu odzyskania większej liczby komórek, a następnie poddaj próbkę krótkotrwałemu wirowaniu pulsacyjnemu.Ponownie przenieś nadaninę za pomocą pipety do probówki z sitkiem do komórek umieszczonym w probówce zbiorczej. W zależności od konsystencji próbki, bardziej odpowiednie może być przelanie nadaniny przez sitko. Przemyj sitko 5 mililitrami HBSS.Wyrzuć probówkę zawierającą resztki tkanki łożyskowej. Odwiruj próbkę supernatantu przez pięć minut przy 340 g, aby utworzyć pellet komórkowy. Erytrocyty są widoczne jako warstwa na dnie pelletu, a komórki mononuklearne, w tym MSC, stanowią jaśniejszą warstwę nad erytrocytami.Przenieś próbki z powrotem do komory bezpieczeństwa biologicznego. Ostrożnie odlej nadsącz i go usuń. Kilka razy uderz palcem w ściankę probówki, aby odczepić pellet komórkowy, a następnie resuspenduj pellet w 35 mililitrach pożywki MSC.Przenieś zawiesinę komórkową do jednej kolby T175 na każde 10 mil tkanki i hoduj w inkubatorze w temperaturze 37 °C z 5% CO2. Po izolacji wymień podłoże hodowalne po 48 godzinach. Dokarmiaj hodowle raz w tygodniu aż do osiągnięcia konfluencji.Kultury powinny osiągnąć konfluencję w ciągu około 14 dni. Na koniec należy namnożyć i kriokonserwować komórki, przeanalizować charakterystykę MSC oraz wykorzystać je w eksperymentach. Po 48 godzinach hodowli komórki MSC przyłączą się do plastiku do hodowli tkankowej, natomiast komórki hematopoetyczne i inne populacje komórek nie zrobią tego.W tym momencie pożywkę wymienia się na 35 ml świeżej pożywki hodowlanej. Wygląd supernatantu hodowli może znacznie różnić się w zależności od dawcy łożyska. Przykład pierwszy i drugi demonstrują tę zmienność.Te dwie izolacje przeprowadzono jednocześnie, lecz z dwóch różnych łożysk. Po przemyciu kultury są wolne od erytrocytów i szczątków tkankowych, co pokazano w przykładzie trzecim, a późniejsze wyniki ekspansji są zazwyczaj spójne. Po wymianie medium po 48 godzinach do kolby przytwierdzone są tylko nieliczne komórki.Siedem dni po izolacji widoczne są kolonie fibroblastycznych MSC, choć obecne są również komórki niebędące MSC, występujące jako komórki okrągłe lub słabo przylegające. 13 dni po izolacji kolonie fibroblastycznych MSC są duże, a warstwa MSC często osiąga wystarczającą konfluencję i jest gotowa do pasażowania. Od pierwszego pasażu i w kolejnych, warstwa MSC przy osiągnięciu konfluencji wykazuje charakterystyczną morfologię przypominającą wiry.Mezenchymalne komórki macierzyste (MSC) z łożyska wykazują klasyczny profil markerów MSC w analizie przepływowej. Komórki są dodatnie w kierunku CD73, CD105 i CD90 oraz ujemne w kierunku markerów hematopoetycznych CD45, CD34 i HLA-DR. MSC z łożyska zazwyczaj ulegają intensywnemu różnicowaniu osteogenicznemu, lecz słabemu różnicowaniu adipogenicznemu.Wiele publikacji zakłada, że komórki wyizolowane z błony owodniowego chorionu po hodowli dają MSC płodu. Jednakże, jak raportowaliśmy wcześniej, wszystkie hodowle pochodne z chorionu płodu uzyskane za pomocą tego protokołu szybko ulegają wzbogaceniu w macierzyste MSC matki, co jest spodziewane w przypadku hodowli MSC z macierzystej błony deciduum. Przedstawione tutaj dane ilościowo określają skład komórek płodowych i macierzyńskich w hodowlach MSC łożyska wyizolowanych z tkanek deciduum, kosmków błoniastych oraz blaszki bliźniączkowej chorionu.Po obejrzeniu tego filmu powinni Państwo mieć dość dobre pojęcie o tym, jak izolować i hodować MSC pochodzące z tkanki łożyskowej. Mamy nadzieję, że metody te okażą się przydatne w Państwa badaniach oraz zastosowaniach klinicznych, w których wykorzystywane są MSC pochodzące z łożyska.

isolation-expansion-mesenchymal-stemstromal-cells-derived-from-human

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Biologia rozwojowa

Zidentyfikowaliśmy łożysko jako główny organ krwiotwórczy podczas rozwoju. Stwierdziliśmy, że macierzyste komórki krwiotwórcze (HSCs) są zarówno generowane, jak i powielane w łożysku w unikalnych niszach mikrośrodowiskowych. W niniejszej pracy opisujemy techniki eksperymentalne niezbędne do izolacji i wizualizacji HSCs w łożysku myszy.

Izolacja i analiza hematopoetycznych komórek macierzystych z łożyska

Niniejszy protokół opisuje izolację i następującą ekspansję mezenchymalnych komórek macierzystych oraz komórek endotelialnych tworzących kolonie bez użycia surowicy zwierzęcej, w celu wygenerowania autologicznych par do celów eksperymentalnej transplantacji.

Izolacja i ekspansja w warunkach wolnych od surowicy zwierzęcej mezenchymalnych komórek macierzystych (MSC) oraz endotelialnych komórek progenitorowych tworzących kolonie (ECFC) pochodzących z ludzkiej pępowiny

Mezenchymalne komórki macierzyste (MSC) mają potencjał różnicowania w kierunku linii osteoblastycznej, gdy są stymulowane przez rozpuszczalne czynniki lub określone biomateriały. W niniejszej pracy przedstawiono nowatorską opcję dostarczania MSCs z ludzkiej błony owodniowej (AM-hMSC), która wykorzystuje macierz kostną bydła Nukbone (NKB) jako rusztowanie.

Izolacja ludzkich mezenchymalnych komórek macierzystych i ich hodowla na porowatej macierzy kostnej

Tutaj prezentujemy protokół do sekcji próbki ludzkiej pępowiny (UC) i łożyska płodu na błonę śluzową pępowiny (CL), galaretkę Whartona (WJ), połączenie pępowina-łożysko (CPJ) i łożysko płodu (FP) w celu izolacji i charakterystyki mezenchymalnych komórek zrębu (MSC) przy użyciu techniki hodowli eksplantatów.

Izolacja i charakterystyka mezenchymalnych komórek zrębu z ludzkiej pępowiny i łożyska płodu

Ludzka pępowina (UC) może być uzyskana w okresie okołoporodowym w wyniku porodu przedwczesnego, terminowego i poterminowego. W tym protokole opisujemy izolację i charakterystykę mezenchymalnych komórek macierzystych pochodzących z WZJG (UC-MSC) od płodów/niemowląt w 19-40 tygodniu ciąży.

Izolacja i charakterystyka ludzkich mezenchymalnych komórek macierzystych pochodzących z pępowiny od wcześniaków i niemowląt urodzonych w terminie

Tkanka tłuszczowa jest doskonałym źródłem mezenchymalnych komórek macierzystych. Tutaj przedstawiamy krok po kroku ekstrakcję, hodowlę i charakterystykę komórek macierzystych pochodzących z tkanki tłuszczowej (ADSC) z tkanki tłuszczowej najądrza szwajcarskich myszy.

Izolacja, ekspansja in vitro i charakterystyka mezenchymalnych komórek macierzystych z tkanki tłuszczowej najądrza myszy

Ten protokół opisuje i porównuje dwie reprezentatywne metody różnicowania hiPSC na mezenchymalne komórki zrębu (MSC). Metoda jednowarstwowa charakteryzuje się niższym kosztem, prostszą obsługą i łatwiejszym różnicowaniem osteogennym. Metoda ciał zarodkowych (EBs) charakteryzuje się mniejszym zużyciem czasu.

Porównanie dwóch reprezentatywnych metod różnicowania ludzkich indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych w mezenchymalne komórki zrębu

Izolacja MSC o wysokimMFGE8 BAMBI, jednej z trzech głównych podgrup tworzących heterogeniczne ludzkie UC-MSC, jest pomocna dla pełnego zrozumienia cech i funkcji tego podtypu dla jego przyszłego zastosowania w celu poprawy skuteczności klinicznej w określonych chorobach. W tym miejscu przedstawiamy metodę sortowania BAMBIhighMFGE8high UC-MSC.

Izolacja ludzkich mezenchymalnych komórek zrębowych pochodzących z pępowiny owysokim poziomieMFGE8

Niejednorodność transkrypcyjna w ludzkich komórkach zrębowych pochodzących z tkanki tłuszczowej może być zdefiniowana na poziomie pojedynczej komórki za pomocą markerów powierzchni komórki i genów osteogennych.  Opisujemy protokół wykorzystujący cytometrię przepływową do izolacji subpopulacji komórek o zwiększonym potencjale osteogennym, który może być wykorzystany do poprawy rekonstrukcji szkieletu twarzoczaszki.

Izolacja i wzbogacenie ludzkich komórek zrębowych pochodzących z tkanki tłuszczowej w celu zwiększenia osteogenezy

Dendrytyczne kolce neuronów piramidowych są miejscami najbardziej pobudzających synaps w korze mózgowej ssaków. Metoda ta opisuje ilościową analizę 3D morfologii kręgosłupa w ludzkich korowych piramidowych neuronach glutaminergicznym pochodzących z indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych.

Trójwymiarowa kwantyfikacja kolców dendrytycznych z neuronów piramidowych pochodzących z ludzkich indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych

Naucz się izolować i ekspandować mezenchymalne komórki macierzyste z ludzkiej tkanki łożyska. Procedura obejmuje manualną dyssekcję, trawienie enzymatyczne oraz hodowlę opartą na adherencji do plastiku.

Izolacja i ekspansja mezenchymalnych komórek macierzystych/zrębowych pochodzących z ludzkiej tkanki łożyska

Przeglądaj więcej filmów