Izolacja i ekspansja mezenchymalnych komórek macierzystych/zrębowych pochodzących z ludzkiej tkanki łożyska

Ogólnym celem tej procedury jest wyizolowanie i namnażanie mezenchymalnych komórek macierzystych zrębu pochodzących z ludzkiej tkanki łożyska. Cześć, nazywam się Mike Doran. Jestem liderem grupy na Queensland University of Technology w Instytucie Badań Translacyjnych w Brisbane w Australii.

Cześć, nazywam się Rebecca Pelekanos i jestem badaczką w Centrum Badań Klinicznych Uniwersytetu Queensland. Dzisiaj zademonstruję procedurę izolacji MSC. Łożysko jest zwykle odrzucane po urodzeniu.

Ponieważ tkanka waży od pięciu do 700 gramów, stanowi wyjątkowo duże źródło allogenicznych mezenchymalnych komórek macierzystych. Ogólnie rzecz biorąc, osoby, które są nowe w izolacji łożyska MSC, będą miały trudności, ponieważ nie są zaznajomione z anatomią łożyska i nie wiedzą, jak przetwarzać tkankę i nie są zaznajomione z tym, jaki typ komórek, matczynych lub płodowych, wypełni ich końcową hodowlę MSC. Aby pomóc naukowcom, omawiamy te ważne szczegóły w tym filmie.

Pierwszym krokiem w tej procedurze jest zorientowanie się w anatomii łożyska. Drugim krokiem w tej procedurze jest ręczne wypreparowanie 10 gramów tkanki z decidua, kosmków kosmówkowych lub płytki kosmówkowej za pomocą nożyczek. Pierwsze dwa kroki są tutaj ponownie schematycznie podsumowane.

W kroku trzecim decidua, kosmki kosmówkowe lub tkanki płytki kosmówkowej są dalej mielone nożyczkami na drobne kawałki. W kroku czwartym komórki są uwalniane z małych kawałków tkanki poprzez jedno- lub dwugodzinne trawienie w dyspazie i kolagenazie, I.In kroku piątym komórki są oddzielane od tkanki włóknistej poprzez przemycie ich przez sitko do komórek. Komórki są następnie zbierane, ponownie zawieszane w pożywce hodowlanej i umieszczane w kolbach hodowlanych.

Mezenchymalne komórki zrębowe (MSC) zostaną wybrane na podstawie ich skłonności do przylegania do plastiku oraz zdolności do przetrwania i namnażania się w pożywce do hodowli komórkowej. Wreszcie, w sekcji wyników, rozszerzony MSC może być scharakteryzowany i przechowywany do wykorzystania w przyszłych eksperymentach. Łożysko jest tymczasowym narządem, który umożliwia wymianę składników odżywczych i produktów przemiany materii między płodem a matką w czasie ciąży.

Łożysko można łatwo pobrać w asepcji po cesarskim cięciu i bezpiecznym porodzie. Łożysko składa się głównie z naczyń krwionośnych i błon pochodzących od płodu. Zawiera jednak również pewne komórki matczyne.

Łożysko jest połączone z macicą zarówno przez matczyne komórki dziesiętne pochodzące z macicy, jak i trofoblasty pochodzące od płodu, inwazyjne. Zwykle nie jest możliwe rozpoznanie na oko dokładnego interfejsu między tkankami matki i płodu. Jednak stronę płodową łożyska można łatwo zidentyfikować jako stronę, po której znajduje się pępowina.

Po porodzie pozostaje tylko cienka warstwa tkanki dziesiętnej połączona z łożyskiem. Poprzez fizyczną orientację łożyska możliwe jest zlokalizowanie tych trzech tkanek, które dzisiaj pobierzemy . Pierwszą tkanką, która zostanie pobrana, jest decidua matczyna.

Zielony znacznik wskazuje na tkankę dziesiętną, która pozostaje na powierzchni po złuszczeniu łożyska ze ściany macicy. Drugą tkanką, która zostanie pobrana z wnętrza łożyska, jest kosmki kosmówki płodu. Wskazują na to niebieskie kółka na diagramach.

Trzecią tkanką, która zostanie pobrana, będzie płytka kosmówkowa płodu. Tkanka ta jest identyfikowana za pomocą czerwonych znaczników na diagramach. Dobra, zacznijmy.

Umieścić łożysko w komorze bezpieczeństwa biologicznego. Otwórz błony płodowe i zorientuj się w częściach łożyska. Strona płodowa z wprowadzeniem pępowiny, laeve naczyniówkowo-owodniowa lub worek owodniowy.

Na powierzchni płodu łożyska znajdują się wyraźne duże naczynia krwionośne w płytce kosmówkowej, z leżącą nad nią błoną owodniową, którą również łatwo oddziela się mechanicznie. Strona matczyna jest przeciwna do strony płodu, z widocznymi liścieniami lub płatami. Upewnij się, że powierzchnia matczyna jest skierowana do góry.

Wytnij kawałki o grubości 0,5 cm od matczynej strony łożyska lub decidua. Podczas sekcji umieść kawałki tkanek na szalce Petriego zawierającej zrównoważony roztwór soli Hanka lub HBSS, aby tkanki były mokre. Wymieszaj tkanki w naczyniach za pomocą HBSS, aby usunąć trochę krwi.

Przenieś wystarczającą ilość tkanki, aby napełnić probówkę do znaku 10 mililitrów w probówce o pojemności 50 mililitrów, około 10 gramów. Należy pamiętać, że na tym etapie można wyizolować więcej tkanki, jeśli pod koniec procedury wymaganych jest więcej komórek. Upewnij się, że powierzchnia płodu jest skierowana do góry.

Mechanicznie usuń błonę owodniową z płodowej powierzchni łożyska, pozostawiając nienaruszoną płytkę kosmówkową. Pokrój płytkę kosmówkową na paski na głębokość około pół centymetra w tkance kosmków pod spodem. Następnie należy wypreparować tkankę kosmków kosmówkowych na głębokość około jednego centymetra w głąb łożyska, z którego usunięto płytkę kosmówkową.

Umieść tkanki w HBSS i zmierz około 10 mililitrów tkanki, tak jak to miało miejsce wcześniej. Przenieś kawałki tkanki, przy minimalnym przenoszeniu płynu, na 10-centymetrową szalkę Petriego i posiekaj nożyczkami na drobne kawałki około jednego mililitra sześciennego. Przenieś zmieloną tkankę z powrotem do probówki o grubości 50 mil.

Powtórzyć te czynności dla wszystkich pozostałych próbek tkanek. Dodać świeżo przygotowaną pożywkę trawiącą w stosunku co najmniej jeden do jednego z tkanką. Odwróć rurkę kilka razy, aby wymieszać.

Inkubować tkanki w probówce z pożywką trawiącą przez jedną do dwóch godzin, w temperaturze 37 stopni w inkubatorze do wytrząsania. Gdy roztwór trawienia tkanek zmieni się w mętny, a białe naczynia krwionośne będą widoczne w roztworze, dodaj 15 mililitrów HBSS, aby rozcieńczyć enzymy w pożywce trawiennej. Krótko odwirować pulsacyjnie próbki tylko do momentu, gdy wirówka osiągnie 340 g przez pięć sekund, a następnie zatrzymać.

Zmusi to duże zanieczyszczenia do zebrania się na dnie rury. Umieścić próbki z powrotem w komorze bezpieczeństwa biologicznego. Umieść sitko do komórek w nowej 50-mililitrowej probówce.

Odpipetować supernatant zawierający komórki jednojądrzaste do sitka, wychwytując eluat w nowej probówce. Pozostaw resztki tkanki łożyska w pierwszej probówce. Dodaj 15 mililitrów HBSS do resztek łożyska, energicznie wstrząśnij, aby odzyskać więcej komórek i odwiruj pulsacyjnie próbkę.

Ponownie odpipetować supernatant do probówki z sitkiem do komórek w probówce zbiorczej. Wlanie supernatantu do sitka do komórek może być bardziej odpowiednie, w zależności od konsystencji próbki. Umyj sitko komórkowe 5 mililitrami HBSS.

Wyrzucić probówkę zawierającą resztki tkanki łożyska. Odwirować próbkę sklarowanego osadu przez pięć minut z prędkością 340 g w celu osadzenia komórek. Czerwone krwinki są widoczne jako warstwa na dnie osadu, a komórki jednojądrzaste, w tym MSC, są jaśniejszą warstwą na wierzchu czerwonych krwinek.

Umieścić próbki z powrotem w komorze bezpieczeństwa biologicznego. Ostrożnie zdekantować supernatant i wyrzucić. Przesuń probówkę kilka razy palcem, aby usunąć osad komórkowy i ponownie zawieś osad ogniwa w 35 mililitrach pożywki MSC.

Przenieść zawiesinę komórkową do jednej kolby T175 na 10 milicali tkanki i hodować w inkubatorze o temperaturze 37 stopni z 5% CO2. Po izolacji zmień pożywkę hodowlaną po 48 godzinach. Karm kultury raz w tygodniu, aż do zlewania się.

Kultury powinny zlewać się przez około 14 dni. Na koniec rozmnażaj i kriokonserwuj komórki, analizuj charakterystykę MSC i wykorzystuj w eksperymentach. Po 48 godzinach hodowli MSC zostanie przyłączony do tkanki tkankowej plastiku, podczas gdy populacje komórek krwiotwórczych i innych nie będą miały.

W tym czasie pożywkę zastępuje się 35 mililitrami świeżej pożywki hodowlanej. Wygląd supernatantu hodowli może się znacznie różnić w zależności od dawcy łożyska. Przykład pierwszy i drugi pokazują tę odmianę.

Te dwie izolacje wykonano równocześnie, ale z dwóch różnych łożysk. Po umyciu kultury są wolne od czerwonych krwinek i resztek tkanek, jak pokazano w przykładzie trzecim, a późniejsze wyniki ekspansji są na ogół spójne. Po 48-godzinnej wymianie pożywki tylko kilka komórek jest przymocowanych do kolby.

Siedem dni po izolacji widoczne są fibroblastyczne kolonie MSC, chociaż obecne są również komórki inne niż MSC, jako okrągłe lub luźno przyczepione komórki. 13 dni po izolacji fibroblastyczne kolonie MSC są duże, a często monowarstwa MSC jest wystarczająco zlewająca się i gotowa do przejścia. Od momentu przejścia do następnego etapu monowarstwa MSC rozwija charakterystyczną morfologię przypominającą wir podczas zbiegu.

Łożyskowy MSC wykazuje klasyczny profil markera MSC za pomocą analizy cytometrii przepływowej. Komórki są dodatnie dla CD73, CD105 i CD90 oraz ujemne dla markerów krwiotwórczych CD45, CD34 i HLA-DR. Łożyskowy MSC na ogół ulega silnemu różnicowaniu osteogennemu, ale słabemu różnicowaniu adipogennemu.

W wielu publikacjach zakłada się, że komórki wyizolowane z kosmówki płodu dają płód MSC po hodowli. Jednak, jak informowaliśmy wcześniej, wszystkie kultury pochodzące z kosmówki płodu przy użyciu tego protokołu szybko ulegają wzbogaceniu w przypadku matczynego MSC, czego można by się spodziewać w przypadku matczynych dziesiętnych kultur MSC. Przedstawione tutaj dane określają ilościowo skład komórek płodu i matki w łożyskowych hodowlach MSC wyizolowanych z tkanek dziesiętnych, kosmków kosmówkowych i płytki kosmówkowej.

Po obejrzeniu tego filmu powinieneś mieć całkiem niezłe pojęcie o tym, jak wyizolować i wyhodować MSC pochodzące z tkanki łożyska. Mamy nadzieję, że metody te okażą się przydatne w badaniach i zastosowaniach klinicznych, w których mogą być wykorzystywane MSC pochodzące z łożyska.