Name: Model komory okienka kości udowej do śledzenia komórek in vivo w mysim szpiku kostnym (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-07-28T13:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 41 s
Description: Poznaj model komory okienka kości udowej do śledzenia neutrofili in vivo w mysim szpiku kostnym. Ta metoda umożliwia długoterminowe obrazowanie wielofotonową mikroskopią fluorescencyjną.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Autorzy chcieliby podziękować Zaawansowanemu Zakładowi Mikroskopii Optycznej (www.aomf.ca) w University Health Network za pomoc w mikroskopii, oraz Panu Jasonowi Ellisowi z Princess Margaret Cancer Center Machine Shop za wykonanie WC i etapu obrazowania. Chcielibyśmy również podziękować dr Iris Kulbatski za redakcję manuskryptu.

UWAGA: Wszystkie prace ze zwierzętami zostały przeprowadzone zgodnie z protokołem #2615 zatwierdzonym przez Instytucjonalny Komitet ds. Opieki i Użytkowania Zwierząt Uniwersyteckiej Sieci Zdrowia.
1. Chirurgiczne przygotowanie myszy
<ol>
	<li>Przed zabiegiem należy wysterylizować wszystkie narzędzia chirurgiczne i komorę okienną (WC) metodą autoklawowania. Uzupełnij wodę do picia w 50 mg/kg masy ciała amoksycyliny na 2 dni przed zabiegiem. Wstrzyknąć myszu 0,1 mg/kg masy ciała buprenorfiny dootrzewnowo na 4 godziny przed zabiegiem.</li>
	<li>Znieczulenie atymicznej nagiej myszy przez dootrzewnowe wstrzyknięcie 350-400 μl roztworu soli fizjologicznej zawierającego 80 mg/kg ketaminy i 13 mg/kg ksylazyny (Uwaga: zostało to zatwierdzone przez Instytucjonalny Komitet ds. Opieki nad Zwierzętami i nie mieliśmy żadnych doświadczeń z działaniami niepożądanymi). Potwierdź prawidłowe znieczulenie, badając odruch stopy. Kontynuuj obserwację wzorca oddechowego, koloru błony śluzowej i odruchu stopy podczas zabiegu.</li>
	<li>Wykonuj zabiegi chirurgiczne w komorze bezpieczeństwa biologicznego, aby utrzymać sterylne warunki podczas operacji. Umieść mysz na elektrycznej poduszce grzewczej pokrytej serwetą chirurgiczną, aby utrzymać temperaturę ciała podczas zabiegu. Wszystkie zabiegi chirurgiczne należy wykonywać pod mikroskopem stereoskopowym.</li>
	<li>Nałóż maść do oczu, aby oczy były wilgotne podczas zabiegu. W razie potrzeby powtórz czynność podczas zabiegu chirurgicznego. Wysterylizuj obszar operacyjny myszy, wycierając kolejno 7,5% jodu powidonu, 70% alkoholu izopropylowego i 10% jodu powidonu i powtórz tę procedurę dwukrotnie.</li>
	<li>Wykonaj 10 mm podłużne nacięcie skóry za pomocą skalpela z ostrzem (#15), zbliżając się do kości udowej od strony bocznej. Odsłoń kość udową między mięśniami zginacza i prostownika przez rozwarstwienie za pomocą kleszczy i hemostatów, aby zapewnić funkcjonalność mięśni.</li>
	<li>Włóż pręt w kształcie litery U pod kość i zainstaluj WC (Rysunek 1). Zabezpiecz pręt z oknem za pomocą dwóch nakrętek i dokręć nakrętki kleszczykami. Wypełnij przestrzeń między kością a toaletą cementem dentystycznym.</li>
	<li>Zeszlifuj kość korową w obszarze 6 x 2 mm2 za pomocą mikrowiertła, aby uzyskać optyczny dostęp do jamy szpiku. 
	Uwaga: Podczas wykonywania tej procedury dokładnie sprawdź ścieńczenie kości korowej pod mikroskopem. Pozostaw nienaruszoną, prawie przezroczystą warstwę okostnej kości.</li>
	<li>Umieść szklankę nakrywkową o grubości 8 mm na oknie i zabezpiecz ją pierścieniem osadczym, aby utrzymać ją na miejscu.</li>
	<li>Dostosuj mięśnie zginaczy i prostowników z powrotem do ich pierwotnych lokalizacji, używając kleszczy, aby utrzymać ich funkcję po operacji. Zszyj skórę właściwą za pomocą szwu 5-0 i uchwytu na igłę.</li>
	<li>Monitoruj mysz pod kątem powrotu do zdrowia, dopóki nie odzyska przytomności i nie będzie w stanie swobodnie się poruszać. Po wyzdrowieniu umieść zwierzę w nowej klatce.</li>
	<li>Po wyzdrowieniu należy wykonać akwizycję obrazu zwierzęcia tego samego dnia lub w dniach następnych (patrz punkt 2). Codziennie monitoruj stan fizyczny myszy. 
	Uwaga: Monitoruj warunki fizyczne, takie jak obciążenie kończyny, garbienie się, szybki lub płytki oddech, obrzęk kończyn tylnych, samookaleczenie, zapalenie tkanki łącznej i ciężkie zapalenie skóry.</li>
	<li>Należy podawać dootrzewnowe wstrzyknięcie 0,1 mg/kg masy ciała buprenorfiny przez 3 dni i 1 mg/kg masy ciała meloksykamu przez 5 dni po zabiegu chirurgicznym w celu leczenia bólu pooperacyjnego i stanu zapalnego. Kontynuuj podawanie wody uzupełnionej amoksycyliną przez 5 dni.</li>
	<li>W eksperymentalnym punkcie końcowym należy poddać zwierzę eutanazji za pomocą narkozy CO2 , a następnie metodzie wtórnej (np. zwichnięciu szyjki macicy).</li>
</ol>
2. Akwizycja obrazu za pomocą połączonej mikroskopii wielofotonowej i konfokalnej 
<ol>
	<li>Przed obrazowaniem należy znieczulić mysz przez dootrzewnowe wstrzyknięcie 350-400 μl roztworu soli fizjologicznej zawierającego 80 mg/kg ketaminy i 13 mg/kg ksylazyny. Alternatywnie użyj wziewnego środka znieczulającego, jeśli jest dostępny. Nałóż maść do oczu.</li>
	<li>Wstrzyknąć mieszaninę barwników wewnątrznaczyniowych do znakowania układu naczyniowego (0,65 mg 2 MDa Fluoresceina (FITC)-dekstran) i neutrofili (4 μg przeciwciała allofikocyjaniny (APC)-anty-Ly6G).</li>
	<li>Użyj pionowego połączonego mikroskopu wielofotonowego i konfokalnego wyposażonego w laser wielofotonowy w zakresie od 705-980 nm do wzbudzenia dwufotonowego, a także lasery jednofotonowe, które zapewniają długości fal wzbudzenia od niebieskiego do czerwonego.</li>
	<li>Ustaw specjalnie wykonany stolik do obrazowania na mikroskopie (ryc. 1B). Przymocuj mysz do sceny, zaciskając dwa końce WC za pomocą zacisków krokodylkowych. 
	Uwaga: Krytycznymi elementami stolika są: dwa zaciski krokodylkowe do przytrzymywania toalety oraz element grzejny do utrzymywania fizjologicznej temperatury (37 °C) myszy podczas obrazowania.</li>
	<li>Włącz laser dwufotonowy i system konfokalny, a następnie uruchom oprogramowanie do akwizycji obrazu, klikając "Uruchom system". Otworzy się okno z 4 zakładkami (Lokalizacja, Pozyskiwanie, Przetwarzanie i Konserwacja).</li>
	<li>Skonfiguruj kanały obrazowania. Kliknij "Smart Setup" w zakładce Akwizycja i wybierz barwniki, które będą używane do obrazowania: FITC (wzbudzenie 488 nm, emisja 493-588 nm) i APC (wzbudzenie 633 nm i emisja 638-743 nm). Wybierz "Najlepszy sygnał" i kliknij "Zastosuj".</li>
	<li>Ręcznie dodaj kanał akwizycji obrazu drugiej generacji harmonicznych (SHG). Włącz laser dwufotonowy w oknie "Laser" w zakładce Akwizycja. W oknie Kanały kliknij znak "+", aby dodać ścieżkę.</li>
	<li>Skonfiguruj ścieżkę SHG. Zmień długość fali na 840 nm w oknie Kanały za pomocą strzałek w górę iw dół i wybierz zakres wykrywania na 415-425 nm w oknie "Ścieżka światła" za pomocą suwaka.</li>
	<li>Kliknij "Oculars Online" w zakładce Zlokalizuj. Kliknij FITC pod ustawieniami filtra dla FITC, aby view obszar zainteresowania i ręcznie wyreguluj ostrość, obracając pokrętło ostrości z boku mikroskopu. Po zlokalizowaniu obszaru zainteresowania kliknij "Oculars Offline" na karcie Zlokalizuj.</li>
	<li>Kliknij zakładkę Akwizycja. Wybierz ścieżkę FITC w oknie Kanały i kliknij "Na żywo", aby wyświetlić podgląd obrazu FITC-dekstranu z obiektywem 5X. W razie potrzeby dostosuj ostrość i kliknij "Zatrzymaj" na karcie Akwizycja, aby zatrzymać podgląd.</li>
	<li>Ręcznie obróć na obiektyw wodny 20X, przesuwając koło nad soczewkami. Obejrzyj ponownie obraz dla FITC-dekstranu za pomocą obiektywu 20X i dostosuj Master Gain i Pinhole w oknie Channels, aby uzyskać optymalny sygnał i kontrast. Powtórz te czynności dla innych kanałów, wybierając ścieżki APC i SHG w oknie Kanały.</li>
	<li>Wybierz parametry obrazowania. Kliknij "Tryb akwizycji", aby otworzyć jego okno. Ustaw rozmiar klatki na 1 024 x 1 024 pikseli i średnio 4X, aby uzyskać obrazy o wysokiej jakości.</li>
	<li>Uzyskiwanie migawki 2D. Wybierz wszystkie kanały w oknie Kanały i kliknij "Snap" w zakładce Akwizycja. Sprawdź jakość obrazu i w razie potrzeby zmień parametry obrazowania.</li>
	<li>Uzyskaj obraz poklatkowy 2D.
	<ol>
		<li>Zaznacz opcję "Szeregi czasowe" na karcie Pozyskiwanie, aby otworzyć okno Szeregi czasowe. Wpisz 0 pod interwałami i 40, aby określić łączną liczbę skanów, aby wykonać 40 zdjęć w sposób ciągły bez odstępu czasu. 
		Uwaga: 40 skanów generuje około 5-minutowe szeregi czasowe z prędkością skanowania 7,5 s/klatkę i rozmiarem obrazu 600 μm x 600 μm. Dostosuj interwał i liczbę skanów w zależności od mikroskopu, ustawień akwizycji obrazu i liczby klatek na sekundę w aparacie. Stały czas interwału (>0 s) może być używany do porównywania zdjęć poklatkowych uzyskanych w różnych punktach czasowych. Dłuższy czas obrazowania poklatkowego może być wymagany w zależności od oczekiwanej średniej prędkości neutrofili (lub innych komórek będących przedmiotem zainteresowania) w warunkach eksperymentalnych.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Uzyskaj obraz 3D.
	<ol>
		<li>Zaznacz "Z-Stack" w zakładce Akwizycja, aby otworzyć okno Z-Stack. Uruchom tryb podglądu "Na żywo" dla FITC-dextran. Skoncentruj się na górnej części próbki i kliknij "Ustaw pierwszy", a następnie skup się na drugim końcu próbki i kliknij "Ustaw ostatnią" w oknie stosu Z.</li>
		<li>Ustaw interwał na 10 μm w oknie Z-stack. W zależności od pierwszego i ostatniego warstwy optycznej wybranej w poprzednim kroku, wygeneruje to 10-20 warstw o całkowitej grubości optycznej 90-180 μm. 
		Uwaga: Interwał stosu z zależy od rozmiaru otworu, który określa grubość warstwy optycznej. Ustaw interwał tak, aby był mniejszy niż grubość warstwy optycznej.</li>
		<li>Kliknij "Rozpocznij eksperyment" na karcie Akwizycja, aby rozpocząć zbieranie obrazów.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Uzyskaj obraz poklatkowy 3D.
	<ol>
		<li>Zaznacz "Szeregi czasowe" i "Stos Z" na karcie Pozyskiwanie, aby otworzyć okna szeregów czasowych i stosu Z.</li>
		<li>Skonfiguruj parametry pozyskiwania szeregów czasowych i stosu Z zgodnie z opisem w krokach 2.14 i 2.15. Kliknij "Rozpocznij eksperyment" na karcie Akwizycja, aby rozpocząć zbieranie obrazów.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Monitoruj mysz podczas obrazowania, aby upewnić się, że jest stabilna i nieprzytomna. Jeśli mysz jest niestabilna i/lub przytomna podczas obrazowania, usuń mysz ze sceny, wstrzyknij dodatkowe 100-150 μl roztworu znieczulającego dootrzewnowo i kontynuuj obrazowanie. 
	Uwaga: Oznaki niestabilności obejmują szybki oddech i ruch myszy, które można zobaczyć jako przesuwające się artefakty na uzyskanych obrazach.</li>
	<li>Po uzyskaniu obrazu zdejmij mysz ze sceny i włóż ją z powrotem do klatki. Użyj lampy grzewczej, aby utrzymać ją w cieple i monitoruj mysz, aż będzie przytomna.</li>
</ol>
3. Analiza obrazu i kwantyfikacja
<ol>
	<li>Użyj oprogramowania do analizy obrazów, aby przeanalizować dane 3D i szeregi czasowe. Otwórz oprogramowanie i dodaj obrazy, przeciągając je na otwarty ekran, który nazywa się widokiem "Arena". Kliknij dwukrotnie plik obrazu, aby go otworzyć; obraz zostanie otwarty w widoku "Przekrocz".</li>
	<li>Utwórz obraz 2D/3D.
	<ol>
		<li>Na pasku "Więcej" znajdującym się w prawym górnym rogu kliknij "Edytuj / Pokaż korektę wyświetlania", aby otworzyć okno "Korekta wyświetlania". Zoptymalizuj wyświetlanie fluorescencji, dostosowując progi dla każdego kanału, a następnie zrób migawkę, aby zapisać obraz.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Generuj ścieżki obiektów za pomocą obrazów poklatkowych.
	<ol>
		<li>Otwórz obraz do analizy w widoku "Przekrocz". Kliknij ikonę z obrazem pomarańczowych kropek, znajdującą się pod ikoną "Surpass". Spowoduje to otwarcie nowego okna "Miejsca".</li>
		<li>Zaznacz "Śledź miejsca (w czasie)" i kliknij niebieską strzałkę, aby przejść do następnego kroku. Wybierz kanał zawierający obiekty do śledzenia w sekcji "Kanał źródłowy" i ustaw szacowaną średnicę obiektu w polu "Szacowana średnica XY", wpisując liczbę. Kliknij niebieską strzałkę, aby przejść do następnego kroku. 
		Uwaga: Do śledzenia neutrofili wybierz kanał zawierający fluorescencję APC dla neutrofili i ustaw średnicę obiektu na 12 μm w oparciu o znaną wielkość neutrofili.</li>
		<li>W oknie znajdź i wybierz filtr "Jakość", klikając strzałkę w dół. Obserwuj punkty zdefiniowane przez oprogramowanie i ręcznie dostosuj próg, aby uwzględnić lub wykluczyć plamy. Po zdefiniowaniu progu kliknij niebieską strzałkę, aby przejść do kroku "Śledzenie".</li>
		<li>W sekcji Algorytm znajdź i wybierz "Algorytm ruchu autorregresyjnego", klikając strzałkę w dół. Wpisz 10 μm dla "Maksymalnej odległości" i 3 dla "Maksymalnego rozmiaru szczeliny" znajdującej się w obszarze Parametry. Zaznacz "Wypełnij luki wszystkimi wykrytymi obiektami", aby rozpocząć śledzenie, i kliknij niebieską strzałkę, aby przejść do następnego kroku. 
		Uwaga: "Algorytm ruchu autoregresywnego" jest używany dla obiektów, które mają skierowany ruch, ponieważ generuje ścieżki na podstawie przewidywanej lokalizacji na podstawie poprzedniego ruchu. "Maksymalna odległość" i "Maksymalny rozmiar przerwy" można dostosować w zależności od oczekiwanego wymiaru i prędkości śledzonego obiektu, a także całkowitego czasu trwania obrazu poklatkowego.</li>
		<li>W sekcji Typ filtru wybierz filtr "Czas trwania ścieżki". Kliknij zieloną strzałkę, aby zakończyć śledzenie i sprawdź wygenerowane ścieżki. W razie potrzeby wróć do poprzedniego kroku, aby ręcznie posortować utwory.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Jeśli wygenerowany obraz poklatkowy dryfuje, skoryguj dryf translacyjny.
	<ol>
		<li>Kliknij ikonę z obrazem ołówka. Jest to zakładka edycji, która otwiera okno "Edytuj utwory". Przyjrzyj się obrazowi poklatkowemu i znajdź punkt odniesienia, który nie powinien się poruszać dla wszystkich obrazów.</li>
		<li>W lewym górnym rogu ekranu znajdź okno "Wskaźnik" i zaznacz "Wybierz", aby aktywować kursor do wyboru miejsca. Kliknij punkt odniesienia.</li>
		<li>Kliknij "Popraw dryf" w oknie "Edytuj ścieżki". Zaznacz "Dryf translacyjny". Oprogramowanie automatycznie wygeneruje poprawioną serię obrazów.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Mierz ruch komórkowy zdefiniowany przez ścieżki obiektów na zdjęciach poklatkowych.
	<ol>
		<li>W oknie "Edytuj ścieżki" zaznacz "Ścieżki" i wybierz ścieżkę, która reprezentuje ruch komórki. Wybrana ścieżka zostanie podświetlona na żółto na obrazie szeregów czasowych.</li>
		<li>Kliknij na ikonę z obrazem wykresu, aby otworzyć okno "Statystyki" (zakładka statystyki).</li>
		<li>W sekcji "Wybór" wybierz "Średnia prędkość ścieżki", klikając strzałkę w dół, aby wygenerować średnią prędkość ścieżki dla wybranej ścieżki. Wybierz różne ścieżki i powtórz kroki, aby zmierzyć średnią prędkość ścieżki dla wszystkich interesujących komórek.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

<ol><li>Zhao, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bone+marrow+and+the+control+of+immunity%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Mol+Immunol%22%5BJournal%5D)">Bone marrow and the control of immunity.</a> Cell Mol Immunol. 9 (1), 11-19 (2012).</li>
<li>Borregaard, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neutrophils%2C+from+marrow+to+microbes%5BTitle%5D)+AND+%22Immunity%22%5BJournal%5D)">Neutrophils, from marrow to microbes.</a> Immunity. 33 (5), 657-670 (2010).</li>
<li>Boxio, R., Bossenmeyer-Pourie, C., Steinckwich, N., Dournon, C., Nusse, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mouse+bone+marrow+contains+large+numbers+of+functionally+competent+neutrophils%5BTitle%5D)+AND+%22J+Leukoc+Biol%22%5BJournal%5D)">Mouse bone marrow contains large numbers of functionally competent neutrophils.</a> J Leukoc Biol. 75 (4), 604-611 (2004).</li>
<li>Fridlender, Z. G., Albelda, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tumor-associated+neutrophils%3A+friend+or+foe%3F%5BTitle%5D)+AND+%22Carcinogenesis%22%5BJournal%5D)">Tumor-associated neutrophils: friend or foe?</a> Carcinogenesis. , (2012).</li>
<li>Fridlender, Z. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Polarization+of+tumor-associated+neutrophil+phenotype+by+TGF-beta%3A+%27N1%27+versus+%27N2+TAN%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Cell%22%5BJournal%5D)">Polarization of tumor-associated neutrophil phenotype by TGF-beta: 'N1' versus 'N2 TAN.</a> Cancer Cell. 16 (3), 183-194 (2009).</li>
<li>Coffelt, S. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((IL-17-producing+%5Bggr%5D%5Bdgr%5D+T+cells+and+neutrophils+conspire+to+promote+breast+cancer+metastasis%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">IL-17-producing [ggr][dgr] T cells and neutrophils conspire to promote breast cancer metastasis.</a> Nature. 522 (7556), 345-348 (2015).</li>
<li>Kitamura, T., Qian, B. Z., Pollard, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immune+cell+promotion+of+metastasis%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Immunol%22%5BJournal%5D)">Immune cell promotion of metastasis.</a> Nat Rev Immunol. 15 (2), 73-86 (2015).</li>
<li>Granot, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tumor+entrained+neutrophils+inhibit+seeding+in+the+premetastatic+lung%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Cell%22%5BJournal%5D)">Tumor entrained neutrophils inhibit seeding in the premetastatic lung.</a> Cancer Cell. 20 (3), 300-314 (2011).</li>
<li>Travlos, G. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Normal+structure%2C+function%2C+and+histology+of+the+bone+marrow%5BTitle%5D)+AND+%22Toxicol+Pathol%22%5BJournal%5D)">Normal structure, function, and histology of the bone marrow.</a> Toxicol Pathol. 34 (5), 548-565 (2006).</li>
<li>Pittet, M. J., Weissleder, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intravital+Imaging%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Intravital Imaging.</a> Cell. 147 (5), 983-991 (2011).</li>
<li>Alieva, M., Ritsma, L., Giedt, R. J., Weissleder, R., van Rheenen, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+windows+for+long-term+intravital+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22IntraVital%22%5BJournal%5D)">Imaging windows for long-term intravital imaging.</a> IntraVital. 3 (2), e29917(2014).</li>
<li>Hamon, P., Rodero, M. P., Combadiere, C., Boissonnas, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tracking+mouse+bone+marrow+monocytes+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Tracking mouse bone marrow monocytes in vivo.</a> J Vis Exp. (96), e52476(2015).</li>
<li>Mazo, I. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hematopoietic+Progenitor+Cell+Rolling+in+Bone+Marrow+Microvessels%3A+Parallel+Contributions+by+Endothelial+Selectins+and+Vascular+Cell+Adhesion+Molecule+1%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Exp.+Med%22%5BJournal%5D)">Hematopoietic Progenitor Cell Rolling in Bone Marrow Microvessels: Parallel Contributions by Endothelial Selectins and Vascular Cell Adhesion Molecule 1.</a> J. Exp. Med. 188 (3), 465-474 (1998).</li>
<li>Scott, M. K., Akinduro, O., Lo Celso, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+Vivo+4-Dimensional+Tracking+of+Hematopoietic+Stem+and+Progenitor+Cells+in+Adult+Mouse+Calvarial+Bone+Marrow%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">In Vivo 4-Dimensional Tracking of Hematopoietic Stem and Progenitor Cells in Adult Mouse Calvarial Bone Marrow.</a> J. Vis. Exp. (91), e51683(2014).</li>
<li>Lassailly, F., Foster, K., Lopez-Onieva, L., Currie, E., Bonnet, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multimodal+imaging+reveals+structural+and+functional+heterogeneity+in+different+bone+marrow+compartments%3A+functional+implications+on+hematopoietic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Multimodal imaging reveals structural and functional heterogeneity in different bone marrow compartments: functional implications on hematopoietic stem cells.</a> Blood. 122 (10), 1730-1740 (2013).</li>
<li>Kohler, A., Geiger, H., Gunzer, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+hematopoietic+stem+cells+in+the+marrow+of+long+bones+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Imaging hematopoietic stem cells in the marrow of long bones in vivo.</a> Methods Mol Biol. 750, 215-224 (2011).</li>
<li>Balan, M., Kiefer, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+model+for+ectopic%2C+chronic%2C+intravital+multiphoton+imaging+of+bone+marrow+vasculature+and+architecture+in+split+femurs%5BTitle%5D)+AND+%22IntraVital%22%5BJournal%5D)">A novel model for ectopic, chronic, intravital multiphoton imaging of bone marrow vasculature and architecture in split femurs.</a> IntraVital. 4 (2), e1066949(2015).</li>
<li>Hansen-Algenstaedt, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Femur+window--a+new+approach+to+microcirculation+of+living+bone+in+situ%5BTitle%5D)+AND+%22J+Orthop+Res%22%5BJournal%5D)">Femur window--a new approach to microcirculation of living bone in situ.</a> J Orthop Res. 23 (5), 1073-1082 (2005).</li>
<li>Xu, N., Lei, X., Liu, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tracking+Neutrophil+Intraluminal+Crawling%2C+Transendothelial+Migration+and+Chemotaxis+in+Tissue+by+Intravital+Video+Microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Tracking Neutrophil Intraluminal Crawling, Transendothelial Migration and Chemotaxis in Tissue by Intravital Video Microscopy.</a> J. Vis. Exp. (55), e3296(2011).</li>
<li>Mizuno, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+imaging+reveals+PKA+regulation+of+ERK+activity+during+neutrophil+recruitment+to+inflamed+intestines%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Exp.+Med%22%5BJournal%5D)">In vivo imaging reveals PKA regulation of ERK activity during neutrophil recruitment to inflamed intestines.</a> J. Exp. Med. 211 (6), 1123-1136 (2014).</li>
<li>Kreisel, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+two-photon+imaging+reveals+monocyte-dependent+neutrophil+extravasation+during+pulmonary+inflammation%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci%22%5BJournal%5D)">In vivo two-photon imaging reveals monocyte-dependent neutrophil extravasation during pulmonary inflammation.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. 107 (42), 18073-18078 (2010).</li>
<li>Yipp, B. G., Kubes, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Antibodies+against+neutrophil+LY6G+do+not+inhibit+leukocyte+recruitment+in+mice+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Antibodies against neutrophil LY6G do not inhibit leukocyte recruitment in mice in vivo.</a> Blood. 121 (1), 241-242 (2013).</li>
<li>Bucher, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluorescent+Ly6G+antibodies+determine+macrophage+phagocytosis+of+neutrophils+and+alter+the+retrieval+of+neutrophils+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22J+Leukoc+Biol%22%5BJournal%5D)">Fluorescent Ly6G antibodies determine macrophage phagocytosis of neutrophils and alter the retrieval of neutrophils in mice.</a> J Leukoc Biol. 98 (3), 365-372 (2015).</li>
<li>Lammermann, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neutrophil+swarms+require+LTB4+and+integrins+at+sites+of+cell+death+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Neutrophil swarms require LTB4 and integrins at sites of cell death in vivo.</a> Nature. 498 (7454), 371-375 (2013).</li>
<li>Progatzky, F., Dallman, M. J., Lo Celso, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((From+seeing+to+believing%3A+labelling+strategies+for+in+vivo+cell-tracking+experiments%5BTitle%5D)+AND+%22Interface+Focus%22%5BJournal%5D)">From seeing to believing: labelling strategies for in vivo cell-tracking experiments.</a> Interface Focus. 3 (3), (2013).</li>
<li>Koewler, N. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+a+Monoclonal+Antibody+Raised+Against+Nerve+Growth+Factor+on+Skeletal+Pain+and+Bone+Healing+After+Fracture+of+the+C57BL%2F6J+Mouse+Femur%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Bone+Miner+Res%22%5BJournal%5D)">Effects of a Monoclonal Antibody Raised Against Nerve Growth Factor on Skeletal Pain and Bone Healing After Fracture of the C57BL/6J Mouse Femur.</a> J. Bone Miner Res. 22 (11), 1732-1742 (2007).</li>
<li>Garcia, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rodent+animal+models+of+delayed+bone+healing+and+non-union+formation%3A+a+comprehensive+review%5BTitle%5D)+AND+%22Eur+Cell+Mater%22%5BJournal%5D)">Rodent animal models of delayed bone healing and non-union formation: a comprehensive review.</a> Eur Cell Mater. 26, 1-12 (2013).</li>
<li>Liu, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+murine+femoral+segmental+defect+model+for+bone+tissue+engineering+using+a+novel+rigid+internal+fixation+system%5BTitle%5D)+AND+%22J+Surg+Res%22%5BJournal%5D)">A murine femoral segmental defect model for bone tissue engineering using a novel rigid internal fixation system.</a> J Surg Res. 183 (2), 493-502 (2013).</li>
<li>Morrison, S. J., Scadden, D. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+bone+marrow+niche+for+haematopoietic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">The bone marrow niche for haematopoietic stem cells.</a> Nature. 505 (7483), 327-334 (2014).</li>
<li>Ellis, S. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+relationship+between+bone%2C+hemopoietic+stem+cells%2C+and+vasculature%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">The relationship between bone, hemopoietic stem cells, and vasculature.</a> Blood. 118 (6), 1516-1524 (2011).</li>
<li>Vacaru, A., Vitale, J., Nieves, J., Baron, M. Mouse Genetics. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aVacaru%2C+A+%22Methods+in+Molecular+Biology%22">Methods in Molecular Biology</a>. Singh, S. R., Coppola, V. 1194, Springer. New York. 289-312 (2014).</li>
</ol>

Autorzy nie mają konkurencyjnych interesów finansowych.

Seryjne obrazowanie dynamicznych procesów komórkowych w szpiku kostnym w czasie rzeczywistym dostarcza informacji, które w innym przypadku byłyby trudne do uzyskania przy użyciu konwencjonalnych technik, takich jak histologia i morfologia krwi. Opisany tutaj model WC kości udowej zapewnia unikalne możliwości badania zmian komórkowych i strukturalnych w szpiku kostnym w czasie. Chociaż model WC kości udowej został już wcześniej opisany, nasz nowatorski projekt zapewnia większe pole widzenia obrazowania i mniejszy ogólny r...

Szpik kostny jest ważnym organem zaangażowanym w hematopoezę i regulację immunologiczną. Składa się ze składnika hematopoetycznego zawierającego hematopoetyczne komórki macierzyste i progenitorowe (HSPC) oraz składnika zrębowego zawierającego niehematopoetyczne komórki progenitorowe, które dają początek komórkom mezenchymalnym1. Dwie trzecie aktywności krwiotwórczej jest przeznaczone na wytwarzanie komórek szpikowych2. W szczególności duża liczba neutrofili jest wytwarzana w szpiku kostnym, przy czym 1-2 x 1011 komórek wytwarza się dziennie u normalnego dorosłego człowieka2. Neutrofile są pierwszą linią obrony przed infekcjami bakteryjnymi i są w większości zarezerwowane w szpiku kostnym, dopóki stres nie uruchomi ich mobilizacji w celu uzupełnienia obwodowych neutrofili1,3. Oprócz działania przeciwbakteryjnego, ostatnie badania sugerują ważną rolę neutrofili w biologii raka, mających zarówno pro-, jak i przeciwnowotworowe fenotypy, w zależności od sygnalizacji transformującego czynnika wzrostu beta (TGF-β) w mikrośrodowisku guza4,5. Ponadto badania wykazały, że neutrofile, które gromadzą się w guzach pierwotnych, wywierają działanie pronowotworowe i przerzutowe poprzez tłumienie cytotoksycznej funkcji limfocytów T6,7, podczas gdy neutrofile w krążeniu wywierają działanie cytotoksyczne, przeciwprzerzutowe8. W związku z tym badanie komórek krwiotwórczych w szpiku kostnym, zwłaszcza neutrofili, ma kluczowe znaczenie dla wyjaśnienia ich roli w regulacji immunologicznej i nowotworowej.
Histopatologia i pełna morfologia krwi obwodowej są rutynowo używane do oceny zmian komórkowych i strukturalnych w szpiku kostnym9. Jednak metody te dostarczają jedynie informacji statycznych o różnych populacjach komórek lub mikrostrukturach tkanek. Obrazowanie podłużne in vivo może być stosowane w połączeniu ze standardowymi metodami do oceny dynamiki wielu składników komórkowych, naczyniowych i zrębowych, a także interakcji międzykomórkowych w sposób podłużny. Mikroskopia przyżyciowa (IVM), definiowana jako obrazowanie żywych zwierząt w rozdzielczościmikroskopowej 10, jest szczególnie przydatna do oceny dynamicznych procesów komórkowych w czasie w tej samej próbce, zmniejszając liczbę wymaganych zwierząt doświadczalnych. IVM jest często łączony z przewlekle przeszczepioną komorą okienną (WC) w celu uzyskania dostępu do narządu zainteresowania w celu obrazowania przez okres od tygodni do miesięcy. Modele WC z fałdami czaszkowymi i grzbietowo-skórnymi mają najdłuższą historię użytkowania sięgającą połowy lat 90. Niedawno opracowano inne specyficzne dla narządu modele WC, takie jak poduszeczka tłuszczowa sutka i różne narządy jamy brzusznej11.
Typowe podejście do obrazowania szpiku kostnego in vivo polegało głównie na ekspozycji kalwarii myszy, gdzie przerzedzona kość umożliwia bezpośrednią wizualizację pojedynczych komórek przy minimalnej interwencji chirurgicznej12-14. Jednak szpik kostny kalwarii może różnić się od szpiku kostnego innych kości, takich jak kość długa, o czym świadczy mniejsza liczba HSPC i komórek niedotlenionych w kalwarii, co wskazuje na zmniejszone utrzymanie i rozwój HSPC15. W związku z tym zbadano alternatywne podejścia do oceny składników komórkowych w kości długiej. Należą do nich bezpośrednie odsłonięcie szpiku kostnego kości udowej16 i ektopowe przeszczepienie rozszczepionej kości udowej w grzbietowym fałdzie skórnym WC17. Jednak pierwsza z nich jest zabiegiem terminalnym, który nie pozwala na śledzenie zmian komórkowych, strukturalnych i funkcjonalnych w dłuższych okresach czasu, a druga prawdopodobnie zaburza normalną funkcję szpiku kostnego z powodu przeszczepu kości udowej do miejsca ektopowego wewnątrz grzbietowego fałdu skórnego. Inną metodą, która umożliwia ortotopowe obrazowanie seryjne szpiku kostnego kości udowej w czasie, jest zastosowanie WC w kości udowej. Jeden z poprzednich raportów wykazał długoterminowe obrazowanie mikrokrążenia w szpiku kostnym kości udowej przy użyciu WC kości udowej u myszy18. Dodatkowo autorzy zademonstrowali wizualizację komórek nowotworowych w kości udowej, wskazując na jej przydatność w monitorowaniu przerzutów do szpiku kostnego. Jednak ta konstrukcja WC była ograniczona przez jej duży rozmiar (1,2 cm średnicy) i stosunkowo mały obszar obrazowania (średnica 4 mm), który był odpowiedni tylko dla dużych myszy (26-34 g, 3-6 miesięcy), co sprawiało, że podejście to było niepraktyczne w rutynowym użyciu.
Dlatego na potrzeby tego badania zaprojektowano nowe WC o mniejszym rozmiarze ogólnym i większym wewnętrznym obszarze obrazowania. Celem pracy było opracowanie metody obrazowania różnych typów komórek w szpiku kostnym kości udowej. Model WC kości udowej został opracowany wewnętrznie i został wykorzystany do wizualizacji i śledzenia neutrofili w sieci naczyniowej 3D. Korzystając z tego modelu, IVM szpiku kostnego może być wykonywany seryjnie przez 40 dni. Podejście to można zastosować w różnych dziedzinach w celu wyjaśnienia procesów hematopoezy, regulacji immunologicznej i rozwoju nowotworu.

<table><tbody><tr><td>NRCNU-F atymiczne nagie myszy</td><td>Taconic</td><td>Ncr nago</td><td>8-10 tygodni, samica</td></tr><tr><td>Saline</td><td>Baxter</td><td>JB1302P</td><td></td></tr><tr><td>Chlorowodorek ketaminy</td><td>Bioniche Animal Health Canada, Inc.&nbsp;</td><td>DIN 01989529</td><td></td></tr><tr><td>Ksylazyna</td><td>Bayer HealthCare, Bayer Inc.</td><td>DIN 02169592</td><td></td></tr><tr><td>Serweta chirurgiczna</td><td>Proxima</td><td>DYNJP2405</td><td></td></tr><tr><td>Elektryczna poduszka grzewcza</td><td>Life Marka</td><td>57800827375</td><td></td></tr><tr><td>Mikroskop stereoskopowy</td><td>Leica</td><td>Leica M60</td><td></td></tr><tr><td>Maść do oczu (żel łzowy)</td><td>Novartis&nbsp;</td><td>T296/2</td><td></td></tr><tr><td>7,5% betadyna</td><td>Purdue Frederick Co</td><td>67618-151-16</td><td></td></tr><tr><td>70% alkohol izopropylowy</td><td>GreenField</td><td>P010IP7P</td><td></td></tr><tr><td>10% betadyna</td><td>Purdue Frederick Co</td><td>67618-150-05</td><td></td></tr><tr><td>Rękojeść skalpela</td> <td>Fine Science Tools</td><td>10003-12</td><td></td></tr><tr><td>Ostrze skalpela (#15)</td><td>VWR</td><td>89176-368</td><td></td></tr><tr><td>Nożyczki sprężynowe zakrzywione</td><td>Narzędzia do nauki</td><td>15023-10</td><td></td></tr><tr><td>Hemostat dla niemowląt</td><td>Narzędzia do nauki</td><td>13013-14</td><td></td></tr><tr><td>Cienkie nożyczki</td><td>Narzędzia do nauki</td><td>14094-11</td><td></td></tr><tr><td>Ekstra cienkie kleszcze Graefe</td><td>Narzędzia do nauki</td><td>11151-10</td><td></td></tr><tr><td>Hemostatyki Halsted-Mosquito</td><td>Narzędzia do nauki pięknej</td><td>13008-12</td><td></td></tr><tr><td>Mikrowiertło</td><td>Harvard Apparaus</td><td>72-6065</td><td></td></tr><tr><td>Frezy do mikrowiertła</td><td>Fine Science Tools</td><td>19007-14</td><td></td></tr><tr><td>Komora okienna kości udowej</td><td>PMCC warsztat mechaniczny projekt</td><td>niestandardowy</td><td>9,1 mm- 8,5 mm- 7,5 mm (średnica zewnętrzna do wewnętrznej), 2,16 mm (promień dwóch otworów), 13,9 mm (odległość między dwoma otworami), 0,7 mm (grubość)</td></tr><tr><td>Pręt w kształcie litery U</td><td>Warsztat mechaniczny PMCC</td><td>niestandardowy projekt</td><td>13,8 mm (długość), 1,6 mm (szerokość), 3,7 mm (wysokość)</td></tr><tr><td>Szkło nakrywkowe (8 mm)</td><td>Warner Instruments&nbsp;</td><td>HBIO 64-0701 CS-8R</td><td></td></tr><tr><td>Pierścień ustalający (8 mm)</td><td>ACKLANDS GRAINGER</td><td>UNSPSC #</td><td></td></tr> 31163202 <tr><td>Nakrętki (sześciokątna stal nierdzewna)</td><td>Fastenal</td><td>70701</td><td></td></tr><tr><td>Cement dentystyczny</td><td>3M</td><td>RelyX U200</td><td></td></tr><tr><td>Szew (5-0 Monosof)</td><td>Covioien</td><td>SN-5698</td><td></td></tr><tr><td>Uchwyt igły Halsey</td><td>Fine Science Tools</td><td>12501-13</td><td></td></tr><tr><td>Buprenorfina (Temgesic)</td><td>Reckitt Benckiser</td><td>DIN 0281251</td><td></td></tr><tr><td>Meloxicam (Metacam)</td><td>Boehringer Ingelheim</td><td>DIN 02240463</td><td></td></tr><tr><td>Amoksycylina (Clamavox)</td><td>Pfizer</td><td>DIN 02027879</td><td></td></tr><tr><td>FITC-Dekstran</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>FD2000S</td><td></td></tr><tr><td>APC- Anti-Mouse Ly-6G (Gr-1)&nbsp;</td><td>eBioscience</td><td>17-9668</td><td></td></tr><tr><td>Mikroskop dwufotonowy LSM 710</td><td>Carl Zeiss</td><td>Zeiss LSM 710 NLO</td><td></td></tr><tr><td>Stolik do obrazowania</td><td>PMCC warsztat mechaniczny projekt</td><td>niestandardowy</td><td>15,9 cm (długość), 11 cm (szerokość), 0,9 cm (wysokość)</td></tr><tr><td>Oprogramowanie Imaris</td><td>Bitplane</td><td>Imaris 8.0</td><td>Oprogramowanie do analizy obrazu opisane w sekcji 3 Protokołu&nbsp;</td></tr><tr><td>Zen 2012</td><td>Zeiss</td><td>Zen 2012</td><td>Oprogramowanie do pozyskiwania obrazów opisane w sekcji 2 Protokołu&nbsp;</td></tr></tbody></table>

model komory okienka kości udowej do śledzenia komórek in vivo w mysim szpiku kostnym

Femur Window Chamber Model for In Vivo Cell Tracking in the Murine Bone Marrow

Szpik kostny to złożony narząd, który zawiera różne komórki krwiotwórcze i niekrwiotwórcze. Komórki te biorą udział w wielu procesach biologicznych, w tym hematopoezie, regulacji immunologicznej i regulacji guza. Powszechnie stosowane metody zrozumienia działań komórkowych w szpiku kostnym, takie jak histologia i morfologia krwi, dostarczają informacji statycznych, a nie rejestrują dynamicznego działania wielu składników komórkowych in vivo. Jako uzupełnienie standardowych metod opracowano model oparty na komorze okiennej (WC), aby umożliwić seryjne obrazowanie in vivo komórek i struktur w mysim szpiku kostnym. Protokół ten opisuje zabieg chirurgiczny polegający na zainstalowaniu WC w kości udowej w celu ułatwienia długotrwałego dostępu optycznego do szpiku kostnego kości udowej. W szczególności, aby zademonstrować swoją eksperymentalną użyteczność, to podejście WC wykorzystano do obrazowania i śledzenia neutrofili w sieci naczyniowej kości udowej, zapewniając w ten sposób nowatorską metodę wizualizacji i ilościowego określania transportu i regulacji komórek odpornościowych w szpiku kostnym. Metoda ta może być stosowana do badania różnych procesów biologicznych w mysim szpiku kostnym, takich jak hematopoeza, przeszczep komórek macierzystych i odpowiedzi immunologiczne w stanach patologicznych, w tym raku.

Szpik kostny kości udowej myszy został pomyślnie udostępniony przy użyciu WC, co umożliwiło wizualizację pojedynczych neutrofili oraz sieci naczyniowych. Rysunek 1 przedstawia instrument WC i opisuje procedurę chirurgiczną, która obejmuje odsłonięcie kości udowej i odcienienie kości korowej w celu uzyskania dostępu optycznego do wnętrza kości. Zabieg jest dobrze tolerowany przez myszy; przez 5 dni po operacji oceniano je pod kątem niepożądanych reakcji fizycznych, takich ...

Protokół opisuje nowatorski model komory okiennej kości udowej dla myszy, który może być używany do śledzenia ruchu komórek w szpiku kości udowej in vivo. Przyżyteczna mikroskopia fluorescencyjna wielofotonowa służy do obrazowania trzech składników szpiku kostnego kości udowej (układu naczyniowego, macierzy kolagenowej i neutrofili) w czasie.

Model komory okienka kości udowej do śledzenia komórek in vivo w mysim szpiku kostnym

Bone marrow is a complex organ that contains various hematopoietic and non-hematopoietic cells. These cells are involved in many biological processes, ...

Ogólnym celem niniejszej procedury jest przeprowadzenie długoterminowego obrazowania mikroskopowego i śledzenia neutrofili w strukturach naczyniowych szpiku kostnego myszy za pomocą wszczepionej chronicznej komory okiennej nad kością udową. Metoda ta może pomóc w udzieleniu odpowiedzi na kluczowe pytania z zakresu immunologii i onkologii dotyczące roli monocytów w regulacji infekcji, tumorigenezy oraz przerzutowania nowotworów. Głównymi zaletami tej techniki są umożliwienie długoterminowego dostępu mikroskopowego do szpiku kostnego kości udowej, będącego centralnym miejscem hemopoezy, oraz dostarczenie dynamicznych informacji, które w inny sposób są trudne do uzyskania za pomocą konwencjonalnych metod.Choć metoda ta jest specyficzna dla obrazowania neutrofili w obrębie sieci naczyniowej, może być ona również wykorzystana do wizualizacji innych interesujących populacji komórek odpornościowych. W dniu operacji potwierdź odpowiedni poziom sedacji u myszy athymic nude, sprawdzając brak reakcji na uszczypnięcie w palcu stopy. Następnie umieść mysz pod stereomikroskopem na elektrycznej podkładce grzewczej, przykrytej chustą chirurgiczną.Następnie nałóż maść do oczu zwierzęcia i wysterylizuj obszar operacyjny, przemywając go dwukrotnie i sekwencyjnie 7,5% povidone-iodine, 70% izopropanolu oraz 10% povidone-iodine. Po przygotowaniu zwierzęcia, użyj skalpela z ostrzem numer 15, aby wykonać 10 milimetrowe podłużne nacięcie skóry w kierunku kości udowej od strony bocznej. Następnie przeprowadź tępe rozcięcie za pomocą pęsety i kleszczyków hemostatycznych, aby odsłonić kość udową pomiędzy mięśniami zginaczami a prostownikami.Po odsłonięciu kości udowej, wsuń pod kość pręt w kształcie litery U i zamontuj komorę okienkową. Za pomocą dwóch nakrętek przymocuj pręt do okna. Następnie dociągnij nakrętki pęsetą.Za pomocą pincety przywróć mięśnie zginacze i prostowniki na ich pierwotne miejsce. Wypełnij przestrzeń między kością a komorą okienkową cementem stomatologicznym, aby unieruchomić komorę. Następnie, używając mikrowiertarki, wyszlifuj w kości korowej obszar o wymiarach 6 × 2 mm, aby uzyskać dostęp optyczny do jamy szpiku.Po uzyskaniu niemal przezroczystej warstwy okostnej kości, należy umieścić ośmiomilimetrowe szkiełko podstawowe na okienku i za pomocą pierścienia zatrzaskowego przymocować szkiełko na miejscu. Następnie należy zamknąć skórę właściwą, używając szwu 5-0 i uchwytu do igieł. Po tym czasie mysz należy umieścić w nowej klatce z czystą ściółką i monitorować jej stan aż do pełnego powrotu do zdrowia.Aby uzyskać połączone obrazy z mikroskopii wielofotonowej i konfokalnej przez komorę okienkową, najpierw wstrzyknij odpowiednie roztwory fluorescencyjne do znakowania neutrofili w naczyniach krwionośnych myszy poprzez żyłę ogonową. Zaciśnij końce komory okienkowej klipsami typu krokodylko, aby przymocować mysz do specjalnie wykonanego stolika. Następnie umieść stolik obrazujący na połączonym mikroskopie wielofotonowym i konfokalnym.Po unieruchomieniu myszy włącz laser dwufotonowy oraz system konfokalny, a następnie kliknij Start System, aby uruchomić oprogramowanie do akwizycji obrazów. Aby skonfigurować kanały obrazowania, w karcie Acquisition kliknij Smart Setup i wybierz lasery do obrazowania. Wybierz opcję Best signal i kliknij Apply.Ręcznie dodaj kanał akwizycji obrazów generacji drugiej harmonicznej, włączając laser dwufotonowy w oknie Laser i ustawiając odpowiednie długości fal akwizycji dla generacji drugiej harmonicznej. W zakładce Locate kliknij Oculars online i zlokalizuj obszar zainteresowania za pomocą mikroskopu poprzez inspekcję wizualną. Kliknij Oculars offline i otwórz zakładkę Acquisition.W oknie Kanały (Channels) wybierz ścieżkę FITC, a następnie kliknij Live, aby wyświetlić podgląd obrazu FITC-dekstranu przy użyciu obiektywu 5x. W razie potrzeby dostosuj ostrość. Następnie w zakładce Akwizycja (Acquisition) kliknij Stop, aby zakończyć podgląd.Teraz należy ręcznie wybrać obiektyw wodny 20x i ponownie wyświetlić obraz FITC-Dextran, regulując główny Gain oraz Pinhole w oknie Channels, aby uzyskać najlepszy sygnał i kontrast. Po uzyskaniu optymalnego obrazu dla wszystkich trzech kanałów, należy zaznaczyć wszystkie kanały w oknie Channels i kliknąć Snap w zakładce Acquisition, aby wykonać dwuwymiarowy zrzut obrazu. Następnie, w celu wykonania dwuwymiarowego obrazu time-lapse, należy wybrać Time Series, aby otworzyć okno Time Series, a następnie wprowadzić wartość zero dla interwałów oraz 40 dla całkowitej liczby skanów, aby uzyskać 40 obrazów w sposób ciągły, bez odstępów czasowych.Aby przeanalizować obrazy, należy uruchomić odpowiednie oprogramowanie do analizy obrazu i otworzyć plik z obrazem. Aby wygenerować ścieżki obiektów na podstawie obrazów z lapse-time, w widoku Surpass należy otworzyć obraz do analizy, a następnie kliknąć ikonę z obrazem pomarańczowych kropek, aby otworzyć nowe okno Spots. Po ustawieniu parametrów śledzenia (Tracking parameters), należy zaznaczyć pole Fill gaps with all detected objects, aby rozpocząć śledzenie.Następnie kliknij niebieską strzałkę, aby przejść do kolejnego kroku. W sekcji Filter Type wybierz filtr Track Duration i kliknij zieloną strzałkę, aby zakończyć śledzenie. Następnie sprawdź wygenerowane ścieżki, wracając do poprzedniego kroku w razie potrzeby.Aby zmierzyć ruch komórkowy, zdefiniowany przez ścieżki obiektów (Object tracks) na obrazach time-lapse, w oknie Edytuj ścieżki (Edit Tracks) zaznacz pole Ścieżki (Tracks), a następnie wybierz ścieżkę odpowiadającą ruchowi analizowanej komórki. Wybrana ścieżka zostanie podświetlona na żółto na obrazie serii czasowej. Na koniec, w zakładce Statystyki (Statistics), kliknij ikonę z wykresem, aby otworzyć okno Statystyk (Statistics).Następnie w sekcji Selection kliknij strzałkę w dół, aby wygenerować Track Speed Mean. Unaczynienie szpiku kostnego można zwizualizować za pomocą barwników do naczyń, takich jak FITC-Dextran. Ponieważ kontrast zależy od wstrzyknięcia barwnika, uzyskany obraz przedstawia funkcjonalne unaczynienie w miejscach, w których występuje wystarczający przepływ krwi.Obrazy tego samego obszaru szpiku kostnego w różnych punktach czasowych wykazują obecność neutrofili zarówno w przestrzeniach wewnątrz-, jak i zewnątrzToBounds naczyniowych w okresie kilku dni. Obrazowanie tej kości korowej, składającej się głównie z włókien kolagenowych, zostało wykonane metodą generowania drugiej harmonicznej, co dodatkowo ilustruje naciekanie tkanki naczyniowej przez neutrofile. Neutrofile te były śledzone w niszy naczyniowej szpiku kostnego bez dodatkowych odstępów czasu między poszczególnymi skanowaniami, co umożliwiło dokładne monitorowanie ich przemieszczania się.Następnie można zmierzyć prędkość ścieżek wygenerowanych przez oprogramowanie do analizy obrazu, aby przeanalizować szybkość każdej komórki. Po zastosowaniu tej procedury można wykorzystać inne metody, takie jak użycie komórek znakowanych ex vivo lub transgenicznych myszy reporterowych, w celu oceny innych procesów biologicznych in situ, na przykład wpływu komórek odpornościowych na progresję i przerzuty nowotworu. Po obejrzeniu tego filmu powinni Państwo posiadać solidną wiedzę na temat tego, jak zainstalować komorę okienkową (window chamber) na kości udowej myszy w celu śledzenia neutrofili w niszach naczyniowych szpiku kostnego i strukturach kolagenowych.

femur-window-chamber-model-for-vivo-cell-tracking-murine-bone

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologia i infekcje

Ten protokół opisuje procedurę seryjnego pobierania próbek szpiku kostnego kości udowej (BM) bez konieczności poświęcania myszy. Procedura ta ułatwia badania podłużne składu BM myszy w czasie i zapewnia szeregowy dostęp do komórek w BM do badań ex vivo i transplantacji.

Aspiracja szpiku kostnego kości udowej u żywych myszy

Kombinatoryczne oznaczanie 5 fluorescencyjnych białek hematopoetycznych komórek macierzystych i progenitorowych pozwala na śledzenie klonów in vivo za pomocą mikroskopii konfokalnej i dwufotonowej, dostarczając wglądu w architekturę hematopoetyczną szpiku kostnego podczas regeneracji. Metoda ta umożliwia nieinwazyjne mapowanie losów kodowanych spektralnie komórek pochodzących z HSPC w nienaruszonych tkankach przez długi czas po przeszczepie.<br...

In vivo (in vivo) Klonalne śledzenie hematopoetycznych komórek macierzystych i progenitorowych oznaczonych pięcioma białkami fluorescencyjnymi przy użyciu mikroskopii konfokalnej i wielofotonowej

Natura interakcji między krwiotwórczymi komórkami macierzystymi i progenitorowymi (HSPC) a niszami szpiku kostnego jest słabo poznana. Niestandardowe modyfikacje sprzętowe i wieloetapowy protokół akwizycji pozwalają na wykorzystanie mikroskopii dwufotonowej i konfokalnej do obrazowania znakowanych ex vivo HSPC umieszczonych w obszarach szpiku kostnego, śledząc interakcje i ruch.

4-wymiarowe śledzenie in vivo hematopoetycznych komórek macierzystych i progenitorowych w dorosłym szpiku kostnym nazębnym myszy

Monocyty są kluczowymi regulatorami odporności wrodzonej i odgrywają kluczową rolę w odnowie obwodowego jednojądrzastego systemu fagocytarnego oraz w przypadku stanów zapalnych. W artykule opisano procedurę obrazowania w czasie rzeczywistym szpiku kostnego kalwarii myszy w celu zbadania mechanizmu mobilizacji monocytów.

Śledzenie monocytów szpiku kostnego myszy in vivo

Przedstawiono strategię ilościowej analizy danych histologicznych w szpiku kostnym. Mikroskopia konfokalna znakowanych fluorescencyjnie komórek w skrawkach tkanek daje 2-wymiarowe obrazy, które są automatycznie analizowane. Analizy kolokalizacyjne różnych typów komórek są porównywane z danymi z symulowanych obrazów, dostarczając ilościowych informacji o interakcjach komórkowych.

Zautomatyzowana kwantyfikacja interakcji komórek krwiotwórczych – komórek zrębu w obrazach histologicznych kości nieodwapnionej

Mikroskopia fluorescencyjna przyżyciowej (IVFM) calvarium jest stosowana w połączeniu z genetycznymi modelami zwierzęcymi do badania naprowadzania i wszczepiania komórek krwiotwórczych do nisz szpiku kostnego (BM).

Połączenie przyżyciowej mikroskopii fluorescencyjnej (IVFM) z modelami genetycznymi w celu zbadania dynamiki wszczepiania komórek krwiotwórczych do nisz szpiku kostnego

Przedstawiono metodę tworzenia i obrazowania na żywo różnych humanizowanych nisz szpiku kostnego u myszy. W oparciu o niszę podporową utworzoną przez ludzkie komórki mezenchymalne, dodanie ludzkich komórek śródbłonka indukuje tworzenie ludzkich naczyń, podczas gdy dodanie rhBMP-2 indukuje tworzenie chimerycznej tkanki kostnej ludzko-mysi.

Bioinżynieria humanizowanych mikrośrodowisk szpiku kostnego u myszy i ich wizualizacja za pomocą obrazowania na żywo

Tutaj prezentujemy protokół do analizy ultrastruktury megakariocytów in situ za pomocą transmisyjnej mikroskopii elektronowej (TEM). Mysie szpiki kostne są zbierane, mocowane, zatapiane w żywicy epoksydowej i cięte na ultracienkie odcinki. Po barwieniu kontrastowym szpik kostny obserwuje się pod mikroskopem TEM przy napięciu 120 kV.

In Situ Badanie mysiej megakariopoezy przy użyciu transmisyjnej mikroskopii elektronowej

Opisujemy tutaj metodę obrazowania megakariocytów i propłytek krwi w szpiku kości czaszki żywych myszy za pomocą mikroskopii dwufotonowej.

In vivo (in vivo) Dwufotonowe obrazowanie megakariocytów i propłytek krwi w szpiku kostnym czaszki myszy

Mikroskopia przyżyciowa umożliwia badanie dynamicznych procesów biologicznych, takich jak regeneracja tkanek i rozwój guza. Szpik kostny kalwarii, wysoce dynamiczna tkanka, oferuje wgląd w hematopoezę i funkcję naczyń krwionośnych. Korzystanie z biokompatybilnego, wydrukowanego w 3D implantu mocującego głowę pozwala na powtarzalne obrazowanie podłużne, zwiększając naszą wiedzę na temat dynamiki tkanek i mikrośrodowiska guza.

Przyżyciowe obrazowanie podłużne dynamiki naczyń krwionośnych w szpiku kostnym kości nazębnej

Model uszkodzenia szpiku kostnego u myszy jest użytecznym narzędziem do badania osteogenezy poporodowej poprzez kostnienie śródbłoniaste. Ten uproszczony protokół chirurgiczny opisuje procedurę ablacji szpiku kostnego w celu dalszej oceny tworzenia się nowej kości i odpowiedzi komórkowych po urazie.

Ulepszona metodologia badania osteogenezy poporodowej poprzez kostnienie śródbłoniaste w mysim modelu uszkodzenia szpiku kostnego

Poznaj model komory okienka kości udowej do śledzenia neutrofili in vivo w mysim szpiku kostnym. Ta metoda umożliwia długoterminowe obrazowanie wielofotonową mikroskopią fluorescencyjną.

Model komory okienka kości udowej do śledzenia komórek in vivo w mysim szpiku kostnym

Przeglądaj więcej filmów