Model komory okienka kości udowej do śledzenia komórek in vivo w mysim szpiku kostnym
28 lipca 2016
Protokół opisuje nowatorski model komory okiennej kości udowej dla myszy, który może być używany do śledzenia ruchu komórek w szpiku kości udowej in vivo. Przyżyteczna mikroskopia fluorescencyjna wielofotonowa służy do obrazowania trzech składników szpiku kostnego kości udowej (układu naczyniowego, macierzy kolagenowej i neutrofili) w czasie.
Ogólnym celem tej procedury jest wykonanie długoterminowego obrazowania mikroskopowego i śledzenie neutrofili w strukturach naczyniowych w obrębie mysiego szpiku kostnego przez wszczepioną przewlekłą komorę okienną nad kością udową. Metoda ta może pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytania w immunologii i onkologii dotyczące roli monocytów w regulacji infekcji, nowotworzeniu i przerzutach nowotworowych. Głównymi zaletami tej techniki jest to, że umożliwia ona długotrwały mikroskopowy dostęp do szpiku kostnego kości udowej, centralnego miejsca hematopoezy, oraz dostarcza dynamicznych informacji, które w innym przypadku byłyby trudne do uzyskania konwencjonalnymi metodami.
Chociaż metoda ta jest specyficzna dla obrazowania neutrofili w sieci naczyniowej, może być również stosowana do wizualizacji innych interesujących populacji komórek odpornościowych. W dniu zabiegu należy potwierdzić odpowiedni poziom sedacji poprzez brak reakcji na uszczypnięcie palca u nogi u nagiej myszy. Następnie umieść mysz na elektrycznej poduszce grzewczej, pokrytej serwetą chirurgiczną, pod mikroskopem stereoskopowym.
Następnie nałóż maść na oczy zwierzęcia i wysterylizuj obszar operacyjny dwoma sekwencyjnymi chusteczkami z 7,5% jodowidonem, 70% alkoholem izopropylowym i 10% jodowidonem. Po przygotowaniu zwierzęcia użyj skalpela z ostrzem numer 15, aby wykonać 10-milimetrowe podłużne nacięcie skóry zbliżające się do kości udowej od strony bocznej. Następnie tępo wypreparuj kleszcze i hemostatyki, aby odsłonić kość udową między mięśniami zginacza i prostowników.
Kiedy można zaobserwować kość udową, włóż pręt w kształcie litery U pod kość i zainstaluj komorę okienną. Za pomocą dwóch nakrętek przymocuj pręt do okna. Następnie dokręć nakrętki kleszkami.
Użyj kleszczy, aby ponownie wyregulować mięśnie zginaczy i prostowników z powrotem do ich pierwotnych lokalizacji. Wypełnij przestrzeń między kością a komorą okienną cementem dentystycznym, aby zamocować komorę okienną na miejscu. Następnie za pomocą mikrowiertła wbij obszar o wymiarach sześć na dwa milimetry w kość korową, aby uzyskać optyczny dostęp do jamy szpiku.
Po uzyskaniu prawie przezroczystej warstwy okostnej kości umieść ośmiomilimetrową szklankę nakrywkową na oknie i użyj pierścienia osadczego, aby zabezpieczyć szkło nakrywkowe na miejscu. Teraz zamknij skórę właściwą za pomocą szwu 5-0 i uchwytu na igłę. Następnie umieść mysz w nowej klatce z czystą ściółką, z monitorowaniem, aż w pełni wyzdrowieje.
Aby uzyskać połączone obrazy z mikroskopii wielofotonowej i konfokalnej przez komorę okienną, najpierw wstrzyknij odpowiednie fluorescencyjne roztwory znakowania neutrofili naczyniowych do myszy przez żyłę ogonową. Zaciśnij końce komory okiennej za pomocą zacisków krokodylkowych, aby przymocować mysz do specjalnie wykonanej sceny. Następnie umieść stolik do obrazowania na połączonym mikroskopie wielofotonowym i konfokalnym.
Gdy mysz jest bezpieczna, włącz laser dwufotonowy i system konfokalny, a następnie kliknij przycisk Start System, aby uruchomić oprogramowanie do akwizycji obrazu. Aby skonfigurować kanały obrazowania, na karcie Akwizycja kliknij opcję Smart Setup (Inteligentna konfiguracja) i wybierz lasery do obrazowania. Wybierz opcję Najlepszy sygnał i kliknij przycisk Zastosuj.
Ręcznie dodaj kanał akwizycji obrazu drugiej generacji harmonicznej, włączając laser dwufotonowy w oknie Laser i ustawiając odpowiednie długości fal akwizycji dla generowania drugiej harmonicznej. Na karcie Lokalizuj kliknij opcję Okulary online i zlokalizuj obszar zainteresowania za pomocą mikroskopu na podstawie oględzin. Kliknij opcję Oculars offline (Okulary offline) i otwórz kartę Acquisition (Akwizycja).
W oknie Kanały wybierz ścieżkę FITC i kliknij Na żywo, aby wyświetlić podgląd obrazu FITC-Dextran z obiektywem 5x. W razie potrzeby dostosuj ostrość. Następnie kliknij przycisk Zatrzymaj na karcie Pozyskiwanie, aby zatrzymać podgląd.
Teraz ręcznie wybierz obiektyw wodny 20x i ponownie wyświetl obraz FITC-Dextran, dostosowując główne wzmocnienie i otwór w oknie Kanały, aby uzyskać najlepszy sygnał i kontrast. Po uzyskaniu optymalnego obrazu dla wszystkich trzech kanałów wybierz wszystkie kanały w oknie Kanały i kliknij przycisk Przyciągaj na karcie Akwizycja, aby uzyskać migawkę 2D. Następnie, aby uzyskać obraz poklatkowy 2D, wybierz Szeregi czasowe, aby otworzyć okno Szeregi czasowe, a następnie wprowadź zero dla interwałów i 40 dla całkowitej liczby skanów, aby uzyskać 40 obrazów w sposób ciągły bez interwału czasu.
Aby przeanalizować obrazy, otwórz odpowiednie oprogramowanie do analizy obrazów i otwórz plik obrazu. Aby wygenerować ślady obiektów za pomocą obrazów poklatkowych, w widoku Surpass otwórz obraz, który chcesz przeanalizować, i kliknij ikonę z obrazem pomarańczowych kropek, aby otworzyć nowe okno Spoty. Po ustawieniu parametrów śledzenia kliknij pole Wypełnij luki wszystkimi wykrytymi obiektami, aby rozpocząć śledzenie.
I kliknij niebieską strzałkę, aby przejść do następnego kroku. W obszarze Typ filtru wybierz filtr Czas trwania ścieżki i kliknij zieloną strzałkę, aby zakończyć śledzenie. Następnie sprawdź wygenerowane ścieżki, w razie potrzeby wracając do poprzedniego kroku.
Aby zmierzyć ruch komórkowy, zdefiniowany przez ścieżki obiektów na obrazach poklatkowych, w oknie Edycja ścieżek zaznacz pole Ścieżki i wybierz ścieżkę odpowiadającą ruchowi interesującej Cię komórki. Wybrana ścieżka zostanie wyróżniona na żółto na obrazie szeregów czasowych. Na koniec w zakładce Statystyki kliknij ikonę z obrazem wykresu, aby otworzyć okno Statystyki.
Następnie w obszarze Wybór kliknij strzałkę w dół, aby wygenerować średnią prędkość toru. Unaczynienie w szpiku kostnym można uwidocznić za pomocą barwników wewnątrznaczyniowych, takich jak FITC-Dextran. Ponieważ kontrast zależy od wstrzyknięcia barwnika, uzyskany obraz reprezentuje funkcjonalne unaczynienie, w którym występuje wystarczający przepływ krwi.
Te obrazy tego samego obszaru szpiku kostnego w różnych punktach czasowych wykazują obecność neutrofili zarówno w przestrzeniach wewnątrznaczyniowych, jak i zewnątrznaczyniowych przez okres kilku dni. Obrazowanie tej kości korowej, składającej się głównie z włókien kolagenowych, zostało wykonane przez drugą generację harmoniczną, co dodatkowo ilustruje infiltrację tkanki naczyniowej przez neutrofile. Te neutrofile były śledzone w niszy naczyniowej szpiku kostnego bez dodatkowego odstępu czasu między każdym skanowaniem, co pozwoliło na dokładne śledzenie ich ruchu.
Prędkość ścieżek generowanych przez oprogramowanie do analizy obrazu może być następnie mierzona w celu analizy prędkości każdej komórki. Po tej procedurze można zastosować inne metody, takie jak użycie komórek znakowanych ex vivo lub transgenicznych myszy reporterowych, do oceny innych procesów biologicznych in situ, takich jak wpływ komórek odpornościowych na progresję guza i przerzuty. Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak zainstalować komorę okienną na mysiej kości udowej w celu śledzenia neutrofili przez niszę naczyniową szpiku kostnego i struktury kolagenowe.
Wyświetl pełny transkrypt i uzyskaj dostęp do tysięcy filmów naukowych
Przegląd
Niniejszy protokół opisuje nowy model komory okiennej kości udowej myszy, służący do śledzenia ruchu neutrofilów w szpiku kostnym udowym in vivo. Wykorzystując intravitalną wielofotonową mikroskopię fluorescencyjną, badacze mogą obrazować naczynia krwionośne, macierz kolagenową oraz neutrofile w czasie.
Kluczowe elementy badania
Dziedzina nauki
- Immunologia
- Onkologia
- Badania nad szpikiem kostnym
Wprowadzenie
- Szpik kostny udowy jest kluczowym miejscem hematopoezy.
- Zrozumienie zachowania neutrofili jest niezbędne do zgłębienia wiedzy na temat dynamiki infekcji i guzów.
- Konwencjonalne metody obrazowania mogą nie dostarczać niezbędnych informacji dynamicznych.
- Technika ta umożliwia długoterminowy dostęp w celu obserwacji interakcji komórkowych.
Cel badania
- W celu przeprowadzenia długoterminowego obrazowania neutrofili w szpiku kostnym myszy.
- W celu zbadania roli komórek odpornościowych w infekcji i progresji nowotworu.
- W celu przedstawienia metody wizualizacji populacji komórek odpornościowych in vivo.
Zastosowane metody
- Implantacja przewlekłej komory okienkowej nad kością udową.
- Intrawitalna wielofotonowa mikroskopia fluorescencyjna do obrazowania.
- Monitorowanie ruchu neutrofili w obrębie struktur naczyniowych.
- Wykorzystanie myszy bezwłosych (nude) atymicznych do przeprowadzenia procedury.
Główne wyniki
- Skuteczne długoterminowe obrazowanie neutrofili w szpiku kostnym uda.
- Dynamiczne śledzenie oddziaływań komórkowych w obrębie sieci naczyniowej.
- Wgląd w zachowanie komórek odpornościowych w odpowiedzi na różne bodźce.
- Potencjalne zastosowania w badaniu tumorigenezy i przerzutowania.
Wnioski
- Model okna komory kości udowej jest skuteczny do obrazowania neutrofilów in vivo.
- Metoda ta pozwala na lepsze zrozumienie dynamiki komórek odpornościowych w szpiku kostnym.
- Otwiera ona nowe możliwości badawcze w immunologii i onkologii.
Najczęściej zadawane pytania
Znaczenie dla przemysłu
Metoda ta umożliwia podłużny obrazowanie intravitalne dynamiki neutrofili w szpiku kostnym uda myszy, wypełniając istotną lukę w wizualizacji migracji i regulacji komórek odpornościowych in vivo. Dzięki zapewnieniu ilościowego śledzenia ruchu komórkowego w czasie rzeczywistym w obrębie niszy naczyniowej, metoda ta wspiera analizę mechanistyczną w immunologii oraz walidację celów w onkologii. Podejście to zwiększa pewność prognostyczną w modelach przedklinicznych poprzez powiązanie zachowania komórek odpornościowych z procesami patofizjologicznymi, takimi jak tumorigenesis i przerzuty.
Strategiczne zastosowania w badaniach i rozwoju biofarmaceutycznym
Wczesne etapy odkrywania i walidacja celu
- Wartość naukowa: Umożliwia badanie mechanizmów zależnych od neutrofili w procesach hematopoezy, regulacji odpornościowej oraz modulacji mikrośrodowiska nowotworowego.
- Wartość operacyjna: Zapewnia funkcjonalne obrazowanie naczyń za pomocą barwników wewnątrznaczyniowych w celu powiązania ruchu komórek ze stanem perfuzji.
- Wartość prognostyczna: Wspomaga redukcję ryzyka związanego z celem terapeutycznym poprzez ilościowe określanie infiltracji i przemieszczania się komórek odpornościowych w odpowiedzi na bodźce patofizjologiczne.
Przesiewanie i opracowanie testu
- Wartość naukowa: Pozwala na uzyskanie ilościowych odczytów, takich jak prędkość przemieszczania się neutrofili i ich rozkład przestrzenny, w celu benchmarkingu testu.
- Wartość operacyjna: Tworzy powtarzalną platformę obrazowania intravitalnego do podłużnego monitorowania odpowiedzi immunologicznej.
- Skalowalność: Kompatybilność z mikroskopią wielofotonową i konfokalną umożliwia wysokotreściową analizę temporalną.
Badania translacyjne i przedkliniczne
- Wartość naukowa: Modeluje dynamikę komórek odpornościowych w stanach patologicznych, w tym w nowotworach, umożliwiając przedkliniczną ocenę interwencji immunomodulacyjnych.
- Ciągłość translacyjna: Łączy walidację celów w fazie odkrywania z przedkliniczną oceną skuteczności poprzez spójne odczyty fenotypowe.
- Mitygacja ryzyka: Redukuje niepewność biologiczną w optymalizacji wiodących kandydatów poprzez wizualizację zachowania komórek odpornościowych in situ.
Integracja potoku i przepływu pracy
Model komory okiennej kości udowej wpisuje się w kontinuum od odkrycia do badań przedklinicznych, umożliwiając charakterystykę fenotypu immunologicznego po związaniu z celem i przed badaniami skuteczności w modelach chorób.
- Biologia odkrywcza: Ułatwia weryfikację hipotez dotyczących funkcji neutrofili w niszach szpiku kostnego poprzez bezpośrednią obserwację intravitalną.
- Przesiewanie: Dostarcza zestandaryzowane, ilościowe wyniki obrazowania kinetyki komórek odpornościowych w celu wsparcia walidacji testów.
- Analityka: Zapewnia mierniki oparte na śledzeniu obiektów, takie jak prędkość i czas trwania, umożliwiając obiektywne porównanie różnych warunków eksperymentalnych.
- Badania translacyjne: Wspiera ciągłość procesu od odkrycia mechanizmów do walidacji przedklinicznej poprzez modelowanie ruchu komórek odpornościowych w kontekstach istotnych dla danej choroby.
- Ponowne wykorzystanie w organizacji: Stanowi powtarzalną możliwość obrazowania intravitalnego, wykorzystywaną w programach badawczych z zakresu immunologii, onkologii i hematopoetyki.
Wpływ operacyjny i przedsiębiorstwowy
- Wartość naukowa: Zwiększa pewność prognostyczną w walidacji celów poprzez redukcję niejednoznaczności mechanistycznej w funkcji komórek odpornościowych.
- Wartość operacyjna: Zapewnia powtarzalność dzięki standaryzacji przygotowania chirurgicznego, parametrów obrazowania oraz procesów analitycznych.
- Wartość strategiczna: Usprawnia podejmowanie decyzji o kontynuacji lub przerwaniu badań (go/no-go) poprzez umożliwienie wczesnej wizualizacji mechanizmów immunologicznych wpływających na progresję guza.
- Wpływ na portfolio: Wspiera priorytetyzację kandydatów immunomodulacyjnych z uwzględnieniem ryzyka, w oparciu o zaobserwowane efekty w mikrośrodowisku szpiku kostnego.
Wskazówki dotyczące implementacji
- Wymagana jest wiedza w zakresie zabiegów chirurgicznych u myszy, mikroskopii intravitalnej oraz analizy obrazu w celu śledzenia komórek.
- Metoda opiera się na systemach mikroskopii wielofotonowej i konfokalnej, odczynnikach do znakowania fluorescencyjnego oraz materiałach do stabilizacji histologicznej.
- Konieczna jest współpraca między zespołami ds. opieki nad zwierzętami, obrazowania i analizy danych w celu zapewnienia spójności podłużnej.
- Adaptacja do innych typów komórek odpornościowych lub modeli chorób może wymagać walidacji specyficzności znakowania oraz stosunku sygnału do szumu.
- Ograniczenia praktyczne obejmują czas rekonwalescencji pooperacyjnej oraz potencjalną fototoksyczność podczas przedłużonych sesji obrazowania, zgodnie z opisem w protokole.
