Analiza mitochondriów mózgu za pomocą seryjnej skaningowej mikroskopii elektronowej

Ogólnym celem techniki skaningowej mikroskopii elektronowej z szeregową powierzchnią blokową jest analiza morfologii, struktury, rozkładu, objętości i liczby mitochondriów w określonym regionie mózgu myszy. Metoda ta może pomóc odpowiedzieć na wiele kluczowych pytań w neurobiologii, takich jak to, czy zmiany w strukturze, liczbie i rozmieszczeniu mitochondriów mózgu w znacznym stopniu przyczyniają się do zaburzeń neurodegeneracyjnych i neurorozwojowych. Główną zaletą tej techniki jest to, że automatyzuje ona proces obrazowania odcinków seryjnych poprzez włączenie niestandardowego ultramikrotomu wbudowanego w komorę niskopróżniowego skaningowego mikroskopu elektronowego.

Aby rozpocząć eksperyment, należy przemyć wcześniej przygotowane tkanki utrwalone aldehydem glutarowym trzy razy przez pięć minut każda w 0,1-molowym buforze kakodylowym. Po utrwaleniu tkanek 1 mililitrem kakodylanu buforowanego 0,1% kwasem garbnikowym przez 30 minut w temperaturze pokojowej. Po utrwaleniu umyć chusteczki w buforze kakodylowym.

Rozpuść 0,3 grama żelazocyjanku potasu i 0,86 grama kakodylanu sodu w 10 mililitrach wody destylowanej. Tuż przed użyciem dodaj 10 mililitrów 4% tetratlenku osmu i zabarwij tkanki 2% roztworem żelazocyjanku osmu przez 90 minut na lodzie. Po zabarwieniu umyj chusteczkę w wodzie destylowanej.

Próbki należy traktować świeżo przygotowanym 1% roztworem 1% tiokarbohydrazydu lub TCH przez 20 minut w temperaturze pokojowej. Następnie umyj próbki. Następnie zabarwić tkanki 2% wodnym tetratlenkiem osmu przez godzinę.

Po zabarwieniu umyj chusteczki wodą destylowaną. Próbki inkubować przez noc w 1% octanie uranylu w wodzie destylowanej o temperaturze 4 stopni Celsjusza. Następnego dnia opłucz tkanki w wodzie destylowanej i inkubuj je z barwnikiem asparaginianowo-ołowiowym Weltona w piekarniku.

Uzyskanie najlepszych możliwych barwień tkanek ma kluczowe znaczenie dla obrazowania, ponieważ słabe barwienie powoduje zjawisko ładowania próbki, które utrudnia lub uniemożliwia obrazowanie. Umyj chusteczkę w wodzie destylowanej. Odwodnić próbki za pomocą stopniowanej serii alkoholi przy użyciu schłodzonych roztworów etanolu przez pięć minut każda, a następnie trzykrotnie odwodnić 100% etanolem przez 10 minut każde.

Przemyć próbki dwa razy przez 15 minut każda w tlenku propylenu. Umieść tkanki w mieszance żywicy i tlenku propylenu w stosunku 1:1, zakryj fiolkę i inkubuj tkanki przez noc. Po dwóch godzinach należy odkręcić fiolkę, tak aby tlenek propylenu odparował w ciągu dziewięciu godzin.

Przenieś chusteczki do 100% świeżej żywicy do zatapiania w czystych fiolkach na dwie godziny. Zanurz próbki w świeżej żywicy do zatapiania w płaskich formach zawierających wydrukowane etykiety papierowe i utwardź je w piecu. Po godzinie sprawdź ułożenie i wyrównanie tkanek i wyreguluj w razie potrzeby.

Przytnij próbki do obszaru zainteresowania i zamontuj je na aluminiowym kołku za pomocą żelującego super kleju cyjanoakrylowego. Następnie pokryj próbkę pastą ze srebra koloidalnego wokół boków bloku, aby zapewnić przewodzącą ścieżkę do aluminiowego kołka. Zbadaj próbki tkanek za pomocą systemu skaningowego mikroskopu elektronowego wyposażonego w umieszczony w komorze stolik ultramikrotomu i detektor elektronów wstecznie rozproszonych o niskiej liczbie kilowoltów.

Zobrazuj próbki z tymi ustawieniami. Rozpocznij analizę, wybierając opcję Obraz, Typ, a następnie 8-bitowy, aby przekonwertować obrazy na 8-bitowy format TIFF z oryginalnego, zastrzeżonego 16-bitowego. Jeśli automatyczna konwersja kontrastu i/lub jasności na tym etapie nie jest idealna dla obrazów, otwórz ponownie obrazy 16-bitowe i naciśnij Obraz, Dostosuj, Jasność/Kontrast.

Wybierz zakres, który działa dla wszystkich obrazów i naciśnij Zastosuj. Następnie wykonaj konwersję. Jeśli wystąpiły niedopuszczalne ruchy obrazu między plasterkami, wyrównaj stosy obrazów, wybierając Wtyczki, Rejestracja i Liniowe wyrównanie stosu za pomocą SIFT i ustaw wyrównanie dla trybu tylko translacji, a nie dla sztywnej bryły.

Powiększ rozmiar płótna przed rejestracją, wybierając Obraz, Dostosuj, Rozmiar płótna. Możesz też zmniejszyć obraz do obszaru zainteresowania, wybierając żądany obszar, a następnie przycinając go. W razie potrzeby przeskaluj obrazy do mniejszego, łatwiejszego w obsłudze rozmiaru za pomocą narzędzia ImageJ, a następnie wybierz opcję Obraz i skala.

Mikroskopia konfokalna na kulturach neuronalnych o małej gęstości wykazała, że mitochondria znajdujące się w somie neuronalnej tworzą siatkowatą sieć, podczas gdy te rezydujące w dystalnych neurytach wykazują dyskretną wydłużoną morfologię. Korzystając z seryjnej skaningowej mikroskopii elektronowej (SBFSEM), mitochondria, dendryty i żylaki aksonów były wyraźnie obserwowane w mózgu myszy. Trzydniowe rekonstrukcje mitochondriów w neurytach tkanki mózgowej myszy wykazały różnicę w wielkości między mitochondriami dendrytycznymi i aksonalnymi.

Dane uzyskane z reprezentatywnego obrazu 2D SBFSEM ujawniły, że objętość lub rozmiar mitochondriów znajdujących się w presynapsach neuronalnych był znacznie mniejszy niż tych znajdujących się w regionie pozasynaptycznym. Obrazy uzyskane za pomocą analizy SBFSEM zapewniają zwiększoną rozdzielczość do uwidocznienia cech ultrastrukturalnych poszczególnych mitochondriów. Możliwe jest sklasyfikowanie przedziału komórkowego mitochondriów, określając jego bliskość do łatwych do zidentyfikowania struktur, takich jak mitochondria somatyczne niesynaptyczne i mitochondria presynaptyczne.

Technikę tę można wykonać w ciągu około siedmiu dni, w tym trzy dni barwienia, dwa dni na utwardzanie żywicy, jeden dzień obrazowania w celu wytworzenia stosu odpowiedniego do tej analizy i około dwóch do czterech godzin na obróbkę obrazu w ramach przygotowań do analizy. Procedura ta może być również stosowana w połączeniu z innymi metodami obrazowania mitochondriów, takimi jak obrazowanie na żywo z genetycznie znakowanymi mitochondriami, aby odpowiedzieć na pytania dotyczące transportu mitochondriów oraz dynamiki ich rozszczepienia i fuzji.