Name: Analiza mitochondriów mózgu za pomocą seryjnej skaningowej mikroskopii elektronowej (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-07-09T15:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 47 s
Description: Poznaj analizę morfologii mitochondriów w mózgu myszy za pomocą seryjnej skaningowej mikroskopii elektronowej. Ta metoda umożliwia trójwymiarową rekonstrukcję organelli i badanie ich roli w chorobach neurodegeneracyjnych.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dziękujemy Sidneyowi Walkerowi za pomoc techniczną. Prace te zostały częściowo wsparte grantem z Narodowego Instytutu Zdrowia (1R01EY024712-01A1).

Oświadczenie etyczne: Procedury z udziałem zwierząt zostały zatwierdzone przez Instytucjonalny Komitet ds. Opieki i Wykorzystania Zwierząt (IACUC) w Virginia Tech.
Ostrzeżenie: Należy podjąć ekstremalne środki ostrożności podczas obchodzenia się i utylizacji kilku składników używanych w tym protokole. Przed użyciem należy ustalić i przestrzegać lokalnych wytycznych instytucjonalnych oraz praktyk w zakresie zdrowia i bezpieczeństwa, w szczególności w odniesieniu do tetratlenku osmu, który jest lotny i niezwykle trujący, octanu uranylu, który jest zarówno metalem ciężkim, jak i źródłem radioaktywności, oraz azotanu ołowiu, który jest trucizną metali ciężkich. Tiokarbohydrazyd (TCH) może ulegać rozkładowi, tworząc wybuchowe i trujące gazy, jeśli jest niewłaściwie obchodzony. Wiele instytucji będzie miało główny zakład EM, w którym odczynniki te są rutynowo wykorzystywane i mogą udzielić pomocy.
1. Przygotowanie tkanki mózgowej i obrazowanie SBFSEM
<ol>
	<li>Znieczulić młodą (~2 - 4 miesiące) czarną mysz C57 (szczep C57BL/6J) za pomocą 4 - 5% izofluranu zgodnie z wytycznymi instytucji. Potwierdź znieczulenie, monitorując utratę napięcia mięśniowego, brak dobrowolnych ruchów i reakcje na bodźce awersyjne, takie jak szczypanie ogona.</li>
	<li>Przypnij mysz do tacki sekcyjnej i wykonaj nacięcie na skórze wzdłuż brzusznej linii środkowej. Wykonaj dalsze nacięcia w skórze, aby odsłonić klatkę piersiową myszy. Naciąć przeponę i ostrożnie wypreparować jamę klatki piersiowej wzdłuż obwodu, aby odsłonić bijące serce, a następnie wykonać nacięcie na prawym przedsionku.</li>
	<li>Za pomocą kaniuli motylkowej kanuluj lewą komorę. Wykonać perfuzję myszy przezskórnie przy użyciu 10 - 20 ml buforu fosforanowego soli fizjologicznej (PBS) o pH 7,2, aż do potwierdzenia wykrwawienia przez zmianę koloru wątroby. 
	Uwaga: Zmiana koloru wątroby służy jako wskazówka do określenia stopnia wykrwawienia. Upewnij się, że kolor wątroby zmienia się z czerwonawo-brązowego na bladoróżowy.</li>
	<li>Perfuzję myszy przeszyderczo za pomocą 10 - 20 ml 2% aldehydu glutarowego i 4% paraformaldehydu wykonanego w 0,10 M buforze kakodylowym (pH 7,2), aby szybko utrwalić tkankę mózgową od wewnątrz. Fiksacja jest monitorowana poprzez obserwację usztywnienia ogona. 
	Uwaga: Przygotować 0,10 M bufor kakodylowy (pH 7,2), rozpuszczając 2,14 g kakodylanu sodu w 80 ml wody, dodać kwas solny w celu dostosowania pH i zwiększyć objętość do 100 ml wodą.</li>
	<li>Po perfuzji odciąć głowę myszy, wypreparować mózg, a następnie utrwalić w 0,10 M buforze kakodylanu sodu (pH 7,2) zawierającym 2% aldehydu glutarowego i 4% paraformaldehydu przez 48 godzin w temperaturze 4 oC.</li>
	<li>Po 48 godzinach wykonaj 400 μm wycinki koronalne za pomocą wibratomu, a następnie ostrożnie wypreparuj obszar zainteresowania w mózgu (na przykład hipokamp) pod mikroskopem preparacyjnym 42. Ostrożnie przytnij tkankę i zrób zdjęcie, aby zachować orientację. 
	Uwaga: Metody barwienia tkanek po przetworzeniu w SBFSEM łączą w sobie różne metody barwienia metalami ciężkimi w celu poprawy rozdzielczości i opierają się na metodzie opracowanej wcześniej przez Deerinck i wsp. 40.</li>
	<li>Przemyć tkanki utrwalone aldehydem glutarowym 3 razy po 5 minut każda w 0,1 M buforze kakodylowym (pH 7,2).</li>
	<li>Przygotować 0,1% roztwór kwasu garbnikowego, rozpuszczając kwas garbnikowy w 0,1 M buforze kakodylanu sodu (pH 7,2). Obracać aż do rozpuszczenia i w razie potrzeby przefiltrować przez filtr 0,45 μm.</li>
	<li>Uzupełnić tkanki kakodylanem buforowanym 0,1% kwasem garbnikowym przez inkubację w 1 ml odczynnika przez 30 - 60 minut w temperaturze RT. 
	Uwaga: Czas inkubacji zależy od wielkości tkanki, ale 30 minut najlepiej sprawdza się w przypadku większości tkanek.</li>
	<li>Umyj chusteczki 3 razy po 5 minut w buforze kakodylowym (pH 7,2).</li>
	<li>Rozpuścić 0,3 g żelazocyjanku potasu i 0,86 g kakodylanu sodu w 10 ml destylowanegoH2O(dH2O). Roztwór żelazocyjanku potasu należy przechowywać na lodzie. Tuż przed użyciem dodać 10 ml 4% tetratlenku osmu (OsO4).</li>
	<li>Tkanki barwić 2% roztworem żelazocyjanku osmu przez 90 minut na lodzie. Prać 3 razy po 5 minut w dH2O.</li>
	<li>Przygotować 1% roztwór tiokarbohydrazydu (TCH), rozpuszczając 0,1 g TCH w 10 mldH2O. Rozpuścić w temperaturze 60 °C, mieszając co 10 minut, aż do całkowitego rozpuszczenia. Przestrzegać środków ostrożności podczas obchodzenia się z TCH, szczególnie uważać, aby nie używać metali, podgrzewać do wysokiej temperatury lub dopuszczać do wyschnięcia roztworu.</li>
	<li>Próbki należy traktować świeżo przygotowanym 1% TCH przez 20 minut w temperaturze pokojowej. Przemyć 3 razy po 5 minut w dH2O.</li>
	<li>Rozcieńczyć 4% OsO4 do 2% dH2O, zabarwić tkanki 2% wodnym tetratlenkiem osmu przez inkubację przez 1 godzinę. Umyć chusteczki 3 razy po 5 minut z dH2O.</li>
	<li>Inkubować próbki O/N w 1% octanie uranylu w dH2O w temperaturze 4 °C.</li>
	<li>Przygotować roztwór asparaginianu ołowiu Waltona (zgodnie z opisem Deerinck i wsp. 40).
	<ol>
		<li>Rozpuścić 0,998 g L-asparaginianu w 250 ml dH2O, a następnie dodać 10 N wodorotlenku potasu (KOH) kroplami, aż pH osiągnie 5,5. Po dostosowaniu pH dodać 0,066 g azotanu ołowiu do 10 ml bulionu z kwasu asparaginowego i podgrzewać do 60 °C przez 30 minut.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Opłukać tkanki wdH2Oi inkubować z barwnikiem asparaginianowo-ołowiowym Waltona przez 30 minut w piecu o temperaturze 60 °C. Prać 3 razy po 5 minut w dH2O.</li>
	<li>Próbki należy odwodnić za pomocą stopniowanej serii alkoholi przy użyciu schłodzonych roztworów 20%, 50%, 75%, 85% i 95% etanolu przez 5 minut każde, a następnie 100% etanolu 3 razy po 10 minut. 
	Uwaga: Użyj 100% etanolu ze świeżo otwartej butelki, ponieważ otwarty etanol pochłania wodę z powietrza i powoduje niepowodzenie osadzania. Konieczne będą dłuższe inkubacje w przypadku większych próbek tkanek.</li>
	<li>Próbki przemyć 2 razy po 15 minut w tlenku propylenu.</li>
	<li>Przygotuj żywicę do zatapiania tworzyw sztucznych przy użyciu 25 ml żywicy, 10,5 ml DDSA (bezwodnik bursztynowy dodecenylu), 15,5 ml NMA (bezwodnik nadic metylu) i 1 ml DMP-30 (2,4,6-Tris dimetyloaminometylofenol). Wymieszaj żywicę, potrząsając. Odwiruj i odstaw żywicę, aż bąbelki się rozpuszczą. 
	Uwaga: Jest to standardowa receptura o średniej twardości. Można stosować inne rodzaje żywic z tworzywa sztucznego do mikroskopii elektronowej (EM), ale należy je wcześniej przetestować z nieistotną próbką kontrolną, ponieważ nie wszystkie żywice działają w przypadku SBFSEM.</li>
	<li>Inkubować tkanki O/N w mieszance żywicy i tlenku propylenu w proporcji 50: 50 w fiolce, która jest początkowo zakryta, a następnie odkrztuszona po 2 godzinach, tak aby tlenek propylenu odparował w ciągu około 8 - 10 godzin.</li>
	<li>Przenieś chusteczki do 100% świeżej żywicy do zatapiania w czystych fiolkach na 2 godziny.</li>
	<li>Próbki należy zatopić w świeżej żywicy do zatapiania, w płaskich formach zawierających zadrukowane etykiety papierowe i utwardzić je w piecu w temperaturze 60 °C przez 48 godzin. Po około 1 godzinie ponownie sprawdź ułożenie i wyrównanie tkanek i w razie potrzeby wyreguluj.</li>
	<li>Przytnij próbki do obszaru zainteresowania i zamontuj na aluminiowym kołku za pomocą żelującego kleju cyjanoakrylowego lub przewodzącej żywicy epoksydowej, a następnie pokryj pastą ze srebra koloidalnego po bokach bloku, aby zapewnić przewodzącą ścieżkę do aluminiowego kołka.</li>
	<li>Badaj próbki tkanek za pomocą systemu skaningowego mikroskopu elektronowego wyposażonego w komorowy stolik ultramikrotomowy i detektor elektronów rozproszonych wstecznie o niskim kV 32, 
	Uwaga: Odbyć szkolenie w zakresie obsługi skaningowej mikroskopii elektronowej (SEM) i stać się autoryzowanym użytkownikiem. Alternatywnie możliwa może być współpraca z naukowcem lub ośrodkiem centralnym w przypadku małych projektów. Szkolenie w zakresie promieniowania może być również wymagane, ponieważ SEM generują promieniowanie rentgenowskie.</li>
	<li>Aby zobrazować próbki, należy użyć następujących ustawień: 2,25 kV, przy rozdzielczości 5 - 10 nm/piksel, z rozmiarami pola od 80 do 250 μm w x,y (możliwe inne rozmiary pola) i grubość warstwy 50 - 100 nm, z łączną liczbą 250 - 600 warstw w okresie 16 - 20 godzin. 
	Uwaga: Ustawienia różnią się znacznie w zależności od różnych mikroskopów, poszczególnych próbek i żądanej rozdzielczości. Dzięki tym ustawieniom powstaną obrazy, które będą łatwe do zinterpretowania dla wielu próbek.</li>
</ol>
2. Analiza zestawu danych obrazowania
Uwaga: Oprogramowanie Image J/Fiji służy do analizy zestawu danych i opiera się na wtyczce TrakEM2. Etapy wstępnego przetwarzania mogą być wykonywane przy użyciu różnych programów i mogą być obszerne lub niewielkie, w zależności od poziomu doświadczenia i uzyskanych stosów. Główne transformacje przy użyciu oprogramowania open source (ImageJ ver 1.50b, FIJI download Oct 1, 2015) są opisane tutaj.
<ol>
	<li>Konwertuj obrazy do 8-bitowego formatu tiff z oryginalnych, zastrzeżonych obrazów 16-bitowych, otwierając oprogramowanie i wybierając pozycje menu Image→Type→8 bit.
	<ol>
		<li>Jeśli automatyczna konwersja kontrastu/jasności na tym etapie nie jest idealna dla obrazów, otwórz ponownie obrazy 16-bitowe i naciśnij Image→Adjust→Brightness/Contrast. Wybierz zakres, który działa dla wszystkich obrazów, a następnie naciśnij przycisk Zastosuj. Następnie wykonaj konwersję. Uwaga: W przypadku niektórych SEM-ów ten krok może wymagać oprogramowania producenta mikroskopu.</li>
		<li>W razie potrzeby, ze względu na niedopuszczalne przemieszczanie się obrazu między plasterkami (np. dryf spowodowany ładowaniem), zarejestruj/wyrównaj stosy obrazów (pozycje menu Plugins→Registration→Linear StackAlignmentWithSIFT). W większości programów rejestracyjnych ustawia się tryb "tylko tłumaczenie", a nie "sztywny korpus". 
		Uwaga: Wiele podejść i programów może działać: wtyczka rejestracyjna SIFT działa dla wielu aplikacji i istnieje wersja wirtualnego stosu.
		<ol>
			<li>W razie potrzeby powiększ rozmiar płótna przed rejestracją (Image→Adjust→CanvasSize) lub zmniejsz go do obszaru zainteresowania (Image→Crop). 
			Uwaga: Może wystąpić pewien dryf lub splay, a wypróbowanie innych wtyczek lub oprogramowania może przynieść lepsze wyniki. Dostępne są również opcje ręczne (np. ImageJ/FIJI, Wtyczki→Rejestracja→ManualLandmarkSelection).</li>
		</ol>
		</li>
		<li>W razie potrzeby przeskaluj obrazy do mniejszego, łatwiejszego w obsłudze rozmiaru (np. 25%) za pomocą ImageJ (Image→Scale).</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Uruchom oprogramowanie, wybierz File→import→image sequence, a następnie wybierz pliki tiff.</li>
	<li>Uruchom wtyczkę, wybierając File→new→TrakEM2 (Puste). Otworzą się dwa okna; Jeden zarządza projektem i area_lists, a drugi zarządza śledzeniem i jest określany jako "płótno".</li>
	<li>Załaduj stos obrazów do wtyczki, klikając prawym przyciskiem myszy import płótna. Wybierz import i kliknij importuj stos. W opcjach wyskakujących okienek zaznacz pole dla virtual stacks. 
	Uwaga: Chociaż stosy obrazów są już otwarte w oprogramowaniu, należy je również otworzyć we wtyczce. Komputer może działać płynniej, jeśli zaznaczone jest pole wirtualne stosy.</li>
	<li>Po utworzeniu mipmap i załadowaniu stosu kliknij prawym przyciskiem myszy, aby nazwać projekt w oknie wtyczki. Kliknij prawym przyciskiem myszy "nowy projekt" w kolumnie szablonu i wybierz "dodaj nowego dziecko" dla tego projektu. Kliknij ponownie prawym przyciskiem myszy, aby wybrać "area_list".</li>
	<li>Ustaw skalę osi Z projektu tak, aby zgadzała się z oryginalnymi ustawieniami mikrografu elektronowego, klikając prawym przyciskiem myszy płótno, a następnie kliknij przycisk Wyświetl i wybierz kalibrację. Ustaw również skalę Z, wybierając wszystkie warstwy w oknie wtyczki, kliknij prawym przyciskiem myszy, aby wybrać skalę Z i grubość.</li>
	<li>Kliknij i przeciągnij "projekt" i wszystkie "potomki" do sekcji obiektów projektu, aby utworzyć "listy obszarów" w zakładce "Przestrzeń Z" w oknie płótna.</li>
	<li>Wybierz "listę obszarów" i kliknij prawym przyciskiem myszy, aby wybrać i ustawić kolor. Teraz użyj narzędzia pędzel malarski, aby śledzić obiekty, takie jak mitochondria, na obrazach z mikrofotografii elektronowej. Użyj "Shift + kliknięcie", aby wypełnić zamknięty okrąg, "Ctrl + przewijanie", aby powiększać i pomniejszać, oraz "Alt + kliknięcie", aby zamienić kursor pędzla w gumkę.</li>
	<li>Wybierz dwa obszary o wymiarach ~10 - 15 μm na 10 - 15 μm w lewym górnym i prawym dolnym rogu obrazu i zidentyfikuj wszystkie mitochondria w tych obszarach, aby umożliwić bezstronne pobieranie próbek mitochondriów w każdym zestawie danych.</li>
	<li>Na "płótnie" obserwuj i śledź mitochondria we wszystkich sekcjach. Uwaga: Mitochondria to dość ciemne/gęsto wyglądające organelle, o podobnej wielkości średnicy i luźno cylindryczne. Unikalne cristae utworzone przez błonę wewnętrzną są łatwo rozpoznawalne wewnątrz tej organelli.</li>
	<li>Po zakończeniu śledzenia kliknij prawym przyciskiem myszy area_list pod zakładką Przestrzeń Z, wybierz "Pokaż w 3D". Spowoduje to uruchomienie wtyczki przeglądarki 3D, aby wyświetlić rekonstrukcję 3D obrysowanego obrazu.
	<ol>
		<li>Aby wykonać pomiary objętości mitochondriów, wybierz obiekt w przeglądarce 3D, kliknij zakładkę "Edycja" i wybierz "Właściwości obiektu". Oszacowanie objętości mitochondriów jest wymienione wraz z kilkoma innymi pomiarami.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

Autorzy oświadczają, że nie mają konkurencyjnych interesów finansowych. Emily K Benson jest płatnym pracownikiem Renovo Neural Inc., a Grahame J. Kidd pełni funkcję dyrektora naukowego 3DEM w Renovo Neural Inc., która jest komercyjnym dostawcą usług i analiz SEM typu serial block-face.

Złożoność układu nerwowego stanowi poważne wyzwanie w rekonstrukcji dużych objętości tkanek oraz analizie morfologii i rozmieszczenia organelli, takich jak mitochondria, z odpowiednią rozdzielczością. Wiele komórek, w tym neurony, oligodendrocyty i astrocyty z licznymi procesami rozszerzonymi w trzech wymiarach, oddziałuje w tkance mózgowej 43. Ponieważ mitochondria znajdują się zarówno w somie komórek, jak i odległych procesach, morfologia mitochondriów jest niezwykle pleomorficzna w układzie nerwowym (<stron...

Mitochondria to dynamiczne organelle, które zmieniają swój kształt i położenie w zależności od sygnałów i potrzeb komórkowych, w ścisłej interakcji z cytoszkieletem komórki i w odpowiedzi na zdarzenia komórkowe, takie jak prądy wapnia w neuronach 1. Mitochondria oddziałują również z innymi organellami komórkowymi, np. retikulum endoplazmatyczne, co z kolei reguluje ich dynamikę i metabolizm2. Morfologia mitochondriów wykazuje niejednorodność w różnych typach komórek, tj. Kształt organelli waha się od rurowego do składającego się z arkuszy, worków i owali 3. Wykazano, że białka cyklu fuzji i rozszczepienia mitochondriów mogą regulować lokalizację, wielkość, kształt i rozmieszczenie mitochondriów 4. Co więcej, zmiany w kształcie mitochondriów są związane z neurodegeneracją, plastycznością neuronów, zanikiem mięśni, sygnalizacją wapniową, wytwarzaniem reaktywnych form tlenu, a także długością życia i śmiercią komórki, co sugeruje, że specyficzna dla komórki morfologia mitochondriów ma kluczowe znaczenie dla utrzymania prawidłowych funkcji komórkowych 5-11.
Główną funkcją bioenergetyczną mitochondriów jest wytwarzanie trifosforanu adenozyny (ATP) poprzez przeprowadzanie serii reakcji metabolicznych, które obejmują całkowity rozkład składników odżywczych (tj. glukozy, kwasów tłuszczowych lub aminokwasów) poprzez cykl TCA i szlaki OXPHOS 12. Ludzki mózg stanowi tylko 2% masy ciała, jednak zużywa ~20% całkowitej wyprodukowanej energii, co czyni go niezwykle energochłonnym narządem13. Nic więc dziwnego, że dysfunkcja mitochondriów u ludzi prowadzi do dużej liczby objawów neurologicznych 14-17. Mutacje genetyczne w składnikach OXPHOS, które upośledzają wytwarzanie ATP, prowadzą do zaburzeń mitochondrialnych 17,18, które są klinicznie niejednorodną grupą zaburzeń o częstości występowania ~1 : 5 000 osób i jedną z najczęstszych przyczyn zaburzeń metabolicznych u dzieci i dorosłych. Deficyt ATP pochodzącego z mitochondriów wpływa na wiele układów narządowych, przy czym narządy wymagające dużej ilości energii, takie jak mózg, serce i mięśnie szkieletowe, są głównie dotknięte u tych pacjentów 14,17,18. W ostatnich latach wiele badań dostarczyło dowodów na dysfunkcję mitochondriów zarówno w zaburzeniach neurorozwojowych, jak i neurodegeneracyjnych 15-17,19,20. Ponieważ mitochondria są niezbędne i krytyczne dla rozwoju i funkcjonowania mózgu, konieczne jest opracowanie protokołów, które mogą analizować zmiany w morfologii, strukturze, rozmiarze, liczbie i dystrybucji mitochondriów mózgu zarówno w stanie zdrowym, jak i chorym. Wyprodukowano modele mysie z mitochondrialnie ukierunkowanym białkiem zielonej fluorescencji (GFP) w celu wizualizacji ruchów mitochondriów i lokalizacji w mózgu 21,22. Chociaż jest to niezwykle przydatne narzędzie do badania ruchliwości mitochondriów i ogólnej dystrybucji, istnieją pewne wady, do których należy ograniczona rozdzielczość i czułość mikroskopii fluorescencyjnej. Te atrybuty utrudniają śledzenie mitochondriów o stosunkowo małych rozmiarach. Podobnie, transmisyjna mikroskopia elektronowa z powodzeniem wykorzystuje się do oglądania mitochondriów synaptycznych 23, ale ta metoda jest bardzo czasochłonna. Wiadomo, że morfologia mitochondriów jest bardzo dynamiczna, ponieważ przechodzą one ciągłe cykle rozszczepienia i fuzji, a w większości komórek mitochondria utrzymują wysoce połączoną sieć 24-26. Neurony są wysoce spolaryzowanymi komórkami z wieloma dendrytami i wydłużonymi aksonami, a mitochondria, które tworzą połączoną siatkowatą sieć w ciele komórki, mogą być zmuszone do rozdzielenia się, gdy przechodzą przez te neuryty (ryc. 1). To sprawia, że mitochondria mózgu są niezwykle zróżnicowane pod względem wielkości i kształtu. Na przykład, stosując technikę seryjnej skaningowej mikroskopii elektronowej (SBFSEM), zaobserwowaliśmy wcześniej, że różnica w objętości lub wielkości mitochondriów pozasynaptycznych w stosunku do mitochondriów obecnych w zakończeniach nerwowych może być nawet szesnastokrotnie 27.
Istnieje kilka podejść do przeprowadzania analiz objętościowych 28, w tym sekcja szeregowa TEM 29, automatyczna taśma zbierająca ultramikrotom SEM 30, skupiona wiązka jonów SEM 31 i SBFSEM 32. Analiza SBFSEM ma tę zaletę, że ma rozdzielczość, która dostarcza danych ilościowych na temat kształtu morfologicznego, wielkości, rozmieszczenia i liczby organelli, takich jak mitochondria, w obszarach do 1 mm mózgu. Operacja techniczna jest również najmniej wymagająca, a pozyskiwanie i analiza danych odbywa się w ramach możliwości wielu laboratoriów biologicznych, które nie mają wcześniejszego doświadczenia w EM. Pojawienie się komercyjnych instrumentów do generowania seryjnych obrazów przypominających przekroje sprawiło, że ultrastrukturalna analiza 3D tkanek stała się rutynową techniką, która dodatkowo pozwala na bezstronną analizę wolumetryczną w szybki i powtarzalny sposób28. SBFSEM został po raz pierwszy opisany i zastosowany w dziedzinie neurobiologii w 2004 roku 32 w oparciu o ideę wprowadzoną przez Leightona w 1981 roku 33 . Wiele badań przeprowadzonych od tego czasu ustaliło, że technika ta jest głównym narzędziem w analizie rekonstrukcji obwodów neuronalnych 34. Ponadto, w przypadku wielu projektów na mniejszą skalę, zapewnia analizę rekonstrukcji w celu identyfikacji organelli komórkowych 27,35-39. Ponieważ uzyskane obrazy pochodzą z niskonapięciowych elektronów rozpraszania wstecznego, opracowano nowe protokoły barwienia, które łączą różne znane techniki barwienia metalami ciężkimi, aby zwiększyć rozdzielczość 40.
W tym artykule przedstawiamy protokół do wykorzystania obrazowania 3D mikroskopii elektronowej i analizy wolumetrycznej mitochondriów mózgu w oparciu o metody, które wcześniej były używane przez nas i innych 38,39,41. Zastosowane metody przetwarzania tkanek były zgodne z wcześniejszymi opisami Deerincka i wsp. 40.

<table><tbody><tr><td>Myszy C57BL/6J Laboratorium Jacksona</td><td>&nbsp;</td><td>664</td><td></td></tr><tr><td>Isoflurane</td><td>VETone, nazwa handlowa Fluriso</td><td>501017</td><td></td></tr><tr><td>Taca preparcyjna</td><td>Fisher scientific&nbsp;</td><td>S65105&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Nożyczki preparacyjne</td><td>Ted Pella Inc.</td><td>1316</td><td></td></tr><tr><td>Kaniula motyla</td><td>Exel International</td><td>26704</td><td></td></tr><tr><td>Bufor fosforanowy sól fizjologiczna</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P4417-100TAB</td><td></td></tr><tr><td>Filtr (0,45 mikrona)</td><td>EMD Milipore</td><td>NC0813356</td><td></td></tr><tr><td>Mikroskop preparacyjny</td><td>Olympus</td><td>SZ61</td><td></td></tr> System <tr><td>do cięcia wibratomu</td><td>Ted Pella Inc.</td><td>Vibratome 3000</td><td></td></tr><tr><td>Kakodylan sodu</td><td>EMS</td><td>12300</td><td></td></tr><tr><td>Kwas garbnikowy</td><td>EMS</td><td>21700</td><td></td></tr><tr><td>Żelazocyjanek potasu</td><td>J.T. Baker</td><td>14459-95-1</td><td></td></tr><tr><td>Tetratlenek osmu 4% roztwór</td><td>EMS</td><td>19150</td><td></td></tr><tr><td>Tiokarbohydrazyd</td><td>EMS</td><td>21900</td><td></td></tr><tr><td>Kwas L-asparaginowy</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A93100</td><td></td></tr><tr><td>Wodorotlenek potasu</td><td>Acros Organics</td><td>43731000</td><td></td></tr><tr><td>Azotan ołowiu</td><td>EMS</td><td>17900</td><td></td></tr><tr><td>EMbed-812 ZESTAW DO OSADZANIA</td><td>EMS</td><td>14120</td><td>Zawiera żywicę Embed 812&nbsp, DDSA, NMA i DMP-30.</td></tr><tr><td>Aldehyd glutarowy 25% klasy EM</td><td>Polysciences Inc.</td><td>1909</td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldehyd</td><td>EMS</td><td>19202</td><td></td></tr><tr><td>Octan uranylu</td><td>EMS</td><td>22400</td><td></td></tr><tr><td>Etanol</td><td>EMS</td><td>15055</td><td></td></tr><tr><td>Tlenek propylenu</td><td>EMS</td><td>20400</td><td></td></tr><tr><td>Forma do zatapiania</td><td>EMS</td><td>70907</td><td></td></tr><tr><td>Aluminiowa próbka szpilki</td><td>EMS</td><td>70446</td><td></td></tr><tr><td>Srebro koloidalne Płyn</td><td>EMS</td><td>12630</td><td></td></tr><tr><td>Razor</td><td>EMS</td><td>72000</td><td></td></tr><tr><td>Super Glue (Loctite Gel Control)</td><td>Loctite</td><td>234790</td><td>Sklepy z narzędziami/rękodziełem oferują ten przedmiot</td></tr><tr><td>Przewodząca żywica epoksydowa</td><td>Ted Pella Inc.</td><td>16043</td><td></td></tr><tr><td>Skaningowy mikroskop elektronowy</td><td>Zeiss</td><td>Sigma VP</td><td></td></tr><tr><td>Ultramikrotom komorowy dla SEM</td><td>Gatan Inc.</td><td>3View2</td><td>Może być zaprojektowany dla innych SEMów</td></tr><tr><td>Mikroskop do przycinania do przygotowania szpilek</td><td>Gatan Inc.</td><td>dostarczany w ramach systemu</td><td></td>3View</tr><tr><td>Detektor elektronów wstecznie rozproszonych Low kV</td><td>Gatan Inc.</td><td>Pakiet przetwarzania 3V-BSED</td><td></td></tr><tr><td>ImageJ/ Fidżi&nbsp;</td><td>ImageJ ver 1.50b, FIJI download Oct 1, 2015</td><td><a href="http://zoi.utia.cas.cz/files/imagej_api.pdf">http://zoi.utia.cas.cz/files/imagej_api.pdf</a></td><td></td></tr><tr><td colspan="4">http://rsb.info.nih.gov/ij/</td></tr><tr><td colspan="4"><a href="http://www.icmr.ucsb.edu/programs/3DWorkshop/Uchic-2015_FIJI_Tutorial.pdf">http://www.icmr.ucsb.edu/programs/3DWorkshop/Uchic-2015_FIJI_Tutorial.pdf</a> </td></tr><tr><td colspan="4"><a href="http://fiji.sc/TrakEM2">http://fiji.sc/TrakEM2</a></td></tr></tbody></table>

analiza mitochondriów mózgowych z wykorzystaniem seryjnej skaningowej mikroskopii elektronowej z obrazowaniem powierzchni bloku (sbf-sem)



Analysis of Brain Mitochondria Using Serial Block-Face Scanning Electron Microscopy

Ludzki mózg jest organem zużywającym dużo energii, który głównie opiera się na glukozie jako źródle paliwa. Glukoza jest katabolizowana przez mitochondria mózgu poprzez glikolizę, cykl kwasu trikarboksylowego (TCA) i szlaki fosforylacji oksydacyjnej (OXPHOS) w celu wytworzenia energii komórkowej w postaci adenozynotrójfosforanu (ATP). Upośledzenie mitochondrialnej produkcji ATP powoduje zaburzenia mitochondrialne, które objawiają się klinicznie wyraźnymi objawami neurologicznymi i miopatycznymi. Defekty mitochondrialne występują również w zaburzeniach neurorozwojowych (np. zaburzenia ze spektrum autyzmu) i neurodegeneracyjnych (np. stwardnienie zanikowe boczne, choroby Alzheimera i Parkinsona). W związku z tym rośnie zainteresowanie tą dziedziną wykonywania analizy 3D morfologii, struktury i dystrybucji mitochondriów zarówno w stanie zdrowym, jak i chorobowym. Morfologia mitochondriów mózgu jest niezwykle zróżnicowana, a niektóre mitochondria, zwłaszcza te w regionie synaptycznym, znajdują się w zakresie średnicy <200 nm, czyli poniżej granicy rozdzielczości tradycyjnej mikroskopii świetlnej. Ekspresja ukierunkowanego na mitochondria białka zielonej fluorescencji (GFP) w mózgu znacznie poprawia wykrywanie organelli za pomocą mikroskopii konfokalnej. Nie przezwycięża jednak ograniczeń czułości wykrywania mitochondriów o stosunkowo małych rozmiarach bez przesycenia obrazów mitochondriów o dużych rozmiarach. Podczas gdy mikroskopia elektronowa z transmisją szeregową została z powodzeniem wykorzystana do scharakteryzowania mitochondriów w synapsie neuronalnej, technika ta jest niezwykle czasochłonna, zwłaszcza w przypadku porównywania wielu próbek. Technika seryjnej skaningowej mikroskopii elektronowej ze skaningiem blokowym (SBFSEM) obejmuje zautomatyzowany proces cięcia, obrazowania bloków tkanek i pozyskiwania danych. W tym miejscu udostępniamy protokół do wykonania SBFSEM zdefiniowanego regionu z mózgu gryzonia w celu szybkiej rekonstrukcji i wizualizacji morfologii mitochondriów. Technika ta może być również wykorzystana do dostarczenia dokładnych informacji na temat liczby, objętości, wielkości i rozmieszczenia mitochondriów w określonym regionie mózgu. Ponieważ uzyskana rozdzielczość obrazu jest wysoka (zwykle poniżej 10 nm), można również wykryć wszelkie poważne wady morfologiczne mitochondriów.

Wykazujemy, że morfologia i rozmiar mitochondriów w mózgu są heterogeniczne w różnych podprzedziałach neuronalnych. Mikroskopia konfokalna kultur neuronalnych o niskiej gęstości, przetransdukowanych lentiwirusem wykazującym ekspresję białka GFP skierowanego do mitochondriów, wykazała, że mitochondria znajdujące się w somach neuronów tworzą sieć retikularną, podczas gdy te zlokalizowane w dystalnych neurytach wykazują dyskretną, wydłużoną morfologię (Rycina 1 A-B). Z zasto...

Wizualizacja i analiza mitochondriów z tkanki mózgowej ssaków to trudne zadanie. W tym miejscu opisujemy, w jaki sposób trójwymiarowa (3D) analiza rekonstrukcji z seryjnej skaningowej mikroskopii elektronowej (SBFSEM) może być wykorzystana do uzyskania wglądu w morfologiczną i wolumetryczną analizę tego krytycznego organcelli generującej energię.

Analiza mitochondriów mózgowych z wykorzystaniem seryjnej skaningowej mikroskopii elektronowej z obrazowaniem powierzchni bloku (SBF-SEM)

Human brain is a high energy consuming organ that mainly relies on glucose as a fuel source. Glucose is catabolized by brain mitochondria via glycolysis, ...

Ogólnym celem techniki seryjnej skaningowej mikroskopii elektronowej powierzchni bloku (serial block-face scanning electron microscopy) jest analiza morfologii, struktury, rozkładu, objętości i liczby mitochondriów w określonym obszarze mózgu myszy. Metoda ta może pomóc w udzieleniu odpowiedzi na wiele kluczowych pytań z zakresu neurobiologii, takich jak to, czy zmiany w strukturze, liczbie i rozkładzie mitochondriów w mózgu w znacznym stopniu przyczyniają się do powstawania zaburzeń neurodegeneracyjnych i neurorozwojowych. Główną zaletą tej techniki jest automatyzacja procesu obrazowania sekcji seryjnych dzięki zastosowaniu specjalnie zaprojektowanego ultramikrotomu wbudowanego w komorę skaningowego mikroskopu elektronowego pracującego w niskiej próżni.Aby rozpocząć eksperyment, uprzednio przygotowane tkanki utrwalone glutaraldehydem należy przemyć trzykrotnie przez pięć minut każdorazowo w 0,1 M buforze kakodylowym. Następnie tkanki należy poddać postutrwalaniu w 1 ml 0,1% kwasu taninowego w buforze kakodylowym przez 30 minut w temperaturze pokojowej. Po postutrwalaniu tkanki należy przemyć w buforze kakodylowym.Rozpuścić 0,3 g ferrocyjanku potasu i 0,86 g kakodylanu sodu w 10 ml wody destylowanej. Bezpośrednio przed użyciem dodać 10 ml 4% tetratlenku osmu i barwić tkanki 2% roztworem ferrocyjanku osmu przez 90 minut w lodzie. Po barwieniu przemyć tkankę wodą destylowaną.Próbki należy inkubować ze świeżo przygotowanym 1% roztworem tiokarbohydrazydy (TCH) przez 20 minut w temperaturze pokojowej. Następnie próbki należy wypłukać. W kolejnym kroku tkanki należy barwić 2% wodnym roztworem czterotlenku osmu przez jedną godzinę.Po barwieniu przemyć tkanki wodą destylowaną. Próbki inkubować przez noc w 1% octanie uranylu w wodzie destylowanej w temperaturze 4 stopni Celsjusza. Następnego dnia opłukać tkanki wodą destylowaną i inkubować je z barwnikiem Weltona (asparchian ołowiu) w piecu.Uzyskanie jak najlepszego barwienia tkanek jest kluczowe dla obrazowania, ponieważ słabe barwienie prowadzi do zjawiska ładowania się próbki, co utrudnia lub uniemożliwia obrazowanie. Przemyć tkankę wodą destylowaną. Odwodnić próbki w szeregu stężeń alkoholu, stosując schłodzone roztwory etanolu przez pięć minut dla każdego stężenia, a następnie przeprowadzić odwodnienie w 100% etanolu trzykrotnie przez 10 minut w każdym cyklu.Próbki należy przemyć dwukrotnie przez 15 minut każdorazowo w tlenku propylenu. Tkanki umieszcza się w mieszaninie żywicy do zatapiania i tlenku propylenu w stosunku 1:1, zakręca fiolkę i inkubuje tkanki przez noc. Po dwóch godzinach należy odkręcić fiolkę, aby tlenek propylenu mógł odparować w ciągu kolejnych dziewięciu godzin.Przenieś tkanki do 100% świeżej żywicy do zatapiania w czystych probówkach na dwie godziny. Zatop próbki w świeżej żywicy do zatapiania w płaskich formach zawierających wydrukowane papierowe etykiety i utwardź je w piecu. Po godzinie sprawdź rozmieszczenie i wyrównanie tkanek, a w razie potrzeby dokonaj korekty.Przytnąć próbki do obszaru zainteresowania i zamocować je na aluminiowym trzpieniu za pomocą żelu cyjanoakrylowego. Następnie pokryć boki bloku pastą z koloidalnego srebra, aby zapewnić ścieżkę przewodzącą do aluminiowego trzpienia. Przebadać preparaty tkankowe za pomocą skaningowego mikroskopu elektronowego wyposażonego w wbudowany w komorę stół ultramikrotomu oraz detektor elektronów wstecznie rozproszonych niskonapięciowy.Wykonaj obrazowanie próbek przy użyciu tych ustawień. Rozpocznij analizę, wybierając Image, Type, a następnie 8-bit, aby przekonwertować obrazy z oryginalnego, zastrzeżonego formatu 16-bit na 8-bitowy format TIFF. Jeśli automatyczna konwersja kontrastu i/lub jasności podczas tego kroku nie jest optymalna dla obrazów, otwórz ponownie obrazy 16-bitowe i wybierz Image, Adjust, Brightness/Contrast.Wybierz zakres odpowiedni dla wszystkich obrazów i kliknij Apply. Następnie przeprowadź konwersję. Jeśli między przekrojami wystąpiło niedopuszczalne przesunięcie obrazu, wyrównaj stosy obrazów, wybierając Plugins, Registration oraz Linear Stack Alignment with SIFT, a następnie ustaw wyrównanie w trybie translation-only zamiast rigid body.Zwiększ rozmiar obszaru roboczego przed rejestracją, wybierając Image, Adjust, Canvas Size. Alternatywnie można ograniczyć obraz do obszaru zainteresowania, zaznaczając pożądany region, a następnie go przycinając. W razie potrzeby przeskaluj obrazy do mniejszego, łatwiejszego w obsłudze rozmiaru w programie ImageJ, wybierając Image oraz Scale.Mikroskopia konfokalna kultur neuronalnych o niskiej gęstości wykazała, że mitochondria znajdujące się w somie neuronów tworzą sieć retikularną, podczas gdy te zlokalizowane w dystalnych neurytach wykazują dyskretną, wydłużoną morfologię. Zastosowanie techniki seryjnego skanowania powierzchni bloku (SBFSEM) pozwoliło na wyraźną obserwację mitochondriów, dendrytów i zgrubień aksonalnych w mózgu myszy. Trójwymiarowe rekonstrukcje mitochondriów w neurytach tkanki mózgowej myszy wykazały różnicę w wielkości między mitochondriami dendrytycznymi a aksonalnymi.Dane wyekstrahowane z reprezentacyjnego obrazu 2-D SBFSEM wykazały, że objętość lub rozmiar mitochondriów znajdujących się w presynapsach neuronalnych była znacząco mniejsza niż mitochondriów zlokalizowanych w regionie pozasynaptycznym. Obrazy uzyskane za pomocą analizy SBFSEM zapewniają zwiększoną rozdzielczość, umożliwiającą wizualizację cech ultrastrukturalnych poszczególnych mitochondriów. Możliwa jest klasyfikacja przedziału komórkowego mitochondriów poprzez określenie ich bliskości względem łatwo identyfikowalnych struktur, takich jak niesynaptyczne mitochondria somatyczne oraz mitochondria presynaptyczne.Technikę tę można przeprowadzić w ciągu około siedmiu dni, co obejmuje trzy dni barwienia, dwa dni utwardzania żywicy, jeden dzień obrazowania w celu uzyskania stosu odpowiedniego do tej analizy oraz około dwóch do czterech godzin postprocesingu obrazów w przygotowaniu do analizy. Procedurę tę można również stosować w połączeniu z innymi metodami obrazowania mitochondriów, takimi jak obrazowanie na żywo mitochondriów znakowanych genetycznie, aby odpowiedzieć na pytania dotyczące transportu mitochondriów oraz dynamiki ich podziału i fuzji.

analysis-brain-mitochondria-using-serial-block-face-scanning-electron

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Neuronauka

Źródło: Mukherjee, K., et. al. Analiza mitochondriów mózgu za pomocą seryjnej skaningowej mikroskopii elektronowej. J. Vis. exp. (2016)Ten film pokazuje przygotowanie,  obrazowanie i analiza tkanki mózgowej myszy przy użyciu seryjnego skaningowego mikroskopu elektronowego z blokową powierzchnią czołową (SBFSEM) w celu wizualizacji ultrastruktury mitochondriów, umożliwiając precyzyjne mapowanie ich morfologii i rozmieszczenia przestrzennego w aksonalnych i dendrytycznych przedziałach...

 Obrazowanie mitochondriów neuronalnych za pomocą seryjnego skaningowego mikroskopu elektronowego typu block-face

Konfokalna mikroskopia skaningowa jest stosowana do obrazowania pojedynczych zdarzeń mitochondrialnych w perfundowanych mięśniach serca lub szkieletowych u żywych zwierząt. Monitorowanie w czasie rzeczywistym pojedynczych procesów mitochondrialnych, takich jak błyski ponadtlenkowe i wahania potencjału błonowego, umożliwia ocenę funkcji mitochondriów w fizjologicznie istotnym kontekście i podczas patologicznych perturbacji.

Obrazowanie konfokalne pojedynczych mitochondrialnych błysków ponadtlenkowych w nienaruszonym sercu lub in vivo

Przedstawiamy protokół do badania rozkładu mitochondriów i retikulum endoplazmatycznego w całych komórkach po modyfikacji genetycznej za pomocą korelacyjnej mikroskopii elektronowej światła i objętości, w tym barwienia peroksydazą askorbinianową 2 i peroksydazy chrzanowej, seryjnego cięcia komórek z i bez genu docelowego w tej samej sekcji oraz seryjnego obrazowania za pomocą mikroskopii elektronowej.

Obrazowanie mitochondriów i retikulum endoplazmatycznego za pomocą korelacyjnej mikroskopii świetlnej i objętościowej

Upośledzony transport i morfologia mitochondriów są zaangażowane w różne choroby neurodegeneracyjne. Prezentowany protokół wykorzystuje indukowane pluripotencjalne neurony przodomózgowia pochodzące z komórek macierzystych do oceny transportu mitochondrialnego i morfologii w dziedzicznej paraplegii spastycznej. Protokół ten pozwala na scharakteryzowanie transportu mitochondrialnego wzdłuż aksonów i analizę ich morfologii, co ułatwi badanie chorób neurodegeneracyjnych.

Analiza transportu i morfologii mitochondriów w indukowanych przez człowieka pluripotencjalnych neuronach pochodzących z komórek macierzystych w dziedzicznej paraplegii spastycznej

Opisujemy szczegółowy protokół generowania ludzkich organoidów mózgowych pochodzących z pluripotencjalnych komórek macierzystych i ich wykorzystania w modelowaniu chorób mitochondrialnych.

Generowanie organoidów ludzkiego mózgu do modelowania chorób mitochondrialnych

Sieć mitochondrialna jest niezwykle złożona, co czyni ją bardzo trudną do analizy. Nowatorskie narzędzie MATLAB analizuje na żywo mitochondria zobrazowane konfokalnie na zdjęciach poklatkowych, ale skutkuje dużą objętością wyjściową wymagającą indywidualnej uwagi ręcznej. Aby rozwiązać ten problem, opracowano rutynową optymalizację, która pozwala na szybką analizę plików.

Zoptymalizowana zautomatyzowana analiza modulacji homeostazy mitochondriów neuronalnych w żywych organizmach neuronalnych przez specyficzne dla izoform receptory kwasu retinowego

To badanie przedstawia metodę analizy morfologii mitochondriów na podstawie barwienia immunologicznego i analizy obrazu w tkance mózgowej myszy in situ. Opisano również, w jaki sposób pozwala to na wykrycie zmian w morfologii mitochondriów wywołanych przez agregację białek w modelach choroby Parkinsona.

Badanie histologiczne morfologii mitochondriów w modelu choroby Parkinsona

Ten protokół opisuje technikę analizy superkompleksów oddechowych, gdy dostępne są tylko małe ilości próbek.

Izolacja mitochondriów do analizy superkompleksów mitochondrialnych z próbek małych tkanek i kultur komórkowych

Ten protokół zapewnia ustandaryzowane podejście do obrazowania morfologii mitochondriów w wielu tkankach C. elegans podczas starzenia.

Obrazowanie i ilościowe określanie morfologii mitochondriów u C. elegans podczas starzenia

W tym badaniu opisujemy krok po kroku protokół i kładziemy nacisk na kluczowe szczegóły dotyczące określania cech morfologicznych mitochondriów w żywych komórkach, w tym przygotowanie próbki, akwizycję obrazu i analizę danych. Ta metoda jest powszechnie stosowana do badania morfologii mitochondriów w celu badania różnych schorzeń.

Oznaczanie morfologii mitochondriów w żywych komórkach za pomocą mikroskopii konfokalnej

Poznaj analizę morfologii mitochondriów w mózgu myszy za pomocą seryjnej skaningowej mikroskopii elektronowej. Ta metoda umożliwia trójwymiarową rekonstrukcję organelli i badanie ich roli w chorobach neurodegeneracyjnych.

Analiza mitochondriów mózgowych z wykorzystaniem seryjnej skaningowej mikroskopii elektronowej z obrazowaniem powierzchni bloku (SBF-SEM)

Przeglądaj więcej filmów