Obserwacja podziału i dynamiki mitotycznej w żywym zarodku danio pręgowanego

Ogólnym celem tej procedury jest monitorowanie wierności segregacji chromosomów podczas mitozy w żywym zarodku ryby danio glowiastej poprzez wykorzystanie znakowanych fluorescencyjnie białek chromatyny i błony komórkowej, które zostaną zobrazowane za pomocą wysokorozdzielczej mikroskopii konfokalnej. Metoda ta może pomóc w odpowiedzi na kluczowe pytania z dziedziny mitozy, takie jak: w jaki sposób defekty mitotyczne prowadzą do wad rozwojowych lub powstawania nowotworów w żywym organizmie kręgowca? Główną zaletą tej techniki jest obserwacja mitozy w żywym organizmie kręgowca, co pozwala na gromadzenie danych o istotności fizjologicznej.

Po rozrodzeniu dorosłych danio pręgowanych i wstrzyknięciu do jaj RNA H2A. F/Z-EGFP i/lub pCS2 mCherry-CAAX, około dwóch godzin przed obrazowaniem, należy użyć fluorescencyjnego mikroskopu stereoskopowego w celu zidentyfikowania embrionów wykazujących ekspresję GFP. Intensywnie zielone embriony exprimujące GFP należy przenieść do nowej szalki Petriego o wymiarach 100 na 15 milimetrów z pożywką E3 blue.

Zagotuj roztwór zapasowy 1% nisko topnej agarozy w buforze E3 blue. Przenieś trzy mililitry roztopionej agarozy do probówki hodowlanej o wymiarach 17 na 100 milimetrów. Utrzymuj agarozę w cieple, umieszczając probówkę w kąpieli wodnej o temperaturze 42°C aż do momentu użycia.

Przygotuj trikainę o stężeniu 15 mM, wyselekcjonowane embriony, agarozę niskotopliwą, E3 blue, szalkę hodowlaną o średnicy 35 mm z przeszklonym dnem oraz stereomikroskop. Następnie, używając pęsety nr 5, ostrożnie usuń choriony z trzech embrionów i umieść je w oddzielnym naczyniu w celu znieczulenia. Następnie, za pomocą pipety transferowej, dodaj trzy krople 15 mM trikainy do szalki zawierającej embriony oraz 5 mL pożywki.

Do probówki z 1% roztopioną agarozą dodaj trzy do czterech kropli 15-milimolowego roztworu tricainy. Gdy embriony zostaną odpowiednio znieczulone, przenieś je do naczynia z pokrywką szklaną, używając Pipetmana P200 z odciętym jednym centymetrem końcówki pipety. Usuń nadmiar roztworu E3 blue tricaine.

Powoli dodaj od 5 do 10 µL roztworu agarozy o niskiej temperaturze topnienia z trikainą na zarodki, dozując każdą kroplę oddzielnie, aby zapobiec zbliżaniu się zarodków do siebie. Następnie, używając igły 21G o długości 1,5 cala, delikatnie ustaw zarodki w agarozie w pożądanej pozycji, kierując obszar zainteresowania jak najbliżej szkiełka nakrywki w przypadku użycia mikroskopu odwróconego. Ze względu na możliwość przesunięcia się próbek, konieczne może być ponowne sprawdzenie każdego zarodka, aby upewnić się, że pozostają one w wymaganej pozycji.

Czynność tę może być konieczne powtórzyć kilkukrotnie, aż do osiągnięcia optymalnej pozycji w miarę krzepnięcia agaru. Po kilku minutach, aby sprawdzić, czy żel stężał, należy za pomocą igły przerwać mały fragment agarozy. Gdy można go będzie oddzielić od kropli, należy użyć dodatkowej agarozy o niskiej temperaturze topnienia, aby uformować kopułę nad zatopionymi zarodkami, pokrywając całą szkiełko nakrywką.

Podczas krzepnięcia agarozy przygotuj trzy mililitry pożywki E3 blue z pięcioma kroplami 15-milimolarnej trikainy, która zostanie naniesiona na unieruchomione embriony podczas obrazowania. Aby przeprowadzić obrazowanie konfokalne 5D żywych embrionów ryb zebrafish, uruchom oprogramowanie do obrazowania i ustaw mikroskop na obiektyw 60X o aperturze numerycznej 1.4. Nałóż olej immersyjny na obiektyw i umieść szalkę hodowlaną w uchwycie na preparaty na stole mikroskopu.

Za pomocą kontrolera osi wycentruj badany embrion nad obiektywem, a następnie podnieś obiektyw, aby zbliżyć go do naczynia hodowlanego. Wlej roztwór E3 blue oraz tricaine na embriony zatopione w agarze. Następnie kliknij ikonę Eye Port, aby obejrzeć embriony przez okular.

Wyłącz wybór portu okularowego (Eye Port), a następnie wybierz View, Acquisition Controls, A1 Scan Area, aby otworzyć narzędzie A1 Scan Area. Wybierz kanał GFP, uruchom skanowanie ponownie i ustaw ostrość na obszarze zainteresowania blisko szkiełka nakrywki. Zatrzymaj skanowanie, wybierz kanały GFP i mCherry oraz ustaw opcję uśredniania linii (line-averaging) na normalną.

Następnie wybierz View, Acquisition Controls, ND Acquisition, aby otworzyć narzędzie A1 ND Acquisition. Rozpocznij skanowanie. Następnie, korzystając z kontrolera osi, ustaw zarodki tak, aby obszar skanowania był wypełniony w jak największym stopniu przez daną rybkę danio pręgowaną.

Ustaw górną granicę stosu Z w miejscu, w którym komórki są poza zakresem ostrości, pozostawiając dodatkowe trzy mikrometry przestrzeni nad próbką, aby umożliwić wzrost i ruch komórek. Następnie ustaw dolną granicę w miejscu, w którym komórki nie są już widoczne, a rozmiar kroku interwału Z ustaw na dwa mikrometry. W przypadku eksperymentów zaprezentowanych w niniejszym materiale dostosuj moc lasera obrazującego, HV lub wzmocnienie (gain) oraz poziomy offsetu zgodnie z poniższą listą.

Po ustawieniu parametrów wyłącz skanowanie, aby zapobiec niepotrzebnej ekspozycji na laser, która może spowodować fototoksyczność i fotoblaknięcie próbki. Następnie wybierz ikonę dwukrotnego uśredniania linii (2X line averaging), która zapewnia najlepszą jakość obrazu i najkrótszy czas skanowania. Wybierz odpowiedni interwał czasowy oraz czas trwania niezbędny dla eksperymentu.

W przypadku podziałów komórek typu dzikiego, dwuminutowe odstępy czasowe przez okres dwóch godzin są wystarczające do wyznaczenia czasu trwania mitozy. Podziały, w których punkt kontrolny montażu wrzeciona pozostaje aktywny przez więcej niż trzydzieści minut, bardziej nadają się do interwałów czterech-pięciu minut przez cztery godziny w celu zachowania fluorescencji, co zostało tutaj zademonstrowane. Aby automatycznie zapisywać plik podczas jego pozyskiwania, zaznacz pole Zapisz do pliku i nadaj plikowi nazwę.

Na koniec upewnij się, że wszystkie parametry zostały ustawione prawidłowo, a następnie kliknij Run Now. Po zakończeniu akwizycji, aby wyświetlić plik w formacie trójwymiarowym, kliknij ikonę Volume Threshold. Rysunek ten demonstruje możliwość obserwacji wielu podziałów komórkowych przy szerokim polu widzenia ogona zarodka rybki danio (zebrafish) linii AB wild-type.

Podziały komórkowe oznaczono gwiazdkami. Odpowiedni film pokazano tutaj. Średnio zaobserwowano 50 dzielących się komórek w grupie AB oraz 30 dzielących się komórek u mutanta aurora B.

Aby uwzględnić zmniejszoną liczbę obrazowanych komórek w mitozie w embrionie mutanta aurora B, obliczono stosunek liczby komórek w mitozie do całkowitej liczby obrazowanych komórek, co sugeruje, że w embrionach mutantów aurora B nie występuje mniejsza liczba komórek przechodzących przez mitozę, lecz raczej mniejsza całkowita liczba obrazowanych komórek. W celu ilościowego określenia czasu trwania mitozy, liczbę odstępów czasowych zajmujących jeden podział komórki pomnożono przez odstęp czasu między każdym Z-stackiem. Jak wynika z tego wykresu, średni czas podziału w typie dzikim AB wynosi 25 minut, a w przypadku mutanta aurora B 58 minut.

Podobnie jak w embrionach typu dzikiego, można rozróżnić każdą fazę mitozy. Jednak w embrionach mutantów aurora B obserwuje się wady mitotyczne, obejmujące zatrzymanie mitozy i nieudaną cytokinezę, co prowadzi do powstania komórek dwojądrowych oraz następczą formację mikrojąder, co potwierdza zwiększony czas podziału zmierzony u tego mutanta. Po opanowaniu techniki, cały proces — od selekcji embrionów po ustawienie parametrów mikroskopu konfokalnego — można przeprowadzić w ciągu jednej godziny.

Podczas wykonywania tej procedury ważne jest pamiętanie o kontekście realizowanego eksperymentu, szczególnie w odniesieniu do obszaru zainteresowania, czasu trwania, interwału czasowego oraz głębokości Z. Pomoże to zmaksymalizować wydajność, a także zapobiec fotoblakaniu i fototoksyczności. Po przeprowadzeniu tej procedury można zastosować inne metody, takie jak preparaty rozprzestrzeń chromozomowych, aby odpowiedzieć na dodatkowe pytania dotyczące przyczyn zaobserwowanych wad mitotycznych, lub zastosować leczenie farmakologiczne w celu określenia wpływu na przebieg, czas trwania mitozy lub losy komórki.

Po opracowaniu technika ta utorowała drogę badaczom w dziedzinie biologii do badania mitozy w kontekście biologii rozwoju i biologii nowotworów z wykorzystaniem danio przełomowego. Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze rozumieć, jak osadzać zarodki danio przełomowego, rejestrować obrazy mitozy na żywo oraz analizować częstotliwość, czas trwania mitozy i los komórek. Pamiętaj, że praca z laserami o wysokiej mocy i światłem fluorescencyjnym może być szkodliwa dla oczu, dlatego podczas wykonywania tej procedury należy zawsze przestrzegać środków ostrożności, takich jak unikanie bezpośredniego kontaktu oczu z wiązką laserową.