Name: Obserwacja podziału i dynamiki mitotycznej w żywym zarodku danio pręgowanego (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-07-15T14:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 10 s
Description: Poznaj metodę obserwacji mitozy w żywych zarodkach danio pręgowanego przy użyciu fluorescencyjnie znakowanych białek chromatyny i błony komórkowej. Technika ta umożliwia badanie wierności segregacji chromosomów oraz wpływu defektów mitotycznych na rozwój i powstawanie nowotworów.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dziękujemy Kristen Kwan za wektory pCS2-H2A.F/Z-EGFP i pCS2-mCherry-CAAX. Dziękujemy Chrisowi Rodeschowi za udzielenie nam korepetycji z obrazowania na żywo u danio pręgowanego. Dziękujemy Shawnowi Williamsowi, Erikowi Malarkeyowi i Bradowi Yoderowi za pomoc w obrazowaniu konfokalnym w UAB i High Resolution Imaging Facility w UAB. Zakład Obrazowania w Wysokiej Rozdzielczości jest wspierany przez UAB Comprehensive Cancer Center Support Grant (P30CA013148) oraz Rheumatic Disease Core Center (P30 AR048311). J.M.P. jest wspierany przez National Institute of Neurological Disease and Stroke (NIH R21 NS092105) oraz granty pilotażowe od American Cancer Society (ACS IRG-60-001-53-IRG) i UAB Comprehensive Cancer Center (P30CA013148). S.M.P. jest wspierany przez Cell and Molecular Biology T32 Training Grant (5T32GM008111-28).

1. Transkrypcja in vitro
<ol>
	<li>Linearyzacja wektorów pCS2-H2A.F/Z-EGFP i/lub pCS2-mCherry-CAAX za pomocą trawienia enzymu restrykcyjnego NotI31. Korzystając z zestawu do transkrypcji RNA in vitro, wygeneruj 5-calowe produkty mRNA z każdej matrycy, zgodnie z protokołem producenta.</li>
	<li>Oczyść zakryte mRNA za pomocą zestawu do oczyszczania. Postępuj zgodnie z instrukcjami producenta. Elute za pomocą H2O, wolnego od RNaz.</li>
	<li>Oznaczyć stężenie RNA przez absorbancję przy 260 nm za pomocą spektrofotometru. (OD260 x rozcieńczenie x 40 μg/ml).</li>
	<li>Rozcieńczyć RNA do 100 ng/μl dla każdego H2A. F/Z-EGFP i mCherry-CAAX z H2O, wolnym od RNaz. Jeśli stężenie RNA jest zbyt niskie, fluorescencja będzie zmniejszona lub nieobecna. Jaśniejsze próbki zmniejszą obawy związane z fototoksycznością i fotowybielaniem. Z drugiej strony, zbyt duża ilość RNA może być toksyczna i/lub powodować efekty niezamierzone. 
	Uwaga: Pozostałe oczyszczone mRNA należy przechowywać w zamrażarce o temperaturze -80 °C.</li>
</ol>
2. Hodowla danio pręgowanego, pobieranie zarodków i wstrzykiwanie mRNA 36-38
<ol>
	<li>Zmontuj zbiorniki hodowlane z barierą, aby podzielić zbiornik na dwa regiony i napełnij każdy zbiornik hodowlany wodą z systemu akwakultury używaną w obiekcie danio pręgowanego.</li>
	<li>Aby zapobiec przedwczesnemu rozmnażaniu, na noc przed rozmnażaniem umieść dwie samce po jednej stronie bariery, a dwie samice po drugiej stronie.</li>
	<li>Następnego dnia przygotowaną wcześniej mieszaninę mRNA rozmrozić na lodzie. Zastąp wodę w zbiornikach hodowlanych świeżą wodą z systemu akwakultury i usuń bariery. Natychmiast po pociągnięciu barier należy rozgrzać formę wtryskową do temperatury 28,5 °C i ustawić sprzęt do mikrowtrysku. 
	Uwaga: Informacje na temat form wtryskowych można znaleźć w Gerlach36.</li>
	<li>Zbieraj jajka co 10 - 15 minut za pomocą sitka do herbaty i płucz jajka na czystej szalce Petriego o wymiarach 100 x 15 mm z E3 Blue (5 mM NaCl, 0,17 mM KCl, 0,33 mM CaCl2, 0,33 mMMgSO4, 10-5% błękitu metylenowego). E3 Blue służy do zapobiegania rozwojowi grzybów i zapewnienia prawidłowego rozwoju larw ryb. Więcej informacji na temat krycia i pobierania zarodków można znaleźć w Gerlach36 i Porazinkski37.</li>
	<li>Osadź jednokomórkowe zarodki w rozgrzanej formie iniekcyjnej i wstrzyknij RNA do żółtka w żądanej liczbie zarodków (ryc. 1A). Weź pod uwagę naturalną śmierć zarodków i zarodki niezapłodnione, wykonując zastrzyki embrionalne na 15% więcej zarodków niż jest to potrzebne w eksperymencie. Dodatkowe informacje na temat mikroiniekcji zarodków danio pręgowanego można znaleźć w Gerlach36 i Porazinkski37. 
	UWAGA: W przypadku pierwszego użycia mRNA należy przeprowadzić analizę krzywej dawki, aby określić optymalną dawkę dla fluorescencji i żywotności (zdefiniowanej jako brak poważnych wad rozwojowych do 5 dpf) przed wykonaniem obrazowania 5D. 150 - 200 ng/μl wstrzyknięte do zarodków to często optymalne stężenie, dlatego jest dobrym punktem wyjścia do końcowego stężenia.</li>
	<li>Ostrożnie wyekstrahuj wstrzyknięte zarodki z formy za pomocą zmodyfikowanej 9-calowej szklanej pipety Pasteura. Aby zmodyfikować pipetę, rozpuść końcówkę za pomocą palnika Bunsena, aż utworzy kulę.</li>
	<li>Umieścić wstrzyknięte zarodki na szalce Petriego o wymiarach 100 x 15 mm w kolorze niebieskim E3 i umieścić w inkubatorze o temperaturze 28,5 °C.</li>
	<li>Sześć godzin po wstrzyknięciu usuń z płytek martwe lub niezapłodnione zarodki i dodaj czysty E3 Blue. Umieścić zarodki w temperaturze 28,5 °C.</li>
</ol>
3. Przygotowanie i osadzanie żywych zarodków danio pręgowanego do obrazowania (Rysunek 1B)
<ol>
	<li>Dwie godziny przed obrazowaniem należy przebadać wstrzyknięte zarodki pod kątem GFP za pomocą fluorescencyjnego mikroskopu preparacyjnego. Umieść jasnozielone zarodki z ekspresją GFP na nowej szalce Petriego o wymiarach 100 x 15 mm z E3 Blue.</li>
	<li>Zagotuj roztwór podstawowy 1% niskotopliwej agarozy, dodając 1 g niskotopliwej agarozy do 100 ml E3 Blue. Po użyciu agarozy przykryj kolbę folią aluminiową. Roztwór podstawowy pozostaje przydatny przez okres do jednego miesiąca.</li>
	<li>Podwielokrotność 3 ml stopionego agaru przelać do probówki hodowlanej o wymiarach 17 x 100 mm. Utrzymuj agarozę w cieple, umieszczając probówkę hodowlaną w łaźni wodnej o temperaturze 42 °C, aż będzie gotowa do użycia. Przygotuj 15 mM roztwór trikainy w wodzie dejonizowanej, aby znieczulić zarodki danio pręgowanego36. 
	UWAGA: Jeśli pożądane jest obrazowanie we wcześniejszych punktach czasowych, stężenie agaru można zmniejszyć nawet do 0,3%39.</li>
	<li>Przynieś 15 mM trikainy, przesiane zarodki, niskotopliwą agarozę, E3 Blue i 35-milimetrową szklaną nakrywkową nasadkę do hodowli pod mikroskopem rozwarstwiającym. Ostrożnie usuń kosmówkę zarodka za pomocą pęsety #5. Zrób to dla trzech zarodków.</li>
	<li>Umieścić zarodki z odciętą kosmówką w osobnym pojemniku do znieczulenia. Do tego celu często używa się pokrywki dolnego naczynia szkiełka nakrywkowego. Za pomocą pipety transferowej dodać trzy krople (około 150 μl) 15 mM trikainy do naczynia z 5 ml E3 blue (w przypadku używania pokrywki dolnego naczynia szkiełka nakrywkowego) lub do momentu, gdy zarodki zostaną wystarczająco znieczulone. Ponadto dodaj 3-4 krople (około 150 - 200 μl) 15 mM roztworu trikainy do 1% stopionej probówki agarozowej.</li>
	<li>Za pomocą pipety p200 z odciętą 1 cm końcówką pipety, przenieść znieczulone zarodki do naczynia z dnem szkiełka nakrywkowego. Usuń nadmiar roztworu E3 Blue:Tricaine.</li>
	<li>Powoli dodaj 5 - 10 μl niskotopliwego roztworu agarozy:Trikainy na zarodki, trzymając każdą kroplę oddzielnie, aby upewnić się, że zarodki nie zbliżą się przypadkowo do siebie. 
	Ostrzeżenie: Jeśli agaroza jest zbyt ciepła, uszkodzi zarodek. Dobra temperatura do utrzymania agaru to 42 °C.</li>
	<li>Za pomocą igły 21 G 1 1/2 delikatnie ustaw zarodek w agarozie w żądanej pozycji. W przypadku korzystania z mikroskopu odwróconego do obrazowania poklatkowego należy ustawić obszar zainteresowania (ROI) jak najbliżej szkiełka nakrywkowego. 
	Uwaga: Do celów ogólnych obszar ogonowy zapewnia łatwą orientację i przejrzystość ze względu na stosunkowo cienką tkankę (ryc. 1A). Można wykorzystać inne tkanki, takie jak warstwa nabłonkowa otaczająca żółtko i fałdy płetw28,29. Tkanki te zapewniają dużą przejrzystość, jednak te obszary mają tylko kilka warstw komórek grubości. Dla celów tego protokołu korzystne jest zobrazowanie obszaru ogona, aby uzyskać jak najwięcej podziałów komórkowych.</li>
	<li>Odczekaj kilka minut na częściowe zestalenie się agaru. Użyj igły, aby rozbić mały kawałek agaru, aby sprawdzić jego zestalenie. Gdy kawałek agaru można oderwać od kropli, przejdź do następnego kroku.</li>
	<li>Przykryj całe szkiełko nakrywkowe niskotopliwym agarem, tworząc kopułę nad osadzonymi zarodkami. Poczekaj, aż agar zastygnie przed przesunięciem naczynia w celu obrazowania konfokalnego (ryc. 1A).</li>
	<li>Podczas procesu krzepnięcia agaru (trwa około 10 minut) należy przygotować 3 ml roztworu E3 Blue z pięcioma kroplami (około 250 μl) 15 mM Trikainy, które należy umieścić na osadzonych zarodkach podczas obrazowania.</li>
</ol>
4. Obrazowanie konfokalne 5D żywych zarodków danio pręgowanego40,41
UWAGA: Zobacz Ariga40 i O'Brien41, aby uzyskać szczegółowe informacje na temat wykonywania obrazowania 5D przy użyciu innych systemów konfokalnych. Aby zapoznać się z definicjami interwału Z, stosu Z, głębokości Z, przedziału czasu i 5D, patrz rysunek 1C.
<ol>
	<li>Otwórz oprogramowanie do obrazowania i ustaw mikroskop na soczewkę obiektywową 60X NA 1.4. Nałóż olejek immersyjny na soczewkę obiektywu i umieść naczynie hodowlane w uchwycie na szkiełku na stoliku mikroskopu. Za pomocą kontrolera osi wyśrodkuj interesujący zarodek nad soczewką obiektywu i skieruj soczewkę obiektywu do góry, aby spotkała się z naczyniem hodowlanym.</li>
	<li>Kliknij ikonę okularu i przełącz się na filtr GFP w mikroskopie. Skoncentruj się na zwrocie z inwestycji. Skupienie się na tkance znajdującej się najbliżej szkiełka nakrywkowego zapewni najlepsze wyniki obrazowania.</li>
	<li>Usuń blokadę. Wybierz kanały GFP i mCherry (wstępnie ustawione długości fal w oprogramowaniu) i ustaw opcję uśredniania linii na normalną.</li>
	<li>Użyj polecenia "View/Acquisition Controls/A1 Scan Area", aby otworzyć narzędzie A1 Scan Area (Obszar skanowania A1).</li>
	<li>Rozpocznij skanowanie. Za pomocą kontrolera osi ustaw zarodek tak, aby obszar skanowania był wypełniony jak największą ilością danio pręgowanego. Moc lasera nie musi być w tym momencie optymalna. Zmniejsz moc lasera, aby uniknąć niepotrzebnego fotowybielania.</li>
	<li>Użyj polecenia "View/Acquisition Controls/ND acquisition" (Widok/Kontrola namierzania/Pozyskiwanie ND), aby otworzyć panel sterowania akwizycją ND.</li>
	<li>Rozpocznij skanowanie, aby ustawić parametry stosu Z. Ustaw górny limit stosu Z na miejsce, w którym komórki nie są aktywne, a dolny limit na miejsce, w którym komórki nie są już widoczne. Pozostawić 3 μm przestrzeni nad próbką na wzrost i ruch komórek, które mogą rozszerzać się w polu obrazowania. Stos Z dla figur pokazanych w tym protokole obejmował głębokość Z 40 μm w ogonie zarodka.</li>
	<li>Ustaw rozmiar kroku interwału Z na 2 μm. Średnio komórka ma średnicę 10 μm; W związku z tym 2 μm da pięć interwałów danych obrazowych, które będą analizowane dla każdej komórki. 
	UWAGA: Głębia obrazu, którą można uzyskać, zależy od interwału Z. Rozdzielczość Z jest poświęcana, aby uzyskać ogólną głębię w wymiarze Z, aby zobrazować jak najwięcej komórek przechodzących mitozę (duża głębokość Z). Odwrotność jest prawdziwa, ponieważ zmniejszając rozmiar kroku, uzyskuje się rozdzielczość Z, podczas gdy poświęcana jest głębokość Z (mała głębokość Z).</li>
	<li>Dostosuj moc lasera obrazu, HV i poziomy przesunięcia. Do eksperymentów zademonstrowanych w tym protokole należy użyć następujących poziomów mocy lasera, HV i przesunięcia ustawionych odpowiednio na odpowiednich poziomach dla kanału GFP; 2 - 5, 120 - 140 i -9 do -11. W przypadku kanału mCherry należy użyć odpowiednio następujących poziomów mocy lasera, HV i przesunięcia; 3 - 6, 120 - 140 i -3 do -8. Po ustawieniu parametrów wyłącz skanowanie, aby zapobiec niepotrzebnej ekspozycji lasera, która może spowodować fototoksyczność i fotowybielanie próbki.</li>
	<li>Wybierz ikonę uśredniania 2x linii. "Bez uśredniania" daje ziarnisty obraz, podczas gdy "4-krotne uśrednianie linii" drastycznie wydłuża czas skanowania. Zastosowanie 2-krotnego uśredniania linii zapewnia najlepszą jakość obrazu i najszybszy czas skanowania.</li>
	<li>Wybierz odpowiedni przedział czasu i czas trwania niezbędny do przeprowadzenia eksperymentu. W przypadku podziałów typu dzikiego dwuminutowe interwały czasowe przez 2 godziny są najlepsze do określenia czasu trwania mitozy (używane na rysunkach 1, 2, 3A i 3B). Podziały, które aktywują punkt kontrolny zespołu wrzeciona na dłużej niż 30 minut, są bardziej odpowiednie dla pięciominutowych odstępów przez cztery godziny w celu zachowania fluorescencji, jak pokazano na rysunku 3C.</li>
	<li>Zaznacz pole "zapisz do pliku" i nazwij plik, aby automatycznie zapisywać plik w miarę jego pobierania. Dokładnie sprawdź, czy wszystkie parametry są ustawione poprawnie i naciśnij "rozpocznij bieg".</li>
	<li>Po zakończeniu pobierania, aby wyświetlić plik w formacie trójwymiarowym, kliknij ikonę progu głośności.</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Zastosowanie tej metody pozwala wywnioskować rozpad otoczki jądrowej, utworzenie płytki metafazowej przez przyłączenie mikrotubula – kinetochor oraz segregację chromatyd siostrzanych w celu utworzenia dwóch nowych komórek in vivo i w sposób zależny od czasu. Możliwość obserwacji mitozy u danio pręgowanego jest korzystniejsza w porównaniu ze stałymi próbkami i systemami hodowli komórkowych, ponieważ komórki są obrazowane w naturalnej fizjologii, tkanka jest przezroczysta, co pozwala na zastosowanie białek fluores...

Mitoza jest krytycznym procesem komórkowym niezbędnym do wzrostu, różnicowania i regeneracji w żywym organizmie. Po dokładnym przygotowaniu i replikacji DNA w interfazie, komórka jest przygotowana do podziału. Pierwsza faza mitozy, profaza, jest inicjowana przez aktywację cykliny B/Cdk1. Profaza charakteryzuje się kondensacją materiału chromatynowego w chromosomach. Rozpad otoczki jądrowej następuje na przejściu między profazą a prometafazą. W prometafazie centrosomy, centrum zarodkowania do tworzenia wrzeciona, zaczynają migrować na przeciwległe bieguny, jednocześnie wydłużając mikrotubule w poszukiwaniu przyczepienia kinetochoru. Po przyłączeniu, konwersje do przyłączenia mikrotubul typu end-on i siły naciągu orientują chromosomy, tworząc płytkę metafazową1. Jeśli wszystkie chromosomy są prawidłowo połączone, punkt kontrolny montażu wrzeciona jest spełniony, pierścienie kohezyny utrzymujące razem chromatydy siostrzane są rozszczepiane, a mikrotubule skracają się, aby przyciągnąć chromatydy siostrzane do przeciwległych biegunów podczas anafazy2,3. Ostatnia faza, telofaza, polega na wydłużeniu komórki i reformacji otoczki jądrowej wokół dwóch nowych jąder. Cytokineza kończy proces podziału poprzez oddzielenie cytoplazmy dwóch nowych komórek potomnych4-6. Zmiana kluczowych szlaków mitotycznych (tj. punkt kontrolny składania wrzeciona, duplikacja centrosomów, kohezja chromatyd siostrzanych itp.) może spowodować zatrzymanie metafazy, nieprawidłową segregację chromosomów i niestabilność genomu7-10. Ostatecznie defekty w szlakach kontrolujących mitozę mogą powodować zaburzenia rozwojowe i raka, co wymaga wizualizacji mitozy i jej defektów w żywym, kręgowym, wielokomórkowym organizmie10-16.
Zarodki zebry pręgowanego służą jako doskonały organizm modelowy do obrazowania na żywo ze względu na przezroczystą tkankę, łatwość mikroiniekcji i szybki rozwój. Ogólnym celem tego manuskryptu jest opisanie metody obrazowania na żywo 5D (wymiary X, Y, Z, czas i długość fali) mitozy17 (ryc. 1C). Wykorzystanie zmutowanych danio pręgowanych z uszkodzeniami w różnych szlakach mitotycznych pokazuje konsekwencje takich defektów. Do tego protokołu wybrano mutanty Aurora B i Esco2, aby zilustrować te defekty. Aurora B to kinaza, która jest częścią kompleksu pasażerskiego chromosomu (CPC) biorącego udział w tworzeniu wrzeciona i przyczepianiu mikrotubul. Jest również niezbędny do tworzenia bruzd rozszczepienia w cytokinezie18,19. U danio pręgowanego niedobór Aurory B prowadzi do wad w indukcji bruzdy, cytokinezie i segregacji chromosomów20. Z drugiej strony Esco2 jest acetylotransferazą, która jest niezbędna do spójności chromatyd siostrzanych21,22. Acetyluje kohezynę na części SMC3 pierścienia, stabilizując w ten sposób kohezynę, aby zapewnić prawidłową segregację chromosomów podczas przejścia metafaza-anafaza23. Utrata Esco2 u danio pręgowanego prowadzi do nieprawidłowej segregacji chromosomów, przedwczesnej separacji chromatyd siostrzanych, niestabilności genomu oraz zależnej i niezależnej apoptozy p5324,25. Ze względu na dostępność, do zilustrowania tej techniki zostaną użyte zmutowane auroraBhi1045 i esco2hi2865 (zwane dalej odpowiednio aurBm/m i esco2m/m)25-27.
Sprzężenie mikroskopii konfokalnej z maszynerią komórkową znakowaną fluorescencyjnie umożliwiło badaczom wizualizację chromatyny i dynamiki błony komórkowej podczas mitozy25,28,29. Histony znakowane fluorescencyjnie były historycznie używane do wizualizacji chromatyny. Histony to białka jądrowe złożone z czterech różnych par (H2A, H2B, H3 i H4), które są odpowiedzialne za strukturę nukleosomów tworzących chromosomy30. Podczas gdy H2B jest prawdopodobnie najczęściej używanym histonem do białek fluorescencyjnych w hodowlach myszy i komórek, zastosowanie histonu 2A, rodziny Z (H2A. F/Z) okazał się dobry do stosowania u danio pręgowanego31,32. Na przykład konkanawalina A i kinaza kazeinowa 1-gamma lokalizują się w błonie komórkowej i wcześniej wykazano skuteczność w wizualizacji błony komórkowej u jeżowców i muszki33,34. Inne badania wykazały, że białko znakowane fluorescencyjnie CAAX znakuje błonę komórkową i odniosło sukces u danio pręgowanego31. CAAX to motyw, który jest rozpoznawany przez potranslacyjne enzymy modyfikujące, takie jak farnezylotransferazy i geranylgeranylotransferazy. Modyfikacje zadane przez te enzymy powodują, że białka stają się związane z błoną, znakując w ten sposób błonę komórkową35.
Ze względu na wcześniejsze użycie u danio pręgowanego, ten protokół zdecydował się na użycie H2A. F/Z i CAAX do znakowania chromatyny i błony komórkowej. Zastosowanie tej metody pozwoli badaczowi monitorować mitozę na poziomie poszczególnych komórek, obserwować dynamikę poszczególnych chromosomów, a także jednocześnie monitorować wiele podziałów komórkowych, które mogą wpływać na różnicowanie i rozwój tkanek. W tym artykule skupimy się na obrazowaniu dynamiki segregacji chromosomów podczas mitozy na poziomie pojedynczej komórki. W tym manuskrypcie zostanie zilustrowana i omówiona umiejętność obserwacji kilku podziałów mitotycznych, obliczania czasu podziału i rozszyfrowywania fenotypów mitotycznych. Korzystając z tych parametrów, można zebrać fizjologicznie istotne dane i zastosować je do kilku stanów chorobowych dotkniętych defektami mitotycznymi.

<table><tbody><tr><td>Wektory pCS2</td><td>Prezent od K. Kwana</td><td></td><td>Dla plazmidu zainteresowania</td></tr><tr><td>Enzym restrykcyjny NotI-HF</td><td>New England BioLabs</td><td>R3189S</td><td>Do trawienia restrykcyjnego plazmidu</td></tr><tr><td>Zestaw mMessage SP6</td><td>Life Technologies</td><td>AM1340</td><td>Do transkrypcji in vitro</td></tr><tr><td>Zestaw RNeasy Mini</td><td>Qiagen</td><td>74104</td><td>Do oczyszczania mRNA</td></tr><tr><td>100 x 15 mm szalki Petriego</td><td>Fisher Scientific</td><td>FB0875712</td><td>Do przechowywania zarodków</td></tr><tr><td>forma do mikroiniekcji</td><td>domowej roboty</td><td></td><td>Do trzymania zarodków podczas mikroiniekcji</td></tr><tr><td>Agaroza II</td><td>Amresco</td><td>0815-25G</td><td>Do osadzania zarodków</td></tr><tr><td>Tricaine</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E10521-10G</td><td>Do znieczulania zarodków</td></tr><tr><td>Chlorek sodu</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S9888</td><td>Dla wody zarodkowej (E3 Blue), rozpuszczonej w UltraPure H2O</td></tr><tr><td>Chlorek potasu</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P3911</td><td>Dla wody dla zarodków (E3 Blue), rozpuszczona w UltraPure H2O</td></tr><tr><td>Chlorek wapnia dwuwodny</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C8106</td><td>Do wody dla zarodków (E3 Blue), rozpuszczony w UltraPure H2O</td></tr><tr><td>Siarczan magnezu</td><td>Fisher Scientific</td><td>M7506</td><td>Do wody zarodkowej (E3 Blue), rozpuszczonej w UltraPure H2O</td></tr><tr><td>Methyle Blue</td><td>Hydrate Sigma-Aldrich</td><td>MB1</td><td>Do wody dla zarodków (E3 Blue), rozpuszczonej w UltraPure H2O</td></tr><tr><td>100 mm probówce hodowlanej</td><td>Fisher Scientific</td><td>50-819-812</td><td>Do stopionego agaru</td></tr><tr><td>35 mm szklane naczynie hodowlane na dnie szkiełka nakrywkowego&nbsp;</td><td>MatTek Corp</td><td>P35G-0-20-C&nbsp;</td><td>Nr 0, szkło 20 mm, Do osadzania zarodków</td></tr><tr><td>#5 pęseta</td><td>Dumont</td><td>72701-D</td><td>Do dekorionacji zarodków</td></tr><tr><td>Igła 21 G 1 1/2 Becton</td><td>Dickinson</td><td>305167</td><td>Do pozycjonowania zarodków w agarze</td></tr><tr><td>Mikroskop preparacyjny</td><td>Nikon AZ100</td><td></td><td>Do badań przesiewowych i osadzania zarodków wystarczy dowolny zakres preparacyjny</td></tr><tr>Mikroskop<td>konfokalny</td><td>Nikon A1 +</td><td></td> <td>Do obrazowania poklatkowego</td></tr><tr><td>Oprogramowanie konfokalne</td><td>NIS Elements AR 4.13.00</td><td></td><td>Do akwizycji i przetwarzania obrazów</td></tr></tbody></table>

obserwacja podziału i dynamiki mitotycznej w żywym zarodku danio pręgowanego

Observing Mitotic Division and Dynamics in a Live Zebrafish Embryo

Mitoza jest kluczowa dla wzrostu i różnicowania organizmu. Proces ten jest bardzo dynamiczny i wymaga uporządkowanych zdarzeń, aby osiągnąć prawidłową kondensację chromatyny, przyłączanie mikrotubula i kinetochor, segregację chromosomów i cytokinezę w krótkim czasie. Błędy w delikatnym procesie mogą skutkować chorobami u ludzi, w tym wadami wrodzonymi i rakiem. Tradycyjne podejścia do badania ludzkich stanów choroby mitotycznej często opierają się na systemach hodowli komórkowych, które nie mają naturalnej fizjologii i kontekstu rozwojowego/tkankowego, co jest korzystne podczas badania chorób ludzkich. Protokół ten pokonuje wiele przeszkód, zapewniając sposób wizualizacji, z wysoką rozdzielczością, dynamiki chromosomów w systemie kręgowców, danio pręgowanego. Protokół ten szczegółowo opisze podejście, które można wykorzystać do uzyskania dynamicznych obrazów dzielących się komórek, które obejmują: transkrypcję in vitro, hodowlę/kolekcjonowanie danio pręgowanego, osadzanie zarodków i obrazowanie poklatkowe. Badane są również optymalizacje i modyfikacje tego protokołu. Korzystanie z H2A. F / Z-EGFP (znakuje chromatynę) i mCherry-CAAX (znakuje błonę komórkową) zarodki wstrzyknięte mRNA, wizualizuje się mitozę u AB typu dzikiego, auroraBhi1045 i esco2hi2865 zmutowanego danio pręgowanego. Obrazowanie na żywo w wysokiej rozdzielczości u danio pręgowanego pozwala na obserwację wielu mitoz w celu statystycznego ilościowego określenia defektów mitotycznych i czasu progresji mitotycznej. Ponadto obserwuje się aspekty jakościowe, które definiują nieprawidłowe procesy mitotyczne (tj. wady kongresowe, nieprawidłowa segregacja chromosomów itp.) oraz niewłaściwe wyniki chromosomowe (tj. aneuploidia, poliploidia, mikrojądra itp.). Test ten może być stosowany do obserwacji różnicowania/rozwoju tkanek i jest podatny na stosowanie zmutowanych danio pręgowanych i środków farmakologicznych. Wizualizacja tego, w jaki sposób defekty mitozy prowadzą do raka i zaburzeń rozwojowych, znacznie poprawi zrozumienie patogenezy choroby.

Rysunek 2 demonstruje możliwość obserwacji wielu podziałów komórkowych przy użyciu szerokiego pola widzenia ogona zarodka danio pręgowanego typu dzikiego AB. W odstępie czasu 14 min obrazowano ponad siedem komórek w fazie mitozy (Film 1). W ciągu dwugodzinnego przebiegu czasowego zarejestrowano ponad 40 zdarzeń mitotycznych. Średnio zaobserwowano 50 dzielących się komórek w embrionach AB i 30 dzielących się komórek w embrionach aurBm/m</...

Mitoza jest niezbędna dla każdego żywego organizmu, a defekty często prowadzą do raka i zaburzeń rozwojowych. Korzystając z tego protokołu obrazowania i danio pręgowanego jako systemu modelowego, naukowcy mogą wizualizować mitozę w żywym organizmie kręgowców i mnogość defektów, które powstają, gdy procesy mitotyczne są wadliwe.

Obserwacja podziału i dynamiki mitotycznej w żywym zarodku danio pręgowanego

Mitosis is critical for organismal growth and differentiation. The process is highly dynamic and requires ordered events to accomplish proper chromatin ...

Ogólnym celem tej procedury jest monitorowanie wierności segregacji chromosomów podczas mitozy w żywym zarodku ryby danio glowiastej poprzez wykorzystanie znakowanych fluorescencyjnie białek chromatyny i błony komórkowej, które zostaną zobrazowane za pomocą wysokorozdzielczej mikroskopii konfokalnej. Metoda ta może pomóc w odpowiedzi na kluczowe pytania z dziedziny mitozy, takie jak: w jaki sposób defekty mitotyczne prowadzą do wad rozwojowych lub powstawania nowotworów w żywym organizmie kręgowca? Główną zaletą tej techniki jest obserwacja mitozy w żywym organizmie kręgowca, co pozwala na gromadzenie danych o istotności fizjologicznej.Po rozrodzeniu dorosłych danio pręgowanych i wstrzyknięciu do jaj RNA H2A. F/Z-EGFP i/lub pCS2 mCherry-CAAX, około dwóch godzin przed obrazowaniem, należy użyć fluorescencyjnego mikroskopu stereoskopowego w celu zidentyfikowania embrionów wykazujących ekspresję GFP. Intensywnie zielone embriony exprimujące GFP należy przenieść do nowej szalki Petriego o wymiarach 100 na 15 milimetrów z pożywką E3 blue.Zagotuj roztwór zapasowy 1% nisko topnej agarozy w buforze E3 blue. Przenieś trzy mililitry roztopionej agarozy do probówki hodowlanej o wymiarach 17 na 100 milimetrów. Utrzymuj agarozę w cieple, umieszczając probówkę w kąpieli wodnej o temperaturze 42°C aż do momentu użycia.Przygotuj trikainę o stężeniu 15 mM, wyselekcjonowane embriony, agarozę niskotopliwą, E3 blue, szalkę hodowlaną o średnicy 35 mm z przeszklonym dnem oraz stereomikroskop. Następnie, używając pęsety nr 5, ostrożnie usuń choriony z trzech embrionów i umieść je w oddzielnym naczyniu w celu znieczulenia. Następnie, za pomocą pipety transferowej, dodaj trzy krople 15 mM trikainy do szalki zawierającej embriony oraz 5 mL pożywki.Do probówki z 1% roztopioną agarozą dodaj trzy do czterech kropli 15-milimolowego roztworu tricainy. Gdy embriony zostaną odpowiednio znieczulone, przenieś je do naczynia z pokrywką szklaną, używając Pipetmana P200 z odciętym jednym centymetrem końcówki pipety. Usuń nadmiar roztworu E3 blue tricaine.Powoli dodaj od 5 do 10 µL roztworu agarozy o niskiej temperaturze topnienia z trikainą na zarodki, dozując każdą kroplę oddzielnie, aby zapobiec zbliżaniu się zarodków do siebie. Następnie, używając igły 21G o długości 1,5 cala, delikatnie ustaw zarodki w agarozie w pożądanej pozycji, kierując obszar zainteresowania jak najbliżej szkiełka nakrywki w przypadku użycia mikroskopu odwróconego. Ze względu na możliwość przesunięcia się próbek, konieczne może być ponowne sprawdzenie każdego zarodka, aby upewnić się, że pozostają one w wymaganej pozycji.Czynność tę może być konieczne powtórzyć kilkukrotnie, aż do osiągnięcia optymalnej pozycji w miarę krzepnięcia agaru. Po kilku minutach, aby sprawdzić, czy żel stężał, należy za pomocą igły przerwać mały fragment agarozy. Gdy można go będzie oddzielić od kropli, należy użyć dodatkowej agarozy o niskiej temperaturze topnienia, aby uformować kopułę nad zatopionymi zarodkami, pokrywając całą szkiełko nakrywką.Podczas krzepnięcia agarozy przygotuj trzy mililitry pożywki E3 blue z pięcioma kroplami 15-milimolarnej trikainy, która zostanie naniesiona na unieruchomione embriony podczas obrazowania. Aby przeprowadzić obrazowanie konfokalne 5D żywych embrionów ryb zebrafish, uruchom oprogramowanie do obrazowania i ustaw mikroskop na obiektyw 60X o aperturze numerycznej 1.4. Nałóż olej immersyjny na obiektyw i umieść szalkę hodowlaną w uchwycie na preparaty na stole mikroskopu.Za pomocą kontrolera osi wycentruj badany embrion nad obiektywem, a następnie podnieś obiektyw, aby zbliżyć go do naczynia hodowlanego. Wlej roztwór E3 blue oraz tricaine na embriony zatopione w agarze. Następnie kliknij ikonę Eye Port, aby obejrzeć embriony przez okular.Wyłącz wybór portu okularowego (Eye Port), a następnie wybierz View, Acquisition Controls, A1 Scan Area, aby otworzyć narzędzie A1 Scan Area. Wybierz kanał GFP, uruchom skanowanie ponownie i ustaw ostrość na obszarze zainteresowania blisko szkiełka nakrywki. Zatrzymaj skanowanie, wybierz kanały GFP i mCherry oraz ustaw opcję uśredniania linii (line-averaging) na normalną.Następnie wybierz View, Acquisition Controls, ND Acquisition, aby otworzyć narzędzie A1 ND Acquisition. Rozpocznij skanowanie. Następnie, korzystając z kontrolera osi, ustaw zarodki tak, aby obszar skanowania był wypełniony w jak największym stopniu przez daną rybkę danio pręgowaną.Ustaw górną granicę stosu Z w miejscu, w którym komórki są poza zakresem ostrości, pozostawiając dodatkowe trzy mikrometry przestrzeni nad próbką, aby umożliwić wzrost i ruch komórek. Następnie ustaw dolną granicę w miejscu, w którym komórki nie są już widoczne, a rozmiar kroku interwału Z ustaw na dwa mikrometry. W przypadku eksperymentów zaprezentowanych w niniejszym materiale dostosuj moc lasera obrazującego, HV lub wzmocnienie (gain) oraz poziomy offsetu zgodnie z poniższą listą.Po ustawieniu parametrów wyłącz skanowanie, aby zapobiec niepotrzebnej ekspozycji na laser, która może spowodować fototoksyczność i fotoblaknięcie próbki. Następnie wybierz ikonę dwukrotnego uśredniania linii (2X line averaging), która zapewnia najlepszą jakość obrazu i najkrótszy czas skanowania. Wybierz odpowiedni interwał czasowy oraz czas trwania niezbędny dla eksperymentu.W przypadku podziałów komórek typu dzikiego, dwuminutowe odstępy czasowe przez okres dwóch godzin są wystarczające do wyznaczenia czasu trwania mitozy. Podziały, w których punkt kontrolny montażu wrzeciona pozostaje aktywny przez więcej niż trzydzieści minut, bardziej nadają się do interwałów czterech-pięciu minut przez cztery godziny w celu zachowania fluorescencji, co zostało tutaj zademonstrowane. Aby automatycznie zapisywać plik podczas jego pozyskiwania, zaznacz pole Zapisz do pliku i nadaj plikowi nazwę.Na koniec upewnij się, że wszystkie parametry zostały ustawione prawidłowo, a następnie kliknij Run Now. Po zakończeniu akwizycji, aby wyświetlić plik w formacie trójwymiarowym, kliknij ikonę Volume Threshold. Rysunek ten demonstruje możliwość obserwacji wielu podziałów komórkowych przy szerokim polu widzenia ogona zarodka rybki danio (zebrafish) linii AB wild-type.Podziały komórkowe oznaczono gwiazdkami. Odpowiedni film pokazano tutaj. Średnio zaobserwowano 50 dzielących się komórek w grupie AB oraz 30 dzielących się komórek u mutanta aurora B.Aby uwzględnić zmniejszoną liczbę obrazowanych komórek w mitozie w embrionie mutanta aurora B, obliczono stosunek liczby komórek w mitozie do całkowitej liczby obrazowanych komórek, co sugeruje, że w embrionach mutantów aurora B nie występuje mniejsza liczba komórek przechodzących przez mitozę, lecz raczej mniejsza całkowita liczba obrazowanych komórek. W celu ilościowego określenia czasu trwania mitozy, liczbę odstępów czasowych zajmujących jeden podział komórki pomnożono przez odstęp czasu między każdym Z-stackiem. Jak wynika z tego wykresu, średni czas podziału w typie dzikim AB wynosi 25 minut, a w przypadku mutanta aurora B 58 minut.Podobnie jak w embrionach typu dzikiego, można rozróżnić każdą fazę mitozy. Jednak w embrionach mutantów aurora B obserwuje się wady mitotyczne, obejmujące zatrzymanie mitozy i nieudaną cytokinezę, co prowadzi do powstania komórek dwojądrowych oraz następczą formację mikrojąder, co potwierdza zwiększony czas podziału zmierzony u tego mutanta. Po opanowaniu techniki, cały proces — od selekcji embrionów po ustawienie parametrów mikroskopu konfokalnego — można przeprowadzić w ciągu jednej godziny.Podczas wykonywania tej procedury ważne jest pamiętanie o kontekście realizowanego eksperymentu, szczególnie w odniesieniu do obszaru zainteresowania, czasu trwania, interwału czasowego oraz głębokości Z. Pomoże to zmaksymalizować wydajność, a także zapobiec fotoblakaniu i fototoksyczności. Po przeprowadzeniu tej procedury można zastosować inne metody, takie jak preparaty rozprzestrzeń chromozomowych, aby odpowiedzieć na dodatkowe pytania dotyczące przyczyn zaobserwowanych wad mitotycznych, lub zastosować leczenie farmakologiczne w celu określenia wpływu na przebieg, czas trwania mitozy lub losy komórki.Po opracowaniu technika ta utorowała drogę badaczom w dziedzinie biologii do badania mitozy w kontekście biologii rozwoju i biologii nowotworów z wykorzystaniem danio przełomowego. Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze rozumieć, jak osadzać zarodki danio przełomowego, rejestrować obrazy mitozy na żywo oraz analizować częstotliwość, czas trwania mitozy i los komórek. Pamiętaj, że praca z laserami o wysokiej mocy i światłem fluorescencyjnym może być szkodliwa dla oczu, dlatego podczas wykonywania tej procedury należy zawsze przestrzegać środków ostrożności, takich jak unikanie bezpośredniego kontaktu oczu z wiązką laserową.

observing-mitotic-division-and-dynamics-in-a-live-zebrafish-embryo

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Biologia rozwojowa

W tym filmie demonstrujemy metodę analizy rozwijającego się mózgu kręgowca w żywych embrionach danio pręgowanego z rozdzielczością pojedynczej komórki przy użyciu mikroskopii konfokalnej. Obejmuje ona sposób, w jaki wstrzykujemy substancje do embrionu danio pręgowanego w stadium jednej komórki, a następnie montujemy i obrazujemy rozwijający się mózg.

Obrazowanie na żywo embrionalnego mózgu rybki zebrafish przy użyciu mikroskopii konfokalnej

Niniejszy film prezentuje metodę wykorzystującą połączenie elektroporacji i mikroskopii konfokalnej do obrazowania na żywo pojedynczych komórek progenitorowych neuronów w rozwijającym się przedmózgowiu danio pręgowanego. W ten sposób można przeprowadzić analizę in vivo rozwoju komórek progenitorowych neuronów przedmózgowia na poziomie klonalnym.

Obrazowanie live w trybie time-lapse klonalnie powiązanych komórek progenitorowych neuronów w rozwijającym się przedmózgowiu danio pręgowanego

Procesy rozwojowe, takie jak proliferacja, wzorzec, różnicowanie i prowadzenie aksonów, mogą być łatwo modelowane w rdzeniu kręgowym drobnicy danio pręgowanego.  W tym artykule opisujemy procedurę montowania zarodków danio pręgowanego, która optymalizuje wizualizację tych zdarzeń.

Rozwarstwienie i boczne dopasowanie zarodków danio pręgowanego: analiza rozwoju rdzenia kręgowego

Obrazowanie dynamicznego zachowania organelli i innych struktur subkomórkowych in vivo może rzucić światło na ich funkcję w warunkach fizjologicznych i chorobowych. W tym artykule przedstawiono metody genetycznego znakowania dwóch organelli, centrosomów i mitochondriów oraz obrazowania ich dynamiki w żywych zarodkach danio pręgowanego za pomocą mikroskopii szerokokątnej i konfokalnej.

Obrazowanie struktur subkomórkowych w żywym zarodku danio pręgowanego

Tutaj prezentujemy uniwersalną metodę montażu, która pozwala na długoterminowe obrazowanie poklatkowe rozwoju tylnej części ciała żywych zarodków danio pręgowanego bez zakłócania normalnego rozwoju.

Uniwersalna metoda montażu do długoterminowego obrazowania rozwoju danio pręgowanego

Kombinacja zaawansowanych technik optycznych laserowej mikroskopii skaningowej z wzbudzeniem fluorescencji wielofotonowej o długich falach została zaimplementowana do przechwytywania wysokiej rozdzielczości, trójwymiarowego obrazowania w czasie rzeczywistym migracji grzebieni nerwowych w zarodkach zebry pręgowanego Tg(sox10:EGFP) i Tg(foxd3:GFP).

Wielofotonowe obrazowanie poklatkowe w celu wizualizacji rozwoju w czasie rzeczywistym: wizualizacja migrujących komórek grzebienia nerwowego w zarodkach danio pręgowanego

Tutaj pokazujemy proces tworzenia linii reportera napięcia elektrycznego komórkowego do wizualizacji rozwoju embrionalnego, ruchu i komórek nowotworowych ryb in vivo.

Wizualizacja komórkowej aktywności elektrycznej we wczesnych zarodkach i nowotworach danio pręgowanego

Ten protokół opisuje podejście do etykietowania in toto i wielowymiarowego obrazowania wczesnego rozwoju oczu danio pręgowanego. Opisujemy znakowanie, osadzanie i obrazowanie czterowymiarowe (4D) za pomocą laserowej skaningowej mikroskopii konfokalnej oraz rozważania dotyczące optymalizacji pozyskiwania zestawów danych do analizy mechanizmów morfogenezy panewki wzrokowej.

4-wymiarowe obrazowanie morfogenezy kubka wzrokowego danio pręgowanego

Pokazujemy metodę, która wykorzystuje szybką skaningową mikroskopię konfokalną do wykonywania na żywo obrazowania komórek mikrogleju w rozwijającym się tektum wzrokowym danio pręgowanego, umożliwiając analizę dynamiki tych komórek in vivo.

Obrazowanie na żywo i charakterystyka dynamiki mikrogleju w zarodku danio pręgowanego

Opisano strategię przygotowania próbki do obrazowania wczesnych zarodków danio pręgowanego w nienaruszonym kosmówce za pomocą mikroskopu z arkuszami świetlnymi. Analizuje różne orientacje, jakie zarodki nabywają w kosmówce na 70% etapie epibolii i pąków, a także szczegółowo opisuje strategie obrazowania w celu uzyskania rozdzielczości w skali komórkowej w całym zarodku przy użyciu systemu arkuszy świetlnych.

Obrazowanie w mikroskopii świetlnej i strategie montażu wczesnych zarodków danio pręgowanego

Poznaj metodę obserwacji mitozy w żywych zarodkach danio pręgowanego przy użyciu fluorescencyjnie znakowanych białek chromatyny i błony komórkowej. Technika ta umożliwia badanie wierności segregacji chromosomów oraz wpływu defektów mitotycznych na rozwój i powstawanie nowotworów.

Obserwacja podziału i dynamiki mitotycznej w żywym zarodku danio pręgowanego

Przeglądaj więcej filmów