Izolowanie mezangiogennych komórek progenitorowych (MPC) z ludzkiego szpiku kostnego

Ogólnym celem tej procedury jest wyizolowanie mezangiogennych komórek progenitorowych lub MPC z ludzkiego szpiku kostnego poprzez selektywne warunki hodowli. Badamy zarówno ich potencjał mezogenny, jak i angiogenny. Mezangiogenne komórki progenitorowe są identyfikowane z niskim procentem za pomocą hodowli komórkowej mesen-ki-ma-stro-mo zoptymalizowanej pod kątem zastosowań klinicznych.

Gdy FBS zostanie zastąpiony surowicą ludzką. Technika ta jest wyjątkowa: pozwala na bardzo konsekwentną izolację dużej liczby alli-polifikowanych NPC odpowiednich do kiełkowania, angiogenezy i generowania zsynchronizowanych kultur MSC. Odkryliśmy to, gdy po podróżach w trawieniu kultur MCS w surowicy talgrum niewiele komórek w kształcie jajka sadzonego pozostaje przyczepionych, ale zróżnicowanych w MC po leczeniu FPS.

Aby wyizolować ludzkie komórki jednojądrzaste szpiku kostnego lub MNC, zacznij od rozcieńczenia od pięciu do 10 mililitrów świeżego szpiku kostnego do całkowitej objętości 50 mililitrów za pomocą DPBS i wymieszaj roztwór komórkowy przez inwersję. Następnie równomiernie rozprowadź 25 mililitrów komórek do dwóch nowych 50-mililitrowych stożkowych probówek i dodaj 25 mililitrów świeżego DPBS do każdej probówki w celu drugiego wymieszania przez odwrócenie. Następnie odpocznij komórki w temperaturze pokojowej, aby umożliwić oddzielenie mineralnych fragmentów kości i tłuszczu od roztworu.

Po 10 minutach użyj pipety pastuera, aby ostrożnie usunąć pływający tłuszcz i przefiltruj zawiesiny komórek przez indywidualne filtry o średnicy 70 mikronów, nie naruszając mineralnych granulek fragmentów kości. Aby wyizolować warstwę MNC, 20-25 mililitrów rozcieńczonego szpiku kostnego na wierzchu temperatury pokojowej 1,007 grama na mililitr pożywki gradientu gęstości w każdej z dwóch 50-mililitrowych probówek i oddzielić komórki przez odwirowanie. Następnie użyj sterylnej pipety pastuer, aby zebrać białawe pierścienie komórek na powierzchniach wejściowych w nowej 50-mililitrowej probówce.

Przemyć izolowane komórki jednojądrzaste świeżą pożywką hodowlaną przez pięć minut w temperaturze 400 razy G i temperaturze pokojowej. Następnie ponownie zawiesić osad w pięciu do 10 mililitrach świeżej pożywki hodowlanej. Aby wyizolować MPC, należy zrównoważyć hydrofobowe kolby T75 z 15 mililitrami świeżej pożywki hodowlanej w temperaturze 37 stopni Celsjusza i pięcioprocentowej zawartości dwutlenku węgla.

Po 30 minutach wysiewaj się od czterech do sześciu razy od 10 do siedmiu komórek jednojądrzastych ludzkiego szpiku kostnego w kolbie przez 48 godzin inkubacji. Drugiego dnia wyrzucić pożywkę i nieprzylegające komórki z kolb i nakarmić komórki 15 mililitrami świeżej pożywki hodowlanej. Zwróć kultury do inkubatora na sześć do ośmiu dni.

Pod koniec inkubacji przemyć przylegające komórki świeżym DMEM. Następnie inkubuj komórki z dwoma mililitrami wolnego od zwierząt roztworu oddzielającego proteas przez pięć do 15 minut w temperaturze 37 stopni Celsjusza. Gdy komórki podniosą się z dna kolby, dodaj 10 mililitrów świeżej pożywki hodowlanej, aby zatrzymać reakcję i zbierz komórki przez odwirowanie, ponownie zawieszając osad w jednym do dwóch mililitrów świeżej pożywki hodowlanej.

Po przeliczeniu płytki MPC dwa razy 10 do czterech na centymetr kwadratowy komórek do kolb hodowlanych T75 poddanych hodowli tkankowej i przylegania komórek przez noc w 15 mililitrach świeżej pożywki hodowlanej w inkubatorze do hodowli komórkowych. Następnego ranka zastąp wyhodowaną pożywkę 200 mikrolitrami na centymetr kwadratowy komórki misancolmulstromul lub pożywki ekspansywnej MSC i hoduj komórki przez kolejne siedem do 10 dni. Gdy kultury osiągną konfluencję, subkultura w ilości od trzech do pięciu razy dziesięć do trzech komórek na centymetr kwadratowy, aż do osiągnięcia nowego zbiegu, pasażu drugiego w MSC, należy przeprowadzić trawienie proteas, aby zebrać komórki, jak wykazano wcześniej.

Płytka dwa razy dziesięć do czwartej komórki na centymetr kwadratowy w hodowli tkankowej traktowana sześcioma dołkami i świeżą pożywką ekspandacyjną. Po ponownym wyhodowaniu kultur do zbieżności, oznacz dwie studzienki jako brak różnicowania i odśwież podłoże ekspansywne. Oznacz dwie studzienki jako osteoblasty i zastąp pożywkę 200 mikrolitrami na centymetr kwadratowy standardowego podłoża osteogennego zaprojektowanego specjalnie do różnicowania MSC.

Następnie oznacz dwie studzienki jako miejsca adipo i zastąp pożywkę 200 mikrolitrami na centymetr kwadratowy standardowego podłoża adipo genic zaprojektowanego specjalnie do różnicowania MSC. Umieść komórki z powrotem w inkubatorze hodowli komórkowych na dwa do trzech tygodni, aż komórki się zróżnicują. Następnie przejdź do fluorescencyjnego wykrywania pozakomórkowych złogów wapnia i akumulacji śródkomórkowych kropelek lipidów.

Aby wytworzyć sferoidy 3D, umieść dużą liczbę 20-litrowych kropli świeżo wyizolowanej zawiesiny MPC o pojemności 20 mikrolitrów na wewnętrznej powierzchni pokrywy szalki Petriego. Po umieszczeniu wszystkich kropli ostrożnie umieść pokrywkę na podstawie płytki Petriego zawierającej DPBS, aby zapobiec parowaniu kropli przez zwisanie, i umieść płytkę na noc w inkubatorze do hodowli komórkowych. Następnego ranka dodaj 300 mikrolitrów allo-kwatów standardowych białek macierzy pozakomórkowej do każdej studzienki 24-dołkowej płytki hodowlanej o temperaturze 4 stopni Celsjusza i żeluj białka matrycy w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez 30 minut.

Dodaj 700 mikrolitrów standardowej pożywki do wzrostu komórek endo thelial bogatej w czynnik wzrostu endo thelial na zżelowane białka ECM. Gdy MPC zagregują się w sferoidy 3D, ostrożnie odwróć pokrywkę szalki Petriego i użyj sterylnej pipety Pasteura, aby delikatnie zebrać sferoidy. Na koniec wysadź sferoidy do dołków hodowlanych i włóż płytkę z powrotem do inkubatora.

Pod względem morficznym MPC charakteryzują się charakterystycznym kształtem jajka sadzonego z grubym obszarem rdzenia otoczonym płaskim, cienkim obwodem z wieloma filipodiami. Często obserwuje się również wydłużenie biegunowe zewnętrznej granicy komórki. Hodowla MPC w pożywce ekspansywnej MSC powoduje szybkie, ale częściowe różnicowanie się w proliferujące płaskie i wielogałęziowe komórki, przy czym nadal wykrywalne są resztkowe niezróżnicowane MPC.

Po dalszym pasażu hodowle powodują powstanie monowarstwy wykładniczo rosnących komórek podobnych do MSC. W tym procesie MPC reorganizuje swoją F-aktynę we włókna stresowe, podczas gdy ekspresja Nestin zostaje ograniczona do kilku rzadkich komórek. Przepływy świeżo wyizolowanego MPC wykazują ponad 95% komórek wykazujących ekspresję CD31 i CD45, ale pozbawionych nieprawidłowo powiązanych antygenów CD90 i CD 73.

Te najnowsze antygeny ulegają wysokiej ekspresji dopiero po całkowitym różnicowaniu się do MSC. Potwierdzając ich niewłaściwą naturę, gdy są karmione pożywką różnicującą przez co najmniej dwa tygodnie, komórki te mogą być łatwo indukowane do wybuchów kostnych, na co wskazują ich złogi wapnia lub tłuszczu tłuszczowego, co widać po nagromadzeniu kropelek lipidów. Potwierdzenie charakteru MSC wstępnie zróżnicowanych kultur komórkowych.

Typowanie MPC jest dodatkowo potwierdzone w teście kiełkowania angiogenezy, w którym komórki wykazują zdolność do inwazji myrianowego żelu białkowego macierzy pozakomórkowej ze sferoid 3D po 24 godzinach bodźca czynnika wzrostu śródbłonka naczyniowego. Po tygodniu inwazyjne komórki migrują na jeszcze większą odległość, co jest zdolnością do inwazji, która jest tracona w MSC drugiego pasażu po różnicowaniu mezangicznym. Po opanowaniu kultur MSC można je założyć w ciągu jednej godziny, jeśli odpowiednio się tym zajmiesz, zapewniając od jednego do dwóch milionów MPC w czasie krótszym niż tydzień.

Podczas próby tej procedury ważne jest, aby ocenić wydajność partii CR u ludzi przed użyciem ich w hodowli. W tej chwili nasz protokół izolacji MPC jest jedynym sposobem na uzyskanie wysoce powtarzalnej, prawie czystej kultury MC do dalszego zastosowania. Po opracowaniu technika ta utorowała drogę badaniom w dziedzinie terapii komórkowych w celu zbadania możliwości zastosowania MPC w regeneracji tkanki szkieletowej.