Techniki ewolucji wytrzymałych drożdży fermentujących pentozy do biokonwersji lignocelulozy do etanolu

Ogólnym celem tej procedury ewolucji adaptacyjnej jest uzyskanie wytrzymałych szczepów natywnych drożdży fermentujących ksylozę scheffersomyces stipitis NRRL Y-7124, które mogą szybciej fermentować cukry heksozowe i pentozowe w niedetoksykowanych hydrolizatach do ekonomicznie odzyskiwalnego etanolu. Metoda ta przemysł lignocelulozy do etanolu, zapewniając mapę drogową dla szczepów o złożonych modyfikacjach, umożliwiając fermentację cukrów w hydrolizatach zawierających inhibitory mikrobiologiczne. W tym przypadku główną zaletą ukierunkowanej ewolucji jest to, że wytrzymałe szczepy są formowane z rodzimych drożdży zdolnych do fermentacji ksylozy, eliminując potrzebę inżynierii przemysłowych szczepów saccharomyces.

Zdaliśmy sobie sprawę, że jest mało prawdopodobne, aby jakikolwiek pojedynczy szczep drożdży był odporny na różne rodzaje hydrolizatów, takie jak słoma kukurydziana poddana wstępnej obróbce AFEX lub rozcieńczona trawa rózgowa potraktowana kwasem. Zdolność Scheffersomyces stipitis do przechodzenia przez płciowy cykl rozrodczy jest korzystna dla dalszego wykorzystania w niniejszej pracy, ponieważ różne rozwinięte szczepy można połączyć w jeden, bardziej wytrzymały szczep poprzez krzyżowanie szczepów o tych różnych cechach. Procedurę zademonstrują współautorki Stephanie Thomson i Maureen Shea-Andersh, które są technikami nauk biologicznych w moim laboratorium.

Przed rozpoczęciem tej procedury wzbogacania należy przygotować wstępną hodowlę szczepu NRRL Y-7124 w kolbie o pojemności 125 mililitrów i serię rozcieńczeń enzymu scukrzanego hydrolizatu słodziaki kukurydzianej poddanego wstępnej obróbce przez ekskrzepowanie włókien amoniakalnych lub AFEX CSH. Użyj powtarzalnej pipety, aby napełnić 96-dołkową mikropłytkę 15 mikrolitrami na dołek i ośmioma dołkami na rozcieńczenie hydrolizatu. Zaszczepić kilkoma mikrolitrami kultury wstępnej na studzienkę, aby umożliwić początkową absorbancję przy 620 nanometrach lub A620 większej lub równej 0,1.

Umieść mikropłytkę w plastikowym pudełku z mokrym ręcznikiem papierowym w celu zapewnienia wilgotności i inkubuj statycznie przez 24 do 28 godzin w temperaturze 25 stopni Celsjusza. Następnie użyj spektrofotometru do odczytu mikropłytek, aby zidentyfikować kultury, które fizycznie urosły do A620 większego niż 1,0 w najbardziej skoncentrowanym rozcieńczeniu hydrolizatu. Zbierz zidentyfikowane studzienki w probówce do mikrofuge i rozprowadź na płycie napełniającej.

Przenieść od jednego do pięciu mikrolitrów z płytki napełniającej do każdej studzienki nowej serii rozcieńczeń hydrolizatu, aby uzyskać początkowy A620 większy lub równy 0,1 i inkubować płytkę jak poprzednio. Monitorować wzrost kultur na mikropłytce za pomocą spektrofotometru do odczytu mikropłytek. Regularnie przygotowuj zapasy glicerolu w kulturach adaptacyjnych.

Połącz cztery studzienki o największym stężeniu hydrolizatu skolonizowanym w kriofilecie i wymieszaj jeden do jednego z 20% sterylnym glicerolem. Zamroź komórki w temperaturze minus 80 stopni Celsjusza. Powtarzaj tę procedurę wzbogacania, aż wzrost 12%glukanu AFEX CSH będzie stale widoczny po 24 godzinach.

Aby rozpocząć tę procedurę, należy przetworzyć wybrane zapasy glicerolu w kulturach adaptacyjnych do dekstrozy peptonu słodu drożdżowego lub agaru YM. Następnie, po wzroście, użyj smug, aby zaszczepić 50 mikrolitrów 3% lub 6% glukanu AFEX CSH w każdym z trzech dołków mikropłytki. Inkubować mikropłytkę przez 24 godziny w temperaturze 25 stopni Celsjusza.

Basen replikuje skolonizowane studnie o najwyższej sile hydrolizatu z silnym wzrostem. I płytkę rozcieńczającą do agaru YM lub 6% glukanu AFEX CSH. Inkubować płytki w inkubatorze o temperaturze 25 stopni Celsjusza przez 24 do 48 godzin.

Wybrać pięć pojedynczych kolonii z płytki o najwyższym rozcieńczeniu, które wykazują wzrost do zamrożenia w postaci kultur wyjściowych glicerolu. Umieść każdą kolonię na płytce YM i inkubuj przez 24 godziny. Za pomocą sterylnej pętli przenieś rozwiniętą smugę komórek do małej objętości 10% glicerolu zmieszanego w celu zawieszenia komórek i rozprowadź do dwóch do trzech kriopilek w celu zamrożenia w temperaturze minus 80 stopni Celsjusza.

Aby przetestować izolaty w prostych hodowlach wsadowych 6%glukanu AFEX CSH, przenieś komórki z 48-godzinnych płytek z zapasami glicerolu do buforu fosforanu potasu o pH 7 w celu przygotowania zawiesin komórkowych. Po zmierzeniu gęstości optycznej zawiesiny każdej komórki, wyreguluj objętość za pomocą dodatkowego bufora, aby osiągnąć A620 równą dziesięciu. Użyj jednego mikrolitra każdej zawiesiny, aby zaszczepić każdą z czterech studzienek po 50 mikrolitrów 3% hydrolizatu glukanu do początkowego A620 0,2.

Inkubować mikropłytkę przez 24 godziny. Następnie przenieś dwie 24-godzinne studzienki mikropłytkowe, aby zaszczepić 25 mililitrowe prekultury 6% glukanu AFEX CSH o pH 5. Zamknąć kolby zamknięciami z gąbki silikonowej i inkubować przez 24 godziny w temperaturze 25 stopni Celsjusza i 150 obr./min.

Użyj 6% glukanu AFEX CSH do zaszczepienia podobnych 25-mililitrowych kultur wzrostu w dwóch egzemplarzach do początkowego A620 wynoszącego 0,1. Inkubuj kultury wzrostowe przez 24 godziny w temperaturze 25 stopni Celsjusza i 150 obr./min. Aby przetestować dioksynowy brak izolatów w kulturach okresowych o optymalnie zdefiniowanej pożywce lub ODM z mieszanymi cukrami, należy zaszczepić prekultury 75 mililitrów ODM 150 gramami na litr ksylozy w 125-mililitrowych kolbach z silikonowymi zamknięciami.

Inkubować przez 24 godziny w temperaturze 25 stopni Celsjusza i 150 obr./min. Użyj kultur wstępnych do zaszczepienia A620 0,1 podobnych zduplikowanych 75-mililitrowych kultur testowych z ODM zawierającym 75 gramów na litr glukozy i 75 gramów na litr ksylozy o pH 6,5. Wstrząsnąć kolbami w temperaturze 25 stopni Celsjusza i 150 obr./min.

24 godziny przed inokulacją ciągłej hodowli przygotować wstępną hodowlę reprezentatywnej kolonii tolerującej AFEX CSH w ODM bez etanolu w kolbie o pojemności 125 mililitrów. Użyj od pięciu do 10 mililitrów prekultury izolatu tolerancyjnego AFEX CSH, aby zaszczepić 100 mililitrów ODM w 100-mililitrowej kolbie obrotowej z płaszczem, aby uzyskać początkowy A620 0,5. Utrzymuj objętość hodowli na poziomie 25 stopni Celsjusza.

Mieszaj z prędkością 200 obr./min i wyposaż w sterylizowalną elektrodę pH, regulator pH i łaźnię wodną z kontrolowaną temperaturą. Początkowo, ponieważ wzrost komórek będzie powolny z powodu ekspozycji na etanol, należy skonfigurować pompę uruchamianą pH tak, aby gdy fermentacja kultury obniży pH do 5,4, pompa będzie podawać pH 6,3 ODM 100 gramami na litr ksylozy i 50 gramami na litr etanolu, aby zatrzymać dalsze spadki pH. Utrzymuj objętość na poziomie 100 mililitrów za pomocą pompy ściekowej stale przesuwającej powierzchnię hodowli.

Zmierz objętość zebranych ścieków i pobieraj próbki z ciągłych hodowli co 48 do 72 godzin w celu analizy stężenia żywotnych komórek, produktów i substratów, jak opisano w manuskrypcie. Regularnie oszczędzaj zapasy glicerolu poprzez izolowanie kolonii z płytek żywotności buforowanych rozcieńczeń próbek, tworzących od 30 do 100 kolonii, reprezentujących najbardziej rozpowszechnione silne kolonie w tym czasie pod względem wzbogacania. Zalej płytki pięcioma mililitrami 10% glicerolu, aby umożliwić przygotowanie zduplikowanych kriopilników.

Jeśli kultury mogą rosnąć stabilnie w określonych szybkościach większych niż 0,01 na godzinę na ksylozie w obecności więcej niż 25 gramów na litr etanolu, rozpocznij ciągłe karmienie kultur przy niskiej szybkości rozcieńczania około 0,01 na godzinę do 100 mililitrowej objętości przetrzymywania. Z biegiem czasu zwiększ ilość etanolu w paszy do 50 gramów na litr. Naświetlanie inokulantem ultrafioletem w celu wznowienia ciągłych hodowli jest opcją przyspieszenia tempa mutacji.

Uchwyć zaawansowane populacje w zapasach glicerolu. Przed wyizolowaniem kolonii pojedynczych komórek identyfikuje się populacje zapasów glicerolu z ulepszoną fermentacją ksylozy w obecności etanolu, zgodnie z opisem w protokole tekstowym. Użyj tych lepszych populacji, aby smugować płytki.

Płytki z prążkami służą do przygotowania gęstych buforowych zawiesin komórek A620 równych pięciu. Następnie zawiesiny komórkowe są używane do inokulacji prekultur w 96 płytkach głębokich. Inkubuj przez 48 godzin w temperaturze 25 stopni Celsjusza, 400 obr./min i orbicie jednego cala.

Następnie wzbogać kolonie tolerancyjne, używając każdej kultury wstępnej do zaszczepienia 16 jednomililitrowych kultur replik do początkowego A620 0,5 w roztworze hydrolizatu z trawy rózgowej poddanej wstępnej obróbce kwasem, zmieszanych jeden do jednego z ODM plus 50 gramów na litr ksylozy i wystarczającej ilości etanolu, aby zapewnić 20, 30 lub 40 gramów na litr etanolu. Inkubuj przez 48 godzin w temperaturze 25 stopni Celsjusza, 400 obr./min i orbicie jednego cala. Dla każdego innego zasobu glicerolu należy zebrać studzienki hodowlane o najwyższym stężeniu etanolu, umożliwiającym wzrost i stosowanie ksylozy.

Umieść każdą linię komórkową na agarze YM, aby uzyskać przeważające pojedyncze kolonie do zachowania w glicerolu. Wybierz 10 kolonii na linię komórkową i przenieś każdą z nich na płytkę z agarem YM w celu przygotowania bulionu glicerynowego. Po adaptacji na AFEX CSH, porównanie wydajności fermentacji w ODM między szczepem macierzystym a przystosowanymi populacjami ujawnia, że przystosowane populacje wykorzystują ksylozę bardziej efektywnie do szybszego wytwarzania etanolu w większych ilościach.

Kolonia odporna na hydrolizat została następnie opracowana w celu poprawy tolerancji etanolu poprzez ciągłą selekcję kultur na ODM zawierającym ksylozę i wysoki poziom etanolu. Wszystkie przystosowane populacje przewyższały rodzica pod względem zdolności do indukowania metabolizmu ksylozy w obecności 40 gramów na litr etanolu. Wykresy te podsumowują wydajność izolatów o najwyższej tolerancji ocenianych pod względem szybkości wchłaniania ksylozy i wydajności etanolu w stosunku do szczepu macierzystego dla każdej formuły PSGHL.

Najlepsze szczepy wybrane z pierwotnego badania przesiewowego na PSGHL bogatym w ksylozę zostały następnie przesiane na trzech kompletnych hydrolizatach, a względny wskaźnik wydajności lub RPI obliczono dla fermentacji każdego izolatu w każdym hydrolizacie. Następnie obliczono łączne ogólne wskaźniki wydajności dla każdego izolatu. Pięć izolatów, trzy, 14, 27, 28 i 33, miało ogólny RPI powyżej 60, co plasowało je jako najbardziej odporne na wszystkie zmiany warunków hydrolizatu i składników odżywczych łącznie.

Po obejrzeniu tego filmu powinieneś wiedzieć, jak rzucić wyzwanie drożdżom fermentującym ksylozę, takim jak scheffersomyces stipitis NRRL Y-7124, w ukierunkowanym procesie ewolucji, wzbogacić, wyizolować i ocenić mocniejsze pochodne, które skuteczniej fermentują zmieszane cukry w niedetoksykowanych hydrolizatach. Po opanowaniu technika ta może być stosowana z codzienną inwestycją czasu wynoszącą średnio około godziny dziennie. Znaczące zmiany w procesie ewolucji można udokumentować w ciągu zaledwie czterech miesięcy.

Próbując tej procedury, ważne jest, aby regularnie ratować rozwijające się populacje, przygotowując zapasy glicerolu do zamrożenia w temperaturze minus 80 stopni Celsjusza. Pozwala to na odbudowę populacji, okresową ocenę, izolację lub ponowne uruchomienie procesu ewolucji. Aby poradzić sobie z różnymi mutacjami, pamiętaj o regularnym badaniu przesiewowym drożdży w warunkach specyficznych dla procesu pod kątem szeregu fenotypów.

Obliczanie całkowitych, bezwymiarowych względnych wskaźników wydajności (RPI) w oparciu o parametry kinetyczne umożliwia ocenę rangi szczepu i odporności na zmiany warunków fermentacji, takich jak rodzaj hydrolizatu i suplementacja składników odżywczych. Lepsze drożdże powstające w każdej fazie procesu ewolucji są kandydatami do sekwencjonowania genomu, dzięki czemu charakter ulepszeń, takich jak tolerancja inhibitorów, jest zmniejszony, a opóźnienie dioksyczne może być zrozumiane i wykorzystane do projektowania szczepów biokatalitycznych nowej generacji.