Name: Techniki ewolucji wytrzymałych drożdży fermentujących pentozy do biokonwersji lignocelulozy do etanolu (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-10-24T13:00:00.000+00:00
Duration: 14 min 53 s
Description: Poznaj techniki ewolucji adaptacyjnej drożdży Scheffersomyces stipitis w celu zwiększenia fermentacji pentoz i heksoz z hydrolizatów lignocelulozowych do etanolu. Ta metoda umożliwia uzyskanie wytrzymałych szczepów bez konieczności inżynierii genetycznej.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Chcielibyśmy wyrazić nasze szczere podziękowania dla Drs. Kenneth Vogel, Robert Mitchell i Gautam Sarath, Grain, Forage, and Bioenergy Research Unit, Agricultural Research Service, Lincoln, NE za ich uprzejme dostarczenie proso rózgowatego do tego projektu. Dziękujemy również Departamentowi Energii Stanów Zjednoczonych za dofinansowanie dla VB za pośrednictwem grantu DOE Great Lakes Bioenergy Research Center (GLBRC) DE-FC02-07ER64494.

<ol><li>Perlack, R. D., Stokes, B. J. US Department of Energy. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aPerlack%2C+RD+%22Billion-Ton+Update%3A+Biomass+Supply+for+a+Bioenergy+and+Bioproducts+Industry%22">Billion-Ton Update: Biomass Supply for a Bioenergy and Bioproducts Industry</a>. , Department of Energy. Oak Ridge National Laboratory, Oak Ridge, TN. (2011).</li>
<li>Prior, B. A., Kilian, S. G., duPreez, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fermentation+of+D-xylose+by+the+yeasts+Candida+shehatae+and+Pichia+stipitis%5BTitle%5D)+AND+%22Process+Biochem%22%5BJournal%5D)">Fermentation of D-xylose by the yeasts Candida shehatae and Pichia stipitis.</a> Process Biochem. 24 (1), 21-32 (1989).</li>
<li>Kurtzman, C. P., Suzuki, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phylogenetic+analysis+of+ascomycete+yeasts+that+form+coenzyme+Q-9+and+the+proposal+of+the+new+genera+Babjeviella%2C+Meyerozyma%2C+Millerozyma%2C+Priceomyces+and+Scheffersomyces%5BTitle%5D)+AND+%22Mcoscience%22%5BJournal%5D)">Phylogenetic analysis of ascomycete yeasts that form coenzyme Q-9 and the proposal of the new genera Babjeviella, Meyerozyma, Millerozyma, Priceomyces and Scheffersomyces.</a> Mcoscience. 51 (1), 2-14 (2010).</li>
<li>Slininger, P. J., Bothast, R. J., Okos, M. R., Ladisch, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparative+evaluation+of+ethanol+production+by+xylose-fermenting+yeasts+presented+high+xylose+concentrations%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechnol.+Lett%22%5BJournal%5D)">Comparative evaluation of ethanol production by xylose-fermenting yeasts presented high xylose concentrations.</a> Biotechnol. Lett. 7 (6), 431-436 (1985).</li>
<li>Slininger, P. J., Bothast, R. J., Ladisch, M. R., Okos, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optimum+pH+and+temperature+conditions+for+xylose+fermentation+by+Pichia+stipitis%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechnol.+Bioeng%22%5BJournal%5D)">Optimum pH and temperature conditions for xylose fermentation by Pichia stipitis.</a> Biotechnol. Bioeng. 35 (7), 727-731 (1990).</li>
<li>Slininger, P. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stoichiometry+and+kinetics+of+xylose+fermentation+by+Pichia+stipitis%5BTitle%5D)+AND+%22Annals+NY+Acad.+Sci%22%5BJournal%5D)">Stoichiometry and kinetics of xylose fermentation by Pichia stipitis.</a> Annals NY Acad. Sci. 589, 25-40 (1990).</li>
<li>Slininger, P. J., Dien, B. S., Gorsich, S. W., Liu, Z. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nitrogen+source+and+mineral+optimization+enhance+D-xylose+conversion+to+ethanol+by+the+yeast+Pichia+stipitis+NRRL+Y-7124%5BTitle%5D)+AND+%22Appl.+Microbiol.+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Nitrogen source and mineral optimization enhance D-xylose conversion to ethanol by the yeast Pichia stipitis NRRL Y-7124.</a> Appl. Microbiol. Biotechnol. 72 (6), 1285-1296 (2006).</li>
<li>Slininger, P. J., Thompson, S. R., Weber, S., Liu, Z. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Repression+of+xylose-specific+enzymes+by+ethanol+in+Scheffersomyces+%28Pichia%29+stipitis+and+utility+of+repitching+xylose-grown+populations+to+eliminat+diauxic+lag%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechnol.+Bioeng%22%5BJournal%5D)">Repression of xylose-specific enzymes by ethanol in Scheffersomyces (Pichia) stipitis and utility of repitching xylose-grown populations to eliminat diauxic lag.</a> Biotechnol. Bioeng. 108 (8), 1801-1815 (2011).</li>
<li>Slininger, P. J., Gorsich, S. W., Liu, Z. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Culture+nutrition+and+physiology+impact+inhibitor+tolerance+of+the+yeast+Pichia+stipitis+NRRL+Y-7124%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechnol.+Bioeng%22%5BJournal%5D)">Culture nutrition and physiology impact inhibitor tolerance of the yeast Pichia stipitis NRRL Y-7124.</a> Biotechnol. Bioeng. 102 (3), 778-790 (2009).</li>
<li>Agbogbo, F. K., Coward-Kelly, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cellulosic+ethanol+production+using+the+naturally+occurring+xylose-fermenting+yeast%2C+Pichia+stipitis%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechnol.+Lett%22%5BJournal%5D)">Cellulosic ethanol production using the naturally occurring xylose-fermenting yeast, Pichia stipitis.</a> Biotechnol. Lett. 30 (9), 1515-1524 (2008).</li>
<li>Balan, V., Bals, B., Chundawat, S., Marshall, D., Dale, B. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lignocellulosic+pretreatment+using+AFEX%5BTitle%5D)+AND+%22Biofuels%3A+Methods+and+protocols%2C+Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Lignocellulosic pretreatment using AFEX.</a> Biofuels: Methods and protocols, Methods in Molecular Biology. 581, Humana Press, a part of Springer Science+Business Media, LLC. 61-77 (2009).</li>
<li>Jin, M., Gunawan, C., Uppugundla, N., Balan, V., Dale, B. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+integrated+biological+process+for+cellulosic+ethanol+production+featuring+high+ethanol+productivity%2C+enzyme+recycling%2C+and+yeast+cells+reuse%5BTitle%5D)+AND+%22Energ.+Environ.+Sci%22%5BJournal%5D)">A novel integrated biological process for cellulosic ethanol production featuring high ethanol productivity, enzyme recycling, and yeast cells reuse.</a> Energ. Environ. Sci. 5 (5), 7168-7175 (2012).</li>
<li>Nigam, J. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+xylose-fermenting+yeast+Pichia+stipitis+for+ethanol+production+through+adaptation+on+hardwood+hemicellulose+acid+prehydrolysate%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Appl.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Development of xylose-fermenting yeast Pichia stipitis for ethanol production through adaptation on hardwood hemicellulose acid prehydrolysate.</a> J. Appl. Microbiol. 90 (2), 208-215 (2001).</li>
<li>Nigam, J. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ethanol+production+from+wheat+straw+hemicellulose+hydrolysate+by+Pichia+stipitis%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Ethanol production from wheat straw hemicellulose hydrolysate by Pichia stipitis.</a> J. Biotechnol. 87 (1), 17-27 (2001).</li>
<li>Hughes, S. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Random+UV-C+mutagenesis+of+Scheffersomyces+%28formerly+Pichia%29+stipitis+NRRL+Y-7124+to+improve+anaerobic+growth+on+lignocellulosic+sugars%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Ind.+Microbiol.+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Random UV-C mutagenesis of Scheffersomyces (formerly Pichia) stipitis NRRL Y-7124 to improve anaerobic growth on lignocellulosic sugars.</a> J. Ind. Microbiol. Biotechnol. 39 (1), 163-173 (2012).</li>
<li>Bajwa, P. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mutants+of+the+pentose-fermenting+yeast+Pichia+stipitis+with+improved+tolerance+to+inhibitors+in+hardwood+spent+sulfite+liquor%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechnol.+Bioeng%22%5BJournal%5D)">Mutants of the pentose-fermenting yeast Pichia stipitis with improved tolerance to inhibitors in hardwood spent sulfite liquor.</a> Biotechnol. Bioeng. 104 (5), 892-900 (2009).</li>
<li>Bajwa, P. K., Pinel, D., Martin, V. J. J., Trevors, J. T., Lee, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Strain+improvement+of+the+pentose-fermenting+yeast+Pichia+stipitis+by+genome+shuffling%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Microbiol.+Methods%22%5BJournal%5D)">Strain improvement of the pentose-fermenting yeast Pichia stipitis by genome shuffling.</a> J. Microbiol. Methods. 81 (2), 179-186 (2010).</li>
<li>Slininger, P. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evolved+strains+of+Scheffersomyces+stipitis+achieving+high+ethanol+productivity+on+acid-+and+base-pretreated+biomass+hydrolyzate+at+high+solids+loading%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechnol.+Biofuels%22%5BJournal%5D)">Evolved strains of Scheffersomyces stipitis achieving high ethanol productivity on acid- and base-pretreated biomass hydrolyzate at high solids loading.</a> Biotechnol. Biofuels. 8:60, 1-27 (2015).</li>
<li>Jeffries, T. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genome+sequence+of+the+lignocellulosic-bioconverting+and+xylose-fermenting+yeast+Pichia+stipitis%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Genome sequence of the lignocellulosic-bioconverting and xylose-fermenting yeast Pichia stipitis.</a> Nature Biotechnol. 25 (3), 319-326 (2007).</li>
<li>Zabriski, D. W., Armiger, W. B., Phillips, D. H., Albano, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fermentation+media+formulation%5BTitle%5D)+AND+%22Trader%27s+Guide+to+Fermentation+Media+Formulation%22%5BJournal%5D)">Fermentation media formulation.</a> Trader's Guide to Fermentation Media Formulation. , 1-39 (1980).</li>
<li>Syzbalski, W., Bryson, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetic+studies+on+microbial+cross+resistance+to+toxic+agents.+I.+Cross+resistance+of+Escherichia+coli+to+fifteen+antibiotics%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Genetic studies on microbial cross resistance to toxic agents. I. Cross resistance of Escherichia coli to fifteen antibiotics.</a> J. Biotechnol. 64 (4), 489-499 (1952).</li>
<li>Klinke, H. B., Thomsen, A. B., Ahring, B. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inhibition+of+ethanol-producing+yeast+and+bacteria+by+degradation+products+produced+during+pre-treatment+of+biomass%5BTitle%5D)+AND+%22Appl.+Microbiol.+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Inhibition of ethanol-producing yeast and bacteria by degradation products produced during pre-treatment of biomass.</a> Appl. Microbiol. Biotechnol. 66, 10-26 (2004).</li>
<li>Almeida, J. R. M., Bertilsson, M., Gorwa-Grauslund, M. F., Gorsich, S., Liden, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Metabolic+effects+of+furaldehydes+and+impacts+on+biotechnological+processes%5BTitle%5D)+AND+%22Appl.+Microbiol.+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Metabolic effects of furaldehydes and impacts on biotechnological processes.</a> Appl. Microbiol. Biotechnol. 82, 625-638 (2009).</li>
<li>Allen, S. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Furfural+induces+reactive+oxygen+species+accumulation+and+cellular+damage+in+Saccharomyces+cerevisiae%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechnol.+Biofuels%22%5BJournal%5D)">Furfural induces reactive oxygen species accumulation and cellular damage in Saccharomyces cerevisiae.</a> Biotechnol. Biofuels. 3, (2010).</li>
<li>Weisburger, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mutagenic%2C+carcinogenic%2C+and+chemopreventive+effects+of+phenols+and+catechols%3A+the+underlying+mechanisms%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Symposium+Series%22%5BJournal%5D)">Mutagenic, carcinogenic, and chemopreventive effects of phenols and catechols: the underlying mechanisms.</a> ACS Symposium Series. 507, 35-47 (2009).</li>
<li>Slininger, P. J., Dien, B. S., Lomont, J. M., Bothast, R. J., Ladisch, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evaluation+of+a+kinetic+model+for+computer+simulation+of+growth+and+fermentation+by+Scheffersomyces+%28Pichia%29+stipitis+fed+D-xylose%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechnol.+Bioeng%22%5BJournal%5D)">Evaluation of a kinetic model for computer simulation of growth and fermentation by Scheffersomyces (Pichia) stipitis fed D-xylose.</a> Biotechnol. Bioeng. 111 (8), 1532-1540 (2014).</li>
<li>Wang, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparative+metabolic+profiling+revealed+limitations+in+xylose-fermenting+yeast+during+co-fermentation+of+glucose+and+xylose+in+the+presence+of+inhibitors%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechnol.+Bioeng%22%5BJournal%5D)">Comparative metabolic profiling revealed limitations in xylose-fermenting yeast during co-fermentation of glucose and xylose in the presence of inhibitors.</a> Biotechnol. Bioeng. 111 (1), 152-164 (2014).</li>
<li>Slininger, P. J., Branstrator, L. E., Bothast, R. J., Okos, M. R., Ladisch, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Growth%2C+death%2C+and+oxygen+uptake+kinetics+of+Pichia+stipitis+on+xylose%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechnol.+Bioeng%22%5BJournal%5D)">Growth, death, and oxygen uptake kinetics of Pichia stipitis on xylose.</a> Biotechnol. Bioeng. 37 (10), 973-980 (1991).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

O powodzeniu procesu ewolucji zadecydowało kilka etapów. Po pierwsze, kluczowe jest wybranie odpowiednich nacisków selekcyjnych, aby kierować ewolucją populacji w kierunku pożądanych fenotypów, które są potrzebne do udanego zastosowania. Do rozwoju S. stipitis wybrano następujące selektywne naprężenia i zastosowano je w odpowiednim czasie, aby ukierunkować wzbogacenie w pożądane fenotypy: zwiększenie mocy 12% glukanu AFEX CSH (który wymusza wzrost i fermentację różnych cukrów w obecności kwasu octowego i niskieg...

Szacuje się, że rocznie 1,3 miliarda ton suchej biomasy lignocelulozowej mogłoby wesprzeć produkcję etanolu i pozwolić Stanom Zjednoczonym na zmniejszenie zużycia ropy naftowej o 30%. 1 Chociaż w wyniku hydrolizy biomasy roślinnej powstają mieszaniny cukrów bogate w glukozę i ksylozę, inhibitory fermentacji są wytwarzane przez chemiczną obróbkę wstępną niezbędną do rozbicia hemicelulozy i wystawienia celulozy na atak enzymatyczny. Uważa się, że kwas octowy, furfural i hydroksymetylofurfural (HMF) są kluczowymi składnikami spośród wielu inhibitorów, które powstają podczas wstępnego leczenia. Aby posunąć naprzód przemysł etanolu lignocelulozowego, potrzebne są badania i procedury umożliwiające ewolucję szczepów drożdży zdolnych do przetrwania i wydajnego funkcjonowania w celu wykorzystania zarówno cukrów heksozowych, jak i pentozowych w obecności takich związków hamujących. Istotną dodatkową słabością tradycyjnych przemysłowych szczepów drożdży, takich jak Saccharomyces cerevisiae, jest brak możliwości efektywnej fermentacji ksylozy dostępnej w hydrolizatach biomasy roślinnej.
Szczep typu Pichia stipitis NRRL Y-7124 (CBS 5773), ostatnio przemianowany na Scheffersomyces stipitis, to rodzime drożdże fermentujące pentozowo, które są dobrze znane z fermentacji ksylozy do etanolu. 2,3 Ewolucja szczepu NRRL Y-7124 była kontynuowana w tym miejscu, ponieważ udokumentowano, że ma on największy potencjał rodzimych szczepów drożdży do akumulacji ekonomicznie odzyskiwalnego etanolu w ilości przekraczającej 40 g/l z niewielką ilością produktu ubocznego ksylitolu. 4,5,6 W optymalnym podłożu szczep S. stipitis NRRL Y-7124 wytwarza 70 g/l etanolu w ciągu 40 godzin (1,75 g/l/h) z wydajnością 0,41 ± 0,06 g/g w hodowlach o dużej gęstości komórek (6 g/l komórek). 7,8 Odnotowano również oporność na inhibitory fermentacji, etanol, furfural i HMF,9 a S. stipitis został sklasyfikowany jako jedne z najbardziej obiecujących rodzimych drożdży fermentujących pentozę dostępnych do produkcji etanolu na skalę komercyjną z lignocelulozy. 10 Naszym celem było zastosowanie różnorodnych, nieodtrutych hydrolizatów lignocelulozowych i nacisków selekcyjnych etanolu, aby wymusić ewolucję w kierunku bardziej wytrzymałej pochodnej szczepu NRRL Y-7124 nadającej się do zastosowań przemysłowych. Kluczowymi z poszukiwanych ulepszeń były szybsze tempo wchłaniania cukru w skoncentrowanych hydrolizatach, zmniejszona diauxy w celu bardziej efektywnego wykorzystania mieszanych cukrów oraz wyższa tolerancja etanolu i inhibitorów. Zastosowanie S. stipitis do nieodtrutych hydrolizatów było kluczowym celem badań mających na celu wyeliminowanie dodatkowych kosztów operacyjnych związanych z procesami detoksykacji hydrolizatów, takimi jak nadmierne wapnowanie.
Do ewolucji sił zastosowano dwa obiecujące hydrolizaty przemysłowe: enzymatyczny hydrolizat słodziany amoniaku wstępnie przetworzony (AFEX CSH) oraz rozcieńczony hydrolizat trawy rózgowej (PSGHL) poddany wstępnej obróbce kwasem. 11,12 Technologia obróbki wstępnej AFEX jest opracowywana w celu zminimalizowania produkcji inhibitorów fermentacji, podczas gdy obróbka wstępna rozcieńczonym kwasem stanowi obecnie najtańszą technologię najczęściej praktykowaną w celu wystawienia biomasy celulozowej do scukrzania enzymatycznego. PSGHL można oddzielić od celulozy pozostałej po obróbce wstępnej i jest charakterystycznie bogaty w ksylozę z hydrolizowanej hemicelulozy, ale ma niską zawartość glukozy. Składy AFEX, CSH i PSGHL różnią się od siebie kluczowymi aspektami, które zostały wykorzystane do zarządzania procesem ewolucji. AFEX CSH ma niższą zawartość aldehydów furanowych i inhibitorów kwasu octowego, ale wyższą zawartość aminokwasów i źródeł azotu amoniakalnego w porównaniu z PSGHL (Tabela 1). PSGHL stanowi dodatkowe wyzwanie polegające na tym, że ksyloza jest dominującym dostępnym cukrem. W związku z tym PSGHL jest odpowiedni do specyficznego wzbogacania w celu poprawy wykorzystania ksylozy w hydrolizatach, co jest słabością uniemożliwiającą komercyjne wykorzystanie dostępnych drożdży. Nawet wśród rodzimych drożdży fermentujących pentozę poleganie na nieoptymalnym cukrze ksylozie w celu wspomagania wzrostu i naprawy komórek staje się jeszcze trudniejsze w hydrolizatach z różnych powodów: niedoborów składników odżywczych, inhibitorów powodujących rozległe uszkodzenia integralności strukturalnej komórek oraz zakłóceń metabolizmu spowodowanych brakiem równowagi redoks. 9 Suplementacja azotem, zwłaszcza w postaci aminokwasów, może stanowić znaczny koszt operacyjny fermentacji. Wpływ suplementacji azotem na badania przesiewowe i klasyfikację izolatów badano za pomocą hydrolizatów proso rózgowatych.
Ulepszone osobniki zostały wzbogacone w ewoluującej populacji, korzystając z wielokrotnych nacisków selekcyjnych zależnych od naturalnej różnorodności genetycznej populacji S. stipitis i mutacji wywołanych ekspozycją na dwa różne hydrolizaty, etanol lub promieniowanie UV. Naciski selekcyjne zastosowano równolegle i szeregowo, aby zbadać postęp ewolucji S. stipitis w kierunku pożądanych pochodnych zdolnych do efektywnego wzrostu i fermentacji w hydrolizatach (ryc. 1). Powtarzające się hodowle populacji funkcjonalnych w coraz trudniejszych hydrolizatach przeprowadzono na mikropłytkach wykorzystujących serię rozcieńczeń 12% glukanu AFEX CSH lub PGSHL przygotowanych przy 20% obciążeniu ciałami stałymi. Zastosowanie wzrostu ksylozy w hodowli ciągłej pod wpływem etanolu jeszcze bardziej poprawiło populacje przystosowane do AFEX CSH poprzez wzbogacenie o fenotypy wykazujące mniejszą podatność na represję etanolu przy wykorzystaniu ksylozy. Ta ostatnia cecha została niedawno wykazana jako problematyczna dla wykorzystania pentozy przez szczep NRRL Y-7124 po fermentacji glukozy. 8 Następnie zbadano wzbogacanie PSGHL w celu poszerzenia funkcjonalności hydrolizatu.
Przypuszczalne ulepszone pochodne S. stipitis NRRL Y-7124 zostały wyizolowane z każdej fazy procesu ewolucji, stosując ukierunkowane wzbogacanie w warunkach stresu i rozcieńczanie posiewu w celu wybrania kolonii z najbardziej rozpowszechnionych populacji. Bezwymiarowe względne wskaźniki wydajności (RPI) wykorzystano do uszeregowania szczepów na podstawie ogólnej wydajności, przy czym zachowanie kinetyczne oceniano na różnych typach hydrolizatów i zastosowanych suplementach odżywczych. Chociaż sukcesy różnych procedur adaptacyjnych mających na celu poprawę funkcjonalności S. stipitis w hydrolizatach lignocelulozowych zostały już wcześniej udokumentowane, szczepy wykazujące ekonomiczną produkcję etanolu na niedetoksykowanych hydrolizatach nie zostały wcześniej zgłoszone. 13-17 Korzystając z procedur ewolucji, które zostaną zobrazowane bardziej szczegółowo tutaj, Slininger i wsp.18 opracowano szczepy, które są znacznie ulepszone w stosunku do szczepu macierzystego NRRL Y-7124 i są w stanie wytwarzać >40 g/l etanolu w AFEX CSH i enzymatyczny scukrzony hydrolizat proso rózgowatych rózg rózgowatych (SGH) odpowiednio uzupełniony źródłami azotu. Te nowe szczepy są w przyszłości interesujące dla rozwijającego się przemysłu lignocelulozy do etanolu oraz jako przedmiot dodatkowych badań genomicznych opartych na wcześniej zsekwencjonowanych szczepach NRRL Y-11545. 19 Badanie genomiczne najważniejszych szczepów wytworzonych w różnych fazach ewolucji, przedstawione na rysunku 1, wyjaśniłoby historię zmian genetycznych, które wystąpiły podczas rozwoju, jako wstęp do dalszych badań nad ulepszaniem szczepów.

<table><tbody><tr><td>Cellic Ctec, zawiera ksylanazę (endo-1,4-)</td><td>Novozymes</td><td>Brak numeru produktu</td><td>www.novozymes.com, 1-919-494-3000</td></tr><tr><td>Cellic Htec, zawiera celulazę i ksylalanazę</td><td>Novozymes</td><td>Brak numeru produktu</td><td>www.novozymes.com, 1-919-494-3000</td></tr><tr><td>Prażona mąka Nutrisoy</td><td>Archer Daniels Midland Co. (ADM)</td><td>63160</td><td>ADM, 4666 Faries Parkway, Decatur, IL&nbsp; 1800-37-5843</td></tr><tr><td>Pluronic F-68 (środek powierzchniowo czynny)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P1300</td><td>Sigma-Aldrich</td></tr><tr><td>Difco Test witaminowy Casaminokwasy</td><td>Becton Dickinson and Company</td><td>228830</td><td>wielu dostawców: np. , Fisher Scientific, VWR, Daigger</td></tr><tr><td>D,L-tryptofan&nbsp;</td><td>Wielu dostawców Sigma-Aldrich</td><td>T3300</td><td>: np. , Fisher Scientific, VWR, Daigger</td></tr><tr><td>L-cysteina&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C7352</td><td>wielu dostawców: e.g., Fisher Scientific, Sigma-Aldrich</td></tr><tr><td>Bacto</td><td>Agar Becton Dickinson and Company</td><td>214010</td><td>wielu dostawców: e.g., Fisher Scientific, VWR, Daigger</td></tr><tr><td>Bacto Malt Extract</td><td>Becton Dickinson and Company</td><td>218630</td><td>wielu dostawców: e.g., Fisher Scientific, VWR, Daigger</td></tr><tr><td>Ekstrakt z drożdży Bacto</td><td>Becton Dickinson and Company</td><td>212750</td><td>wielu dostawców: np. , Fisher Scientific, VWR, Daigger</td></tr><tr><td>Pepton Type IV z soi</td><td>Fluka</td><td>P0521-500g</td><td>wielu dostawców: np. , Fisher Scientific, VWR, Daigger</td></tr><tr><td>Adenine, >99% proszek</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A8626</td><td>CAS 73-24-5. Przydałyby się inne marki. Wielu dostawców: np. , Sigma-Aldrich, Acros Organics, MP Biomedicals LLC</td></tr><tr><td>Cytosine, >99%</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C3506</td><td>CAS 71-30-7. Przydałyby się inne marki. Wielu dostawców: np. , Sigma-Aldrich, Acros Organics, MP Biomedicals LLC</td></tr><tr><td>Guanina, SigmaUltra</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G6779</td><td>CAS 73-40-5. Przydałyby się inne marki. Wielu dostawców: np. , Sigma-Aldrich, Acros Organics, MP Biomedicals LLC</td></tr><tr><td>Thymine, 99%</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T0376</td><td>CAS 65-71-4. Przydałyby się inne marki. Wielu dostawców: np. , Sigma-Aldrich, Acros Organics, MP Biomedicals LLC</td></tr><tr><td>Uracil, 99%</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>U0750</td><td>CAS 66-22-8. Przydałyby się inne marki. Wielu dostawców: np. , Sigma-Aldrich, Acros Organics, MP Biomedicals LLC</td></tr><tr><td>Dekstroza (D-glukoza), Bezwodny, Certyfikowany ACS</td><td>Fisher Chemical</td><td>D16-500</td><td>CAS 50-99-7. Przydałyby się inne marki. Wielu dostawców: np. , Acros Organics, Fisher Scientific, MP Biomedicals, Sigma-Aldrich</td></tr><tr><td>D-Xylose, test >99%</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>X1500</td><td>CAS 58-86-6. Przydałyby się inne marki. Wielu dostawców: np. , Acros Organics, Fisher Scientific, MP Biomedicals, Sigma-Aldrich</td></tr><tr><td>96-well, płaskie płyty</td><td>Becton Dickinson Falcon</td><td>351172</td><td>wielu dostawców: np. , Thermo-Fisher, VWR, Daigger</td></tr><tr><td>Wypall L40 Wiper</td><td>Kimberly-Clark</td><td></td><td>ręcznik w pudełkach na mikropłytki do wchłaniania wody do nawilżania; wielu dostawców np. , Thermo-Fisher, uline,</td></tr><tr><td>kolba pyreksowa Daigger Corning, 125 ml, wąski otwór (korek #5)</td><td>Corning Life Science Glass</td><td>4980-125</td><td>wielu dostawców: np. , Thermo-Fisher, VWR,</td></tr><tr><td>wytrząsarka/inkubator Daigger Innova 42R, obrót o 2,5 cm (1")</td><td>New Brunswick Scientific (1-800-631-5417)</td><td>M1335-0016</td><td>wielu dostawców: np. , Eppendorf, Thermo-Fisher. Można użyć innych wytrząsarek/inkubatorów o skoku 2,5 cm (1").</td></tr><tr><td>Duetz Zacisk pokrywy do 4 płytek głębinowych MTP</td><td>Applikon Biotechnology</td><td>Z365001700</td><td>applikon-biotechnology.com (USA), 1-650-578-1396</td></tr><tr><td>Pokrowiec warstwowy Duetz System na 96 płytek głębinowych</td><td>Applikon Biotechnology</td><td>Z365001296</td><td>applikon-biotechnology.com (USA), 1-650-578-1396</td></tr><tr><td>Uszczelka silikonowa Duetz System (0,8 mm niski parownik) do pokrywy płytki głębinowej</td><td>96 Applikon Biotechnology</td><td>V0W1040027</td><td>applikon-biotechnology.com (Stany Zjednoczone), 1-650-578-1396</td></tr><tr><td>Niebieska warstwa z mikrofibry do pokrowca kanapkowego systemu Duetz</td><td>Applikon Biotechnology</td><td>V0W1040001</td><td>applikon-biotechnology.com (USA), 1-650-578-1396</td></tr><tr><td>96 dołków, 2 ml kwadratowe płytki dolne w kształcie piramidy, naturalny popypropylen</td><td>Applikon Biotechnology</td><td>ZC3DXP0240</td><td>applikon-biotechnology.com (USA), 1-650-578-1396</td></tr><tr><td>Zamknięcia z gąbki silikonowej Bellco 32 mm, opakowanie 25 sztuk do kolb 125 ml</td><td>Bellco</td><td>1924-00032</td><td>Thomas Scientific, ich numer katalogowy to 1203K27</td></tr><tr><td>Bellco Spinner Flask, 1968-Szklana kopuła, typ kołnierza uszczelnianego, objętość robocza 100 ml. Ten projekt nie był już produkowany.</td><td>Bellco</td><td>1968-00100 (oryginał Kat. Nie.)</td><td>Naczynia z płaszczem mają dolne porty wlotowe i wylotowe do kontroli temperatury z obiegową łaźnią wodną. Zbiorniki mają średnicę zewnętrzną 75 mm i wysokość 200 mm. Istnieją cztery boczne porty w ~45&#176; kątowniki i jeden górny port. Otwory na porty odpowiedni rozmiar dla korków neoprenowych w rozmiarze 0 (średnice wewnętrzne 21-22 mm na portach).</td></tr><tr><td>Suszarka na podczerwień Mathis Labomat</td><td>MathisAg</td><td>Typ-NBR BFA12 215307</td><td>Werner Mathis U.S.A. Inc. usa@mathisag.com, 704-786-6157</td></tr><tr><td>Dwukanałowy analizator biochemiczny</td><td>YSI Life Sciences</td><td>2900D-UP</td><td>www.ysi.com, zrobotyzowany system do szybkiego oznaczania cukrów w formacie 96-dołkowej mikropłytki</td></tr><tr><td>Spektrofotometr MicroPlate PowerWave XS</td><td>Bio-Tek Instruments, Inc</td><td>MQX200R</td><td><a href="http://www.biotek.com/">www.biotek.com</a></td></tr></tbody></table>

techniki ewolucji wytrzymałych drożdży fermentujących pentozy do biokonwersji lignocelulozy do etanolu

Techniques for the Evolution of Robust Pentose-fermenting Yeast for Bioconversion of Lignocellulose to Ethanol

Biomasa lignocelulozowa jest obfitym, odnawialnym surowcem przydatnym do produkcji etanolu klasy paliwowej i innych bioproduktów. Procesy obróbki wstępnej i scukrzania enzymatycznego uwalniają cukry, które mogą być fermentowane przez drożdże. Tradycyjne drożdże przemysłowe nie fermentują ksylozy (stanowiącej do 40% cukrów roślinnych) i nie są w stanie funkcjonować w skoncentrowanych hydrolizatach. Skoncentrowane hydrolizaty są potrzebne do ekonomicznego odzyskiwania etanolu, ale są one obciążone toksycznymi produktami ubocznymi powstającymi podczas obróbki wstępnej. Chociaż metody detoksykacji mogą sprawić, że hydrolizaty będą fermentować, są kosztowne i generują zobowiązania z tytułu utylizacji odpadów. W tym miejscu opisano i zademonstrowano techniki ewolucji adaptacyjnej i izolacji, aby uzyskać pochodne rodzimego szczepu Scheffersomyces stipitis NRRL Y-7124, które są w stanie skutecznie przekształcać hydrolizaty w ekonomicznie odzyskiwalny etanol pomimo niekorzystnych warunków hodowli. Ulepszone osobniki są wzbogacane w ewoluującej populacji przy użyciu wielokrotnych nacisków selekcyjnych zależnych od naturalnej różnorodności genetycznej populacji S. stipitis i mutacji wywołanych ekspozycją na dwa różne hydrolizaty, etanol lub promieniowanie UV. Kultury w końcowej ewolucji są rozcieńczane w celu zebrania dominujących izolatów, podczas gdy populacje pośrednie, zamrożone w glicerolu na różnych etapach ewolucji, są wzbogacane na selektywnych podłożach przy użyciu odpowiednich gradientów naprężeń w celu odzyskania najbardziej obiecujących izolatów poprzez rozcieńczanie. Izolaty są poddawane badaniom przesiewowym na różnych typach hydrolizatów i klasyfikowane przy użyciu nowatorskiej procedury obejmującej bezwymiarowe przemiany wskaźnika względnej wydajności (RPI) szybkości wchłaniania ksylozy i danych dotyczących uzysku etanolu. Korzystając z parametru statystycznego RPI, oblicza się ogólną względną średnią wydajności w celu uszeregowania izolatów na podstawie wielu czynników, w tym warunków hodowli (różniących się składnikami odżywczymi i inhibitorami) oraz cech kinetycznych. Dzięki zastosowaniu tych technik, pochodne szczepu rodzicielskiego miały następujące ulepszone cechy w scukrzanych enzymach hydrolizatach o pH 5-6: zmniejszone początkowe opóźnienie fazy poprzedzającej wzrost, zmniejszone opóźnienie diauxic podczas przejścia glukoza-ksyloza, znacznie zwiększone tempo fermentacji, lepsza tolerancja etanolu i akumulacja do 40 g / l.

S. stipitis ewoluował przy użyciu kombinacji trzech kultur selekcyjnych, które obejmowały AFEX CSH, PSGHL oraz kulturę ciągłą zasilaną ksylozą i poddaną stresowi etanolowemu. Rycina 1 przedstawia schemat przeprowadzonych eksperymentów ewolucyjnych wraz z izolatami, które wykazały najwyższą ogólną efektywność lub najwyższą efektywność na jednym z badanych hydrolizatów. Tabela 3 zawiera numery akcesyjne NRRL tych lepszych izolatów i podsumowuje stresy adaptacyjne zastosowane w pro...

Techniki adaptacyjnej ewolucji i izolacji są opisane i zademonstrowane, aby uzyskać pochodne szczepu Scheffersomyces stipitis NRRL Y-7124, które są w stanie szybko zużywać mieszaninę cukrów heksozowych i pentozowych w enzymatycznych scukrzanych niedetoksykowanych hydrolizatach i gromadzić ponad 40 g/L etanolu.

Techniki ewolucji wytrzymałych drożdży fermentujących pentozy do biokonwersji lignocelulozy do etanolu

Lignocellulosic biomass is an abundant, renewable feedstock useful for production of fuel-grade ethanol and other bio-products. Pretreatment and enzyme ...

Ogólnym celem tej procedury ewolucji adaptacyjnej jest uzyskanie wytrzymałych szczepów rodzimego fermentującego ksylozę drożdży scheffersomyces stipitis NRRL Y-7124, które potrafią szybciej fermentować cukry heksozy i pentozy w niedeotoksykowanych hydrolizatach do ekonomicznie odzyskiwalnego etanolu. Metoda ta posuwa naprzód przemysł przetwarzania lignocelulozy na etanol, dostarczając schematu otrzymywania szczepów o złożonych modyfikacjach, umożliwiających fermentację cukrów w hydrolizatach zawierających inhibitory drobnoustrojowe. W tym przypadku główną zaletą ewolucji celowanej jest to, że wytrzymałe szczepy są kształtowane z rodzimych drożdży zdolnych do fermentacji ksylozy, co eliminuje konieczność modyfikowania przemysłowych szczepów saccharomyces.Uznano, że mało prawdopodobne jest, aby pojedynczy szczep drożdży był odporny na różne rodzaje hydrolizatów, takie jak zdrawo corn stover poddane obróbce AFEX lub switchgrass poddany obróbce kwasem rozcieńczonym. Zdolność *Scheffersomyces stipitis* do przechodzenia cyklu rozmnażania płciowego jest korzystna dla dalszego wykorzystania w niniejszej pracy, ponieważ różne opracowane szczepy mogą zostać połączone w jeden, bardziej odporny szczep poprzez krzyżowanie szczepów posiadających te różnorodne cechy. Procedurę zaprezentują współautorzy, Stephanie Thomson i Maureen Shea-Andersh, które są technikami nauk biologicznych w moim laboratorium.Przed rozpoczęciem tej procedury wzbogacania należy przygotować prekulturę szczepu NRRL Y-7124 w kolbie o pojemności 125 ml oraz szereg rozcieńczeń hydrolizatu słomy kukurydzianej poddanej wstępnej obróbce AFEX i sacharyfikacji enzymatycznej (AFEX CSH). Używając pipety wielokanałowej, należy napełnić mikropłytkę 96-dołkową, dozując 15 µL na dołek, po osiem dołków na każde rozcieńczenie hydrolizatu. Następnie należy zaszczepić każdy dołek kilkoma mikrolitrami prekultury, aby uzyskać początkową absorbancję przy 620 nm (A620) większą lub równą 0,1.Umieść mikropłytkę w plastikowym pudełku z wilgotnym ręcznikiem papierowym w celu zapewnienia wilgotności i inkubuj statycznie przez 24 do 28 godzin w temperaturze 25 °C. Następnie użyj spektrofotometru do odczytu mikropłytek, aby zidentyfikować hodowle, które fizycznie urosły do A620 większej niż 1,0 w najbardziej skoncentrowanym rozcieńczeniu hydrolizatu. Połącz zawartość zidentyfikowanych studzienek w probówce do mikrowirówki i przenieś do płytki do napełniania.Przenieś od jednego do pięciu mikrolitrów z płytki wypełniającej do każdej studzienki nowej serii rozcieńczeń hydrolizatu, aby uzyskać początkową wartość A620 większą lub równą 0,1, a następnie inkubuj płytkę w ten sam sposób co poprzednio. Monitoruj wzrost kultur w mikropłytce za pomocą spektrofotometru do odczytu mikropłytek. Regularnie przygotowuj zapasy glicerolowe kultur adaptacyjnych.Połącz zawartość czterech studzienek z największym stężeniem hydrolizatu, w których nastąpiła kolonizacja, w probówce typu cryofile i wymieszaj w stosunku jeden do jednego z 20% sterylnym glicerolem. Zamroź komórki w temperaturze minus 80 °C. Powtarzaj tę procedurę wzbogacania, aż wzrost w 12% glucan AFEX CSH będzie stale widoczny po 24 godzinach.Aby rozpocząć tę procedurę, należy wykonać posiewy wybranych stoków glicerolowych kultur adaptowanych na agar YM (yeast malt peptone dextrose). Po wzroście należy wykorzystać kolonie z posiewów do zaszczepienia 50 µL 3% lub 6% glucan AFEX CSH w każdym z trzech dołków mikropłytki. Mikropłytkę należy inkubować przez 24 godziny w temperaturze 25 °C.Złącz powtórzenia z kolonizowanych studni przy najwyższym stężeniu hydrolizatu wykazujących silny wzrost. Następnie wykonaj posiewy rozcieńczalnikowe na agar YM lub 6% glucan AFEX CSH. Inkubuj płytki w inkubatorze w temperaturze 25 °C przez 24 do 48 godzin.Wybierz pięć pojedynczych kolonii z płytki o najwyższym rozcieńczeniu wykazującej wzrost, aby zamrozić je jako kultury zapasowe w glicerolu. Przeznacz każdą kolonię na płytkę YM i inkubuj przez 24 godziny. Za pomocą sterylnej pętli przenieś rozwiniętą smugę komórek do małej objętości 10% glicerolu, wymieszaj w celu zawieszenia komórek, a następnie rozdziel do dwóch lub trzech krioprobek w celu zamrożenia w temperaturze -80 °C.Aby przetestować izolaty w prostych hodowlach okresowych CSH w 6% glucanie AFEX, przenieś komórki z 48-godzinnych płytek z posiewami z banków glicerolowych do buforu fosforanowego potasu o pH 7 w celu przygotowania zawiesin komórkowych. Po zmierzeniu gęstości optycznej każdej zawiesiny komórkowej, dostosuj objętość za pomocą dodatkowego buforu, aby osiągnąć A620 równą dziesięciu. Użyj jednego mikrolitra każdej zawiesiny do inokulacji czterech studzienek zawierających po 50 mikrolitrów 3% hydrolizatu glucanu, aby uzyskać początkowe A620 na poziomie 0,2.Inkubuj mikropłytkę przez 24 godziny. Następnie przenieś zawartość dwóch studzienek mikropłytki po 24 godzinach inkubacji w celu zaszczepienia 25 mililitrów prekultur 6%glucan AFEX CSH przy pH 5. Zamknij kolby zatyczkami z gąbki silikonowej i inkubuj przez 24 godziny w temperaturze 25 stopni Celsjusza przy 150 RPM.Wykorzystaj precultury 6% glukanu AFEX CSH do zaszczepienia analogicznych kultur wzrostowych o objętości 25 mililitrów w dwóch powtórzeniach, do początkowej wartości A620 równej 0,1. Inkubuj kultury wzrostowe przez 24 godziny w temperaturze 25 stopni Celsjusza przy 150 RPM. Aby przetestować brak izolatów dioksycznych w kulturach okresowych w optymalnej pożywce zdefiniowanej, ODM, z mieszanymi cukrami, zaszczep precultury 75 mililitrów ODM z 150 gramami na litr ksylozy w kolbach o pojemności 125 mililitrów z zamknięciem z gąbki silikonowej.Inkubować przez 24 godziny w temperaturze 25 °C przy 150 RPM. Wykorzystać prekultury do zaszczepienia dwóch analogicznych kultur testowych o objętości 75 ml do A620 równego 0,1 w podłożu ODM zawierającym 75 g/L glukozy i 75 g/L ksylozy przy pH 6,5. Kolby inkubować w wytrząsaniu w temperaturze 25 °C przy 150 RPM.Na 24 godziny przed zaszczepieniem hodowli ciągłej, przygotuj precivulaturę reprezentatywnej kolonii odpornej na AFEX CSH w medium ODM bez etanolu w kolbie o pojemności 125 ml. Użyj od 5 do 10 ml precivulaturę izolatu odpornego na AFEX CSH, aby zaszczepić 100 ml medium ODM w płaszczowej kolbie spinnerze o pojemności 100 ml, aby uzyskać początkową wartość A620 równą 0,5. Utrzymuj objętość hodowli w temperaturze 25 °C.Mieszaj roztwór z prędkością 200 RPM, wyposażając układ w sterylizowalną elektrodę pH, kontroler pH oraz cyrkulacyjną kąpiel wodną z regulacją temperatury. Początkowo, ze względu na powolny wzrost komórek wynikający z ekspozycji na etanol, skonfiguruj pompę sterowaną pH w taki sposób, aby w momencie, gdy fermentacja hodowli obniży pH do wartości 5,4, pompa dozowała ODM o pH 6,3 zawierające 100 g/L ksylozy i 50 g/L etanolu, aby zatrzymać dalszy spadek pH. Utrzymuj objętość na poziomie 100 ml, stosując pompę odpływową do ciągłego usuwania warstwy wierzchniej hodowli.Zmierzyć objętość zebranego odpływu i pobierać próbki z kultur ciągłych co 48 do 72 godzin w celu analizy stężenia żywych komórek, produktów i substratów, zgodnie z opisem w manuskrypcie. Regularnie przygotowywać zapasy w glicerolu poprzez izolację kolonii z płytek przeznaczonych do oceny żywotności rozcieńczonych próbek w buforze, na których wyrosło od 30 do 100 kolonii, reprezentujących w danym czasie najliczniejsze i najodporniejsze kolonie w procesie wzbogacania. Zalać płytki pięcioma mililitrami 10% glicerolu, aby umożliwić przygotowanie podwójnych kriopróbek.Jeśli kultury mogą rosnąć stabilnie przy określonych szybkościach przekraczających 0,01 na godzinę na ksylozie w obecności więcej niż 25 gramów na litr etanolu, należy rozpocząć zasilanie kultury ciągłej przy niskiej szybkości rozcieńczania wynoszącej około 0,01 na godzinę do objętości roboczej 100 mililitrów. Z czasem należy zwiększać zawartość etanolu w pożywce do poziomu 50 gramów na litr. Opcją przyspieszającą tempo mutacji przy restartowaniu kultur ciągłych jest naświetlanie inokulum promieniowaniem ultrafioletowym.Przechowywanie wyselekcjonowanych populacji w stokach glicerolowych. Przed izolacją pojedynczych kolonii komórkowych, populacje w stokach glicerolowych wykazujące poprawioną fermentację ksylozy w obecności etanolu są identyfikowane zgodnie z opisem w protokole tekstowym. Wykorzystaj te lepsze populacje do wysiewu na płytki.Płytki z posiewem kreskowym służą do przygotowania gęstych buforowanych zawiesin komórkowych o wartości A620 równej pięć. Następnie zawiesiny komórkowe są wykorzystywane do szczepienia prekultur w 96-dołkowych płytkach głębokich. Inkubować przez 48 godzin w temperaturze 25 °C, przy 400 RPM i orbicie wynoszącej jeden cal.Następnie wzbogacić kolonie tolerancyjne, wykorzystując każdą prekulturę do zaszczepienia 16 powtórznych kultur o objętości jednego mililitra do początkowego A620 wynoszącego 0,5 w kwasowo poddanym wstępnej obróbce ługu z hydrolizatu trawy przełącznikowej, zmieszanego w stosunku jeden do jednego z ODM oraz 50 g/L ksylozy i wystarczającą ilością etanolu, aby zapewnić wyzwanie etanolowe na poziomie 20, 30 lub 40 g/L. Inkubować przez 48 godzin w temperaturze 25 °C, przy 400 RPM i orbicie wynoszącej jeden cal. Dla każdego różnego stocku glicerolu zebrać kultury z dołków z najwyższym stężeniem etanolu umożliwiającym wzrost i wykorzystanie ksylozy.Każdą linię komórkową wysiej na agar YM, aby uzyskać liczne pojedyncze kolonie do przechowywania w glicerolu. Wybierz 10 kolonii z każdej linii komórkowej i wysiej każdą z nich na płytkę z agarem YM w celu przygotowania zapasów w glicerolu. Po adaptacji na AFEX CSH, porównanie wydajności fermentacji w ODM między szczepem wyjściowym a populacjami zaadaptowanymi wykazało, że populacje zaadaptowane wykorzystują ksylozę bardziej efektywnie, produkując etanol szybciej i w większych ilościach.W celu zwiększenia tolerancji na etanol opracowano dalej kolonię odporną na hydrolizat, stosując selekcję w kulturze ciągłej na pożywce ODM zawierającej ksylozę i wysokie stężenia etanolu. Wszystkie zaadaptowane populacje przewyższyły szczep rodzicielski pod kątem zdolności do indukowania metabolizmu ksylozy w obecności 40 g/L etanolu. Wykresy te podsumowują wyniki najlepszych izolatów odpornych, ocenione pod kątem szybkości poboru ksylozy i wydajności etanolu w stosunku do szczepu rodzicielskiego dla każdej formulacji PSGHL.Najlepsze szczepy wybrane podczas wstępnego przesiewu na podłożu PSGHL bogatym w ksylozę zostały następnie poddane analizie na trzech kompletnych hydrolizatach, a dla procesu fermentacji każdego izolatu w każdym hydrolizacie obliczono względny indeks wydajności (RPI). Następnie obliczono łączny ogólny indeks wydajności dla każdego izolatu. Pięć izolatów: 3, 14, 27, 28 i 33, uzyskało ogólne wartości RPI powyżej 60, co zakwalifikowało je jako najbardziej odporne na wszystkie kombinacje wariantów hydrolizatów i warunków odżywczych.Po obejrzeniu tego filmu powinni Państwo wiedzieć, jak poddać drożdże fermentujące ksylozę, takie jak *Scheffersomyces stipitis* NRRL Y-7124, procesowi ukierunkowanej ewolucji, a następnie wzbogacić, wyizolować i ocenić bardziej odporne pochodne, które skuteczniej fermentują cukry mieszane w niedetoksykowanych hydrolizatach. Po opanowaniu technika ta może być stosowana przy średnim nakładzie czasu wynoszącym około jednej godziny dziennie. Znaczące zmiany w procesie ewolucji można udokumentować w czasie zaledwie czterech miesięcy.Podczas przeprowadzania tej procedury ważne jest regularne zabezpieczanie rozwijających się populacji poprzez przygotowywanie stoków glicerolowych do mrożenia w temperaturze -80 °C. Pozwala to na odzyskanie populacji, okresową ewaluację, izolację lub ponowne uruchomienie procesu ewolucji. Aby zarządzać różnymi mutacjami, należy pamiętać o regularnym przesiewaniu drożdży w warunkach specyficznych dla procesu pod kątem szeregu fenotypów.Obliczenie całkowitych bezwymiarowych wskaźników wydajności względnej (RPI), opartych na parametrach kinetycznych, pozwala na ocenę rankingu szczepów oraz ich odporności na zmienność warunków fermentacji, takich jak rodzaj hydrolizatu i suplementacja składników odżywczych. Wybitne drożdże pochodzące z każdej fazy procesu ewolucji są kandydatami do sekwencjonowania genomu, aby można było zrozumieć charakter ulepszeń, takich jak zwiększona tolerancja na inhibitory i skrócenie fazy adaptacyjnej (dioxic lag), oraz wykorzystać tę wiedzę do projektowania biokatalitycznych szczepów nowej generacji.

techniques-for-evolution-robust-pentose-fermenting-yeast-for

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Bioinżynieria

Opisano prostą i szybką metodę określania potencjału sacharyfikacji dla dużej liczby próbek biomasy roślinnej. Zautomatyzowana platforma do tej analizy obejmuje przygotowanie biomasy roślinnej do analizy w płytkach 96-dołkowych, a następnie przeprowadzenie obróbki wstępnej, hydrolizy oraz kwantyfikacji uwolnionych cukrów.

Wysokoprzepustowy test sacharyfikacji materiałów lignocelulozowych

Struktura ściany komórkowej roślin i cechy chemiczne są oceniane w celu zidentyfikowania idealnych surowców do produkcji biopaliw i biomateriałów. Standardowe metody mają ograniczenia, gdy są stosowane do dużych zestawów danych. Te wysokoprzepustowe metody obróbki wstępnej, scukrzania enzymatycznego i pirolizy ze spektrometrią mas wiązki molekularnej porównują dużą liczbę próbek biomasy przy skróconym czasie i kosztach eksperymentu.

Wysokoprzepustowe badania przesiewowe zmian oporności biomasy lignocelulozowej: lignina całkowita, monomery ligniny i enzymatyczne uwalnianie cukru

Przedstawiamy szczegółowy protokół do konstruowania i sprawdzania bibliotek mutantów dla kampanii ukierunkowanej ewolucji u Saccharomyces cerevisiae.

Metoda ukierunkowanej ewolucji u Saccharomyces cerevisiae: tworzenie i badanie przesiewowe biblioteki mutantów

Przedstawiono protokół komobilizacji biokatalizatorów całych komórek w celu regeneracji kofaktora i poprawy możliwości ponownego wykorzystania, na przykładzie produkcji L-ksylulozy. Regenerację kofaktora uzyskuje się poprzez sprzężenie dwóch szczepów Escherichia coli wykazujących ekspresję funkcjonalnie uzupełniających się enzymów; Immobilizacja biokatalizatora całej komórki odbywa się poprzez enkapsulację komórek w kulkach alginianu wapnia.

Immobilizacja wielu biokatalizatorów w kulkach alginianowych w celu regeneracji kofaktora i poprawy możliwości ponownego użycia

Pokazano wstępną obróbkę biomasy lignocelulozowej za pomocą protonowych, tanich płynów jonowych, w wyniku czego powstaje deligtynizowana miazga bogata w celulozę i oczyszczona lignina. Miazga powoduje wysoką wydajność glukozy po scukrzaniu enzymatycznym.

Wstępna obróbka biomasy lignocelulozowej za pomocą tanich cieczy jonowych

Niniejszym opisujemy metody molekularnej manipulacji genetycznej szczepu Yarrowia lipolytica Po1g w celu poprawy efektywności delecji genów. Powstałe w ten sposób zmodyfikowane szczepy Y. lipolytica mają potencjalne zastosowania w produkcji biopaliw i biochemii.

Inżynieria genetyczna niekonwencjonalnych drożdży do produkcji biopaliw odnawialnych i biochemicznych

Optogenetyczna kontrola metabolizmu mikrobiologicznego oferuje elastyczną dynamiczną kontrolę nad procesami fermentacji. Niniejszy protokół pokazuje, jak skonfigurować fermentację regulowaną niebieskim światłem do produkcji chemicznej i białkowej w różnych skalach objętościowych.

Fermentacja kontrolowana światłem do produkcji mikrobiologicznej, chemicznej i białkowej

Ten protokół wykorzystuje bioluminescencyjny reporter, który umożliwia pomiary aktywności transkrypcyjnej u Saccharomyces eubayanus w celu monitorowania przejścia z glukozy do maltozy, umożliwiając analizę adaptacji metabolicznych w czasie rzeczywistym i wspierając optymalizację szczepu do fermentacji przemysłowej w różnych warunkach.

In vivo (in vivo) Monitorowanie aktywności transkrypcyjnej podczas przemiany metabolicznej za pomocą bioluminescencyjnego reportera w drożdżach

Zaprojektowano cykliczny bioreaktor ciśnieniowy, który umożliwia poddawanie tkanki zastawek serca fizjologicznym oraz patologicznym warunkom ciśnieniowym. Program LabVIEW pozwala użytkownikom na kontrolowanie wartości, amplitudy oraz częstotliwości ciśnienia. Urządzenie to może być wykorzystywane do badania mechanobiologii tkanki zastawek serca lub izolowanych komórek.

Projekt cyklicznego bioreaktora ciśnieniowego do badań ex vivo zastawek tętniczych serca

Opisujemy tutaj działanie urządzenia mikroprzepływowego, które umożliwia ciągłe i wysokorozdzielcze obrazowanie mikroskopowe pojedynczych pączkujących komórek drożdży podczas ich pełnego okresu replikacji i/lub chronologicznego życia.

Ciągła obserwacja mikroskopowa w wysokiej rozdzielczości starzenia replikacyjnego u pączkujących drożdży

Poznaj techniki ewolucji adaptacyjnej drożdży Scheffersomyces stipitis w celu zwiększenia fermentacji pentoz i heksoz z hydrolizatów lignocelulozowych do etanolu. Ta metoda umożliwia uzyskanie wytrzymałych szczepów bez konieczności inżynierii genetycznej.

Techniki ewolucji wytrzymałych drożdży fermentujących pentozy do biokonwersji lignocelulozy do etanolu

Przeglądaj więcej filmów