Name: Jak badać sztywność błony podstawnej jako biofizyczny wyzwalacz w raku prostaty i innych patologiach związanych z wiekiem lub chorobach metabolicznych (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-09-20T08:00:00.000+00:00
Duration: 13 min 18 s
Description: Odkryj metodę modelowania sztywności błony podstawnej w raku prostaty. Technika łączy chemię, fizykę i biologię, umożliwiając badanie inwazyjnego zachowania komórek nowotworowych.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dziękujemy Simonowi Haywardowi (Vanderbilt University Medical Center) za komórki BPH-1; oraz Thomasowi Coxowi i Janine Erler (Centrum Badań i Innowacji Biotechnologicznych, Uniwersytet w Kopenhadze) za ich pomoc w pomiarach reologicznych. Badanie MR-T zostało sfinansowane przez Worldwide Cancer Research, dawniej The Association of International Cancer Research (grant 08-0803 dla JS), Ambasadę Brytyjską w Montevideo oraz Agencia Nacional de Investigación e Innovación (UK_RH_2015_1_2 do MR-T). MC był wspierany przez Prostate Cancer UK (grant S14-017 dla JS i GS). KW został ufundowany przez Chińską Radę Stypendialną. MAM został sfinansowany przez Biuro Kultury Arabii Saudyjskiej.

<ol><li>Timpl, R., Brown, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Supramolecular+assembly+of+basement+membranes%5BTitle%5D)+AND+%22Bioessays%22%5BJournal%5D)">Supramolecular assembly of basement membranes.</a> Bioessays. 18 (2), 123-132 (1996).</li>
<li>Yurchenco, P. D., Ruben, G. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Type+IV+collagen+lateral+associations+in+the+EHS+tumor+matrix.+Comparison+with+amniotic+and+in+vitro+networks%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Pathol%22%5BJournal%5D)">Type IV collagen lateral associations in the EHS tumor matrix. Comparison with amniotic and in vitro networks.</a> Am J Pathol. 132 (2), 278-291 (1988).</li>
<li>Halfter, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protein+composition+and+biomechanical+properties+of+in+vivo-derived+basement+membranes%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Adh+Migr%22%5BJournal%5D)">Protein composition and biomechanical properties of in vivo-derived basement membranes.</a> Cell Adh Migr. 7 (1), 64-71 (2013).</li>
<li>Candiello, J., Cole, G. J., Halfter, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Age-dependent+changes+in+the+structure%2C+composition+and+biophysical+properties+of+a+human+basement+membrane%5BTitle%5D)+AND+%22Matrix+Biol%22%5BJournal%5D)">Age-dependent changes in the structure, composition and biophysical properties of a human basement membrane.</a> Matrix Biol. 29 (5), 402-410 (2010).</li>
<li>To, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Diabetes-induced+morphological%2C+biomechanical%2C+and+compositional+changes+in+ocular+basement+membranes%5BTitle%5D)+AND+%22Exp+Eye+Res%22%5BJournal%5D)">Diabetes-induced morphological, biomechanical, and compositional changes in ocular basement membranes.</a> Exp Eye Res. 116, 298-307 (2013).</li>
<li>Debnath, J., Muthuswamy, S. K., Brugge, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Morphogenesis+and+oncogenesis+of+MCF-10A+mammary+epithelial+acini+grown+in+three-dimensional+basement+membrane+cultures%5BTitle%5D)+AND+%22Methods%22%5BJournal%5D)">Morphogenesis and oncogenesis of MCF-10A mammary epithelial acini grown in three-dimensional basement membrane cultures.</a> Methods. 30 (3), 256-268 (2003).</li>
<li>Bello, D., Webber, M. M., Kleinman, H. K., Wartinger, D. D., Rhim, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Androgen+responsive+adult+human+prostatic+epithelial+cell+lines+immortalized+by+human+papillomavirus+18%5BTitle%5D)+AND+%22Carcinogenesis%22%5BJournal%5D)">Androgen responsive adult human prostatic epithelial cell lines immortalized by human papillomavirus 18.</a> Carcinogenesis. 18 (6), 1215-1223 (1997).</li>
<li>Hayward, S. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Establishment+and+characterization+of+an+immortalized+but+non-transformed+human+prostate+epithelial+cell+line%3A+BPH-1%5BTitle%5D)+AND+%22In+Vitro+Cell+Dev+Biol+Anim%22%5BJournal%5D)">Establishment and characterization of an immortalized but non-transformed human prostate epithelial cell line: BPH-1.</a> In Vitro Cell Dev Biol Anim. 31 (1), 14-24 (1995).</li>
<li>Kaighn, M. E., Narayan, K. S., Ohnuki, Y., Lechner, J. F., Jones, L. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Establishment+and+characterization+of+a+human+prostatic+carcinoma+cell+line+%28PC-3%29%5BTitle%5D)+AND+%22Invest+Urol%22%5BJournal%5D)">Establishment and characterization of a human prostatic carcinoma cell line (PC-3).</a> Invest Urol. 17 (1), 16-23 (1979).</li>
<li>Laemmli, U. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cleavage+of+structural+proteins+during+the+assembly+of+the+head+of+bacteriophage+T4%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4.</a> Nature. 227 (5259), 680-685 (1970).</li>
<li>Towbin, H., Staehelin, T., Gordon, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Electrophoretic+transfer+of+proteins+from+polyacrylamide+gels+to+nitrocellulose+sheets%3A+procedure+and+some+applications%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Electrophoretic transfer of proteins from polyacrylamide gels to nitrocellulose sheets: procedure and some applications.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 76 (9), 4350-4354 (1979).</li>
<li>Rabilloud, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanisms+of+protein+silver+staining+in+polyacrylamide+gels%3A+a+10-year+synthesis%5BTitle%5D)+AND+%22Electrophoresis%22%5BJournal%5D)">Mechanisms of protein silver staining in polyacrylamide gels: a 10-year synthesis.</a> Electrophoresis. 11 (10), 785-794 (1990).</li>
<li>Rodriguez-Teja, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((AGE-modified+basement+membrane+cooperates+with+Endo180+to+promote+epithelial+cell+invasiveness+and+decrease+prostate+cancer+survival%5BTitle%5D)+AND+%22J+Pathol%22%5BJournal%5D)">AGE-modified basement membrane cooperates with Endo180 to promote epithelial cell invasiveness and decrease prostate cancer survival.</a> J Pathol. 235 (4), 581-592 (2015).</li>
<li>Graf, B. W., Boppart, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+and+analysis+of+three-dimensional+cell+culture+models%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Imaging and analysis of three-dimensional cell culture models.</a> Methods Mol Biol. 591, 211-227 (2010).</li>
<li>Yao, N. Y., Larsen, R. J., Weitz, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Probing+nonlinear+rheology+with+inertio-elastic+oscillations%5BTitle%5D)+AND+%22J+Rheology%22%5BJournal%5D)">Probing nonlinear rheology with inertio-elastic oscillations.</a> J Rheology. 52 (4), 1013-1025 (2008).</li>
<li>Baker, A. M., Bird, D., Lang, G., Cox, T. R., Erler, J. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lysyl+oxidase+enzymatic+function+increases+stiffness+to+drive+colorectal+cancer+progression+through+FAK%5BTitle%5D)+AND+%22Oncogene%22%5BJournal%5D)">Lysyl oxidase enzymatic function increases stiffness to drive colorectal cancer progression through FAK.</a> Oncogene. 32 (14), 1863-1868 (2013).</li>
<li>Caley, M. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tumor-associated+Endo180+requires+stromal-derived+LOX+to+promote+metastatic+prostate+cancer+cell+migration+on+human+ECM+surfaces%5BTitle%5D)+AND+%22Clin+Exp+Metastasis%22%5BJournal%5D)">Tumor-associated Endo180 requires stromal-derived LOX to promote metastatic prostate cancer cell migration on human ECM surfaces.</a> Clin Exp Metastasis. 3 (2), 151-165 (2016).</li>
<li>Sturge, J., Wienke, D., East, L., Jones, G. E., Isacke, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((GPI-anchored+uPAR+requires+Endo180+for+rapid+directional+sensing+during+chemotaxis%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">GPI-anchored uPAR requires Endo180 for rapid directional sensing during chemotaxis.</a> J Cell Biol. 162 (5), 789-794 (2003).</li>
<li>Sturge, J., Wienke, D., Isacke, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Endosomes+generate+localized+Rho-ROCK-MLC2-based+contractile+signals+via+Endo180+to+promote+adhesion+disassembly%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Endosomes generate localized Rho-ROCK-MLC2-based contractile signals via Endo180 to promote adhesion disassembly.</a> J Cell Biol. 175 (2), 337-347 (2006).</li>
<li>Rodriguez-Teja, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Survival+Outcome+and+EMT+Suppression+Mediated+by+a+Lectin+Domain+Interaction+of+Endo180+and+CD147%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">Survival Outcome and EMT Suppression Mediated by a Lectin Domain Interaction of Endo180 and CD147.</a> Mol Cancer Res. 13 (3), 538-547 (2015).</li>
<li>Paszek, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tensional+homeostasis+and+the+malignant+phenotype%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Cell%22%5BJournal%5D)">Tensional homeostasis and the malignant phenotype.</a> Cancer Cell. 8 (3), 241-254 (2005).</li>
<li>Levental, K. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Matrix+crosslinking+forces+tumor+progression+by+enhancing+integrin+signaling%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Matrix crosslinking forces tumor progression by enhancing integrin signaling.</a> Cell. 139 (5), 891-906 (2009).</li>
<li>Carson, W. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Material+characterization+of+ex+vivo+prostate+tissue+via+spherical+indentation+in+the+clinic%5BTitle%5D)+AND+%22Med+Eng+Phys%22%5BJournal%5D)">Material characterization of ex vivo prostate tissue via spherical indentation in the clinic.</a> Med Eng Phys. 33 (3), 302-309 (2011).</li>
<li>Hoyt, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tissue+elasticity+properties+as+biomarkers+for+prostate+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Biomark%22%5BJournal%5D)">Tissue elasticity properties as biomarkers for prostate cancer.</a> Cancer Biomark. 4 (4-5), 213-225 (2008).</li>
<li>Krouskop, T. A., Wheeler, T. M., Kallel, F., Garra, B. S., Hall, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Elastic+moduli+of+breast+and+prostate+tissues+under+compression%5BTitle%5D)+AND+%22Ultrason+Imaging%22%5BJournal%5D)">Elastic moduli of breast and prostate tissues under compression.</a> Ultrason Imaging. 20 (4), 260-274 (1998).</li>
<li>Zhang, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+characterization+of+viscoelastic+properties+of+human+prostate+correlated+with+histology%5BTitle%5D)+AND+%22Ultrasound+Med+Biol%22%5BJournal%5D)">Quantitative characterization of viscoelastic properties of human prostate correlated with histology.</a> Ultrasound Med Biol. 34 (7), 1033-1042 (2008).</li>
<li>Corona, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Benign+prostatic+hyperplasia%3A+a+new+metabolic+disease+of+the+aging+male+and+its+correlation+with+sexual+dysfunctions%5BTitle%5D)+AND+%22Int+J+Endocrinol%22%5BJournal%5D)">Benign prostatic hyperplasia: a new metabolic disease of the aging male and its correlation with sexual dysfunctions.</a> Int J Endocrinol. , Article ID:329456 (2014).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Protokół generowania trójwymiarowych (3D) cewek gruczołowych z komórek nabłonkowych piersi (MECs) w czystych żelach z rBM6 został zmodyfikowany w poprzednim badaniu poprzez dodanie 4 mg/ml kolagenu typu I do macierzy rBM. Dodatek kolagenu spowodował wzrost modułu sprężystości żelu rBM ze 175 ± 37 do 1589 ± 380 Pa. Ten 9,1-krotny wzrost sztywności modulował wzrost, przeżywalność, migrację i różnicowanie MECs21. Protokół zmodyfikowano ponownie, wprowadzając etap traktowania D-(-)-rybozą w celu promowania nieenzymatycznego sieciowania kolagenu typu I dodanego do żelu rBM. Stwierdzono, że wynikający z tego 15-krotny wzrost sztywności współdziała z transformacją onkogenną MECs, promując ich inwazyjne zachowanie22. Podejście eksperymentalne polegające na dodawaniu kolagenu typu I do żeli rBM ułatwia bezpośrednią interakcję MECs z włóknami kolagenowymi, co w tkance ludzkiej zachodzi dopiero po proteolitycznej degradacji bariery fizycznej między stromą a nabłonkiem, tworzonej przez BM. Poprzez generowanie 3D cewek gruczołowych z komórek nabłonkowych prostaty (PECs) w czystych żelach rBM wstępnie traktowanych GLA, niniejszy protokół otwiera drogę do badania, w jaki sposób sztywność BM per se może wywoływać ich inwazyjne zachowanie (Rycina 3). Poziomy sztywności BM indukowane w tym protokole mają znaczenie fizjologiczne. Inkubacja z 50 mM GLA przez odpowiednio 6 h i 14 h zwiększyła moduły sprężystości czystego żelu rBM do 175 ± 90 oraz 322 ± 160 Pa, w porównaniu do 122 ± 55 Pa w żelach rBM traktowanych PBS (Tabela 1). Ten 1,7- do 3,2-krotny wzrost sztywności rBM odzwierciedla 2,5- do 3,4-krotny wzrost sztywności zaobserwowany w tkance złośliwej w porównaniu do prawidłowej prostaty lub tkanki z BPH23-26. Jak opisano w niedawnej publikacji13, zmiany morfologiczne indukowane przez akumulację AGE i sztywność rBM w cewkach PEC można ilościowo określić pod kątem statystycznie istotnego przejścia z kształtu zaokrąglonego na wielokątny, zmniejszenia stosunku powierzchni światła do całkowitej powierzchni cewki oraz obecności komórek migrujących z acina do bogatego w AGE rBM (Rycina 3). Immunoblotting może być również wykorzystany do oceny markerów EMT (np. utraty E-kadheryny13) oraz zachowania kurczliwego (np. fosforylowanej lekkiej łańcuchowej miozyny-2, pMLC213) w PECs hodowanych w prawidłowym oraz sztywnym rBM (Rycina 3). Dalsza ewaluacja z wykorzystaniem barwienia immunofluorescencyjnego i mikroskopii konfokalnej może zostać zastosowana do wizualizacji BM (np. lamininy, kolagenu IV i akumulacji AGE13), polarności komórkowej od strony apikalnej do bazalnej (np. apikalnej lokalizacji EEA1: wczesnego antygenu endosomalnego 1 oraz GM130: markera cis-Golgi o masie 130 kDa13) oraz wzorców rozmieszczenia cząsteczek adhezyjnych (np. lokalizacji E-kadheryny w połączeniach międzykomórkowych13) (Rycina 3).
<img alt="Schemat procesu hodowli komórkowej z użyciem reologii, mikroskopii, SDS-PAGE i fotometrii do analizy danych." src="/files/ftp_upload/54230/54230fig3.jpg" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Rysunek 3"> 
Rysunek 3: Przegląd przedstawionych tutaj różnych protokołów. Schemat przedstawia sposób przygotowania i utwardzania zrekonstytuowanej błony podstawnej (rBM) za pomocą glikolaldehydu (reakcja Maillarda), sposób wysiewania komórek na utwardzoną rBM, sposób analizy utwardzonej rBM (stopień reakcji Maillarda) oraz procedury, które można wykorzystać do analizy zmian komórkowych i molekularnych indukowanych przez rBM bogatą w AGE. AGE, zaawansowane produkty glikacji; BM, błona podstawna; DAPI, 4',6-diamidino-2-fenyloindol; EEA1, wczesny antygen endosomalny 1; GAPDH, gliceraldehyd-3-fosforanowa dehydrogenaza; GLA, glikolaldehyd; GEE, ester etylowy glicyny; GM130, marker cis-Golgiego 130 kDa; p-MLC2 (Thr18/Ser19), łańcuch lekki miozyny-2 fosforylowany w pozycjach treonina 18 i seryna 19; rBM, zrekonstytuowana błona podstawna; SDS-PAGE, elektroforeza w żelu poliakrylamidowym z dodecylofosforanem sodu. Dla acynów RWPE1 pasek skali = 10 µm; dla sferoidów komórek nowotworowych PC3 pasek skali = 100 µm. Rysunek został zmodyfikowany na podstawie referencji13. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54230/54230fig3large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby zobaczyć powiększoną wersję tego rysunku.</a>
Konieczne będzie podjęcie kroków rozwiązywania problemów, jeśli jako czynnik sieciujący dla rBM zostanie wybrana D-(-)-ryboza. Podczas opracowywania protokołu stwierdzono, że inkubacja z 1 M D-(-)-rybozą przez 72 hr, zgodnie z wcześniejszym opisem dla żeli rBM/kolagenowych22, prowadziła do odwodnienia i kurczenia się żeli rBM. Ocena zastosowania niższych stężeń D-(-)-rybozy oraz krótszych czasów inkubacji może pomóc w przezwyciężeniu tego ograniczenia.
Potencjalne ograniczenie w przyszłych zastosowaniach protokołu może wystąpić w sytuacjach, gdy wymagany jest wyższy poziom sztywności rBM. Jeśli w celu uzyskania większej sztywności żelu rBM zastosowane zostaną dłuższe czasy inkubacji i wyższe stężenia GLA, konieczne będzie ocenienie, czy warunki te wpływają na przeżywalność i proliferację komórek, zgodnie z wcześniejszymi opisami13. Należy również zauważyć, że inkubacja komórek RWPE-1 z surowicą indukuje fenotypową transformację typu EMT, dlatego należy unikać ekspozycji na surowicę lub materiały zawierające surowicę. Na przykład, jeśli eksperymenty obejmują transfekcję oligonukleotydów krótkiego interferującego RNA (siRNA), procedura powinna zostać zoptymalizowana przy użyciu komórek RWPE-1 hodowanych w KSFM, bez przenoszenia komórek do mediów transfekcyjnych z niską zawartością surowicy. To ograniczenie może wpłynąć na poziom wyciszenia genów osiągany podczas stosowania przejściowych metod siRNA w tym modelu. W przypadku niektórych białek docelowych zaleca się zastosowanie indukowalnych wektorów shRNA w celu regulowanego wyciszania genów i uzyskania pożądanego obniżenia poziomu białka. W przyszłych modelach można wprowadzić adaptacje uwzględniające enzymatyczne sieciowanie za pomocą oksydazy lizylowej (LOX)17 związanej z komórkami zrębu lub komórkami nowotworowymi.
Niniejszy protokół ułatwi przyszłe badania nad mechanizmami proinwazyjnymi wywołanymi przez zależną od AGE sztywność błony podstawnej w PECs (RWPE-1, BPH-1) oraz ocenę celów antymetastatycznych w inwazyjnych PTCs (PC3). Biorąc pod uwagę, że BPH jest uważana za zaburzenie metaboliczne27, protokół ten toruje również drogę do lepszego zrozumienia związku między zaburzeniami metabolicznymi a zwiększonym ryzykiem raka prostaty. Ponieważ sztywność błony podstawnej indukowana ekspozycją na AGE może być wyzwalaczem inwazyjności w innych typach nowotworów, interesujące będzie wykorzystanie tego protokołu do stworzenia podobnych modeli obejmujących prawidłowe komórki nabłonkowe i komórki nowotworowe z innych organów (np. piersi, jelita grubego, jajników, trzustki).
Kluczowe etapy protokołu wraz z ich czasem trwania przedstawiono w Rysunku 4. Podczas pierwszego etapu niezbędne jest utrzymywanie roztworu zapasowego rBM w temperaturze 4 °C podczas rozmrażania, aby zapobiec jego polimeryzacji. Końcówki do pipet nie powinny być wprowadzane do roztworu zapasowego rM, dopóki nie zostaną schłodzone do 4 °C>. W kolejnym kroku ważne jest również upewnienie się, że szkiełka komorowe osiągnęły temperaturę 4 °C przed pokryciem ich roztworem rBM. Gdy tylko temperatura roztworu rBM wzrośnie powyżej 4 °C, ulegnie on nieodwracalnej polimeryzacji, tworząc żel. Niezbędne jest, aby nie zakłócać rBM podczas etapu polimeryzacji, aby zapewnić utworzenie gładkiej powierzchni odpowiedniej do hodowli komórkowej i analizy mikroskopowej. Czas inkubacji z GLA, z inhibitorami reakcji Maillarda (cyjanoborowodorek sodu i aminoguanidyna) lub bez nich, określi stopień sztywności żelu rBM. W przypadku zapotrzebowania na warunki półsztywne zaleca się 6-godzinną inkubację z GLA, a w przypadku warunków sztywnych – inkubację 14-godzinną (Tabela 1). Jeśli pożądany jest inny stopień sztywności, można zastosować alternatywne czasy inkubacji lub stężenia GLA. W takim przypadku konieczne jest włączenie analizy reologicznej żeli rBM jako niezbędnego etapu. Po etapie przerywania reakcji Maillarda poprzez inkubację z GEE i następujących po niej etapach płukania PBS, żele rBM można wykorzystać natychmiast lub przechowywać w temperaturze 4 °C do 48 h przed użyciem do hodowli komórek. Po przygotowaniu hodowli komórkowych ważne jest zmienianie pożywki (wraz z wszelkimi substancjami do traktowania) co dwa dni. Zaleca się utrzymywanie trójwymiarowych (3D) hodowli komórkowych przez 3-12 dni, w zależności od badanych parametrów. W przypadku 3D acini PEC zaleca się analizę hodowli po 6 dniach, a w przypadku 3D sferoidów PTC analizę zaleca się w pierwszej kolejności po 3 dniach hodowli.
<img alt="Analiza hodowli 3D; metoda polimeryzacji rBM; schemat procedury; rBM, GLA, GEE; kwantyfikacja." src="/files/ftp_upload/54230/54230fig4.jpg" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Rycina 4"> 
Rycina 4: Przegląd protokołu z zaznaczonymi krytycznymi krokami i ramami czasowymi. Schemat blokowy przedstawia sposób przygotowania i utwardzania zrekonstytuowanej błony podstawnej (rBM) za pomocą glikolaldehydu (reakcja Maillarda) z zaznaczeniem krytycznych kroków i czasu trwania. Wskazano również punkty, w których można przerwać protokół i przechowywać żele rBM. rBM, zrekonstytuowana błona podstawna; GLA, glikolaldehyd; GEE, ester etylowy glicyny; O.N., przez noc; PBS, roztwór soli fosforanowej; R.T., temperatura pokojowa. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54230/54230fig4large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.</a>

Błona podstawna (BM) to arkusz wyspecjalizowanej macierzy zewnątrzkomórkowej (ECM), która utrzymuje stabilne granice tkanek poprzez oddzielanie warstw komórek nabłonkowych od zrębu1. Sieciowanie kowalencyjne między sąsiednimi potrójnymi helisami kolagenu IV w BM stabilizuje ich boczne powiązanie poprzez ustanowienie nieregularnej sieci super skręconych helis2. Te kolagenowe sieci dożylne działają jak rusztowanie dla jego interakcji z lamininą i innymi składnikami BM1. Układ strukturalny BM zapewnia mu wytrzymałość mechaniczną i sztywność niezbędną do prawidłowego rozwoju nabłonka gruczołowego3. 
Podczas starzenia się i choroby BM stopniowo gęstnieje i sztywnieje3,4. Na przykład 3-krotny wzrost modułu sprężystości (E) BM oka występuje między 50 a 80 rokiem życia w normalnej populacji, a usztywnienie to nasila się w zaburzeniach metabolicznych, takich jak cukrzyca5. Zmiany strukturalne i biomechaniczne w BM, które powodują jego zwiększoną sztywność, zachodzą, gdy jego składniki ECM, kolagen IV i laminina, stają się nieenzymatycznie usieciowane po ekspozycji na zaawansowane produkty końcowe glikacji (AGE).
Celem opisanej tutaj metody było stworzenie modelu do badania, w jaki sposób sztywność BM, spowodowana ekspozycją na AGE, sprzyja inwazyjności komórek nabłonka prostaty (PEC) i komórek nowotworu prostaty (PTC) w kontekście przejścia na raka prostaty z przerzutami (PCa). Aby to zrobić, poprzednia metoda stosowana do generowania 3D gruczołowych acini z komórek nabłonka sutka (MEC) w odtworzonych żelach rBM6 została dostosowana do dodatkowego etapu, w którym żele rBM są wstępnie traktowane aldehydem glikolowym (GLA). Opisano kilka technik oceny sieciowania i usztywnienia indukowanego GLA wstępnie poddanych obróbce żeli rBM, w tym analizę fotometryczną, elektroforezę w żelu poliakrylamidowym dodecylosiarczanu sodu (SDS PAGE), mikroskopię konfokalną i analizę reometryczną. Typy komórek gruczołu krokowego wybrane do hodowli na wstępnie usztywnionym rBM obejmują: RWPE-1, PEC pochodzące z normalnego gruczołu krokowego7; BPH-1, PEC pochodzące z gruczołu krokowego dotkniętego BPH8; i PC3, przerzutowe PTC pochodzące z guza wtórnego zlokalizowanego w kości kręgowej pacjenta z rakiem prostaty (PCa)9. 
Oprócz postępu w badaniach nad patologią gruczołów krokowych, protokół usztywniania żeli rBM poprzez ich leczenie GLA może być dostosowany do zbadania, w jaki sposób sztywność BM przyczynia się do innych patologii związanych z wiekiem i zaburzeń metabolicznych. Na przykład, model może być bezpośrednio zastosowany do zbadania, w jaki sposób rak z przerzutami jest wywoływany przez sztywność BM w narządach takich jak piersi, okrężnica, jajnik i trzustka poprzez włączenie odpowiednich typów komórek. Co więcej, protokół może zostać dostosowany do zbadania, w jaki sposób sztywny BM sprzyja biomechanicznym mechanizmom progresji choroby w chorobach mikronaczyniowych związanych z cukrzycą, retinopatii, nefropatii i neuropatii.

<table><tbody><tr><td>I - Materiał do hodowli jednowarstwowej</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>BPH-1</td><td>Baza danych linii komórkowych CaP</td><td>PCaCL-132</td><td>Kontakt: simon.hayward@mcmail.vanderbilt.edu</td></tr><tr><td>Kompletne podłoża bez keratynocytów w surowicy&nbsp;</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>17005-075</td><td>Nie ogrzewać się w temperaturze 37 & ordm; C przed użyciem</td></tr><tr><td>Surowica cielęca płodu&nbsp;</td><td>First Link UK Ltd</td><td>02-00-850</td><td>Sklep pod adresem -20 &ordm; C w podwielokrotnościach</td></tr><tr><td>PC3&nbsp;</td><td>American Type Culture Collection</td><td>CRL-1435</td><td></td></tr><tr><td>Penicylina/streptomycyna</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>15070-063</td><td></td></tr><tr><td>Bufor fosforanowy Sól fizjologiczna w tabletkach (Dulbecco A)</td><td>Oxoid</td><td>BR0014G</td><td></td></tr><tr><td>RPMI 1640 średni&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>R5886</td><td>ciepły w 37 & ordm; C kąpiel wodna przed użyciem</td></tr><tr><td>RWPE-1&nbsp;</td><td>American Type Culture Collection</td><td>CRL-11609</td><td></td></tr><tr><td>Roztwór trypsyny-EDTA</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T4049</td><td></td></tr><tr><td>Nazwa</td><td>Company</td><td>Numer katalogowy</td><td>Komentarze</td></tr><tr><td>II - Materiał do hodowli 3D</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Acetonitryl</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>271004</td><td></td></tr><tr><td>Chlorowodorek aminoguanidyny</td><td>Sigma-Aldrich 396494</td><td></td><td>Działa drażniąco na oczy, układ oddechowy i skórę</td></tr><tr><td>Szkiełka komorowe, 8-dołkowe&nbsp;</td><td>Thermo Scientific Nunc Lab-Tek</td><td>TKT-210-816M</td><td></td></tr><tr><td>Culture Matrix odtworzona membrana podstawna (rBM) ekstrakt zredukowanego czynnika wzrostu&nbsp;</td><td>AMS Biotechnology</td><td>3445-005-01</td><td>Przechowuj membranę podstawną (BM) przy -80 &ordm; C w podwielokrotnościach</td></tr><tr><td>Bromek cyjanu&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C91492</td><td>Działa toksycznie przez skórę kontaktową i wdychanie</td></tr><tr><td>Kwas mrówkowy</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>695076</td><td></td></tr><tr><td>Chlorowodorek estru etylowego glicyny (GEE)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>50060</td><td>Działa drażniąco na oczy</td></tr><tr><td>Dimer aldehydu glikolowego (GLA)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G6805</td><td></td></tr><tr><td>Cyjanoborowodorek sodu&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>71435</td><td>Wysoce łatwopalny; Działa toksycznie przez kontakt ze skórą i wdychanie</td></tr><tr><td>Filtr strzykawkowy 0,22 mikrona</td><td>Appleton Woods</td><td>BC680</td><td></td></tr><tr><td>Nazwa</td><td>Firma</td><td>Numer katalogowy</td><td>Komentarze</td></tr><tr><td>III - Materiał do ilościowego określenia reakcji Maillarda</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>4',6-diamidyn-2-fenyloindol (DAPI)</td><td>ThemoFisher Scientific</td><td>D3571</td><td>wrażliwy na światło i przechowywany w temperaturze -20 &ordm; C w podwielokrotnościach Cylindry</td></tr><tr><td>klonujące</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C1059</td><td></td></tr><tr><td>Kozia anty-mysia IgG (H+L) Alexa Fluor 488 koniugat</td><td>ThemoFisher Scientific</td><td>A-11001</td><td>światłoczuły</td></tr><tr><td>Kozioł anty-królik IgG (H+L) Alexa Fluor 488 koniugat</td><td>ThemoFisher Scientific</td><td>A-11034</td><td>światłoczuła</td></tr><tr><td>surowica kozia</td><td>Abcam</td><td>ab7481</td><td>Przechowywać pod adresem -20 &ordm; C w podwielokrotnościach Nośniki montażowe</td></tr><tr><td>Vectashield&nbsp;</td><td>Vector Laboratories</td><td>H-1000</td><td></td></tr><tr><td>Mysz klon anty-pentozydyny PEN-12 mAb</td><td>TransGenic Inc</td><td>KH012</td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldehyd (PFA)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F8775</td><td>Przechowywać w temperaturze -20 &ordm; C w podwielokrotnościach</td></tr><tr><td>Królicze przeciwciało poliklonalne anty-kolagen ludzki IV&nbsp; &nbsp;</td><td>Przeciwciała Acris</td><td>R1041</td><td>Przechowywać w temperaturze -20 &ordm; C w podwielokrotnościach</td></tr><tr><td>Królik anty-laminina A/C pAb</td><td>Santa Cruz Biotechnology Inc</td><td>sc-7292</td><td>Przechowywać pod adresem -20 &ordm; C w podwielokrotnościach</td></tr><tr><td>Eter tert-oktylofenylowy glikolu polietylenowego (Triton-X100)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T9284</td><td></td></tr><tr><td>Monolaurynian glikolu polietylenowego sorbitanu (Tween-20)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P1379</td><td></td></tr><tr><td>Kaseta do dializy Slide-A-Lyzer</td><td>ThemoFisher Scientific</td><td>66333</td><td></td></tr><tr><td>Nazwa</td><td>Company</td><td>Numer katalogowy</td><td>Uwagi</td></tr><tr><td>IV - Sprzęt</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>ARG2 reometr rotacyjny z kontrolowanym odkształceniem</td><td>T.A. Instruments</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Mikroskop Axiovert S100 (20-krotne powiększenie)</td><td>Zeiss Komora</td> inkubacyjna nawilżana sterowana CO2 Zeiss <td></td><td></td></tr><tr><td>do mikroskopu Zeiss Axio S100</td><td>Mikroskop Solent Scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Confocal Axiovert 200M (powiększenie 40X, 63X)</td><td>Mikroskop Zeiss</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Olympus LH50A wyposażony w kamerę cyfrową wykorzystującą kontrast fazowy&nbsp;</td><td>Olimpia&nbsp;</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Spektrofotometr czytnika płytek PHERAstar Plus</td><td>BMG Labtech</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Nazwa</td><td>Firma</td><td>Numer katalogowy</td><td>Uwagi</td></tr><tr><td>V - Oprogramowanie</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Image J 1.47v</td><td>Narodowy Instytut Zdrowia, USA</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Urządzenia molekularne</td><td></td><td></td> <td>MetaXpress</td></tr></tbody></table>

jak badać sztywność błony podstawnej jako biofizyczny wyzwalacz w raku prostaty i innych patologiach związanych z wiekiem lub chorobach metabolicznych

How to Study Basement Membrane Stiffness as a Biophysical Trigger in Prostate Cancer and Other Age-related Pathologies or Metabolic Diseases

Tutaj opisujemy protokół, który może być wykorzystany do badania mikrośrodowiska biofizycznego związanego ze zwiększoną grubością i sztywnością błony podstawnej (BM) podczas patologii związanych z wiekiem i zaburzeń metabolicznych (np. rak, cukrzyca, choroby mikronaczyniowe, retinopatia, nefropatia i neuropatia). Założeniem modelu jest nieenzymatyczne sieciowanie odtworzonej matrycy BM (rBM) poprzez traktowanie aldehydem glikolowym (GLA) w celu promowania wytwarzania zaawansowanych produktów końcowych glikacji (AGE) w reakcji Maillarda. Przedstawiono przykłady technik laboratoryjnych, które można wykorzystać do potwierdzenia generowania AGE, nieenzymatycznego sieciowania i zwiększonej sztywności w rBM poddanych działaniu GLA. Obejmują one przygotowanie natywnego rBM (traktowanego solą fizjologiczną buforowaną fosforanami, PBS) i sztywnego rBM (traktowanego GLA) w celu oznaczenia: zawartości jego AGE za pomocą analizy fotometrycznej i mikroskopii immunofluorescencyjnej, jego nieenzymatycznego sieciowania za pomocą elektroforezy w żelu poliakryloamidowym dodecylosiarczanu sodu (SDS PAGE) oraz mikroskopii konfokalnej oraz jego zwiększonej sztywności za pomocą reometrii. Opisana tutaj procedura może być stosowana do zwiększenia sztywności (modułów sprężystości, E) rBM do 3,2 razy, zgodnie z pomiarami wykonanymi w zdrowej i chorej tkance gruczołu krokowego człowieka. Aby odtworzyć biofizyczne mikrośrodowisko związane ze starzeniem się i chorą gruczołem krokowym, wprowadzono trzy typy komórek gruczołu krokowego do natywnego rBM i sztywnego rBM: RWPE-1, komórki nabłonka prostaty (PEC) pochodzące z normalnego gruczołu krokowego; BPH-1, PEC pochodzące z gruczołu krokowego dotkniętego łagodnym przerostem gruczołu krokowego (BPH); i PC3, komórki przerzutowe pochodzące z wtórnego guza kości wywodzącego się z raka prostaty. Można mierzyć wiele parametrów, w tym wielkość, kształt i charakterystykę inwazyjną gruczołów 3D utworzonych przez RWPE-1 i BPH-1 na natywnym i sztywnym rBM oraz średnią długość komórki, prędkość migracji i trwałość ruchu komórek sferoid 3D utworzonych przez komórki PC3 w tych samych warunkach. Można również ocenić komórkowe szlaki sygnałowe i subkomórkową lokalizację białek.

Kultury 3D acini prostaty na sztywnym rBM
Po 6 dniach hodowli, PEC wywodzące się z prawidłowej tkanki prostaty (RWPE-1) (Ryc. 1A) oraz tkanki BPH (BPH-1) (Ryc. 1B) tworzą na natywnym (traktowanym PBS) rBM acini, które są zorganizowane w jednorodne sferoidy komórek nabłonkowych. Acini te wykazują również cechy wysoce zorganizowanych PEC z polaryzacją od strony apikalnej do bazalnej oraz widoczną przestrzenią luminalną13,20.
Acini utworzone przez PEC pochodzące z prawidłowej tkanki prostaty (RWPE-1) (Ryc. 1A) oraz tkanki BPH (BPH-1) (Ryc. 1B) na usztywnionym (bogatym w AGE) rBM (poddanym działaniu GLA) wykazują zaburzoną architekturę (zmiana kształtu z sferoidalnego na wielokątny oraz protruzja/migracja komórek z acini do rBM bogatego w AGE) (Ryc. 1A). Acini te charakteryzują się również silnie zdezorganizowanymi PEC, które utraciły polarność od wierzchołkową do podstawnej, z niewielką lub nieistniejącą przestrzenią luminalną13.
<img alt="Wzrost komórek prostaty, sekwencja obrazów mikroskopowych, RWPE 1, BPH 1, natywna, rBM bogata w AGE, time-lapse." src="/files/ftp_upload/54230/54230fig1.jpg" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Rysunek 1"> 
Rysunek 1: Komórki nabłonka prostaty hodowane jako 3D gruczołowe acini na natywnej i sztywnej zrekonstytuowanej błonie podstawnej (rBM). (A) Obrazy w jasnym polu komórek RWPE-1 hodowanych od 12 h do 6 dni na żelach rBM traktowanych PBS (natywna) lub 50 mM glikolaldehydem przez 14 h (bogata w AGE; sztywna); pasek skali = 50 µm. (B) Komórki BPH-1, hodowane zgodnie z opisem w panelu A; paski skali = 50 µm; dane są reprezentatywne dla 3 niezależnych eksperymentów. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54230/54230fig1large.jpg" target="_blank">Proszę kliknąć tutaj, aby zobaczyć powiększoną wersję tego rysunku.</a>
<img alt="Tabela cech cewek acynarnych; analiza sztywności w Pa, klasyfikacja, kształt komórkowy, inwazyjność podstawna." src="/files/ftp_upload/54230/54230table1.jpg" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Tabela 1"> 
Tabela 1: Charakterystyka cewek acynarnych nabłonka prostaty RWPE-1 hodowanych na naturalnej, półsztywnej i sztywnej zrekonstytuowanej błonie podstawnej (rBM). Cewki acynarne RWPE-1 hodowano na rBM poddanych wstępnej obróbce w PBS przez 14 h (naturalna), glikolaldehydem (GLA) przez 6 h (półsztywna) lub GLA przez 14 h (sztywna). W przypadku kształtu cewek obliczono odsetek (%) ± odchylenie standardowe (SD) cewek okrągłych, półpoligonalnych i poligonalnych na podstawie 5 niezależnych eksperymentów (ilościowo określono 50 cewek na warunek). Względną wielkość cewek obliczono (naturalna rBM = 100 %) na podstawie 3 niezależnych eksperymentów. W celu oceny inwazyjności obliczono % ± SD cewek z jedną lub więcej komórkami prototypującymi na podstawie 3 niezależnych eksperymentów. Krotność zmiany (fold change) obliczono, dzieląc średnią wartość uzyskaną w warunkach półsztywnych lub sztywnych przez odpowiednią wartość dla warunków naturalnych. Wartości p obliczono za pomocą testu t Student'a (α = 0.05).
Zależny od wieku wzrost sztywności rBM promuje migrację komórek raka prostaty PC3
Komórki PC3 hodowane na natywnej rBM migrują, utrzymując ciągły kontakt międzykomórkowy, podczas gdy komórki PC3 hodowane na rBM bogatej w AGE (sztywnej) poruszają się niezależnie od siebie (Rysunek 2A). Po 72 h hodowli komórki PC3 tworzą ogniska (sferoidy) na natywnej rBM (traktowanej PBS), natomiast komórki PC3 na sztywnej (bogatej w AGE) rBM nie tworzą sferoidów i migrują niezależnie (Rysunek 2B). Komórki PC3 na sztywnej (bogatej w AGE) rBM są bardziej wydłużone niż komórki PC3 hodowane na natywnej rBM (Rysunek 2C). Komórki PC3 na sztywnej rBM migrują szybciej niż komórki PC3 hodowane na natywnej rBM (Rysunek 2D). Komórki PC3 na sztywnej rBM wykazują zmniejszoną uporczywość ruchu w porównaniu do komórek PC3 hodowanych na natywnej rBM (Rysunek 2E).
<img alt="Time-lapse migracji komórek na macierzach rBM; schemat, analiza długości komórek/prędkości migracji/trwałości." src="/files/ftp_upload/54230/54230fig2.jpg" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Rycina 2"> 
Rycina 2: Migracja komórek nowotworu prostaty na natywnej i sztywnej zrekonstytuowanej błonie podstawnej (rBM). (A) Obrazy w jasnym polu komórek PC3 hodowanych na żelach rBM traktowanych PBS (natywne) lub 50 mM glikolaldehydem przez 14 h (bogate w AGE, sztywne). Obrazowanie komórek wykonano za pomocą mikroskopu w jasnym polu (obiektyw 10X) z częstotliwością akwizycji 1 obrazu na godzinę przez 12 h, a następnie przeprowadzono śledzenie komórek w celu wygenerowania trajektorii. Przedstawione obrazy odpowiadają punktom czasowym po 0, 3, 6, 9 i 12 h. Trajektorie pojedynczych komórek pokazano dla punktu czasowego 12 h. Pasek skali = 100 µm. (B) Komórki PC3 hodowane na natywnej lub sztywnej rBM przez 72 h, obrazowane zgodnie z opisem w panelu (A). Pasek skali = 100 µm. Szczegół pokazuje wybrany obszar przy powiększeniu 2X. (C) Średnia ± S.D. długość komórek (µm); istotna różnica między natywną rBM a sztywną rBM (p = 1.2 x 10-23). (D) Średnia ± S.D. prędkość (µm/hr) obliczona z trajektorii komórek; istotna różnica między natywną rBM a sztywną rBM (p = 0.004). (E) Średnia ± S.D. trwałość ruchu komórek (stosunek D/T, gdzie D = odległość od początku do końca trajektorii komórki, T = całkowita długość trajektorii komórki); istotna różnica między natywną rBM a sztywną rBM (p = 0.0007). Dla paneli C-E przeanalizowano &gt;10 komórek, dane są reprezentatywne dla 3 niezależnych eksperymentów. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54230/54230fig2large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.</a>

Tutaj wyjaśniamy protokół modelowania mikrośrodowiska biofizycznego, w którym sieciowanie i zwiększona sztywność błony podstawnej (BM) indukowana przez zaawansowane produkty końcowe glikacji (AGE) ma patologiczne znaczenie.

Jak badać sztywność błony podstawnej jako biofizyczny wyzwalacz w raku prostaty i innych patologiach związanych z wiekiem lub chorobach metabolicznych

Here we describe a protocol that can be used to study the biophysical microenvironment related to increased thickness and stiffness of the basement ...

Ogólnym celem tego modelu jest zbadanie, w jaki sposób sztywność i grubość błony podstawnej, wynikające z zaawansowanej glikacji i ekspozycji na produkty glikacji, mogą modulować inwazyjne zachowanie komórek odpowiadające wczesnym i zaawansowanym stadiom przerzutowego raka prostaty. Metoda ta może pomóc w odpowiedzi na kluczowe pytania z dziedziny patologii związanych z wiekiem, takie jak wpływ zwiększonej sztywności i grubości błony podstawnej na progresję nowotworu, a także na zaburzenia metaboliczne, np. cukrzycę.Główną zaletą tej techniki jest to, że zapewnia ona prostą metodę naśladowania poziomu sztywności mierzonego w guzach prostaty u ludzi w warunkach klinicznych. Znaczenie tej techniki rozciąga się na terapię i diagnostykę raka prostaty poprzez poprawę zrozumienia tego, w jaki sposób sztywność błony podstawnej promuje zmiany molekularne i komórkowe. Osoby rozpoczynające pracę z tą metodą mogą napotkać trudności, ponieważ model ten jest multidyscyplinarny.Łącząc techniki z dziedzin chemii, fizyki i biologii. Pomysł na tę metodę pojawił się, gdy postawiliśmy hipotezę, że sztywność błony podstawnej w gruczole przed prostatą może promować inwazyjne zachowanie de novo w znanych przekształconych komórkach nabłonkowych. Demonstracja wideo tej metody jest kluczowa, ponieważ niezbędne jest opisanie kroków interdyscyplinarnych.W tym etapie przeprowadza się sieciowanie błony podstawnej, a następnie trójwymiarową hodowlę komórek. Należy rozpocząć od przygotowania równej powierzchni lodu i wykorzystania jej do schłodzenia szkiełka przedmiotowego z ośmioma komorami do temperatury 4 °C. Następnie należy odciąć końcówkę pipety o objętości 200 µL i również schłodzić ją do 4 °C.Po ochłodzeniu nałóż końcówkę na pipetę o pojemności 200 µL. Następnie za jej pomocą przenieś 40 µL lodowatego roztworu macierzy BM do każdej studzienki schłodzonego szkiełka przedmiotowego z ośmioma komorami. Następnie umieść szkiełko w temperaturze 37 °C na 30 minut, aby wspomóc polimeryzację błony podstawnej.Bardzo ostrożnie zamknij drzwi inkubatora, aby nie zakłócić struktury zrekonstytuowanej błony podstawnej w formie ciekłej. Po dokładnie 30 minutach dodaj 250 µL przygotowanego roztworu glikolaldehydu, aby pokryć spolimeryzowaną, zrekonstytuowaną błonę podstawną. Następnie przygotuj kontrolę negatywną, dodając 250 µL sterylnego PDS do natywnego żelu zrekonstytuowanej błony podstawnej.Należy również przygotować dwie dodatkowe kontrolki, dodając 50 mM cyjanoborowodorek sodu lub 250 mM aminoguanidynę do roztworu glikolaldehydu przed jego dodaniem do żelu z błony podstawnej. Następnie żele należy inkubować w temperaturze 37 °C przez sześć godzin w celu uzyskania żelu półsztywnego lub przez 14 godzin w celu uzyskania żelu sztywnego.Po inkubacji ostrożnie usuń roztwory z żeli i dodaj do każdego żelu 250 µL 1 M glicynianu etylu. Inkubuj je w temperaturze 37 °C przez jedną godzinę. Każdy żel przemyj 10 razy w 500 µL PBS, aby usunąć wszelkie ślady roztworu glikolaldehydu oraz glicynianu etylu.Następnie dodaj 400 µL PBS, aby zapobiec odwodnieniu, i inkubuj zrekonstytuowane żele błony podstawnej przez noc w temperaturze 37 °C. Po przygotowaniu do dalszych działań usuń PBS z zrekonstytuowanych żeli błony podstawnej i dodaj 250 µL lodowatej, dwukrotnie destylowanej wody do każdej studzienki. Inkubuj żele w temperaturze 4 °C przez 16 do 24 godzin, aby upewnić się, że macierz została całkowicie upłynniona.Następnie przenieś upłynnioną błonę podstawną do probówki o pojemności 1,5 mililitra i zmierz emisję fluorescencyjną roztworu za pomocą spektrofotometru. Następnie odwiruj roztwór w wirówce i usuń powstały nadsącz. Ponownie zawieś osad w 500 mikrolitrach roztworu zawierającego 20 miligramów na mililitr bromku cyjanowego i 70% kwasu mrówkowego.Inkubować próbki przez noc w temperaturze pokojowej. Następnie, używając jednorazowej strzykawki o pojemności 1 ml, przenieść resuspensowany żel błony podstawnej do kasety dializacyjnej z granicą odcięcia masy cząsteczkowej 3,5 kDa. Zanurzyć kasetę w szklanym zlewce o pojemności 500 ml zawierającej 500 ml wody dwukrotnie destylowanej.Następnie mieszać wodę za pomocą magnetycznego mieszadełka. Pozostawić tak przygotowany układ przez noc w temperaturze 4 °C, aby usunąć wszelkie ślady bromku cyjanogenowego i kwasu mrawkowego. Za pomocą jednorazowej strzykawki o pojemności 1 mL przenieść dializowany roztwór z kasety do probówki o pojemności 1,5 mL.Następnie przeanalizuj roztwór, przeprowadzając elektroforezę na 12% żelu poliakryloamidowym. Żel należy zabarwić azotanem srebra, aby zwizualizować wzór elektroforetyczny peptydów macierzy po traktowaniu bromkiem cyjanogenu. Rozpoczynając od żeli błony podstawnej pokrytych PBS, wypłucz żele dodatkowo dwa razy, używając 300 µL PBS zawierającego 0,1 mmol chlorku wapnia.Oraz 0,5 mmol chlorku magnezu. Przez pięć minut w temperaturze pokojowej. Następnie usunąć PBS i dodać 300 µL 4% paraformaldehydu, aby pokryć każdy zrekonstytuowany żel błony podstawnej.Inkubuj żele przez 30 minut w temperaturze pokojowej, aby utrwalić zrekonstytuowane składniki błony podstawnej. Następnie usuń utrwalacz i dodaj 300 µL roztworu gaszącego zawierającego 75 mM chlorku amonu i 0,5 mM chlorku magnezu. Inkubuj roztwór przez pięć minut w temperaturze pokojowej, a następnie usuń go i powtórz płukanie jeszcze cztery razy.Po końcowym płukaniu do zrekonstytuowanych żeli błony podstawnej należy dodać 300 µL buforu do immunofluorescencji, aby zapobiec niespecyficznym reakcjom. Żele należy inkubować w roztworze przez dwie godziny w temperaturze pokojowej na platformie wytrząsowej. Następnie należy usunąć bufor blokujący do immunofluorescencji.Następnie dodaje się 300 µL przeciwciała pierwszorzędowego rozcieńczonego w buforze blokującym. Żele zrekonstytuowanej błony podstawnej inkubuje się w temperaturze 4 °C przez 16 godzin. Następnego dnia należy usunąć przeciwciało pierwszorzędowe i trzykrotnie przemyć żele 300 µL buforu do immunofluorescencji.Wstrząsaj żele w temperaturze pokojowej na platformie wytrząsającej przez 10 minut po każdym dodaniu buforu. Następnie usuń bufor i dodaj 300 µL przeciwciała wtórnego znakowanego fluorescencyjnie, rozcieńczonego w buforze blokującym. Umieść próbki na platformie wytrząsającej i inkubuj żele przez dwie godziny w temperaturze pokojowej.Usunąć przeciwciało wtórne. Przepłukać próbkę w buforze do immunofluorescencji, a następnie w PBS, po czym ponownie utrwalić i zgasić próbki. Na koniec zamontować żele i za pomocą mikroskopu przeanalizować formowanie się gęstych pęczków.Aby utworzyć acini gruczołu krokowego, należy zawiesić 5 000 komórek RWPE-1 w 300 µl kompletnego KSFM uzupełnionego o 2% roztworu błony podstawnej. W przypadku agregatów komórek nowotworu prostaty należy zawiesić 2 500 komórek PC3 w 300 µl pożywki hodowlanej RPMI-1640 uzupełnionej o 2% roztworu błony podstawnej. Po inkubacji zrekonstytuowanych żeli błony podstawnej w PBS przez noc, należy przepłukać je dwukrotnie 500 µl pożywki hodowlanej.Przed wysiewaniem komórek. Delikatnie wysiej komórki na natywne oraz utwardzone produktami końcowymi zaawansowanej glikacji zrekonstytuowane błony podstawne. Następnie ostrożnie umieść hodowle w inkubatorze, aby zapewnić równomierne rozmieszczenie rosnących acini i sferoidów.W przypadku komórek tworzących cewki (acini), wymieniaj medium co dwa dni na świeże medium hodowlane, zawierające 2% roztworu błony podstawnej. Zapewni to komórkom czynniki wzrostu niezbędne do prawidłowej homeostazy cewek. Po sześciu dniach hodowli komórki nabłonka prostaty tworzą cewki na natywnej zrekonstytuowanej błonie podstawnej.Są one zorganizowane w jednorodnie uformowane sferoidy komórek nabłonkowych. Acini te posiadają również cechy wysoko zorganizowanych PEC, z polaryzacją od strony apikalnej do bazalnej oraz widoczną przestrzenią światłowową. Po sześciodniowej hodowli na usztywnionej błonie komórki wykazują zaburzoną architekturę.Następnie zmieniają kształt z sferoidalnego na poligonalny. Ponadto acini te są silnie zdeorganizowane i utraciły polarność apikalno-bazalną, a ich światło jest bardzo wąskie lub nieobecne.Obowiązuje to również w przypadku komórek pochodzących z gruczołu prostaty dotkniętego łagodnym przerostem prostaty. Podczas pomiarów komórek nowotworowych prostaty stwierdzono, że na sztywnej, zrekonstytuowanej błonie podstawnej komórki były dłuższe, migrowały szybciej i wykazywały zwiększoną trwałość kierunku ruchu. Po obejrzeniu tego filmu powinieneś mieć dobre zrozumienie sposobu modelowania wpływu sztywności błony podstawnej na zachowanie komórek nabłonkowych i nowotworowych.Podczas wykonywania tej procedury należy pamiętać, że indukowany jest pożądany poziom sztywności błony podstawnej, a poszczególne acini lub s-sferoidy formują się prawidłowo. Po opracowaniu ta technika utorowała drogę badaczom z dziedziny onkologii do zbadania indukcji inwazji komórek nowotworowych przez sztywność błony podstawnej w gruczole przed prostatą. Po zastosowaniu tego protokołu można przeprowadzić inne metody, takie jak immunoblotting lizatu komórkowego, aby odpowiedzieć na dodatkowe pytania dotyczące szlaków sygnałowych modulowanych przez sztywność błony podstawnej.Należy pamiętać, że praca z cyjanoborowodorkiem sodu, bromkiem cyjanogenu i kwasem mrówkowym może być niezwykle niebezpieczna, dlatego podczas wykonywania tej procedury zawsze należy przestrzegać środków ostrożności, takich jak noszenie fartucha laboratoryjnego, rękawiczek, osłony twarzy i respiratora podczas pracy w dygestorium.

how-to-study-basement-membrane-stiffness-as-biophysical-trigger

Research

JoVE Journal

Cancer Research

Badania nad rakiem

Wpływ sztywności podłoża na funkcje komórkowe można modelować in vitro, wykorzystując hydrożele poliakryloamidowe o różnym stopniu podatności.

Badanie wpływu sztywności macierzy na funkcje komórkowe z wykorzystaniem hydrożeli na bazie akrylamidu

W niniejszej pracy opisujemy szybką i prostą metodę pomiaru sztywności komórek. Ogólna zasada tego podejścia polega na pomiarze deformacji błony w odpowiedzi na ściśle określone podciśnienie przyłożone do powierzchni komórki za pomocą mikropipety. Metoda ta stanowi potężne narzędzie do badania właściwości biomechanicznych komórek przytwierdzonych do podłoża.

Aspiracja mikropipetą komórek przytwierdzonych do podłoża w celu oszacowania sztywności komórek

Mikroreologia śledząca cząstki może być wykorzystana do nieniszczącego ilościowego i przestrzennego mapowania zmian właściwości mechanicznych macierzy zewnątrzkomórkowej w modelach 3D nowotworów.

Podłużny pomiar sztywności macierzy zewnątrzkomórkowej w modelach 3D guzów przy użyciu mikroreologii śledzenia cząstek

Przedstawiamy szczegółowe protokoły izolacji aort od myszy i pomiaru ich modułu sprężystości za pomocą mikroskopii sił atomowych.

Pomiar sztywności mysich aort ex vivo za pomocą mikroskopii sił atomowych

Opracowaliśmy wielodołkowy test na bazie poliakrylamidu do badania wpływu sztywności macierzy zewnątrzkomórkowej na infekcję bakteryjną przylegających komórek. Test ten jest kompatybilny z cytometrią przepływową, barwieniem immunologicznym i mikroskopią sił trakcyjnych, umożliwiając ilościowe pomiary interakcji biomechanicznych między komórkami, ich macierzą zewnątrzkomórkową i bakteriami chorobotwórczymi.

Wielodołkowy test na bazie poliakrylamidu do badania wpływu sztywności macierzy zewnątrzkomórkowej na infekcję bakteryjną przylegających komórek

Siły mechaniczne są ważne dla kontrolowania migracji komórek. Protokół ten demonstruje użycie elastycznych hydrożeli, które można odkształcić za pomocą szklanej mikropipety i mikromanipulatora w celu stymulacji komórek za pomocą lokalnego gradientu sztywności w celu wywołania zmian w strukturze komórki i migracji.

Test durotaksji pojedynczej komórki do oceny mechanicznej kontroli ruchu komórkowego i powiązanych zdarzeń sygnalizacyjnych

Prezentowany jest tutaj protokół techniki Conpokal, która łączy mikroskopię konfokalną i mikroskopię sił atomowych w jedną platformę instrumentów. Conpokal zapewnia tę samą komórkę, ten sam region, prawie równoczesne obrazowanie konfokalne i mechaniczną charakterystykę żywych próbek biologicznych.

Niemal równoczesna skaning laserowy Mikroskopia konfokalna i mikroskopia sił atomowych (Conpokal) na żywych komórkach

Niedawno zidentyfikowaliśmy usztywnienie naczyń włosowatych siatkówki jako nowy paradygmat dysfunkcji siatkówki związanej z cukrzycą. W protokole tym omówiono etapy izolacji naczyń włosowatych siatkówki myszy i macierzy podśródbłonkowej z kultur śródbłonka siatkówki, a następnie opisano technikę pomiaru sztywności za pomocą mikroskopii sił atomowych.

Izolacja naczyń włosowatych siatkówki myszy i macierzy podśródbłonkowej do pomiaru sztywności za pomocą mikroskopii sił atomowych

Ten protokół wizualizuje, jak przygotować kriosekcje mysiej tkanki płucnej, przeprowadzić eksperymenty z mapą siły pod mikroskopią sił atomowych i przeanalizować dane w celu określenia modułu Younga natywnej mysiej błony podstawnej płuc.

Wyodrębnianie modułu Younga natywnych mysich błon podstawnych płuc z map sił pochodnych mikroskopii sił atomowych

Ten protokół pokazuje, jak generować fluorescencyjnie oznaczone, genetycznie zdefiniowane guzy klonalne w oku/czułkach Drosophila imaginal discs (EAD). Opisuje, jak rozdzielić EAD i mózg od larw trzeciego stadium rozwojowego i jak je przetworzyć w celu wizualizacji i ilościowego określenia zmian ekspresji genów i inwazyjności guza.

Model guza dysku imaginalnego Drosophila: wizualizacja i kwantyfikacja ekspresji genów i inwazyjności guza za pomocą mozaik genetycznych

Odkryj metodę modelowania sztywności błony podstawnej w raku prostaty. Technika łączy chemię, fizykę i biologię, umożliwiając badanie inwazyjnego zachowania komórek nowotworowych.

Jak badać sztywność błony podstawnej jako biofizyczny wyzwalacz w raku prostaty i innych patologiach związanych z wiekiem lub chorobach metabolicznych (Wideo) | JoVE Journal

Jak badać sztywność błony podstawnej jako biofizyczny wyzwalacz w raku prostaty i innych patologiach związanych z wiekiem lub chorobach metabolicznych

Przeglądaj więcej filmów