Jak badać sztywność błony podstawnej jako biofizyczny wyzwalacz w raku prostaty i innych patologiach związanych z wiekiem lub chorobach metabolicznych

Ogólnym celem tego modelu jest zbadanie, w jaki sposób sztywność i grubość błony podstawnej, spowodowana zaawansowaną glikacją i ekspozycją na produkt, może modulować inwazyjne zachowanie komórek odpowiadające wczesnym i zaawansowanym stadiom przerzutowego raka prostaty. Ta metoda może pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytania w dziedzinie patologii związanych z wiekiem. Na przykład to, jak zwiększona sztywność i grubość błony podstawnej przyczynia się do progresji raka, a także zaburzeń metabolicznych, takich jak cukrzyca.

Główną zaletą tej techniki jest to, że zapewnia prostą metodę naśladowania poziomu sztywności mierzonego w ludzkich guzach prostaty w warunkach klinicznych. Implikacje tej techniki rozciągają się na naszą terapię i diagnostykę raka prostaty, poprawiając nasze zrozumienie, w jaki sposób sztywność błony podstawnej sprzyja zmianom molekularnym i komórkowym. Osoby, które dopiero zaczynają przygodę z tą metodą, mogą mieć trudności, ponieważ model jest multidyscyplinarny.

Łączenie technik z dziedziny chemii, fizyki i biologii. Po raz pierwszy wpadliśmy na pomysł tej metody, gdy postawiliśmy hipotezę, że sztywność błony podstawnej gruczołu krokowego może sprzyjać inwazyjnemu zachowaniu de novo w znanych przekształconych komórkach nabłonka. Demonstracja wideo tej metody ma kluczowe znaczenie, ponieważ należy opisać interdyscyplinarne kroki.

W tym sieciowanie błony podstawnej, a następnie hodowla komórek 3D. Zacznij od przygotowania równej powierzchni lodu i użycia go do schłodzenia szklanego szkiełka z ośmioma dołkami do czterech stopni Celsjusza. Następnie odetnij końcówkę końcówki pipety o pojemności 200 mikrolitrów i również ostudź końcówkę do czterech stopni Celsjusza.

Po schłodzeniu umieść końcówkę na pilniku pipetującym o pojemności 200 mikrolitrów. I użyj go do przeniesienia 40 mikrolitrów lodowatego roztworu matrycowego BM do każdej studzienki schłodzonego szkła z ośmioma doładowaniami. Następnie umieść szkiełko komory w temperaturze 37 stopni Celsjusza na 30 minut, aby przyspieszyć polimeryzację błony podstawnej.

Bardzo ostrożnie zamknij drzwi inkubatora, aby uniknąć naruszenia błony podstawnej odtworzonej w płynie. Dokładnie po 30 minutach dodać 250 mikrolitrów przygotowanego roztworu aldehydu glikolowego, aby pokryć spolimeryzowaną, odtworzoną membranę podstawną. Następnie należy przygotować kontrolę ujemną, dodając 250 mikrolitrów sterylnego PDS do natywnego, odtworzonego żelu z membrany podstawnej.

Przygotuj również dwie dodatkowe kontrole, dodając 50-milimolowy cyjanoborowodorek sodu lub 250-milimolową aminoguanidynę do roztworu aldehydu glikolowego przed dodaniem go do żelu z membraną podstawną. Następnie inkubuj żele w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez sześć godzin, aby uzyskać półsztywny żel. Lub przez 14 godzin, aby wytworzyć sztywny żel.

Po inkubacji ostrożnie usunąć roztwory z żeli i dodać 250 mikrolitrów jednego molowego estru etylowego glicyny do każdego żelu. I inkubuj je w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez godzinę. Umyj każdy żel 10 razy w 500 mikrolitrach PBS, aby usunąć wszelkie ślady roztworu aldehydu glikolowego i estru etylowego glicyny.

Następnie dodaj 400 mikrolitrów PBS, aby zapobiec odwodnieniu i inkubuj odtworzone żele z błony podstawnej przez noc w temperaturze 37 stopni Celsjusza. Gdy będziesz gotowy do kontynuowania, usuń PBS z odtworzonych żeli membranowych podstawy i dodaj 250 mikrolitrów lodowatej, podwójnie destylowanej wody do każdej studzienki. Inkubować żele w temperaturze czterech stopni Celsjusza przez 16 do 24 godzin, aby upewnić się, że matryca jest całkowicie upłynniona.

Następnie przenieś skroploną membranę podstawną do 1,5 mililitrowej probówki i zmierz emisję fluorescencyjną roztworu za pomocą spektrofotometru. Następnie odwirować roztwór i usunąć powstały supernatant. Ponownie zawiesić osad w 500 mikrolitrach roztworu zawierającego 20 miligramów na mililitr bromku cyjanu i 70% kwasu mrówkowego.

Próbki należy inkubować przez noc w temperaturze pokojowej. Następnie użyj jednorazowej strzykawki o pojemności jednego mililitra, aby przenieść ponownie zawieszony żel z błony podstawnej do kasety dializacyjnej z odciętą masą cząsteczkową 3,5 kilodaltonów. Zanurz kasetę w szklanej zlewce o pojemności 500 mililitrów zawierającej 500 mililitrów podwójnie destylowanej wody.

I zamieszaj wodę za pomocą mieszadła magnetycznego. Umieść ten zestaw na noc w temperaturze czterech stopni Celsjusza, aby usunąć wszelkie ślady bromku cyjanu i kwasu mrówkowego. Użyj jednorazowej strzykawki o pojemności jednego mililitra, aby przenieść dializowany roztwór z kasety do rurki o pojemności 1,5 mililitra.

Następnie przeanalizuj roztwór, uruchamiając go na 12% żelu poliakrylamidowym. Zabarwić żel srebrną plamą, aby uwidocznić wzór elektroforetyczny peptydów matrycy bromku cyjanolu. Zaczynając od żeli z membraną podstawną pokrytych PBS, spłucz żele jeszcze dwa razy 300 mikrolitrami PBS zawierającymi 0,1 milimoli chlorku wapnia.

I 0,5 milimola chlorku magnezu. Przez pięć minut w temperaturze pokojowej. Następnie usuń PBS i dodaj 300 mikrolitrów 4% paraformaldehydu, aby pokryć każdy odtworzony żel z membraną podstawną.

Inkubować żele przez 30 minut w temperaturze pokojowej, aby utrwalić odtworzone składniki błony podstawnej. Następnie usuń utrwalacz i dodaj 300 mikrolitrów roztworu hartowniczego zawierającego 75 milimoli chlorku amonu i 0,5 milimoli chlorku magnezu. Inkubować roztwór przez pięć minut w temperaturze pokojowej, a następnie usunąć roztwór i powtórzyć płukanie jeszcze cztery razy.

Po ostatnim płukaniu dodaj 300 mikrolitrów buforu immunofluorescencyjnego do odtworzonych żeli z błony podstawnej, aby zapobiec niespecyficznym reakcjom. Inkubować żele w roztworze przez dwie godziny w temperaturze pokojowej na platformie wstrząsającej. Następnie usuń bufor blokujący immunofluorescencję.

I dodaj 300 mikrolitrów przeciwciała pierwszorzędowego, które rozcieńcza się w buforze blokującym. Inkubować odtworzone żele błony podstawnej w temperaturze czterech stopni Celsjusza przez 16 godzin. Następnego dnia usuń przeciwciało pierwotne i przemyj żele trzykrotnie 300 mikrolitrami buforu immunofluorescencyjnego.

Wstrząsaj żelami w temperaturze pokojowej na platformie do wytrząsania przez 10 minut po każdym dodaniu buforu. Następnie usunąć bufor i dodać 300 mikrolitrów znakowanego kwiatowo przeciwciała drugorzędowego, rozcieńczonego w buforze blokującym. Umieścić próbki na platformie do wytrząsania i inkubować żele przez dwie godziny w temperaturze pokojowej.

Usuń przeciwciało drugorzędowe. Przepłukać próbkę w buforze immunofluorescencyjnym, a następnie PBS, a następnie utrwalić i schłodzić próbki po raz drugi. Na koniec zamontuj żele i użyj mikroskopu, aby przeanalizować tworzenie się gęstych wiązek.

Aby utworzyć acini gruczołu krokowego, rozcieńczyć 5 000 komórek RWPE-1 w 300 mikrolitrach kompletnego KSFM, uzupełnionego 2% roztworem błony podstawnej. W przypadku agregatów komórek nowotworowych gruczołu krokowego rozcieńczyć 2 500 komórek PC3 w 300 mikrolitrach pożywki hodowlanej RPMI-1640, uzupełnionej 2% roztworu błony podstawnej. Po całonocnej inkubacji odtworzonych żeli błony podstawnej w PBS, przepłukać je dwukrotnie 500 mikrolitrami pożywki hodowlanej.

Przed wysianiem komórek. Delikatnie zasiaj komórki na natywnych i zaawansowanych błonach podstawnych, usztywnionych produktem końcowym glikacji. I ostrożnie umieść kultury w inkubatorze, aby zapewnić równomierne rozprowadzenie rosnących acini i sferoidów.

W przypadku komórek tworzących acini należy zmieniać pożywkę co dwa dni na świeżą pożywkę hodowlaną, zawierającą 2% roztworu błony podstawnej. Aby zapewnić, że komórki mają czynniki wzrostu wymagane do prawidłowej homeostazy acini. Po sześciu dniach w hodowli komórki nabłonka prostaty tworzą acini na natywnej odtworzonej błonie podstawnej.

I są zorganizowane w jednolite sferoidy komórek nabłonkowych. Te acini mają również cechy wysoce zorganizowanych PEC z polaryzacją wierzchołkową do podstawowej i widzialną przestrzenią świetlną. Podczas hodowli przez sześć dni na usztywnionej błonie komórki mają zaburzoną architekturę.

I zmień kształt z sferoidalnego na wielokątny. Ponadto te acini są bardzo zdezorganizowane. I straciły polaryzację wierzchołkową do podstawowej, z małą lub żadną przestrzenią świetlną.

Dotyczy to również komórek pochodzących z gruczołu krokowego dotkniętego łagodnym rozrostem gruczołu krokowego. Kiedy zmierzono komórki guza prostaty, okazało się, że komórki są dłuższe na sztywnej, odtworzonej błonie podstawnej, a także migrują szybciej i mają zwiększoną trwałość komórek. Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak modelować wpływ sztywności błony podstawnej na zachowanie nabłonka i komórek nowotworowych.

Podejmując się tej procedury, należy pamiętać, że indukowany jest pożądany poziom sztywności błony podstawnej, a poszczególne acini lub sferoidy s są prawidłowo uformowane. Po jej opracowaniu, technika ta utorowała drogę naukowcom w dziedzinie onkologii do zbadania indukcji inwazji komórek rakowych przez sztywność błony podstawnej gruczołu krokowego. Zgodnie z tym protokołem można przeprowadzić inne metody, takie jak immunoblotting lizatu komórkowego, aby odpowiedzieć na dodatkowe pytania dotyczące szlaku sygnałowego, modulowanego sztywnością błony podstawnej.

Nie zapominaj, że praca z cyjanoborowodorkiem sodu, bromkiem cyjanu i kwasem mrówkowym może być bardzo niebezpieczna, a podczas pracy w dygestoriach należy zawsze zachować środki ostrożności, takie jak noszenie fartucha laboratoryjnego, rękawiczek, osłony twarzy i respiratora.