Oczyszczanie całego genomu pozachromosomalnego kolistego DNA z komórek eukariotycznych

Ogólnogenomowa puryfikacja pozachromosomalnego kolistego DNA z komórek eukariotycznych. Cześć, jestem Rasmus. Przedstawię tutaj cały schemat metody puryfikacji kolistego DNA.

W pierwszej części hodowane i zbierane są komórki drożdży. Następnie koliste DNA jest oczyszczane i powielane w trzech etapach. Pierwszym z nich jest rozdział kolumnowy, podczas którego koliste DNA jest oczyszczane i wzbogacane.

Następnie, poprzez potraktowanie DNA egzonukleazą w celu strawienia całego pozostałego linearnego DNA, a na koniec poprzez amplifikację kolistego DNA przy użyciu polimerazy phi-29. W piątej części niniejszego protokołu koliste cząsteczki DNA zostaną zsekwencjonowane, a odczyty zmapowane do genomu referencyjnego Saccharomyces cerevisiae. Na końcu tego filmu przedstawimy kilka reprezentatywnych wyników.

Omówimy perspektywy przyszłych badań oraz zalety stosowania tej metody. Część pierwsza,y zbieranie komórek. Kultura startowa jest hodowana w temperaturze 30 °C z wytrząsaniem do osiągnięcia maksymalnej gęstości, która wynosi około 200 milionów komórek na mililitr i jest osiągana po 24 do 48 godzinach.

Wyhodowaną kulturę przenosi się do probówki Falcon i pelletuje poprzez wirowanie przez trzy minuty. Nadpływ zostaje usunięty. Duży pellet miesza się w wstrząsarce w buforze TE, a następnie ponownie pelletuje przez wirowanie.

Część druga, oczyszczanie kolumnowe. Na tym etapie wykorzystujemy komercyjnie dostępny zestaw do oczyszczania kolumnowego, który pozwala uzyskać wysoko oczyszczone plazmidy z bakteryjnego genomowego DNA. Przed zastosowaniem tego zestawu w przypadku drożdży konieczne jest rozbicie ściany komórkowej.

Jest to osiągane poprzez ponowne zawieszenie przemytego osadu komórkowego w buforze L-1 z zestawu. Zawiesinę komórkową przenosi się do probówki do mikrowirówki i dodaje szklane kuleczki w ilości stanowiącej jedną trzecią całkowitej objętości. Próbkę mieszano w wstrząsarze typu vortex z maksymalną prędkością przez 10 minut, a kuleczki usuwano poprzez wirowanie z prędkością 2 000 obr./min przez 30 sekund.

Nadpływ przenosi się do nowej probówki. W tej metodzie do nadpływu dodaje się silnie rozcieńczone plazmidy w trzech różnych stosunkach. Proponujemy włączenie silnie rozcieńczonego plazmidu do cyklu.

Może to służyć jako wewnętrzne przewodniki referencyjne. Można ich użyć do kontroli jakości puryfikacji i amplifikacji DNA, a także do półilościowej oceny zawartości niecyklicznych cząsteczek DNA na komórkę przy użyciu tych plazmidów spike-in. Należy dodawać jedynie silnie rozcieńczone plazmidy, ponieważ w przeciwnym razie wpłyną one na rozdzielczość sekwencjonowania innych cyklicznych cząsteczek DNA.

Zawiesinę komórkową zawierającą dodane plazmidy traktuje się roztworem L-2 z zestawu, a następnie postępuje zgodnie z protokołem zestawu. Po nałożeniu próbki na kolumnę białka, lipidy i chromosomalne DNA są usuwane poprzez dwukrotne przemycie kolumny. Pozakomórkowe koliste DNA są silnie wzbogacone w frakcji eluatem.

Część trzecia, trawienie liniowego DNA. Na tym etapie wykorzystujemy egzonukleazę do strawienia pozostałego liniowego DNA. Egzonukleaza zależna od ATP specyficznie celuje w liniowe dwuniciowe i jednoniciowe DNA, nie trawiąc DNA kolistego.

Specyficzność egzonukleazy względem liniowego DNA została potwierdzona za pomocą elektroforezy żelowej po 29 godzinach inkubacji z DNazą. Wyniki pokazują, że DNA genomowe ulega trawieniu, podczas gdy DNA plazmidowe pozostaje nienaruszone, co wskazuje czerwona strzałka. Drożdże posiadają 16 chromosomów o długości do 1 500 kilobaz.

Aby ułatwić trawienie egzonukleazą, stosuje się rzadko tnącą endonukleazę w celu uzyskania zwiększonej liczby dostępnych końców DNA. W przypadku użycia enzymu restrykcyjnego NotI, każdy chromosom jest przecinany do siedmiu razy, zgodnie z oznaczeniem. DNA oczyszczone kolumnowo poddaje się działaniu NotI w temperaturze 37°C w bloku grzewczym przez noc.

Po inaktywacji termicznej NotI, przecięte DNA poddaje się działaniu egzonukleaz w temperaturze 37°C zgodnie z protokołem producenta. Po traktowaniu egzonukleazami, enzymy są inaktywowane termicznie w temperaturze 70°C przez 30 minut. Trawienie całego liniowego DNA chromosomowego przy użyciu dodatkowego ATP i egzonukleazy może potrwać kilka dni. Aby upewnić się, że całe liniowe DNA zostało całkowicie strawione, próbki analizuje się metodami PCR lub qPCR, wykorzystując wewnętrzny gen referencyjny, taki jak ACTI.

Część czwarta, amplifikacja DNA. Na tym etapie wzbogacamy i amplifikujemy koliste DNA przy użyciu polimerazy phi-29. Reakcja zachodzi w temperaturze 30°C z wykorzystaniem losowych oligonukleotydów heksamerowych oraz phi-29.

Polimeraza charakteryzuje się wysoką wiernością oraz aktywnością korekcyjną, co zapewnia nieobciążoną amplifikację DNA. Każda polimeraza może, poprzez replikację z kolistym wzorcem (rolling circle replication), zsyntetyzować do 100 kilobaz DNA. Polimeraza wykazuje również wysoką procesywność, amplifikując DNA do 10⁹ razy.

Część piąta, sekwencjonowanie. Zgodnie z protokołem dla platformy wysokoprzepustowego sekwencjonowania nowej generacji, DNA poddano sonikacji do średniej wielkości 300 par zasad i zsekwencjonowano jako jednoniciowe odczyty o długości 141 nukleotydów. Odczyty sekwencji zmapowano do genomu referencyjnego Saccharomyces cerevisiae, korzystając z bezpłatnej bazy danych Galaxy.

Sekwencjonowane dane są przesyłane do Galaxy, a odczyty są mapowane przy użyciu narzędzia do wyrównywania krótkich odczytów Bowtie2, które umożliwia mapowanie odczytów częściowych. Część szósta, reprezentatywne wyniki. Po sekwencjonowaniu i mapowaniu do genomu referencyjnego Saccharomyces cerevisiae, odczyty można zwizualizować w przeglądarce genomu w oprogramowaniu Galaxy.

DNA o pochodzeniu kolistym można na przykład zliczać jako regiony zawierające spójne odczyty o długości większej niż jeden kilobaza, co jest wskazane na ekranie. Przykładem regionu na chromosomie czwartym, który zawiera spójne odczyty obejmujące więcej niż jeden kilobaza, jest region z genami transporterów heksóz sześć i siedem. Przy zastosowaniu tej metody w populacji komórek drożdży, w tym locus często odnajdywane są zmapowane odczyty, a pokrycie odczytami wyraźnie sugeruje, że koliste DNA utworzyło się pomiędzy paralogicznymi genami transporterów heksóz.

Ze względu na wysoką homologię sekwencji między genami transporterów heksoz, przypuszczamy, że nieprawidłowa rekombinacja homologiczna prowadzi do cyrkularyzacji tego DNA. Modelem mutacji DNA kolistego jest sytuacja, w której proces naprawy DNA przebiega w sposób niepełny. Na przykład, jeśli w elemencie repetytywnym wystąpi pęknięcie obu nici, sekwencja homologiczna na tej samej chromatydzie może zostać wykorzystana jako matryca do naprawy DNA poprzez rekombinację homologiczną.

Po resekcji, inwazji nici, syntezie DNA i rozdzieleniu wszystkich struktur pośrednich, z genomu może wyłonić się kolista cząsteczka DNA, co prowadzi do delecji DNA w chromosomie. Efekty traktowania DNA egzonukleazami oraz polimerazą phi-29 można zwizualizować przy użyciu barwienia jodkiem propidyny. Kontrole barwienia DNA genomicznego wyglądają jak na obrazie po lewej stronie, natomiast DNA plazmidowe jak na obrazie po prawej stronie.

Po 29 godzinach traktowania 400 nanogramami genomowego DNA egzonukleazą, większość DNA ulega strawieniu, co pokazano na lewym obrazie. Wynik ten został potwierdzony za pomocą elektroforezy żelowej, zgodnie z obrazem żelu po prawej stronie. Po 72 godzinach traktowania egzonukleazą, a następnie syntezie DA przez polimerazę phi-29, wciąż można zidentyfikować miliony kopii DNA.

Podobnie, po 29 godzinach inkubacji 400 nanogramów DNA genomowego oraz dodatkowych 100 nanogramów DNA plazmidowego z egzonukleazą, większość DNA genomowego uległa trawieniu. Jednak DNA plazmidowe nie zostało strawione, co widać na obrazie żelu. Po poddaniu próbki inkubowanej z egzonukleazą przez 72 godziny działaniu polimerazy phi-29, większość amplifikowanego DNA pojawiła się w formie zabarwionych plazmidów.

W pierwszej kolejności przesialiśmy geny pod kątem obecności kolistego DNA i byliśmy naprawdę zaskoczeni, odkrywszy kilkaset różnych typów próbek DNA. Tak, fakt, jak powszechne są koliste DNA w populacji drożdży, był naprawdę zaskakujący i uważamy, że metodę tę można zastosować w wielu rodzajach badań. Oczywistym kierunkiem byłoby przyjrzenie się tkankom ludzkim.

Wiemy, że geny mogą ulegać amplifikacji na elementach acyrkularnych, oczywiście w drożdżach, a nawet w komórkach nowotworowych. Myślę, że ogólnie interesujące będzie przyjrzenie się komórkom somatycznym i zbadanie, jaki typ kolistego DNA tam znajdziemy oraz w jaki sposób możemy wpłynąć na ten proces cyrkularyzacji. W starzejących się komórkach mamy kręgi, które gromadzą się wraz z wiekiem, i spodziewamy się, że na kolistym DNA znajdzie się więcej genów.

Dodatkowo chcielibyśmy przyjrzeć się molekularnym mechanizmom cyrkularyzacji DNA; oczywistym rozwiązaniem jest zbadanie drożdży, w których dysponujemy mutantami z defektami w zakresie rekombinacji homologicznej oraz niehomologicznej. Badając te mutanty, spodziewamy się, że profil cyrkularyzacji DNA będzie różnił się w zależności od rodzaju mutanta i mamy nadzieję, że dzięki badaniom nad drożdżami będziemy w stanie dowiedzieć się znacznie więcej o cyrkularyzacji DNA. W porównaniu z innymi metodami, metoda ta jest znacznie bardziej czuła. Możliwe będzie wykrycie cyklicznego DNA w około jednej na 10 000 komórek.

Z tego, co wiem z badań przeprowadzonych w ramach obszernych prób, allele mutantów muszą zazwyczaj osiągnąć proporcję od 1 do 10% populacji, aby można było je wykryć. Zgadza się, a stosując tę technikę, nie trzeba posiadać żadnej wiedzy uprzedniej o utworzonych kolistych cząsteczkach DNA, w przeciwieństwie do innych technik, w których koliste cząsteczki DNA muszą być w pewnym stopniu związane, aby można było je łatwo wykryć jako amplifikacje za pomocą sekwencjonowania lub barwienia chromosomów.

Tak, zatem uważam, że główną zaletą jest czułość i mam nadzieję, że będziemy mogli wykorzystać tę metodę do wielu interesujących zastosowań.