Name: Przygotowanie kolonii jednokohortowych i leczenie hormonalne robotnic pszczół miodnych w celu analizy fizjologii związanej z rolą i/lub układem hormonalnym (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-09-06T13:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 53 s
Description: Poznaj metodę przygotowania kolonii jednokohortowych pszczół miodnych i zabiegów hormonalnych z hormonem młodocianym oraz ekdysonem. Technika umożliwia analizę fizjologii związanej z rolą robotnic i regulacją endokrynną.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Ta praca była wspierana przez Grant-in-Aid na Badania Naukowe (B) oraz Grant-in Aid na Badania Naukowe w Innowacyjnych Obszarach 'Systemy Etologii Molekularnej' z Ministerstwa Edukacji, Kultury, Sportu, Nauki i Technologii (MEXT) Japonii. T.U. był beneficjentem Grant-Aid od Japan Society for the Promotion of Science for Young Scientists.

1. Przygotowanie kolonii jednokohortowych
<ol>
	<li>Przygotuj trzy rodziny pszczół miodnych, aby stworzyć dwie kolonie jednokohortowe i uzyskać wystarczającą liczbę nowo powstałych robotnic.
	<ol>
		<li>Sprawdź, czy niektóre poczwarki w zasklepionych komórkach obwodowych grzebieni mają brązowe oczy i pigmentowany naskórek, otwierając zakryte grzebienie za pomocą pęsety. Jeśli poczwarki te występują w obwodowych komórkach grzebieniowych, większość poczwarek w całych grzebieniach pojawi się w ciągu około 1-3 dni.</li>
		<li>Następnie zbierz plastry zawierające te poczwarki po usunięciu wszystkich przylegających dorosłych pszczół za pomocą pędzla i wymieszaj plastry z trzech kolonii, aby zminimalizować zmienność między rodzinami.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Zebrane grzebienie umieścić w pustym ulu i inkubować w temperaturze 33 °C w wilgotnych warunkach (>60% wilgotności względnej). Zbierz około 6 000 nowo powstałych robotnic w ciągu 3 dni (3 000 robotnic na kolonię) z zebranych grzebieni.</li>
	<li>Określ liczbę robotnic na podstawie wagi pięciu nowo wyłonionych robotnic losowo wybranych z niezmanipulowanych kolonii.
	<ol>
		<li>Zważ pięć nowo wyłonionych robotnic losowo wybranych z niezmanipulowanych kolonii za pomocą maszyn ważących. 
		Uwaga: Waga pięciu nowo powstałych pracowników wynosi na ogół 500-600 mg.</li>
		<li>Oszacuj liczbę zebranych pracowników, dzieląc wagę zebranych pracowników przez średnią wagę pięciu nowo przybyłych pracowników.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Nałóż ślady farby na klatki piersiowe około 1 800 robotnic (900 robotnic na kolonię) za pomocą wodnych markerów do plakatów. 
	Uwaga: Zmywalny marker, który służy do nakładania farby, jest wymieniony w Tabeli materiałów.</li>
	<li>Wprowadź królową i około 3000 robotnic w wieku 0-2 dni do nowego pudełka ula, które zawiera dwa plastry, jeden plaster zawierający miód i pyłek jako konserwowaną żywność, a drugi pusty plaster do składania jaj przez królową. Zbierz plaster zawierający miód i pyłek z innej niezmodyfikowanej kolonii po usunięciu wszystkich przylegających pszczół. 
	Uwaga: Zaleca się użycie skrzynki ula nuklearnego (skrzynka ula o małych rozmiarach).</li>
	<li>Zbieraj pszczoły pielęgniarki i przedwcześnie rozwinięte zbieraczki ze śladami farby 6 do 8 dni po utworzeniu kolonii jednokohortowych.
	<ol>
		<li>Aby zebrać pszczoły pielęgniarki, podnieś robotnice, które wkładają głowy do komórek grzebieniowych, aby zadbać o czerw. Użyj pęsety, aby zebrać pszczoły pielęgniarki z plastrów, które zawierają wiele czerwiu i dorosłych robotnic. 
		Uwaga: Jeśli HPG zebranych robotnic powstaje podczas preparacji zgodnie z opisem w kroku 1.7, robotnice te definiuje się jako pszczoły pielęgniarki. Zaleca się trzymanie klatki piersiowej pęsetą w celu podniesienia robotników z grzebieni.</li>
		<li>Aby zebrać zbieracze, użyj siatki przeciw owadom, aby złapać robotnice, które wracają do uli z ładunkiem pyłku na tylnych nogach. 
		Uwaga: Jeśli HPG schwytanych robotnic wydają się skurczone po wypreparowaniu zgodnie z opisem w kroku 1.7, robotnice te są definiowane jako zbieracze.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Podziel HPG na trzy grupy: "Rozwinięty", "Pośredni" i "Skurczony" przez rozbiór pod mikroskopem stereoskopowym.
	<ol>
		<li>Znieczulij 10-15 pszczół w klatce dla owadów w lodówce przez 10-15 minut, aż pszczoły nie będą mogły latać ani chodzić. Następnie przenieś pszczoły na lód i zakończ znieczulenie na lodzie przez 5 min. 
		Uwaga: Uzyskanie znieczulenia zajmuje łącznie około 15-20 minut. Jeśli czas znieczulenia wymaga skrócenia, liczbę pszczół w klatce należy zmniejszyć do 1-3 pszczół na klatkę.</li>
		<li>Odetnij głowę od ciała nożyczkami i pęsetą. Zamocuj głowę na wosku dentystycznym umieszczonym na szalce Petriego za pomocą szpilek. Włóż dwa kołki w podstawy anten, aby zamocować głowicę. Namocz stałe głowice w soli fizjologicznej (130 mM NaCl, 5 mM KCl, 1 mM CaCl2).</li>
		<li>Usuń przednią stronę naskórka głowy za pomocą cienkiej pęsety i noża chirurgicznego pod mikroskopem lornetkowym. 
		Uwaga: HPG można łatwo znaleźć w głowie po usunięciu naskórka. HPG to narząd botryoidalny, który istnieje wokół mózgu w głowie.</li>
		<li>Usuń tkankę tchawicy, która jest białą błoniastą tkanką pod naskórkiem. Następnie wypreparuj HPG z głowy, powoli ciągnąc je pęsetą.</li>
		<li>Klasyfikować HPG z dużymi i okrągłymi acini jako "rozwinięte". Klasyfikuj HPG z małymi i zniekształconymi acini jako "skurczone". Klasyfikować HPG, które nie odpowiadają ani "rozwiniętym", ani "skurczonym", jako "pośrednie". 
		Uwaga: Reprezentatywne fotografie, które pokazują te trzy klasy stanów HPG, są pokazane na rysunku 2.</li>
		<li>Poddaj "rozwinięte" i "skurczone" HPG ekstrakcji RNA odpowiednio jako "HPG pszczół pielęgniarek" i "HPG zbieraczy" i porównaj ekspresję genów w HPG między pszczołami pielęgniarkami a zbieraczkami (sekcja 4).</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. Wtrysk 20E
<ol>
	<li>Zbierać pszczoły pielęgniarki z typowych rodzin pszczelich zgodnie z opisem w procedurze 1.6.1. 
	Uwaga: HPG nie mogą być badane u tych pszczół, ponieważ pszczoły będą hodowane.</li>
	<li>Znieczulić pszczoły w temperaturze 4 °C w lodówce (nie na lodzie). 
	Uwaga: Uzyskanie znieczulenia zajmuje około 30 minut. Jeśli czas znieczulenia zostanie skrócony, liczbę pszczół w klatce należy zmniejszyć do 1-3 pszczół na klatkę.</li>
	<li>Za pomocą pęsety unieruchamiaj pszczoły na wosku dentystycznym umieszczonym na szalce Petriego.</li>
	<li>Wstrzyknąć 1 μl roztworu 20E w przednią część głowy za pomocą końcówki iniekcyjnej wykonanej ze skalibrowanej mikropipety kapilarnej za pomocą ściągacza do szklanych igieł.
	<ol>
		<li>Rozpuścić 20E w mieszaninie etanolu i soli fizjologicznej (130 mM NaCl, 5 mM KCl, 1 mM CaCl2) (1:4) w stężeniu 2,5 μg/μl.</li>
		<li>Podłączyć końcówkę do wstrzykiwań do gumowej rurki, a żółtą końcówkę do mikropipety podłączyć do przeciwnej strony probówki.</li>
		<li>Umieścić 1 μl roztworu 20E na parafilmie za pomocą mikropipety, przytrzymać żółtą końcówkę mikropipety w ustach i wciągnąć roztwór do końcówki iniekcyjnej.</li>
		<li>Włożyć końcówkę do wstrzykiwań do podstawy anten i wstrzyknąć roztwór, przedmuchując przez żółtą końcówkę mikropipety. 
		Uwaga: Protokół przedstawiony w tym kroku jest reprezentatywną metodą wstrzykiwania, ale w razie potrzeby ze względów bezpieczeństwa zaleca się użycie automatycznej wtryskarki20.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Pszczoły, którym wstrzyknięto nasiona, należy hodować w klatkach dla owadów w temperaturze 33-36 °C (idealna temperatura to 35 °C) w ciemnych i wilgotnych warunkach (>60 % wilgotności względnej) przez 1 lub 3 dni. Dostarczyć pszczołom mieszaninę miodu i wody (1:1). W razie potrzeby policz pszczoły, które przeżyły po wstrzyknięciu.</li>
</ol>
3. Zastosowanie metoprenu
<ol>
	<li>Zbierz plastry zawierające poczwarki z typowych kolonii po usunięciu wszystkich przylegających dorosłych pszczół za pomocą pędzla. Inkubuj grzebienie w temperaturze 33-36 °C (idealna temperatura to 35 °C) w wilgotnych warunkach (>60% wilgotności względnej) przez okres do 1 dnia.</li>
	<li>Zbierz nowo wylęgłe pszczoły z zebranych plastrów i nałóż ślady farby na ich klatkę piersiową za pomocą farby plakatowej, zgodnie z opisem w protokole przygotowania kolonii jednokohortowych. Zwróć oznaczone pszczoły do ich kolonii.</li>
	<li>Po 6 dniach zbierz pomalowane robotnice (w wieku 6 dni) z kolonii. Podnieś pomalowane robotnice z grzebieni, przytrzymując ich klatki piersiowe pęsetą.</li>
	<li>Znieczulić pszczoły w temperaturze 4 °C w lodówce (nie na lodzie), jak w procedurze 2.2. Za pomocą pęsety unieruchamić pszczoły na wosku dentystycznym umieszczonym na szalce Petriego i za pomocą mikropipety nanieść na ich głowy 1-5 μl roztworu metoprenu (50-250 μg/μl) rozpuszczonego w acetonie. Użyj końcówki filtra, która jest odporna na aceton. 
	Uwaga: Aceton może mieć szkodliwy wpływ na pszczoły, prowadząc do śmierci. W przypadku zaobserwowania wysokiej śmiertelności pszczół zaleca się zmniejszenie objętości acetonu do minimum 1 μl.</li>
	<li>Hoduj pszczoły w klatkach dla owadów w temperaturze 33-36 °C (idealna temperatura to 35 °C) przez 7 dni w ciemnych i wilgotnych warunkach (>60% wilgotności względnej). Dostarczyć pszczołom mieszaninę miodu i wody (1:1). W razie potrzeby policz pszczoły, które przeżyły po zastosowaniu miejscowym. 
	Uwaga: W tym artykule pszczoły, które przeżyły, są liczone 7 dni po zastosowaniu (tabela 3).</li>
</ol>
4. Ekstrakcja RNA i ilościowy RT-PCR
<ol>
	<li>Znieczulić pszczoły i przeprowadzić sekcję HPG zgodnie z opisem w krokach od 1.7.1 do 1.7.4.</li>
	<li>Wypreparowane HPG należy zebrać w probówce do mikrowirówki na suchym lodzie i przechowywać w temperaturze -80 °C do momentu użycia.</li>
	<li>Dodać 400 μl odczynnika do denaturacji białek. 
	Uwaga: Ten odczynnik jest dostępny w handlu (patrz Tabela materiałów).</li>
	<li>Homogenizuj tkanki HPG za pomocą ręcznego miksera elektrycznego z tłuczkiem homogenizacyjnym, który mieści się w probówce do mikrowirówki. Homogenizować z prędkością obrotową około 300 obr./min przez 1 minutę na lodzie w celu rozbicia i lizy komórek tkankowych. 
	Uwaga: Ręczny mikser elektryczny jest dostępny w handlu (patrz Tabela materiałów).</li>
	<li>Dodaj 80 μl chloroformu i dobrze wymieszaj. Inkubować przez 5 minut w temperaturze pokojowej.</li>
	<li>Odwirować probówki do mikrowirówek o sile 14,170 x g przez 15 minut w temperaturze 4 °C. Przenieść fazę wodną do nowej probówki. Dodać równą objętość izopropanolu i 1 μl glikogenu (5 mg/ml). Inkubować w temperaturze -20 °C przez co najmniej 20 minut.</li>
	<li>Probówki do mikrowirówek odwirowywać przy 14,170 x g przez 10 minut w temperaturze 4 °C i usunąć supernatant.</li>
	<li>Dodać 400 μl 75% etanolu do osadu i dobrze wymieszać, odwirować probówki do mikrowirówek o stężeniu 14,170 x g przez 15 minut w temperaturze 4 °C i usunąć sklarowany nad osadem. Powtórz te procedury jeszcze raz.</li>
	<li>Suszyć granulat na powietrzu przez 5-10 minut, a następnie rozpuścić go w 10 μl wody wolnej od RNaz. 
	Uwaga: Całkowite wysuszenie osadu może spowodować nierozpuszczalność osadu RNA w wodzie. Tak więc osad, który jest lekko mokry, nadaje się do rozpuszczenia.</li>
	<li>Zmierz stężenie RNA za pomocą spektrofotometru, takiego jak NanoDrop lub podobnego.</li>
	<li>Potraktować 500 ng całkowitego RNA 2,0 U DNazy I, inkubując w temperaturze 37 °C przez 30 minut w celu degradacji zanieczyszczającego genomowego DNA.</li>
	<li>Odwrotna transkrypcja 200 ng RNA poddanego działaniu DNazy I i przeprowadzenie PCR w czasie rzeczywistym przy użyciu dostępnych na rynku zestawów (patrz lista w Tabeli materiałów i odczynników) oraz starterów specyficznych dla genu (mrjp2; 5'-AAATGGTCGCTCAAAATGACAGA-3' i 5'-ATTCATCCTTTACAGGTTTGTTGC-3', Hbg3; 5'-TACCTGGCTTCGTGTCAAC-3' i 5'-ATCTTCGGTTTCCCTAGAGAATG-3'). Wykonaj PCR w następujący sposób: [95 °C x 30 sekund + (95°C x 5 sekund + 60°C x 15 sekund + 72 °C x 20 sekund) x 45-55 cykli].</li>
	<li>Normalizuj ilość transkryptu z ilością czynnika elongacji 1α-F2 (EF1α˗F2) lub białka rybosomalnego 49 (rp49)9,16,21,22. Geny te są wiarygodnymi genami kontrolnymi do analizy ekspresji genów w HPG za pomocą qRT-PCR.</li>
	<li>Wykonaj dwustronny test t, aby wykryć znaczące różnice między dwiema grupami eksperymentalnymi (pszczoły pielęgniarki vs. przedwcześnie rozwinięte zbieracze, pszczoły leczone 20E vs. pszczoły kontrolne oraz pszczoły leczone metoprenem vs. pszczoły kontrolne) za pomocą oprogramowania statystycznego. 
	Uwaga: Jeśli test F zakłada jednorodność wariancji, można użyć testu t Studenta. Jeśli nie, można użyć testu t Welcha.</li>
</ol>

<ol><li>Wilson, E. O. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aWilson%2C+EO+%22The+insect+societies%22">The insect societies</a>. , Harvard university press. (1971).</li>
<li>Winston, M. L. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aWinston%2C+ML+%22The+biology+of+the+honey+bee%22">The biology of the honey bee</a>. , Harvard university press. (1987).</li>
<li>Lindauer, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ein+Beitrag+zur+Frage+der+Arbeitsteilung+im+Bienenstaat%5BTitle%5D)+AND+%22Zeitschrift+f%C3%BCr+vergleichende+Physiologie%22%5BJournal%5D)">Ein Beitrag zur Frage der Arbeitsteilung im Bienenstaat.</a> Zeitschrift für vergleichende Physiologie. 34 (4), 299-345 (1952).</li>
<li>Sakagami, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Untersuchungen+uber+die+Arbeitsteilung+in+einen+Zwergvolk+der+Honigbienen.+Beitrage+zur+Biologie+des+Bienenvolkes%2C+Apis+mellifera+L%5BTitle%5D)+AND+%22I.+Jap+J+Zool%22%5BJournal%5D)">Untersuchungen uber die Arbeitsteilung in einen Zwergvolk der Honigbienen. Beitrage zur Biologie des Bienenvolkes, Apis mellifera L.</a> I. Jap J Zool. 11, 117-185 (1953).</li>
<li>Kubo, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Change+in+the+expression+of+hypopharyngeal-gland+proteins+of+the+worker+honeybees+%28Apis+mellifera+L.%29+with+age+and%2For+role%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biochem%22%5BJournal%5D)">Change in the expression of hypopharyngeal-gland proteins of the worker honeybees (Apis mellifera L.) with age and/or role.</a> J Biochem. 119 (2), 291-295 (1996).</li>
<li>Ohashi, K., Natori, S., Kubo, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Change+in+the+mode+of+gene+expression+of+the+hypopharyngeal+gland+cells+with+an+age-dependent+role+change+of+the+worker+honeybee+Apis+mellifera+L%5BTitle%5D)+AND+%22Eur+J+Biochem%22%5BJournal%5D)">Change in the mode of gene expression of the hypopharyngeal gland cells with an age-dependent role change of the worker honeybee Apis mellifera L.</a> Eur J Biochem. 249 (3), 797-802 (1997).</li>
<li>Ohashi, K., Natori, S., Kubo, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expression+of+amylase+and+glucose+oxidase+in+the+hypopharyngeal+gland+with+an+age-dependent+role+change+of+the+worker+honeybee+%28Apis+mellifera+L%29%5BTitle%5D)+AND+%22Eur+J+Biochem%22%5BJournal%5D)">Expression of amylase and glucose oxidase in the hypopharyngeal gland with an age-dependent role change of the worker honeybee (Apis mellifera L).</a> Eur J Biochem. 265 (1), 127-133 (1999).</li>
<li>Ohashi, K., Sawata, M., Takeuchi, H., Natori, S., Kubo, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+cloning+of+cDNA+and+analysis+of+expression+of+the+gene+for+alpha-glucosidase+from+the+hypopharyngeal+gland+of+the+honeybee+Apis+mellifera+L%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem+Biophys+Res+Commun%22%5BJournal%5D)">Molecular cloning of cDNA and analysis of expression of the gene for alpha-glucosidase from the hypopharyngeal gland of the honeybee Apis mellifera L.</a> Biochem Biophys Res Commun. 221 (2), 380-385 (1996).</li>
<li>Ueno, T., Nakaoka, T., Takeuchi, H., Kubo, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differential+gene+expression+in+the+hypopharyngeal+glands+of+worker+honeybees+%28Apis+mellifera+L.%29+associated+with+an+age-dependent+role+change%5BTitle%5D)+AND+%22Zoolog+Sci%22%5BJournal%5D)">Differential gene expression in the hypopharyngeal glands of worker honeybees (Apis mellifera L.) associated with an age-dependent role change.</a> Zoolog Sci. 26 (8), 557-563 (2009).</li>
<li>Robinson, G. E., Page, R. E., Strambi, C., Strambi, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hormonal+and+genetic+control+of+behavioral+integration+in+honey+bee+colonies%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Hormonal and genetic control of behavioral integration in honey bee colonies.</a> Science. 246 (4926), 109-112 (1989).</li>
<li>Sullivan, J. P., Fahrbach, S. E., Robinson, G. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Juvenile+hormone+paces+behavioral+development+in+the+adult+worker+honey+bee%5BTitle%5D)+AND+%22Horm+Behav%22%5BJournal%5D)">Juvenile hormone paces behavioral development in the adult worker honey bee.</a> Horm Behav. 37 (1), 1-14 (2000).</li>
<li>Ben-Shahar, Y., Robichon, A., Sokolowski, M. B., Robinson, G. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Influence+of+gene+action+across+different+time+scales+on+behavior%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Influence of gene action across different time scales on behavior.</a> Science. 296 (5568), 741-744 (2002).</li>
<li>Lehman, H. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Division+of+labor+in+the+honey+bee+%28Apis+mellifera%29%3A+the+role+of+tyramine+beta-hydroxylase%5BTitle%5D)+AND+%22J+Exp+Biol%22%5BJournal%5D)">Division of labor in the honey bee (Apis mellifera): the role of tyramine beta-hydroxylase.</a> J Exp Biol. 209 (Pt 14), 2774-2784 (2006).</li>
<li>Mutti, N. S., Wang, Y., Kaftanoglu, O., Amdam, G. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Honey+bee+PTEN--description%2C+developmental+knockdown%2C+and+tissue-specific+expression+of+splice-variants+correlated+with+alternative+social+phenotypes%29%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Honey bee PTEN--description, developmental knockdown, and tissue-specific expression of splice-variants correlated with alternative social phenotypes).</a> PLoS One. 6 (7), e22195(2011).</li>
<li>Whitfield, C. W., Cziko, A. M., Robinson, G. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gene+expression+profiles+in+the+brain+predict+behavior+in+individual+honey+bees%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Gene expression profiles in the brain predict behavior in individual honey bees.</a> Science. 302 (5643), 296-299 (2003).</li>
<li>Ueno, T., Takeuchi, H., Kawasaki, K., Kubo, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Changes+in+the+Gene+Expression+Profiles+of+the+Hypopharyngeal+Gland+of+Worker+Honeybees+in+Association+with+Worker+Behavior+and+Hormonal+Factors%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Changes in the Gene Expression Profiles of the Hypopharyngeal Gland of Worker Honeybees in Association with Worker Behavior and Hormonal Factors.</a> PLoS One. 10 (6), e0130206(2015).</li>
<li>Paul, R. K., Takeuchi, H., Matsuo, Y., Kubo, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gene+expression+of+ecdysteroid-regulated+gene+E74+of+the+honeybee+in+ovary+and+brain%5BTitle%5D)+AND+%22Insect+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Gene expression of ecdysteroid-regulated gene E74 of the honeybee in ovary and brain.</a> Insect Mol Biol. 14 (1), 9-15 (2005).</li>
<li>Takeuchi, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+a+novel+gene%2C+Mblk-1%2C+that+encodes+a+putative+transcription+factor+expressed+preferentially+in+the+large-type+Kenyon+cells+of+the+honeybee+brain%5BTitle%5D)+AND+%22Insect+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Identification of a novel gene, Mblk-1, that encodes a putative transcription factor expressed preferentially in the large-type Kenyon cells of the honeybee brain.</a> Insect Mol Biol. 10 (5), 487-494 (2001).</li>
<li>Takeuchi, H., Paul, R. K., Matsuzaka, E., Kubo, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((EcR-A+expression+in+the+brain+and+ovary+of+the+honeybee+%28Apis+mellifera+L%29%5BTitle%5D)+AND+%22Zoolog+Sci%22%5BJournal%5D)">EcR-A expression in the brain and ovary of the honeybee (Apis mellifera L).</a> Zoolog Sci. 24 (6), 596-603 (2007).</li>
<li>Yamane, T., Miyatake, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reduced+female+mating+receptivity+and+activation+of+oviposition+in+two+Callosobruchus+species+due+to+injection+of+biogenic+amines%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Insect+Physiology%22%5BJournal%5D)">Reduced female mating receptivity and activation of oviposition in two Callosobruchus species due to injection of biogenic amines.</a> Journal of Insect Physiology. 56 (3), 271-276 (2010).</li>
<li>Ben-Shahar, Y., Leung, H. T., Pak, W. L., Sokolowski, M. B., Robinson, G. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((cGMP-dependent+changes+in+phototaxis%3A+a+possible+role+for+the+foraging+gene+in+honey+bee+division+of+labor%5BTitle%5D)+AND+%22J+Exp+Biol%22%5BJournal%5D)">cGMP-dependent changes in phototaxis: a possible role for the foraging gene in honey bee division of labor.</a> J Exp Biol. 206 (Pt 14), 2507-2515 (2003).</li>
<li>Danforth, B. N., Ji, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Elongation+factor-1+alpha+occurs+as+two+copies+in+bees%3A+implications+for+phylogenetic+analysis+of+EF-1+alpha+sequences+in+insects%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Biol+Evol%22%5BJournal%5D)">Elongation factor-1 alpha occurs as two copies in bees: implications for phylogenetic analysis of EF-1 alpha sequences in insects.</a> Mol Biol Evol. 15 (3), 225-235 (1998).</li>
<li>Pandey, A., Bloch, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Juvenile+hormone+and+ecdysteroids+as+major+regulators+of+brain+and+behavior+in+bees%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Opinion+in+Insect+Science%22%5BJournal%5D)">Juvenile hormone and ecdysteroids as major regulators of brain and behavior in bees.</a> Current Opinion in Insect Science. 12, 26-37 (2015).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Przygotowanie kolonii jednokohortowych
Tutaj opisaliśmy protokół zastosowany w naszym poprzednim badaniu16 w celu przygotowania kolonii jednokohortowych do analizy fizjologii HPG związanej ze zmianą roli pszczół robotnic. W rodzinach jednokohortowych obserwowano pszczoły pielęgniarki i przedwcześnie rozwinięte zbieraczki, które spełniały kryteria opisane w procedurach 1.6-1.7 i rycinie 2 (tab. 1). Fotografie na rysunku 2 mogą być pr...

Europejska pszczoła miodna, Apis mellifera, jest owadem eusocjalnym o wysoce zorganizowanym społeczeństwie1. Robotnice pszczół miodnych (kasta robotnicza) są zaangażowane w różne zadania mające na celu utrzymanie aktywności kolonii, a zadania te zmieniają się w zależności od wieku robotnicy pszczoły miodnej po elokcji, co jest określane jako podział pracy związany z wiekiem2-4. Młode robotnice (<13 dni) opiekują się czerwiem w ulu, wydzielając mleczko pszczele (pszczoły karmiące), podczas gdy starsze robotnice (>15 dni) zbierają nektar i pyłek poza ulem (zbieraczki)2-4. Fizjologia pracowników zmienia się w związku z tą zmianą ról. Na przykład funkcja gruczołów podgardłowych (HPG), parzystych gruczołów zewnątrzwydzielniczych znajdujących się w głowie, zmienia się w związku z przesunięciem roli z karmienia na żerowanie2,5. HPG pszczół pielęgniarek syntetyzują głównie główne białka mleczka pszczelego, które są głównymi składnikami mleka pszczelego. Z drugiej strony, zbieracze HPG głównie syntetyzują enzymy metabolizujące węglowodany, takie jak α-glukozydaza III, w celu przetworzenia nektaru na miód poprzez przekształcenie sacharozy w glukozę i fruktozę. Nasze poprzednie badania wykazały, że ekspresja mrjp2, który koduje główne białko mleczka pszczelego, i Hbg3, który koduje α-glukozydazę III, zmienia się podczas zmiany ról6-9.
Aby ustalić, czy zmiany fizjologiczne w tkankach robotnic, w tym w HPG, są związane ze zmianą ról, czy z wiekiem robotnic, przydatne byłoby manipulowanie składem populacji kolonii pszczół miodnych, na przykład przygotowanie kolonii jednokohortowych, w których robotnice prawie w tym samym wieku wykonują różne zadania10,11. Robinson i wsp. (1989) opisał metodę tworzenia kolonii jednokohortowej10. Kolonie jednokohortowe składają się początkowo z królowej i robotnic w wieku 0-2 dni. Kilka dni po założeniu kolonii robotnicy w prawie tym samym wieku podejmują różne zadania. Niektóre robotnice wykonują zadania pielęgnacyjne jak w typowych koloniach, podczas gdy inne robotnice wykonują zadania związane z żerowaniem wcześniej niż zwykle i dlatego nazywane są przedwcześnie rozwiniętymi zbieraczami. Porównania ekspresji genów między pszczołami pielęgniarkami a przedwcześnie rozwiniętymi zbieraczkami dostarczyłyby użytecznych informacji na temat fizjologii tkanek robotnic związanych z rolami12-16. W tym miejscu opisujemy szczegółowy protokół przygotowania kolonii jednokohortowych do analizy fizjologii HPG związanej z rolą i/lub wiekiem16. Pokrótce opisujemy również, jak badać ekspresję genów mrjp2 i Hbg3 za pomocą ilościowej reakcji łańcuchowej polimerazy z odwrotną transkrypcją (RT-PCR) w celu oceny fizjologii HPG.
Oprócz analizy fizjologii pracowników w koloniach jednokohortowych, badanie układu hormonalnego jest ważne dla analizy mechanizmów regulacyjnych fizjologii pracowników związanych z rolą. Hormon juwenilny (JH), który jest znany jako hormon "status quo" u larw owadów, przyspiesza zmianę roli z karmienia na żerowanie u robotnic pszczół miodnych11. Co więcej, ekdyzon, który jest znany jako hormon linienia podczas metamorfozy, może być zaangażowany w zmianę ról, ponieważ geny kodujące cząsteczki sygnalizacyjne ekdyzonu ulegają ekspresji w ciałach grzybów, wyższym centrum mózgu robotnicy17-19. Dlatego opisujemy również szczegółowy protokół zastosowany w naszym poprzednim badaniu16 do leczenia pracowników 20E, który jest aktywną formą ekdyzonu, oraz metoprenem, analogiem JH, w celu analizy wpływu układu hormonalnego na fizjologię HPG (ekspresja mrjp2 i Hbg3).

<table><tbody><tr><td>UNIPOSCA</td><td>Mitsubishi pencil</td><td>PC-5M</td><td>Marker do nanoszenia znaków na pszczoły&nbsp; &nbsp;</td></tr><tr><td>20-hydroksyekdyzon</td><td>Sigma Aldrich</td><td>H5142</td><td></td></tr><tr><td>Metopren</td><td>Sigma Aldrich</td><td>33375</td><td></td></tr><tr><td>Przypadek lęgowy</td><td>owada IRIS OHYAMA</td><td>CP-SS</td><td></td></tr><tr><td>Mieszalnik elektroruchu&nbsp;</td><td>ISO</td><td>23M-R25</td><td>homogenizacja tkanek</td></tr><tr><td>TRIZol Odczynnik</td><td>Invitrogen</td><td>15596-026</td><td>odczynnik do ekstrakcji całkowitego RNA</td></tr><tr><td>DNaza I&nbsp;</td>Zestaw odczynników <td>Takara</td><td>2270A</td><td></td></tr><tr><td>PrimeScript RT</td><td>Takara</td><td>RR037A</td><td>odczynnik do odwrotnej transkrypcji</td></tr><tr><td>SYBR Premix ExTaq II</td><td>Takara</td><td>RR820A</td><td>odczynnik do PCR w czasie rzeczywistym</td></tr><tr><td>LightCycle 1.2 Instrument</td><td>Roche</td><td>12011468001</td><td>instrument do PCR w czasie rzeczywistym</td></tr><tr><td>Kapilary LightCycle (20&mu; l)</td> <td>Roche</td><td>4929292001</td><td>materiał do PCR w czasie rzeczywistym</td></tr></tbody></table>

przygotowanie kolonii jednokohortowych i leczenie hormonalne robotnic pszczół miodnych w celu analizy fizjologii związanej z rolą i/lub układem hormonalnym

Preparation of Single-cohort Colonies and Hormone Treatment of Worker Honeybees to Analyze Physiology Associated with Role and/or Endocrine System

Robotnice pszczół miodnych są zaangażowane w różne zadania związane z utrzymaniem aktywności kolonii. Zadania pracowników zmieniają się w zależności od ich wieku (podział pracy związany z wiekiem). Młode robotnice zajmują się pielęgnacją czerwiu (pszczoły karmiące), podczas gdy starsze robotnice zajmują się zbieraniem nektaru i pyłku (zbieraczki). Fizjologia pracowników zmienia się w związku z tą zmianą ról. Na przykład główna funkcja gruczołów podgardłowych (HPG) zmienia się z wydzielania głównych białek mleczka pszczelego (MRJP) na wydzielanie enzymów metabolizujących węglowodany. Ponieważ zadania robotnic zmieniają się wraz z wiekiem w typowych koloniach, trudno jest odróżnić zmiany fizjologiczne, które zachodzą wraz ze starzeniem się, od tych, które zachodzą wraz ze zmianą ról. Aby zbadać zmiany fizjologiczne w tkankach robotnic, w tym w HPG, w związku ze zmianą ról, przydatne byłoby manipulowanie populacją kolonii pszczół miodnych poprzez przygotowanie kolonii jednokohortowych, w których robotnice w prawie tym samym wieku wykonują różne zadania. Poniżej opisujemy szczegółowy protokół przygotowania kolonii jednokohortowych do tej analizy. Sześć do ośmiu dni po przygotowaniu kolonii jednokohortowej w kolonii pojawiają się przedwcześnie rozwinięte zbieracze, które wykonują zadania żerowania wcześniej niż zwykle. Reprezentatywne wyniki wskazują na zmiany związane z rolą w ekspresji genu HPG, co sugeruje funkcję HPG związaną z rolą. Oprócz manipulowania populacją kolonii, analiza układu hormonalnego jest ważna dla badania fizjologii związanej z rolą. W tym miejscu opisujemy również szczegółowy protokół leczenia pracowników 20-hydroksyekdyzonem (20E), aktywną formą ekdyzonu, oraz metoprenem, analogiem hormonu juwenilnego. Wskaźnik przeżywalności leczonych pszczół był wystarczający do zbadania ekspresji genów w HPG. Zmiany ekspresji genów zaobserwowano w odpowiedzi na leczenie 20E i/lub metoprenem, co sugeruje, że leczenie hormonalne indukuje zmiany fizjologiczne HPG. Opisany tutaj protokół leczenia hormonalnego jest odpowiedni do badania wpływu hormonów na fizjologię pracowników.

Przegląd protokołu przygotowania kolonii jednowiekowych przedstawiono na Rysunku 1A. Harmonogram eksperymentów, od przygotowania kolonii jednowiekowych do pobrania próbek, pokazano na Rysunku 1B. Z kolonii jednowiekowych wyselekcjonowano robotnice spełniające kryteria behawioralne dla zachowań pielęgnacyjnych lub żerowania, a następnie oceniono stopień rozwoju HPG u tych osobników. W Tabeli 1 przedstawiono klasyfikację rozwoju HPG na trzy...

Tutaj opisujemy nasz szczegółowy protokół przygotowania jednokohortowych kolonii pszczół miodnych - użyteczne narzędzie do analizy fizjologii pracowników związanych z rolą. Opisujemy również szczegółowe protokoły leczenia pracowników hormonem juwenilnym i ekdyzonem, aby ocenić udział tych hormonów w regulacji zachowania i/lub fizjologii pracowników.

Przygotowanie kolonii jednokohortowych i leczenie hormonalne robotnic pszczół miodnych w celu analizy fizjologii związanej z rolą i/lub układem hormonalnym

Honeybee workers are engaged in various tasks related to maintaining colony activity. The tasks of the workers change according to their age (age-related ...

Ogólnym celem tych procedur jest zbadanie fizjologii robotnic pszczół miodnych w powiązaniu z ich rolą oraz stanem układu hormonalnego. Jest to metoda szeroko stosowana do analizy zachowania robotnic, która może również pomóc w odpowiedzi na kluczowe pytania dotyczące związku między fizjologią a rolą robotnic pszczół miodnych. Główną zaletą tej techniki jest fakt, że jest ona stosunkowo łatwa do wykonania.Aby stworzyć dwie kolonie jednowiekowe, należy zacząć od trzech standardowych kolonii i zebrać nowo wyklute robotnice z każdej z tych trzech kolonii. Za pomocą pęsety należy regularnie sprawdzać kolonie pod kątem pojawienia się pupy w zamkniętych komórkach peryferyjnych, które mają brązowe oczy i pigmentowaną kutykulę. Po ich zidentyfikowaniu większość pupy wykluje się w ciągu najbliższych kilku dni.Następnie zmieć dorosłe osobniki z plastrów i wyjmij plastry z kolonii. Połącz jeden taki plaster z każdej z trzech kolonii w pustej skrzynce ula nukleusowego. Przygotuj dwie takie skrzynki ula i inkubuj je w temperaturze 33 °C przy wilgotności względnej co najmniej 60%. W ciągu następnych trzech dni zbierz około 3 000 nowo wyklutych robotnic z każdej nowej skrzynki ula.Aby przybliżyć

preparation-single-cohort-colonies-hormone-treatment-worker-honeybees

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Neuronauka

Prezentujemy sposób wdrożenia metody farmakologii behawioralnej w paradygmacie apetycyjnego warunkowania węchowego u pszczół miodnych (Apis mellifera) poprzez systemiczne podawanie leków. Metoda ta pozwala w prosty i niezawodny sposób badać mechanizmy leżące u podstaw uczenia się i tworzenia pamięci.

Farmakologia behawioralna w klasycznym warunkowaniu odruchu wyciągania trąbka u pszczoły miodowej (Apis mellifera)

W tym protokole opisujemy dwie strategie, które jednocześnie tłumią dwa geny (podwójny knockdown genu) u pszczół miodnych. Następnie przedstawiamy, jak wykorzystać test odpowiedzi na rozszerzenie trąby (PER) do zbadania wpływu knockdownu podwójnego genu na percepcję smakową pszczoły miodnej.

Pomiar podwójnego knockdownu genu i percepcji smakowej za pośrednictwem RNAi u pszczół miodnych (Apis mellifera)

U robotnic pszczół miodnych starzenie się zależy od zachowań społecznych, a nie od wieku chronologicznego. Tutaj pokazujemy, w jaki sposób można uzyskać i przeanalizować typy pracowników o bardzo różnych wzorcach starzenia się pod kątem starzenia się komórek.

Uzyskiwanie próbek ze spowolnionym, przyspieszonym i odwróconym starzeniem w modelu pszczoły miodnej

Protokół warunkowania Proboscis Extension Response (PER), opracowany dla pszczół miodnych (Apis mellifera), dostarcza ekologicznie istotnych i łatwo mierzalnych środków do badania kilku różnych mechanizmów uczenia się u wielu gatunków owadów.

Protokół odpowiedzi na wydłużenie trąby do badania plastyczności behawioralnej u owadów: zastosowanie do badań podstawowych, biomedycznych i rolniczych

Konsorcja mikrobiologiczne w ulach trzmieli wzbogacają i zachowują pyłek dla larw pszczół. Wykorzystując sekwencjonowanie nowej generacji, wraz z eksperymentami laboratoryjnymi i terenowymi, manuskrypt ten opisuje protokoły stosowane do testowania hipotezy, że pozostałości fungicydów zmieniają mikrobiom pyłku i demografię kolonii, ostatecznie prowadząc do utraty kolonii.

Techniki empiryczne, metagenomiczne i obliczeniowe rzucają światło na mechanizmy, za pomocą których fungicydy zagrażają zdrowiu pszczół

Ten manuskrypt opisuje kilka protokołów podawania środków farmakologicznych pszczołom miodnym, w tym proste nieinwazyjne metody dla pszczół swobodnie latających, a także bardziej inwazyjne warianty, które pozwalają na precyzyjne, miejscowe leczenie krępowanych pszczół.

Neurofarmakologiczna manipulacja skrępowanych i swobodnie latających pszczół miodnych, Apis mellifera

Niniejszym przedstawiamy metodę karmienia skażoną pestycydami żywnością zarówno pojedynczej pszczoły miodnej, jak i kolonii ula. Procedura ocenia wpływ pestycydów na poszczególne pszczoły miodne poprzez dokarmianie in vivo podstawową dietą larw, a także na naturalny stan rodziny pszczelej.

Ocena wpływu chemikaliów środowiskowych na rozwój pszczół miodnych od poziomu osobnika do poziomu kolonii

Subletalne dawki pestycydów mogą wpływać na kolonie w sposób, który jest trudny do wykrycia przy użyciu tylko metod okresowych lub wizualnych. Podano metody pomiaru całkowitej masy dorosłych pszczół, czerwiu i zasobów pokarmowych poprzez ważenie uli i części ula, fotografowanie ramek i instalowanie czujników. Poruszana jest również kwestia analizy danych.

Monitorowanie wpływu narażenia na subletalne pestycydy na pszczoły miodne na poziomie kolonii

Spraye fungicydowe na kwitnące rośliny mogą narażać samotne pszczoły na wysokie stężenia pozostałości fungicydów przenoszonych przez pyłki. Wykorzystując eksperymenty laboratoryjne z udziałem larw pszczół hodowanych in vitro, badanie to bada interaktywne efekty spożywania pyłku poddanego działaniu fungicydów pochodzącego z roślin żywicielskich i niebędących żywicielami.

In vitro Hodowla pszczół samotnic: narzędzie do oceny czynników ryzyka larw

Tutaj opisujemy dwa protokoły: pierwszy do rozmnażania, ekstrakcji, oczyszczania i ilościowego oznaczania dużych ilości bezotoczkowych cząsteczek wirusa pszczoły miodnej, w tym metoda usuwania poczwarek pszczół miodnych, a drugi do testowania skutków infekcji wirusowej za pomocą wysoce powtarzalnego, wysokoprzepustowego testu biologicznego w klatce.

Przygotowanie inokulum wzbogaconego wirusem do doustnego zakażenia pszczół miodnych (Apis mellifera)

Ten protokół został opracowany w celu lepszego zrozumienia, jak agrochemikalia wpływają na reprodukcję pszczół miodnych (Apis mellifera), poprzez ustanowienie metod wystawiania królowych pszczół miodnych i ich opiekunów na działanie agrochemikaliów w kontrolowanych, laboratoryjnych warunkach i uważne monitorowanie ich odpowiednich reakcji.

Ocena ryzyka agrochemicznego dla krytych matek pszczół miodnych

Poznaj metodę przygotowania kolonii jednokohortowych pszczół miodnych i zabiegów hormonalnych z hormonem młodocianym oraz ekdysonem. Technika umożliwia analizę fizjologii związanej z rolą robotnic i regulacją endokrynną.

Przygotowanie kolonii jednokohortowych i leczenie hormonalne robotnic pszczół miodnych w celu analizy fizjologii związanej z rolą i/lub układem hormonalnym (Wideo) | JoVE Journal

Przygotowanie kolonii jednokohortowych i leczenie hormonalne robotnic pszczół miodnych w celu analizy fizjologii związanej z rolą i/lub układem hormonalnym

Przeglądaj więcej filmów