Posiew czynnika stymulującego tworzenie kolonii makrofagów Zróżnicowane ludzkie makrofagi pochodzące z monocytów

Ogólnym celem niniejszej procedury jest zwiększenie dostępności monocytów oraz zminimalizowanie zmienności uzyskanej gęstości komórek podczas różnicowania ludzkich monocytów krwi w makrofagi indukowanego przez MCSF. Metoda ta może pomóc w udzieleniu odpowiedzi na kluczowe pytania dotyczące biologii ludzkich makrofagów. Główną zaletą tej strategii jest możliwość łatwego uzyskania kultur makrofagów pochodzących z ludzkich monocytów przy zmniejszeniu zależności od dostępności dawców.

Dodatkowo można w ten sposób konsekwentnie uzyskiwać pożądaną gęstość komórek makrofagów oraz homogeniczne hodowle. Aby rozpocząć tę procedurę, należy pozyskać komórki mononuklearne od dawców ludzkich metodą leukaferezy, a następnie wzbogacić monocyty poprzez ciągłą przeciwprądową elutriację odśrodkową komórek mononuklearnych. Następnie należy policzyć komórki za pomocą hemocytometru.

Następnie monocyty odwiruj w 15 mililitrowej probówce z polipropylenu przez pięć minut w temperaturze pokojowej. Potem usuń nadsącz i delikatnie resuspenduj komórki w FBS, a następnie w Dimethyl Sulfoxide, aby uzyskać końcowe stężenie 90% FBS, 10% Dimethyl Sulfoxide oraz 50 × 10⁶ komórek na mililitr. Po tym dodaj jeden mililitr zawiesiny komórkowej do pojedynczej krio probówki.

Umieść krioopakowania w pojemniku do zamrażania komórek, a następnie przenieś go do zamrażarki o temperaturze -80 °C na 24 godziny. Po 24 godzinach przenieś pojemnik do zbiornika z ciekłym azotem w celu długoterminowego przechowywania. Na tym etapie rozmroź krioopakowanie z komórkami, utrzymując je przez krótką chwilę w kąpieli wodnej o temperaturze 37 °C.

Gdy zawiesina komórkowa zostanie rozmrożona w około 70%, należy ją niezwłocznie wyjąć z kąpieli wodnej i pozostawić w temperaturze pokojowej. Po całkowitym rozmrożeniu zawiesiny komórkowej, przenieś 1 ml zawartości cryofile do 50 ml medium RPMI 1640 z dodatkiem 2 mM L-glutaminy, 50 ng/ml M-CSF, 25 ng/ml IL-10 oraz 10% FBS w temperaturze 37 °C. Następnie przenieś 25 ml zawiesiny monocytów do dwóch plastikowych kolb hodowlanych o powierzchni 75 cm².

Inkubować hodowle w temperaturze 37°C przez 48 godzin. Należy pamiętać, aby nie zmieniać pożywki przed upływem 48 godzin; w przeciwnym razie komórki nie przywrą prawidłowo i zostaną wypłukane. Po 48 godzinach wypłukać hodowle trzy razy, używając 10 ml uprzednio ogrzanej pożywki RPMI 1640.

Ostrożnie usuń medium hodowlane, aby uniknąć odrywania słabo przytwierdzonych komórek. Następnie dodaj medium kompletne i hoduj komórki przez jeden tydzień. Wymieniaj medium co dwa dni, aż monocyty zróżnicują się i namnożą efektywnie, tworząc warstwę konfluencyjną.

Następnie opłucz zróżnicowane makrofagi w kolbie trzykrotnie 10 ml DPBS bez wapnia i magnezu o temperaturze 37°C. Następnie dodaj 10 ml 0,25% roztworu Trypsyny EDTA o temperaturze 37°C. Kolejnie umieść kolbę w inkubatorze do hodowli komórkowych na 10 do 15 minut.

Następnie około 90% makrofagów powinno stać się okrągłe i oddzielić się od podłoża. Wówczas należy dodać 10 mililitrów pożywki RPMI 1640 zawierającej 10% FBS, aby zatrzymać proces trypsynizacji. W razie potrzeby należy użyć scrapera do całkowitego usunięcia komórek.

Czasami w tej procedurze wiele makrofagów pozostaje przytwierdzonych. Makrofagi te można usunąć po trypsynizacji, przesuwając zgarniacz do komórek po powierzchni kolby. Następnie przenieść zawiesinę komórek makrofagów z kolby do 15 mililitrowej probówki polipropylenowej.

Wiruj przez pięć minut w temperaturze pokojowej, a następnie odlej nadsącz. Po tym delikatnie resuspenduj makrofagi w jednym mililitrze pożywki kompletnej. W zależności od liczby komórek dodaj dodatkową pożywkę kompletną, aby uzyskać pożądaną gęstość wysiewu komórek.

Następnie wysiej makrofagi w 1,5 ml pożywki na każdą studienkę płytki 12-dołkowej. Zastosowanie 1 × 10⁵ komórek w 1,5 ml pożywki na studienkę zazwyczaj pozwala uzyskać kulturę niemal konfluencyjną. Po wysianiu inkubuj makrofagi przez noc w temperaturze 37 °C, aby umożliwić adhezję komórek przed ich wykorzystaniem w eksperymentach.

Rysunek ten przedstawia mikroskopowe obrazy kontrastowe twarzy kriokonserwowanych świeżych monocytów podczas ich różnicowania w makrofagi indukowanego przez MCSF przy małym powiększeniu. Obrazy monocytów wykonano w trzecim i siódmym dniu hodowli w kolbie oraz w ósmym dniu, jeden dzień po ich zbiorze i ponownym wysianiu na płytkę hodowlaną z 12 dołkami. Przedstawiono tutaj porównanie świeżych i kriokonserwowanych monocytów wykorzystanych do wytworzenia makrofagów przy dużym powiększeniu.

Wakuole rozluźnione w fazie są makropinosomami. Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze rozumieć, jak kriokonserwować, a następnie różnicować ludzkie monocyty z pomocą MCSF w makrofagi. Następnie makrofagi mogą być hodowane przy pożądanej gęstości komórek na potrzeby eksperymentów.