Name: Posiew czynnika stymulującego tworzenie kolonii makrofagów Zróżnicowane ludzkie makrofagi pochodzące z monocytów (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-06-30T15:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 46 s
Description: Poznaj metodę hodowli ludzkich makrofagów pochodzących z monocytów z użyciem M-CSF. Protokół obejmuje leukaferezę, elucjację i krioprezerwację, zapewniając spójne gęstości komórek i odtwarzalność badań w immunologii.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Departament Medycyny Transfuzjologicznej, Centrum Kliniczne, National Institutes of Health, dostarczył elutryzowane monocyty. Praca ta była wspierana przez Intramural Research Program, National Heart, Lung, and Blood Institute, National Institutes of Health.

Leukafereza została przeprowadzona zgodnie z protokołem badawczym na ludziach, zatwierdzonym przez instytucjonalną komisję rewizyjną National Institutes of Health.
1. Izolacja i kriokonserwacja monocytów
<ol>
	<li>Otrzymać komórki jednojądrzaste metodą leukaferezy dawców ludzkich i wzbogacić monocyty przez ciągłą elutriację komórek jednojądrzastych przez wirowanie przeciwprądowe, jak opisano w piśmiennictwie 7,8. Otrzymać około 100 x 106 elutriowanych komórek (około 80 - 90% monocytów) w buforze elutrycyjnym określonym przez producenta. Policz komórki za pomocą hemocytometru.</li>
	<li>Odwirować monocyty w probówce polipropylenowej o pojemności 15 ml przy 300 x g przez 5 minut w temperaturze pokojowej.</li>
	<li>Usunąć supernatant i delikatnie ponownie zawiesić komórki w FBS, a następnie dimetylosulfotlenek, aby osiągnąć końcowe stężenie 90% FBS/10% dimetylosulfotlenku i 50 x 106 komórek/ml.</li>
	<li>Dodać każdy ml zawiesiny komórkowej do indywidualnego kriowialu.</li>
	<li>Umieścić kriowiale w pojemniku do zamrażania komórek i przenieść do zamrażarki o temperaturze -80 °C na 24 godziny przed przeniesieniem do kriowialnego zbiornika z ciekłym azotem w celu długotrwałego przechowywania.</li>
</ol>
2. Różnicowanie monocytów na makrofagi
<ol>
	<li>Rozmrozić kriowial komórek, szybko przenosząc go do łaźni wodnej o temperaturze 37 °C, a następnie natychmiast usuwając, gdy zawiesina komórek rozmrozi się o około 70%.</li>
	<li>Natychmiast po całkowitym rozmrożeniu w temperaturze pokojowej przenieś 1 ml zawartości kriowialnej do 50 ml podgrzałego podłoża Roswell Park Memorial Institute (RPMI) 1640 o temperaturze 37 °C z 2 mM L-glutaminy, 50 ng / ml M-CSF, 25 ng / ml interleukiny-10 (IL-10) i 10% FBS (kompletna pożywka).</li>
	<li>Przenieść 25 ml zawiesiny monocytów do każdej z dwóch plastikowych kolb do hodowli komórkowycho długości 75 cm2.</li>
	<li>Inkubować kultury w inkubatorze do hodowli komórkowych w temperaturze 37 °C z 5% CO2 / 95% powietrzem przez 48 godzin.</li>
	<li>Wypłucz kultury 3 razy 10 ml pożywki RPMI 1640 (podgrzanej do 37 °C), delikatnie usuwając pożywkę, aby uniknąć przemieszczenia luźno przyczepionych komórek.</li>
	<li>Po wypłukaniu dodaj świeżą, kompletną pożywkę, zmieniając pożywkę co 2 dni, aż monocyty zróżnicują się i namnażą na tyle, aby się zlały. Wymaga to około tygodnia kultury.</li>
</ol>
3. Zbieranie makrofagów w celu rozpoczęcia eksperymentów
<ol>
	<li>Przepłukać zróżnicowane makrofagi w kolbie 3 razy 10 ml wstępnie podgrzanego roztworu soli fizjologicznej Dulbecco buforowanego fosforanem o temperaturze 37 °C bez Ca2+ i Mg2+ przed dodaniem 10 ml wstępnie podgrzanego roztworu 0,25% kwasu trypsynowo-etylenodiaminotetraoctowego (EDTA) o temperaturze 37 °C.</li>
	<li>Umieścić kolbę w inkubatorze do hodowli komórkowych na 10 - 15 minut, w tym czasie około 90% makrofagów powinno się zaokrąglić i oderwać. Sprawdzić to za pomocą badania mikroskopowego kolby.</li>
	<li>Dodać 10 ml pożywki RMPI 1640 zawierającej 10% FBS, aby zatrzymać trypsynizację.</li>
	<li>Przenieść zawiesinę komórek makrofagów z kolby do probówki polipropylenowej o pojemności 50 ml, odwirować 300 x g przez 5 minut i odrzucić supernatant.</li>
	<li>Delikatnie zawiesić makrofagi w 1 ml kompletnej pożywki.</li>
	<li>Zmieszać 10 μl zawiesiny komórek makrofagów z 10 μl roztworu błękitu trypanowego i określić liczbę komórek makrofagów oraz żywotność (zwykle > 95%) za pomocą hemocytometru.</li>
	<li>Na podstawie liczby komórek (zwykle około 15 - 18 x 105 makrofagów) dodaj dodatkowe kompletne podłoże, aby osiągnąć pożądaną gęstość komórek wysiewu. Uwaga: 1 x 105 makrofagów w 1,5 ml pożywki na dołek 12-dołkowej płytki wytworzy prawie zlewającą się kulturę.</li>
	<li>Po wysiewie inkubować makrofagi przez noc w inkubatorze do hodowli komórkowych w temperaturze 37 °C z 5% CO2 / 95% powietrzem, aby umożliwić przyczepienie komórek. Następnie rozpocznij pożądane eksperymenty.</li>
</ol>

<ol><li>Dey, A., Allen, J., Hankey-Giblin, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ontogeny+and+polarization+of+macrophages+in+inflammation%3A+blood+monocytes+versus+tissue+macrophages%5BTitle%5D)+AND+%22Front.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Ontogeny and polarization of macrophages in inflammation: blood monocytes versus tissue macrophages.</a> Front. Immunol. 5, 683(2014).</li>
<li>Waldo, S. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Heterogeneity+of+human+macrophages+in+culture+and+in+atherosclerotic+plaques%5BTitle%5D)+AND+%22Am.+J.+Pathol%22%5BJournal%5D)">Heterogeneity of human macrophages in culture and in atherosclerotic plaques.</a> Am. J. Pathol. 172, 1112-1126 (2008).</li>
<li>Akagawa, K. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+heterogeneity+of+colony-stimulating+factor-induced+human+monocyte-derived+macrophages%5BTitle%5D)+AND+%22Int.+J.+Hematol%22%5BJournal%5D)">Functional heterogeneity of colony-stimulating factor-induced human monocyte-derived macrophages.</a> Int. J. Hematol. 76, 27-34 (2002).</li>
<li>Akagawa, K. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+heterogeneity+of+colony-stimulating+factor-induced+human+monocyte-derived+macrophages%5BTitle%5D)+AND+%22Respirology%22%5BJournal%5D)">Functional heterogeneity of colony-stimulating factor-induced human monocyte-derived macrophages.</a> Respirology. 11 Suppl, S32-S36 (2006).</li>
<li>Fleetwood, A. J., Lawrence, T., Hamilton, J. A., Cook, A. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Granulocyte-macrophage+colony-stimulating+factor+%28CSF%29+and+macrophage+CSF-dependent+macrophage+phenotypes+display+differences+in+cytokine+profiles+and+transcription+factor+activities%3A+implications+for+CSF+blockade+in+inflammation%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Granulocyte-macrophage colony-stimulating factor (CSF) and macrophage CSF-dependent macrophage phenotypes display differences in cytokine profiles and transcription factor activities: implications for CSF blockade in inflammation.</a> J. Immunol. 178, 5245-5252 (2007).</li>
<li>Lacey, D. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Defining+GM-CSF-+and+macrophage-CSF-dependent+macrophage+responses+by+in+vitro+models%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Defining GM-CSF- and macrophage-CSF-dependent macrophage responses by in vitro models.</a> J. Immunol. 188, 5752-5765 (2012).</li>
<li>Strasser, E. F., Eckstein, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optimization+of+leukocyte+collection+and+monocyte+isolation+for+dendritic+cell+culture%5BTitle%5D)+AND+%22Transfus.+Med.+Rev%22%5BJournal%5D)">Optimization of leukocyte collection and monocyte isolation for dendritic cell culture.</a> Transfus. Med. Rev. 24, 130-139 (2010).</li>
<li>Kim, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Monocyte+enrichment+from+leukapheresis+products+by+using+the+Elutra+cell+separator%5BTitle%5D)+AND+%22Transfusion+%28Paris%29%22%5BJournal%5D)">Monocyte enrichment from leukapheresis products by using the Elutra cell separator.</a> Transfusion (Paris). 47, 2290-2296 (2007).</li>
<li>Strober, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Trypan+blue+exclusion+test+of+cell+viability%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Protoc.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Trypan blue exclusion test of cell viability.</a> Curr. Protoc. Immunol. Appendix 3 (Appendix 3B), (2001).</li>
<li>Anzinger, J. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Native+low-density+lipoprotein+uptake+by+macrophage+colony-stimulating+factor-differentiated+human+macrophages+is+mediated+by+macropinocytosis+and+micropinocytosis%5BTitle%5D)+AND+%22Arterioscler.+Thromb.+Vasc.+Biol%22%5BJournal%5D)">Native low-density lipoprotein uptake by macrophage colony-stimulating factor-differentiated human macrophages is mediated by macropinocytosis and micropinocytosis.</a> Arterioscler. Thromb. Vasc. Biol. 30, 2022-2031 (2010).</li>
<li>Zhao, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Constitutive+receptor-independent+low+density+lipoprotein+uptake+and+cholesterol+accumulation+by+macrophages+differentiated+from+human+monocytes+with+macrophage-colony-stimulating+factor+%28M-CSF%29%5BTitle%5D)+AND+%22+J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">Constitutive receptor-independent low density lipoprotein uptake and cholesterol accumulation by macrophages differentiated from human monocytes with macrophage-colony-stimulating factor (M-CSF).</a> J. Biol. Chem. 281, 15757-15762 (2006).</li>
<li>Freeman, S. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ABCG1-mediated+generation+of+extracellular+cholesterol+microdomains%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Lipid+Res%22%5BJournal%5D)">ABCG1-mediated generation of extracellular cholesterol microdomains.</a> J. Lipid Res. 55, 115-127 (2014).</li>
<li>Kruth, H. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Receptor-independent+fluid-phase+pinocytosis+mechanisms+for+induction+of+foam+cell+formation+with+native+low-density+lipoprotein+particles%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Opin.+Lipidol%22%5BJournal%5D)">Receptor-independent fluid-phase pinocytosis mechanisms for induction of foam cell formation with native low-density lipoprotein particles.</a> Curr. Opin. Lipidol. 22, 386-393 (2011).</li>
<li>Jin, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ABCA1+contributes+to+macrophage+deposition+of+extracellular+cholesterol%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Lipid+Res%22%5BJournal%5D)">ABCA1 contributes to macrophage deposition of extracellular cholesterol.</a> J. Lipid Res. 56, 1720-1726 (2015).</li>
<li>Ong, D. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Extracellular+cholesterol-rich+microdomains+generated+by+human+macrophages+and+their+potential+function+in+reverse+cholesterol+transport%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Lipid+Res%22%5BJournal%5D)">Extracellular cholesterol-rich microdomains generated by human macrophages and their potential function in reverse cholesterol transport.</a> J. Lipid Res. 51, 2303-2313 (2010).</li>
<li>Hashimoto, S., Yamada, M., Motoyoshi, K., Akagawa, K. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enhancement+of+macrophage+colony-stimulating+factor-induced+growth+and+differentiation+of+human+monocytes+by+interleukin-10%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Enhancement of macrophage colony-stimulating factor-induced growth and differentiation of human monocytes by interleukin-10.</a> Blood. 89, 315-321 (1997).</li>
<li>Hashimoto, S. I., Komuro, I., Yamada, M., Akagawa, K. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((IL-10+inhibits+granulocyte-macrophage+colony-stimulating+factor-dependent+human+monocyte+survival+at+the+early+stage+of+the+culture+and+inhibits+the+generation+of+macrophages%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Immunol%22%5BJournal%5D)">IL-10 inhibits granulocyte-macrophage colony-stimulating factor-dependent human monocyte survival at the early stage of the culture and inhibits the generation of macrophages.</a> J. Immunol. 167, 3619-3625 (2001).</li>
<li>Lund, P. K., Joo, G. B., Westvik, A. B., Ovstebo, R., Kierulf, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+of+monocytes+from+whole+blood+by+density+gradient+centrifugation+and+counter-current+elutriation+followed+by+cryopreservation%3A+six+years%27+experience%5BTitle%5D)+AND+%22Scand.+J.+Clin.+Lab.+Invest%22%5BJournal%5D)">Isolation of monocytes from whole blood by density gradient centrifugation and counter-current elutriation followed by cryopreservation: six years' experience.</a> Scand. J. Clin. Lab. Invest. 60, 357-365 (2000).</li>
<li>Weiner, R. S., Normann, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+integrity+of+cryopreserved+human+monocytes%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Natl.+Cancer+Inst%22%5BJournal%5D)">Functional integrity of cryopreserved human monocytes.</a> J. Natl. Cancer Inst. 66, 255-260 (1981).</li>
<li>Hansen, J. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Retention+of+phagocytic+functions+in+cryopreserved+human+monocytes%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Leukoc.+Biol%22%5BJournal%5D)">Retention of phagocytic functions in cryopreserved human monocytes.</a> J. Leukoc. Biol. 57, 235-241 (1995).</li>
<li>Seager Danciger, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Method+for+large+scale+isolation%2C+culture+and+cryopreservation+of+human+monocytes+suitable+for+chemotaxis%2C+cellular+adhesion+assays%2C+macrophage+and+dendritic+cell+differentiation%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Immunol.+Methods%22%5BJournal%5D)">Method for large scale isolation, culture and cryopreservation of human monocytes suitable for chemotaxis, cellular adhesion assays, macrophage and dendritic cell differentiation.</a> J. Immunol. Methods. 288, 123-134 (2004).</li>
<li>Jin, X., Xu, Q., Champion, K., Kruth, H. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Endotoxin+contamination+of+apolipoprotein+A-I%3A+effect+on+macrophage+proliferation--a+cautionary+tale%5BTitle%5D)+AND+%22Atherosclerosis%22%5BJournal%5D)">Endotoxin contamination of apolipoprotein A-I: effect on macrophage proliferation--a cautionary tale.</a> Atherosclerosis. 240, 121-124 (2015).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Generowanie zdefiniowanych typów makrofagów może wyjaśnić niektóre ze sprzecznych wyników uzyskanych przez badaczy podczas badania biologii makrofagów. Wykorzystanie różnych warunków hodowli i czynników różnicujących do wytworzenia pierwotnych ludzkich makrofagów może prowadzić do bardzo różnych typów makrofagów, co może nie zostać docenione przez badacza. Na przykład makrofagi są czasami generowane z ludzkich monocytów bez surowicy, samej surowicy ludzkiej, surowicy ludzkiej uzupełnionej M-CSF, FBS samym lub FBS zawiera...

Badanie hodowanych makrofagów jest użytecznym modelem do zrozumienia funkcji tych komórek w stanach zapalnych, takich jak to ma miejsce w blaszkach miażdżycowych. Gdy badania koncentrują się na chorobach ludzi obejmujących makrofagi, przydatne jest badanie pierwotnych makrofagów ludzkich, a nie makrofagów innych niż ludzie, aby uniknąć różnic gatunkowych. Ponadto skutków transformacji komórek można uniknąć, stosując pierwotne makrofagi, a nie linie komórkowe makrofagów. W tym celu makrofagi zróżnicowane z monocytów wyizolowanych z ludzkiej krwi służą jako sposób na uzyskanie pierwotnych makrofagów ludzkich. 
Makrofagi tkankowe mogą być albo rezydowane w tkankach, albo mogą pochodzić z monocytów, które migrują do tkanki i różnicują się w makrofagi 1. Zdefiniowano dwa typy ludzkich makrofagów pochodzących z monocytów, które różnią się nie tylko morfologią, ale także ekspresją genów i funkcją komórki 2. Te dwa typy uzyskuje się z monocytów, które są zróżnicowane w makrofagi w obecności M-CSF + płodowej surowicy bydlęcej (FBS) i monocytów, które są różnicowane w makrofagi w obecności czynnika stymulującego tworzenie kolonii granulocytów-makrofagów (GM-CSF) + FBS 2-6. Z naszego doświadczenia (obserwacja niepublikowana) wynika, że stosowanie surowicy ludzkiej zamiast FBS generuje typ GM-CSF niezależnie od tego, czy w pożywce różnicującej znajduje się M-CSF czy GM-CSF. Makrofagi typu M-CSF są zwykle bardziej wydłużone niż makrofagi typu GM-CSF, które swoją morfologią przypominają jajka sadzone. Badacze powinni uznać, że ludzkie makrofagi pochodzące z monocytów M-CSF i GM-CSF to nie to samo, co tak zwane makrofagi M1 i M2 pochodzące ze szpiku kostnego myszy 6.
Podczas badań z wykorzystaniem ludzkich makrofagów M-CSF pochodzących z monocytów, doświadczyliśmy trudności związanych z dostępnością monocytów do inicjowania eksperymentów i zmiennością uzyskanej gęstości komórek makrofagów podczas różnicowania monocytów w makrofagi. Aby przezwyciężyć te problemy, opracowaliśmy następujący protokół, w którym monocyty są zamrażane do czasu, gdy będą potrzebne do użycia, a monocyty są różnicowane luzem w makrofagi, które można następnie usunąć z kolb hodowlanych i posiać w pożądanej gęstości komórek, aby uzyskać bardziej jednolite kultury z eksperymentu na eksperyment.

<table><tbody><tr><td>Cellbind 12-dołkowa płytka hodowlana</td><td>Corning</td><td>3336</td><td></td></tr><tr><td>CELLSTAR, kolba T-75, pożywka do hodowli tkankowej</td><td>Greiner Bio-One North America</td><td>658157</td><td></td></tr><tr><td>RPMI 1640</td><td>Cellgro Mediatech</td><td>15-040-CM</td><td>podgrzana do 37 stopni Celsjusza; C</td></tr><tr><td>L-Glutamina</td><td>Cellgro Mediatech</td><td>25-005-CI</td><td></td></tr><tr><td>Surowica bydlęca</td><td>płodu Gibco</td><td>16000-036</td><td></td></tr><tr><td>M-CSF</td><td>PeproTech</td><td>300-25</td><td></td></tr><tr><td>GM-CSF</td><td>PeproTech</td><td>300-03</td><td></td></tr><tr><td>IL-10&nbsp;</td><td>PeproTech</td><td>200-10</td><td></td></tr><tr><td>DMSO</td><td>Sigma</td><td>D2650</td><td></td></tr><tr><td>Kriowalny&nbsp;</td><td>Thermo Scientific&nbsp;</td><td></td><td></td>375418</tr><tr><td>DPBS bez Ca2+ i Mg2+&nbsp;</td><td>Corning cellgro</td><td>21-031-CV</td><td></td></tr><tr><td>0,25% Trypsyna-EDTA&nbsp;</td><td>Gibco</td><td>25200-056</td><td></td></tr><tr><td>50 ml polipropylenowa rurka stożkowa</td><td>Falcon</td><td>352070</td><td></td></tr><tr><td>Trypan</td><td>Blue Lonza</td><td>17-942E</td> Hemocytometr światła jasnego z ulepszeniem <td></td></tr><tr><td>Neubauera</td><td>Paul Marienfeld GmbH & Co. KG</td><td>610031</td><td>http://www.marienfeld-superior.com/index.php/counting-chambers/articles/counting-chambers.html</td></tr><tr><td>zamrażanie komórek CoolCell LX pojemnik</td><td>BioCision</td><td>BCS-405</td><td>inne pojemniki do zamrażania również powinny&nbsp; być odpowiednie do tego etapu</td></tr><tr><td>System Magazynowania Ciekłego Azotu, CryoPlus 1</td><td>Thermo Scientific&nbsp;</td><td>7400</td><td>Każdy zbiornik ciekłego azotu powinien być odpowiedni</td></tr></tbody></table>

posiew czynnika stymulującego tworzenie kolonii makrofagów zróżnicowane ludzkie makrofagi pochodzące z monocytów

Culture of Macrophage Colony-stimulating Factor Differentiated Human Monocyte-derived Macrophages

Przedstawiono protokół dla hodowli komórkowej makrofagów makrofagów stymulujących tworzenie kolonii (M-CSF) zróżnicowanych ludzkich makrocytów pochodzących z monocytów. W celu rozpoczęcia eksperymentów, świeże lub mrożone monocyty hoduje się w kolbach przez 1 tydzień z M-CSF w celu wywołania ich różnicowania w makrofagi. Następnie makrofagi można zebrać i wysiać w studzienkach hodowlanych o wymaganej gęstości komórek do przeprowadzenia eksperymentów. Użycie określonej liczby makrofagów, a nie określonej liczby monocytów do inicjacji kultur makrofagów do eksperymentów, daje kultury makrofagów, w których pożądana gęstość komórek może być osiągana bardziej konsekwentnie. Zastosowanie kriokonserwowanych monocytów zmniejsza zależność od dostępności dawców i pozwala uzyskać bardziej jednorodne kultury makrofagów.

Żywotność świeżych lub kriozach somehow zachowanych monocytów wynosiła ponad 95%, co określono za pomocą barwienia błękitem trypanowym. 9. Rycina 1 i Rysunek 2 porównaj odpowiednio przy mniejszym i większym powiększeniu postępy świeżych i kriokonserwowanych (t. j., zamrożonych) różnicowanie monocytów w makrofagi. Należy zauważyć, że w porównaniu z monocytami kriozachowanymi, monocyty świeże wykazują subpopulację różnic...

Przedstawiono protokół dla hodowli komórkowej makrofagów makrofagów stymulujących tworzenie kolonii (M-CSF) zróżnicowanych ludzkich makrocytów pochodzących z monocytów. Protokół wykorzystuje krioprezerwację monocytów w połączeniu z ich masowym różnicowaniem do makrofagów. Następnie zebrane makrofagi można następnie wysiać w studzienkach hodowlanych o wymaganej gęstości komórek do przeprowadzenia eksperymentów.

Posiew czynnika stymulującego tworzenie kolonii makrofagów Zróżnicowane ludzkie makrofagi pochodzące z monocytów

A protocol is presented for cell culture of macrophage colony-stimulating factor (M-CSF) differentiated human monocyte-derived macrophages. For initiation ...

Ogólnym celem niniejszej procedury jest zwiększenie dostępności monocytów oraz zminimalizowanie zmienności uzyskanej gęstości komórek podczas różnicowania ludzkich monocytów krwi w makrofagi indukowanego przez MCSF. Metoda ta może pomóc w udzieleniu odpowiedzi na kluczowe pytania dotyczące biologii ludzkich makrofagów. Główną zaletą tej strategii jest możliwość łatwego uzyskania kultur makrofagów pochodzących z ludzkich monocytów przy zmniejszeniu zależności od dostępności dawców.Dodatkowo można w ten sposób konsekwentnie uzyskiwać pożądaną gęstość komórek makrofagów oraz homogeniczne hodowle. Aby rozpocząć tę procedurę, należy pozyskać komórki mononuklearne od dawców ludzkich metodą leukaferezy, a następnie wzbogacić monocyty poprzez ciągłą przeciwprądową elutriację odśrodkową komórek mononuklearnych. Następnie należy policzyć komórki za pomocą hemocytometru.Następnie monocyty odwiruj w 15 mililitrowej probówce z polipropylenu przez pięć minut w temperaturze pokojowej. Potem usuń nadsącz i delikatnie resuspenduj komórki w FBS, a następnie w Dimethyl Sulfoxide, aby uzyskać końcowe stężenie 90% FBS, 10% Dimethyl Sulfoxide oraz 50 × 10⁶ komórek na mililitr. Po tym dodaj jeden mililitr zawiesiny komórkowej do pojedynczej krio probówki.Umieść krioopakowania w pojemniku do zamrażania komórek, a następnie przenieś go do zamrażarki o temperaturze -80 °C na 24 godziny. Po 24 godzinach przenieś pojemnik do zbiornika z ciekłym azotem w celu długoterminowego przechowywania. Na tym etapie rozmroź krioopakowanie z komórkami, utrzymując je przez krótką chwilę w kąpieli wodnej o temperaturze 37 °C.Gdy zawiesina komórkowa zostanie rozmrożona w około 70%, należy ją niezwłocznie wyjąć z kąpieli wodnej i pozostawić w temperaturze pokojowej. Po całkowitym rozmrożeniu zawiesiny komórkowej, przenieś 1 ml zawartości cryofile do 50 ml medium RPMI 1640 z dodatkiem 2 mM L-glutaminy, 50 ng/ml M-CSF, 25 ng/ml IL-10 oraz 10% FBS w temperaturze 37 °C. Następnie przenieś 25 ml zawiesiny monocytów do dwóch plastikowych kolb hodowlanych o powierzchni 75 cm².Inkubować hodowle w temperaturze 37°C przez 48 godzin. Należy pamiętać, aby nie zmieniać pożywki przed upływem 48 godzin; w przeciwnym razie komórki nie przywrą prawidłowo i zostaną wypłukane. Po 48 godzinach wypłukać hodowle trzy razy, używając 10 ml uprzednio ogrzanej pożywki RPMI 1640.Ostrożnie usuń medium hodowlane, aby uniknąć odrywania słabo przytwierdzonych komórek. Następnie dodaj medium kompletne i hoduj komórki przez jeden tydzień. Wymieniaj medium co dwa dni, aż monocyty zróżnicują się i namnożą efektywnie, tworząc warstwę konfluencyjną.Następnie opłucz zróżnicowane makrofagi w kolbie trzykrotnie 10 ml DPBS bez wapnia i magnezu o temperaturze 37°C. Następnie dodaj 10 ml 0,25% roztworu Trypsyny EDTA o temperaturze 37°C. Kolejnie umieść kolbę w inkubatorze do hodowli komórkowych na 10 do 15 minut.Następnie około 90% makrofagów powinno stać się okrągłe i oddzielić się od podłoża. Wówczas należy dodać 10 mililitrów pożywki RPMI 1640 zawierającej 10% FBS, aby zatrzymać proces trypsynizacji. W razie potrzeby należy użyć scrapera do całkowitego usunięcia komórek.Czasami w tej procedurze wiele makrofagów pozostaje przytwierdzonych. Makrofagi te można usunąć po trypsynizacji, przesuwając zgarniacz do komórek po powierzchni kolby. Następnie przenieść zawiesinę komórek makrofagów z kolby do 15 mililitrowej probówki polipropylenowej.Wiruj przez pięć minut w temperaturze pokojowej, a następnie odlej nadsącz. Po tym delikatnie resuspenduj makrofagi w jednym mililitrze pożywki kompletnej. W zależności od liczby komórek dodaj dodatkową pożywkę kompletną, aby uzyskać pożądaną gęstość wysiewu komórek.Następnie wysiej makrofagi w 1,5 ml pożywki na każdą studienkę płytki 12-dołkowej. Zastosowanie 1 × 10⁵ komórek w 1,5 ml pożywki na studienkę zazwyczaj pozwala uzyskać kulturę niemal konfluencyjną. Po wysianiu inkubuj makrofagi przez noc w temperaturze 37 °C, aby umożliwić adhezję komórek przed ich wykorzystaniem w eksperymentach.Rysunek ten przedstawia mikroskopowe obrazy kontrastowe twarzy kriokonserwowanych świeżych monocytów podczas ich różnicowania w makrofagi indukowanego przez MCSF przy małym powiększeniu. Obrazy monocytów wykonano w trzecim i siódmym dniu hodowli w kolbie oraz w ósmym dniu, jeden dzień po ich zbiorze i ponownym wysianiu na płytkę hodowlaną z 12 dołkami. Przedstawiono tutaj porównanie świeżych i kriokonserwowanych monocytów wykorzystanych do wytworzenia makrofagów przy dużym powiększeniu.Wakuole rozluźnione w fazie są makropinosomami. Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze rozumieć, jak kriokonserwować, a następnie różnicować ludzkie monocyty z pomocą MCSF w makrofagi. Następnie makrofagi mogą być hodowane przy pożądanej gęstości komórek na potrzeby eksperymentów.

culture-macrophage-colony-stimulating-factor-differentiated-human

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologia i infekcje

Ten film pokazuje proces wstępowania pierwotnych monocytów do makrofagów. Pierwotne ludzkie monocyty można wyizolować i zróżnicować do fenotypu prozapalnego podobnego do M1 przy użyciu czynnika stymulującego tworzenie kolonii granulocytów-makrofagów (GM-CSF) lub do fenotypu przeciwzapalnego podobnego do M2 za pomocą czynnika stymulującego tworzenie kolonii makrofagów (M-CSF).

Hodowla in vitro i różnicowanie pierwotnych monocytów do makrofagów

W tym filmie demonstrujemy procedurę indukowania różnicowania i polaryzacji monocytów pochodzących z krwi obwodowej na makrofagi M1 lub M2. Inkubacja z czynnikiem stymulującym tworzenie kolonii granulocytów-makrofagów, lipopolisacharydem i interferonem-gamma daje prozapalne makrofagi M1, podczas gdy inkubacja z czynnikiem stymulującym tworzenie kolonii makrofagów i interleukiną-4 indukuje przeciwzapalną produkcję makrofagów M2.

Różnicowanie i polaryzacja komórek pochodzących z monocytów w komórki podobne do makrofagów

Makrofagi pochodzące z monocytów są ważnymi komórkami wrodzonego układu odpornościowego. W tym miejscu opisujemy łatwy w użyciu model in vitro do generowania tych komórek. Korzystając z wirowania gradientowego, izolacji ujemnych kulek i określonych warunków hodowli komórek, można wygenerować makrofagi pochodzące z monocytów do badań fenotypowych i funkcjonalnych.

Model in vitro do badania heterogeniczności różnicowania i polaryzacji ludzkich makrofagów

Prezentujemy prosty i skuteczny protokół do generowania ludzkich makrofagów. Płaszcze kożuchowe są przetwarzane przez wirowanie gradientowe o podwójnej gęstości, a izolowane monocyty są następnie różnicowane do makrofagów w workach do hodowli komórkowych pokrytych teflonem. Maksymalizuje to wydajność makrofagów i ułatwia pobieranie komórek do kolejnych eksperymentów.

Izolacja ludzkich monocytów przez wirowanie z podwójnym gradientem i ich różnicowanie do makrofagów w workach do hodowli komórkowych pokrytych teflonem

Komórki szpiku kostnego hodowane za pomocą czynnika stymulującego tworzenie kolonii makrofagów granulocytów (GM-CSF) generują heterogeniczną hodowlę zawierającą makrofagi i komórki dendrytyczne (DC). Metoda ta kładzie nacisk na wykorzystanie wiązania MHCII i hialuronianu (HA) w celu odróżnienia makrofagów od DC w kulturze GM-CSF. Makrofagi w tej kulturze mają wiele podobieństw do makrofagów pęcherzykowych.

Generowanie i identyfikacja makrofagów i komórek dendrytycznych pochodzących z GM-CSF

Prezentowany tutaj jest zoptymalizowany protokół izolacji, hodowli, transfekcji i różnicowania ludzkich pierwotnych monocytów od osób zakażonych wirusem HIV i zdrowych osób kontrolnych.

Izolacja, transfekcja i hodowla pierwotnych ludzkich monocytów

Prezentowany tutaj jest protokół do wykrywania produkcji pułapek zewnątrzkomórkowych makrofagów (MET) w hodowli żywych komórek za pomocą mikroskopii i barwienia fluorescencyjnego. Protokół ten można dalej rozszerzyć w celu zbadania specyficznych markerów białka MET za pomocą barwienia immunofluorescencyjnego.

Stymulacja in vitro i wizualizacja uwalniania pułapek zewnątrzkomórkowych w zróżnicowanych ludzkich makrofagach pochodzących z monocytów

Makrofagi podobne do M2 związane z nowotworami (TAM) są związane z progresją guza i złym rokowaniem w raku. Protokół ten służy jako szczegółowy przewodnik do powtarzalnego różnicowania i polaryzacji komórek podobnych do monocytów THP-1 w makrofagi podobne do M2 w ciągu 14 dni. Model ten jest podstawą do badania przeciwzapalnego działania TAM w mikrośrodowisku guza.

Różnicowanie i polaryzacja makrofagów do fenotypu podobnego do M2 przy użyciu ludzkiej linii komórkowej białaczki THP-1 podobnej do monocytów

Obecny protokół opisuje izolację i hodowlę makrofagów pochodzących ze szpiku kostnego od myszy.

Izolacja i hodowla makrofagów pochodzących ze szpiku kostnego od myszy

Monocyty i makrofagi to bardzo plastyczne i reprogramowalne komórki odpornościowe, kluczowe dla zdrowia i choroby. Wyczuwają i reagują na szeroki zakres bodźców, przyjmując określone programy różnicowania i fenotypy. Ustandaryzowaliśmy model in vitro do badania polaryzacji i przeprogramowania makrofagów, zapewniając cenne narzędzie do badań.

Przeprogramowanie modelu ludzkich makrofagów pochodzących z monocytów do testów in vitro

Poznaj metodę hodowli ludzkich makrofagów pochodzących z monocytów z użyciem M-CSF. Protokół obejmuje leukaferezę, elucjację i krioprezerwację, zapewniając spójne gęstości komórek i odtwarzalność badań w immunologii.

Posiew czynnika stymulującego tworzenie kolonii makrofagów Zróżnicowane ludzkie makrofagi pochodzące z monocytów

Przeglądaj więcej filmów