Połączenie przyżyciowej mikroskopii fluorescencyjnej (IVFM) z modelami genetycznymi w celu zbadania dynamiki wszczepiania komórek krwiotwórczych do nisz szpiku kostnego

Ogólnym celem tej procedury jest wizualizacja i pomiar wszczepienia in vivo przeszczepionych komórek krwi do nisz szpiku kostnego biorcy. Główną zaletą tej techniki jest to, że umożliwia wizualizację procesów komórkowych, takich jak naprowadzanie, ekspansja i lokalizacja w różnych niszach szpiku kostnego komórek krwiotwórczych dawcy po przeszczepie. Podejście to, stosowane w połączeniu ze zmodyfikowanymi modelami zwierzęcymi, może pomóc w zdefiniowaniu szlaków molekularnych krytycznych dla regeneracji komórek krwiotwórczych.

W przeciwieństwie do histologii lub innych technik obrazowania, mikroskopia przyżyteczkowa umożliwia uchwycenie interakcji międzykomórkowych u żywego zwierzęcia na poziomie komórkowym i w czasie rzeczywistym. Zdecydowaliśmy się zastosować tę metodę do określenia, czy mikrośrodowisko szpiku kostnego było początkowym miejscem rozwoju choroby mieloproliferacyjnej spowodowanej utratą sygnalizacji Notch. Wyzwania dla osób, które dopiero zaczynają przygodę z tą techniką, obejmują minimalizację artefaktów oddychania, optymalne ułożenie i stabilizację głowy oraz uniknięcie nasycenia obrazu.

Na jedną do dwóch godzin przed przeszczepem spryskaj mysz EGFP zlizowaną 70% etanolem. Następnie użyj nożyczek chirurgicznych, aby wykonać nacięcie w skórze każdej nogi wokół kostki i kleszczy chirurgicznych, aby usunąć skórę i sierść razem, aby odsłonić czystą tkankę mięśniową. Usuń jak najwięcej mięśni z nóg.

Następnie przetnij kości w stawach kolanowych i skokowych i za pomocą gąbek z gazy usuń pozostałą tkankę mięśniową z kości udowych i piszczelowych. Opłukać oczyszczone kości na sześciodołkowej płytce zawierającej DMEM uzupełniony 10% FBS. Następnie przenieś wszystkie cztery kości tylnych nóg do 10 mililitrów zimnego EDTA w PBS do moździerza i zmiażdż kości tłuczkiem.

Potarytować komórki szpiku kostnego, aby uzyskać zawiesinę jednokomórkową i przecedzić zawiesinę przez filtr o średnicy 70 mikronów do 15-mililitrowej probówki wirówkowej. Wypłucz filtr dwoma do trzech mililitrów PBS. Następnie odwiruj komórki i ponownie zawieś osad w 10 mililitrach świeżego DMEM plus 10% FBS.

Do wstrzyknięcia odwirować zawiesinę komórek, a następnie policzyć i dostosować stężenie komórek do 1,5 razy 10 do siódmych komórek na mililitr w IMDM bez surowicy. Umieść komórki na lodzie. Pięć do sześciu godzin po drugiej dawce promieniowania wstrzyknąć trzy razy po 10 do szóstych komórek szpiku kostnego do żyły ogonowej każdego napromieniowanego biorcy.

Dodaj odpowiedni punkt czasowy po przeszczepie. Umieść znieczuloną mysz biorcy na poduszce grzewczej o temperaturze 37 stopni Celsjusza i potwierdź brak reakcji na szczypanie palców u stóp. Nałóż maść na oczy zwierzęcia i podaj 100 mikrolitrów odpowiedniego markera fluorescencyjnego przez żyłę ogonową.

Następnie za pomocą małych elektrycznych maszynek do strzyżenia usuń włosy z grzbietowej powierzchni głowy zwierzęcia, a następnie nałóż krem do depilacji. Po pięciu minutach usuń krem gąbkami z gazy i spłucz pozostały roztwór solą fizjologiczną. Zdezynfekuj skórę głowy wacikiem nasączonym 70% etanolem.

Następnie użyj cienkich kleszczy i nożyczek, aby wykonać 10 do 20 milimetrowe nacięcie skóry w linii środkowej na skórze głowy, aby odsłonić leżącą pod spodem grzbietową powierzchnię czaszki. Używając jedwabiu chirurgicznego 5-0, umieść dwa szwy podtrzymujące po każdej stronie nacięcia, tworząc płat, aby odsłonić kalwarię do obrazowania. Nałóż kroplę oleju na odsłoniętą czaszkę.

Trzymając mysz w pozycji leżącej, zanurz odsłoniętą skórę głowy w szklanym naczyniu wypełnionym olejem mikroskopowym. Następnie umieść zwierzę na wielofotonowym stoliku obrazowania z kalwarią nad obiektywem i przykryj zwierzę poduszką grzewczą o temperaturze 37 stopni Celsjusza. Istotne jest, aby głowa pozostała ustabilizowana we właściwej pozycji podczas akwizycji obrazu wielofotonowego.

Użyj urządzenia stereotaktycznego lub zabezpiecz mysz taśmą, jeśli to konieczne. Korzystając z odwróconego systemu konfokalnego zmodyfikowanego do obrazowania wielofotonowego, dostrój laser dwufotonowy do 830 nanometrów. Następnie otwórz odpowiednie oprogramowanie do akwizycji obrazów.

W menu ustawień akwizycji upewnij się, że wybrano tryb skanowania jednokierunkowego i ustaw szybkość skanowania na cztery mikrosekundy na piksel, liczbę klatek na sekundę na 512 na 512 pikseli, a powiększenie na 1,5. Wybierz 20X W w obiektywie 0,95. Otwórz okno listy barwników i wybierz dwa fotony.

Następnie wybierz lustro RDM690 w oknie kontrolera mikroskopu. W oknie ścieżki światła i kostki zaznacz pole dwa zespołu laserowego, aby sprawdzić, czy migawka lasera dwufotonowego jest otwarta. Wybierz EPI Lamp i wybierz kostkę filtra B/G EPI.

Następnie skoncentruj obiektyw na próbce, aby uwidocznić przepływ naczyniowy w niszy szpiku kostnego calvarium, wykorzystując rozwidlenie żyły centralnej i szew wieńcowy jako punkty odniesienia. Korzystając z trybu non-descanned, wybierz trzy detektory zewnętrzne i zobrazuj próbkę z szybkością skanowania czterech mikrosekund na piksel bez uśredniania oraz ze stałą mocą lasera i wzmocnieniem detektora, aby wykorzystać pełny zakres dynamiki detektora przy minimalnym nasyceniu. Po pobraniu serii skrawków przez głębokość tkanki, otwórz odpowiednie dedykowane oprogramowanie do oceny ilościowej i wizualizacji obrazu 3 do 4D.

Interaktywnie wizualizuj stosy Z za pomocą odpowiedniego algorytmu renderowania 3D zgodnie z instrukcjami producenta. Następnie użyj modułu segmentacji obiektów punktowych, aby podzielić komórki GFP na segmenty i zastosować przetwarzanie arytmetyczne stosu, aby wyeliminować fałszywie dodatnie komórki GFP w kanałach zielonym i czerwonym. Na koniec użyj modułu segmentacji powierzchni, aby zreformować segmentację układu naczyniowego i powierzchni kości, stosując algorytmy odległości naprężenia X miejsca do powierzchni, aby w razie potrzeby obliczyć odległości komórek od dowolnej z powierzchni dystalnych.

W tym przypadku stosy Z zebrane z każdego z sześciu standardowych regionów kości nazębnej szpiku kostnego zostały wyrenderowane jako projekcja 3D maksymalnej intensywności, projekcja cienia 3D z uwzględnieniem składnika kostnego oraz obrazy segmentowane 3D, umożliwiające ilościowe określenie komórek i pomiar ich odległości od kości i naczyń. W tym eksperymencie obrazowanie in vivo komórek szpiku szpikowego w mikrośrodowisku szpiku kostnego z wadą Notch wykazało, że lizane komórki GFP dawcy mają podobną skuteczność naprowadzania u biorców typu dzikiego i nokautują po 24 godzinach od przeszczepu, podczas gdy wykazują inne wszczepienie w późniejszych punktach czasowych. Analiza dynamiki ekspansji progenitorów szpiku wykazała, że adaptacyjnie komórki przeszczepione szpikowi kostnemu rozwijały się szybciej i w większej liczbie u biorców z nokautem po dwóch tygodniach od przeszczepu.

Komórki szpiku kostnego dawcy u biorców typu dzikiego rozrosły się później, ale w dwukrotnie większej liczbie niż komórki dawcy i biorcy nokautowi po czterech tygodniach, w czasie, gdy komórki dawcy w szpiku kostnym z nokautem są zmniejszone, ponieważ szybko wchodzą w krążenie. I to po sześciu tygodniach różnice w liczbie komórek dawcy w kości nazębnej szpiku kostnego wyrównują się. Co więcej, analiza segmentacji 3D dolnego środkowego obszaru kalwarii nokautowej i dzikiej po sześciu tygodniach od przeszczepu szpiku kostnego wskazuje, że lizowane komórki GFP są zlokalizowane w tej samej odległości od kości u obu typów zwierząt biorców, ale co ciekawe, znajdują się one dalej od układu naczyniowego u myszy z nokautem.

Po opanowaniu, obrazowanie szpiku kostnego przyżyciowego można wykonać w ciągu jednej godziny i 30 minut na mysz, jeśli zostanie wykonane prawidłowo. Korzystając z tego podejścia, ważne jest, aby pamiętać o pobraniu próbki z wielu obszarów szpiku kostnego calvarium na mysz i przeanalizowaniu co najmniej trzech myszy na eksperyment, aby uwzględnić wszelkie różnice wewnątrz i między próbkami. Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak połączyć przeszczep szpiku kostnego i obrazowanie przyżyciowe w celu określenia kinetyki wszczepienia określonej subpopulacji krwi do mikrośrodowiska szpiku kostnego.