Name: Połączenie przyżyciowej mikroskopii fluorescencyjnej (IVFM) z modelami genetycznymi w celu zbadania dynamiki wszczepiania komórek krwiotwórczych do nisz szpiku kostnego (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-03-21T13:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 6 s
Description: Poznaj mikroskopię fluorescencyjną przyżyciową (IVFM) do badania wszczepiania komórek krwiotwórczych w nisze szpiku kostnego. Ta metoda umożliwia wizualizację procesów komórkowych w czasie rzeczywistym u żywych zwierząt.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Obrazowanie zostało przeprowadzone w Indiana Center for Biological Microscopy na Indiana University, kierowanym przez Dr. Kena Dunna. Urządzenie stereotaktyczne jest prototypem zaprojektowanym i wykonanym przez Marka Soonpaa z Wells Center for Pediatric Research. Prace te były wspierane przez NIH/R01DK097837-09 (NC), NIH/R01HL068256-05 (NC), NIH/NIDDK1U54DK106846-01 (NC), Fundację Badawczą MPN (NC) oraz wspólny projekt CTSI IUSM/Notre Dame (NC).

Wszystkie procedury związane z wykorzystaniem zwierząt zostały przeprowadzone za zgodą Komitetu ds. Opieki nad Zwierzętami i Użytkowania Szkoły Medycznej Uniwersytetu Indiana. Należy zapewnić przestrzeganie przepisów dotyczących doświadczeń na zwierzętach obowiązujących w kraju, w którym praca jest wykonywana.
1. Przygotowanie myszy Mx1CreRBPJ-/- Recipient
<ol>
	<li>Skrzyżuj myszy Mx1-Cre+ z myszamiRBPJ lox/lox10, aby uzyskać Mx1-Cre dodatnie myszy RBPJlox/lox12 i Mx1-Cre ujemne RBPJlox/lox rodzeństwo z miotu do użycia jako kontrole. Sprawdź genotyp za pomocą PCR10.</li>
	<li>Użyj 6-8 tygodniowych myszy Mx1Cre+/RBPJlox/lox i Mx1Cre-/RBPJlox/lox, aby przeprowadzić indukcję poliI:C.</li>
	<li>Wstrzyknąć poliI:C 200 μg i.p. do myszy Cre+ i Cre-. Wykonywać jedno wstrzyknięcie poliI:C co drugi dzień przez 3 dni w pierwszym tygodniu. Wykonać jedno wstrzyknięcie poliI:C w drugim tygodniu, 7 dni po poprzednim wstrzyknięciu (w sumie cztery wstrzyknięcia).
	<ol>
		<li>Użyj myszy RBPJKO (indukowane Mx1Cre+/RBPJlox/lox) i RBPJWT (indukowane Mx1Cre-/RBPJlox/lox) jako biorców 3 tygodnie po ostatnim wstrzyknięciu polyI:C. 
		UWAGA: Zaleca się stosowanie myszy indukowanych przez pI:pC 3 tygodnie po wstrzyknięciu. Odpowiedź IFNα wywołana przez poliI:C indukuje znaczące zmiany w BM, co skutkuje immunofenotypową ekspansją HSC i zmniejszoną produkcją dojrzałych komórek progenitorowych do krwi obwodowej 16,17. Reprezentacja podzbiorów krwiotwórczych jest normalizowana 3 tygodnie po wstrzyknięciu, a myszy mogą być wykorzystywane bez zakłócających skutków stanu zapalnego. Ten protokół indukcji został zoptymalizowany pod kątem RBPJ. W przypadku usunięcia innego genu protokół indukcji może się różnić w zależności od konstruktu, a delecja musi zostać zweryfikowana. Zwalidowaliśmy ~100% delecję regionu RBPJ między miejscami loxP za pomocą RT-PCR po łącznie czterech wstrzyknięciach poliI: C.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. Przygotowanie komórek szpiku kostnego dawcy Lys-EGFP do przeszczepu
<ol>
	<li>Poddaj eutanazji jedną mysz Lys-EGFP (dwutlenek węgla, a następnie zwichnięcie szyjki macicy) 1 lub 2 godziny przed przeszczepem.</li>
	<li>Spryskaj powierzchnię ciała zwierzęcia 70% etanolem.</li>
	<li>Użyj nożyczek chirurgicznych, aby wykonać nacięcie skóry na obu nogach wokół kostki, a za pomocą kleszczy chirurgicznych oderwij skórę i futro razem, aby odsłonić czystą tkankę mięśniową.</li>
	<li>Użyj nożyczek chirurgicznych, aby usunąć jak najwięcej mięśni z nóg. Za pomocą nożyczek przetnij kości (w stawie kolanowym i skokowym) i oczyść pozostałą tkankę mięśniową z kości udowych i piszczelowych za pomocą gąbek z gazy. Umieść kości (dwie kości udowe i dwie piszczele) w 6-dołkowej płytce zawierającej DMEM 10% FBS.</li>
	<li>Zmiażdżyć kości w moździerzu z 10 ml zimnego 2 mM EDTA PBS i odpipetować komórki szpiku kostnego, aby doprowadzić komórki do zawiesiny jednokomórkowej. Alternatywnie, przepłukać kości 2 mM EDTA PBS 3 razy z każdej strony za pomocą strzykawki o pojemności 1 ml.</li>
	<li>Przefiltruj komórki szpiku kostnego za pomocą filtra 70 μm do probówki wirówkowej o pojemności 15 ml. Przepłucz filtr 2-3 ml PBS. Odwiruj komórki w dół 10 minut przy 460 x g, ponownie zawieś komórki w 10 ml świeżego DMEM 10% FBS.</li>
	<li>Policz komórki szpiku kostnego na hemocytometrze i dostosuj stężenie do 1,5 x 107 komórek/ml w IMDM bez surowicy. Użyj 3 x 106 komórek na zwierzę o objętości 200 μl. Około 1/3 komórek całkowitego BM to mieloidalne komórki GFP+. Pozostawić komórki na lodzie do czasu, aż będą gotowe do wstrzyknięcia. Użyj komórek 0,5 x 105, aby określić wyrażenie GFP za pomocą FACS9.</li>
</ol>
3. Przeszczep szpiku kostnego komórek Lys-GFP do myszy RBPJKO
<ol>
	<li>Trzymaj myszy biorców w klatce na ciasto. Napromieniuj myszy śmiertelną dawką promieniowania gamma (1,200 Rad) na promiennik Cs 137. Stosuj protokół podzielonej dawki: 900 radów wieczorem, a następnie 300 radów następnego ranka (w odstępie 16 godzin).</li>
	<li>Przeszczep śmiertelnie napromieniowane myszy RBPJWT i biorcze RBPJKO 5-6 godzin po drugiej dawce promieniowania. Wstrzyknąć komórki BM pobrane od myszy Lys-EGFP w stężeniu 3 x 106 komórek na zwierzę poprzez wstrzyknięcie do żyły ogonowej (patrz szczegóły dotyczące pobierania komórek w sekcji 2).</li>
	<li>Niezależne od obrazu kohorty myszy przeszczepionych metodą IVFM w różnych punktach czasowych: 24 godziny oraz w 2., 4. i 6. tygodniu, jak opisano poniżej (patrz sekcja 4 i 5 dotycząca procedury obrazowania in vivo).</li>
</ol>
4. Przygotowanie chirurgiczne do obrazowania przyżyciowego
<ol>
	<li>Sterylizuj narzędzia chirurgiczne. Dwa cienkie kleszcze (jeden prosty, jeden kątowy), jedna para cienkich nożyczek i jedna para uchwytów na igły. Przygotuj obszar operacyjny ze wszystkimi materiałami potrzebnymi do zabiegu.</li>
	<li>Podać myszy wstrzyknięcie IP koktajlu ketaminowego znieczulającego (ksylazyna 2,5-5 mg/kg + acepromazyna 1,0-2,5 mg/kg + ketamina 90-100 mg/kg) za pomocą strzykawki igłowej 26-28 G. Zwierzę będzie monitorowane co 15 minut podczas zabiegu, a środek znieczulający zostanie uzupełniony w razie potrzeby w 1/4 pierwotnej dawki.</li>
	<li>Umieść mysz na odpowiednim źródle ciepła (poduszka grzewcza o temperaturze 37 °C, zwierzę chronione przed bezpośrednim kontaktem z poduszką grzewczą) i wizualnie monitoruj częstość oddechów.</li>
	<li>Sprawdź odruchy, korzystając z reakcji uszczypnięcia palca u nogi. Upewnij się, że zwierzę jest całkowicie pod narkozą przed rozpoczęciem jakichkolwiek zabiegów chirurgicznych.</li>
	<li>Użyj strzykawki z igłą o rozmiarze 26-28, aby wstrzyknąć myszom do żyły ogonowej fluorescencyjny marker naczyniowy (dekstran, 100 μl roztworu o stężeniu 20 mg/ml).</li>
	<li>Nałóż maść do oczu weterynarza na oba oczy. Przytnij grzbietową powierzchnię głowy zwierzęcia za pomocą małych elektrycznych maszynek do strzyżenia. Nałóż krem do depilacji na 5 minut. Użyj gąbek z gazy, aby usunąć krem, a następnie spłucz solą fizjologiczną. Przygotuj oczyszczoną skórę głowy za pomocą 70% alkoholu za pomocą bawełnianego wacika.</li>
	<li>Użyj cienkich kleszczy i nożyczek, aby wykonać małe nacięcie skóry w linii środkowej (10-20 mm) na skórze głowy, aby odsłonić leżącą pod spodem grzbietową powierzchnię czaszki. Użyj jedwabiu chirurgicznego 5-0, aby umieścić dwa szwy podtrzymujące w skórze po każdej stronie nacięcia, tworząc płat odsłaniający kalwarię do obrazowania.</li>
	<li>Ułóż myszy na plecach i zanurz odsłoniętą skórę głowy w szklanym naczyniu wypełnionym olejem mikroskopowym. Przetransportować zwierzę do pomieszczenia do obrazowania mutifotonowego.</li>
	<li>Umieść zwierzę na stoliku mikroskopowym z kalwarią umieszczoną na szklanym naczyniu nad obiektywem, a następnie przykryj poduszką grzewczą o temperaturze 37 °C (zwierzę należy chronić przed bezpośrednim kontaktem z ciepłem).</li>
</ol>
5. Obrazowanie in vivo w wysokiej rozdzielczości kości kalwarskiej myszy
<ol>
	<li>Użyj odwróconego systemu konfokalnego zmodyfikowanego do obrazowania wielofotonowego (patrz Tabela materiałów). Postępując zgodnie z instrukcjami producenta, dostrój laser 2-fotonowy do 830 nm, umieść soczewkę obiektywu 20X W, NA 0,95 w końcówce mikroskopu i sprawdź wyrównanie wiązki laserowej. 
	UWAGA: Do tych badań najczęściej stosuje się pionowe systemy mikroskopowe, ale można również zastosować odwrócony system wielofotonowy. W tym badaniu wykorzystano specjalnie zaprojektowane atraumatyczne urządzenie stereotaktyczne. Chociaż istnieje kilka dostępnych na rynku urządzeń stereotaktycznych do pionowych systemów mikroskopowych, nie ma komercyjnie dostępnego urządzenia stereotaktycznego do systemu mikroskopu odwróconego, którego celem jest zabezpieczenie czaszki myszy. Jako alternatywę dla niestandardowego urządzenia stereotaktycznego, czaszka może być zabezpieczona w pozycji nad obiektywem przy użyciu różnych metod taśmy lub kleju w celu zapewnienia stabilności.</li>
	<li>Otwórz oprogramowanie do akwizycji obrazów. W panelu "Ustawienia akwizycji" sprawdź, czy wybrany jest jeden tryb skanowania kierunkowego. Ustaw szybkość skanowania na 4 μs/piksel, liczbę klatek na sekundę na 512 x 512 pikseli i powiększenie na 1,5. Wybierz obiektyw 20X W Na 0.95 z listy dostępnych soczewek obiektywowych, aby dopasować go do soczewki umieszczonej w końcówce.</li>
	<li>Uzyskaj dostęp do "Listy barwników" z panelu "Kontrola akwizycji obrazu" i wybierz "Dwa fotony". Otwórz okno "Light Path & Dyes" i wybierz DM690-980 excitation DM. Otwórz migawkę lasera 2P, zaznaczając pole wyboru w Laser Unit 2. W oknie "Kontroler mikroskopu" wybierz lustro RDM690.</li>
	<li>Wybierz "EPI LAMP", wybierz kostkę epi-filtra B / G i ustaw ostrość obiektyw na próbce, aby uwidocznić przepływ naczyniowy i niszę szpiku kostnego calvarium, używając jako odniesienia rozwidlenia żyły centralnej (a) i szwu wieńcowego (b) (ryc. 2A).</li>
	<li>Zbieraj obrazy w trybie bez deskanowania. Wybierz trzy detektory zewnętrzne: detektor PMT1 do zbierania sygnału SHG kolagenu (filtr emisyjny - 430/100 nm), detektor GaAsP2 do zbierania sygnału GFP (filtr emisyjny - 525/50) i detektor GaAsP3 do zbierania sygnału TRITC-dekstranu (filtr emisyjny - 605/90 nm).
	<ol>
		<li>Wykonuj obrazowanie z szybkością skanowania 4 μs/piksel bez uśredniania, aby zminimalizować fototoksyczność. Zbieraj obrazy ze stałą mocą lasera i wzmocnieniem detektora dostosowanym do wykorzystania pełnego zakresu dynamiki detektora przy minimalnym nasyceniu.</li>
		<li>Zbierz serię przekrojów przez głębokość tkanki (stosy Z 60 x 1 μm) z 6 regionów szpiku kostnego kalwarii. Użyj ustawień rozmiaru kroku 1 μm, zoomu 1,5 i rozmiaru klatki 512 x 512 pikseli (423 μm x 423 μm). 
		Uwaga: Całkowity czas potrzebny do wykonania zdjęcia jednej myszy to 1-1,5 godziny.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
6. Analiza ilościowa
<ol>
	<li>Wykonaj kwantyfikację obrazu i rekonstrukcje 3D za pomocą dedykowanego oprogramowania do kwantyfikacji i wizualizacji obrazu 3D/4D zgodnie z instrukcjami producenta (patrz Tabela materiałów). Interaktywnie wizualizuj stosy Z w 3D, korzystając z algorytmów renderowania objętości projekcji maksymalnej intensywności (MIP), alfa-blend lub projekcji cienia.</li>
	<li>Segmentacja komórek GFP za pomocą modułu "Segmentacja obiektów dodatkowych". Zastosuj przetwarzanie arytmetyczne stosu (odejmowanie kanałów), aby wyeliminować fałszywie dodatnią liczbę komórek GFP (eliminuje to sygnał komórek kostnych wykazujących silną fluorescencję w kanałach zielonym i czerwonym).</li>
	<li>Wykonaj segmentację układu krwionośnego i powierzchni kości za pomocą modułu Segmentacja powierzchni. W razie potrzeby oblicz odległości komórek do dowolnej z powyższych powierzchni, stosując algorytmy naprężenia X zwane "odległością punktu do powierzchni".</li>
</ol>

<ol><li>Carlesso, N., Cardoso, A. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stem+cell+regulatory+niches+and+their+role+in+normal+and+malignant+hematopoiesis%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Opin+Hematol%22%5BJournal%5D)">Stem cell regulatory niches and their role in normal and malignant hematopoiesis.</a> Curr Opin Hematol. 17 (4), 281-286 (2010).</li>
<li>Lo Celso, C., Scadden, D. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+haematopoietic+stem+cell+niche+at+a+glance%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Sci%22%5BJournal%5D)">The haematopoietic stem cell niche at a glance.</a> J Cell Sci. 124 (PT 21), 3529-3535 (2011).</li>
<li>Calvi, L. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Osteoblastic+cells+regulate+the+haematopoietic+stem+cell+niche%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Osteoblastic cells regulate the haematopoietic stem cell niche.</a> Nature. 425 (6960), 841-846 (2003).</li>
<li>Kiel, M. J., Yilmaz, O. H., Iwashita, T., Terhorst, C., Morrison, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((SLAM+family+receptors+distinguish+hematopoietic+stem+and+progenitor+cells+and+reveal+endothelial+niches+for+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">SLAM family receptors distinguish hematopoietic stem and progenitor cells and reveal endothelial niches for stem cells.</a> Cell. 121 (7), 1109-1121 (2005).</li>
<li>Zhang, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+the+haematopoietic+stem+cell+niche+and+control+of+the+niche+size%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Identification of the haematopoietic stem cell niche and control of the niche size.</a> Nature. 425 (6960), 836-841 (2003).</li>
<li>Mendez-Ferrer, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mesenchymal+and+haematopoietic+stem+cells+form+a+unique+bone+marrow+niche%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Mesenchymal and haematopoietic stem cells form a unique bone marrow niche.</a> Nature. 466 (7308), 829-834 (2010).</li>
<li>Naveiras, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bone-marrow+adipocytes+as+negative+regulators+of+the+haematopoietic+microenvironment%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Bone-marrow adipocytes as negative regulators of the haematopoietic microenvironment.</a> Nature. 460 (7252), 259-263 (2009).</li>
<li>Scheiermann, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adrenergic+nerves+govern+circadian+leukocyte+recruitment+to+tissues%5BTitle%5D)+AND+%22Immunity%22%5BJournal%5D)">Adrenergic nerves govern circadian leukocyte recruitment to tissues.</a> Immunity. 37 (2), 290-301 (2012).</li>
<li>Faust, N., Varas, F., Kelly, L. M., Heck, S., Graf, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Insertion+of+enhanced+green+fluorescent+protein+into+the+lysozyme+gene+creates+mice+with+fluorescent+granulocytes+and+macrophages%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Insertion of enhanced green fluorescent protein into the lysozyme gene creates mice with fluorescent granulocytes and macrophages.</a> Blood. 96 (2), 716-726 (2000).</li>
<li>Han, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inducible+gene+knockout+of+transcription+factor+recombination+signal+binding+protein-J+reveals+its+essential+role+in+T+versus+B+lineage+decision%5BTitle%5D)+AND+%22Int+Immunol%22%5BJournal%5D)">Inducible gene knockout of transcription factor recombination signal binding protein-J reveals its essential role in T versus B lineage decision.</a> Int Immunol. 14 (6), 637-645 (2002).</li>
<li>Lo Celso, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Live-animal+tracking+of+individual+haematopoietic+stem%2Fprogenitor+cells+in+their+niche%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Live-animal tracking of individual haematopoietic stem/progenitor cells in their niche.</a> Nature. 457 (7225), 92-96 (2009).</li>
<li>Wang, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Notch-dependent+repression+of+miR-155+in+the+bone+marrow+niche+regulates+hematopoiesis+in+an+NF-kappaB-dependent+manner%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Notch-dependent repression of miR-155 in the bone marrow niche regulates hematopoiesis in an NF-kappaB-dependent manner.</a> Cell Stem Cell. 15 (1), 51-65 (2014).</li>
<li>Miyamoto, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Myeloid+or+lymphoid+promiscuity+as+a+critical+step+in+hematopoietic+lineage+commitment%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Cell%22%5BJournal%5D)">Myeloid or lymphoid promiscuity as a critical step in hematopoietic lineage commitment.</a> Dev Cell. 3 (1), 137-147 (2002).</li>
<li>Luc, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Down+Regulation+of+Mpl+marks+the+transition+to+lymphoid-primed+multipotent+progenitors+with+gradual+loss+of+granulocyte-monocyte+potential%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Down Regulation of Mpl marks the transition to lymphoid-primed multipotent progenitors with gradual loss of granulocyte-monocyte potential.</a> Blood. 111 (7), 3424-3434 (2008).</li>
<li>Suzuki, M., Moriguchi, T., Ohneda, K., Yamamoto, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differential+contribution+of+the+Gata1+gene+hematopoietic+enhancer+to+erythroid+differentiation%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Differential contribution of the Gata1 gene hematopoietic enhancer to erythroid differentiation.</a> Mol Cell Biol. 29 (5), 1163-1175 (2009).</li>
<li>Essers, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((IFNalpha+activates+dormant+haematopoietic+stem+cells+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">IFNalpha activates dormant haematopoietic stem cells in vivo.</a> Nature. 458 (7240), 904-908 (2009).</li>
<li>Pietras, E. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Re-entry+into+quiescence+protects+hematopoietic+stem+cells+from+the+killing+effect+of+chronic+exposure+to+type+I+interferons%5BTitle%5D)+AND+%22J+Exp+Med%22%5BJournal%5D)">Re-entry into quiescence protects hematopoietic stem cells from the killing effect of chronic exposure to type I interferons.</a> J Exp Med. 211 (2), 245-262 (2014).</li>
<li>Scott, M. K., Akinduro, O., Lo Celso, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+4-dimensional+tracking+of+hematopoietic+stem+and+progenitor+cells+in+adult+mouse+calvarial+bone+marrow%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">In vivo 4-dimensional tracking of hematopoietic stem and progenitor cells in adult mouse calvarial bone marrow.</a> J Vis Exp. (91), e51683(2014).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Protokół ten opisuje projekt eksperymentalny zoptymalizowany pod kątem badania kinetyki wszczepiania komórek krwiotwórczych za pomocą przyżyciowej mikroskopii fluorescencyjnej. W tym badaniu ekspansja mieloidalnych komórek progenitorowych w WT BM lub w wadliwym BM sygnalizującym Notch była śledzona w kości calvarium poprzez śledzenie komórek szpikowych Lys-GFP dodatnich po BMT do biorców RBPJWT lub RBPJKO. Podejście to jest proponowane jako model, który można zastosować do odpowiedzi na podobne pytania, na przykład: i) d...

Wielofotonowa mikroskopia fluorescencyjna (IVFM) to potężna technika obrazowania, która pozwala na obrazowanie tkanek w czasie rzeczywistym o wysokiej rozdzielczości i głębokości do 1mm, w zależności od tkanki. Po zastosowaniu do kalwarii myszy pozwala na obserwację zachowania komórek krwiotwórczych w obrębie BM w sposób nieinwazyjny do 60-100 μm11. Podejście to jest stosowane tutaj do określenia kinetyki wszczepienia normalnych komórek progenitorowych szpiku w BM myszy z nokautem RBPJ pozbawionych kanonicznej sygnalizacji Notch.
Ostatnie prace naszej grupy wykazały, że wadliwa sygnalizacja kanoniczna Notch w mikrośrodowisku BM prowadzi do choroby podobnej do mieloproliferacyjnej12. Utratę sygnalizacji Notch uzyskano przez warunkową delecję domeny wiążącej DNA RBPJ, krytycznego czynnika transkrypcyjnego poniżej kanonicznej sygnalizacji Notch, przy użyciu rekombinacji indukowanej Mx1-Cre10. W tym badaniu wykorzystano model myszy Mx1-Cre/RBPJlox/lox. Warunkowa delecja motywu wiążącego DNA RBPJ powoduje utratę sygnalizacji ze wszystkich receptorów Notch. W modelu Mx1-Cre ekspresja Cre jest napędzana przez promotor Mx1 aktywowany po podaniu polyI:C, co powoduje indukcję docelowej delecji genu w komórkach krwi, a także w składnikach zrębu wielu narządów, w tym BM, śledziony i wątroby.
Mx1-Cre+/RBPJlox/lox i Mx1-Cre-/RBPJmyszy lox/lox indukowane poliI:C (tutaj oznaczone odpowiednio jako RBPJKO i RBPJWT) zostały śmiertelnie napromieniowane i przeszczepione normalnymi, dzikimi komórkami krwiotwórczymi. Począwszy od 4 tygodnia po przeszczepie, u biorców RBPJKO rozwinęła się znaczna leukocytoza, a następnie powiększenie śledziony. Chociaż myszy RBPJKO wykazywały zwiększony odsetek komórek progenitorowych szpiku w BM w 8 tygodniu po przeszczepie i w późniejszych punktach czasowych, analiza BM w 4 i 6 tygodniu nie ujawniła uderzających różnic w zawartości komórek szpikowych w porównaniu z biorcami RBPJWT z grupy kontrolnej. Obserwacja ta, wraz z faktem, że Mx1-Cre ulega ekspresji w różnych narządach krwiotwórczych, zrodziła pytanie, czy mikrośrodowisko BM miało bezpośredni wpływ na inicjację fenotypu mieloproliferacyjnego.
Aby ustalić, czy BM był krytycznym początkowym miejscem rozwoju choroby, zastosowano IVFM mysiego calvarium w połączeniu z przeszczepem BM (BMT), modelem RBPJ knock-out i systemem śledzenia linii. Transgeniczne myszy wykazujące ekspresję EGFP pod kontrolą specyficznego promotora lizozymu (Lys-GFP) 9 wykorzystano do uzyskania komórek dawcy, które można było uwidocznić podczas obrazowania BM po BMT. Ekspresja lizozymu jest specyficzna dla komórek szpikowych, a Lys-GFP oznacza komórki od wspólnego przodka szpiku (CMP) do dojrzałego granulocytu13.
IVFM BM w różnych punktach czasowych pokazało, że komórki Lys-GFP są podobne do BM biorców RBPJWT i RBPJKO, ale rozszerzają się i szybciej wszczepiają w BM biorców RBPJKO. Różnica ta była dramatyczna we wcześniejszym punkcie czasowym (tydzień 2) i zmniejszała się z czasem (tygodnie 4 i 6). Jednak w tych późniejszych punktach czasowych ocena przedziału krwiotwórczego u tego samego biorcy wykazała stały wzrost liczby komórek szpikowych krążących w PB i zlokalizowanych w śledzionie myszy RBPJKO, co wskazuje na zwiększoną produkcję komórek z BM do krążenia. Analiza lokalizacji komórek Lys-GFP w BM przeszczepionych myszy po 6 tygodniach wykazała, że komórki szpikowe znajdowały się dalej od układu naczyniowego w mikrośrodowisku RBPJKO niż w kontroli.
Podsumowując, połączenie IVFM z tymi specyficznymi modelami zwierzęcymi dostarczyło wglądu w dynamikę wszczepiania komórek szpikowych w mikrośrodowisku RBPJKO BM. Opisany tutaj projekt eksperymentalny i podejście ilościowe są proponowane jako paradygmat, który można zastosować do odpowiedzi na podobne pytania. Na przykład zastosowanie innych modeli śledzenia linii specyficznych dla komórek, takich jak myszy RAG1-GFP14 lub Gata1-GFP15, może pozwolić na śledzenie zachowania odpowiednio komórek progenitorowych limfoidalnych lub erytroidalnych w BM.

<table><tbody><tr><td>Koktajl ketaminowy</td><td>IU School of Medicine</td><td></td><td>Ketamina 90-100 mg/kg, Ksylazyna 2,5-5,0 mg/kg, Acepromazyna 1,0-2,5 mg/kg</td></tr><tr><td>TRITC dekstran</td><td>Tdb Doradztwo</td><td>TD150-100mg</td><td>Można stosować dekstran o innym kolorze.</td></tr><tr><td>Maszynka do strzyżenia włosów Andis</td><td>Braintree Scientific</td><td>CLP-323 75</td><td></td></tr><tr><td>Gąbka z gazy</td><td>Med Vet International</td><td>PK224</td><td>4-warstwowa, 2 x 2</td></tr><tr><td>Krem do depilacji Nair</td><td>Sklep</td><td></td><td></td>komercyjny</tr><tr><td>Saline</td><td>Med Vet International</td><td>RXSAL-POD1LT</td><td>0,9% Butelka z chlorkiem sodu</td></tr><tr><td>Strzykawka insulinowa</td><td>Fisher Scientific</td><td>14-826-79</td><td>28 g, 1/2 cc</td></tr><tr><td>Cienkie kleszcze</td><td>Fine Science Tools</td><td>00108-11, 00109-11</td><td>kleszcz prosty, kleszcz kątowy</td></tr><tr><td>Nożyczki</td><td>Fine Science Tools</td><td>15018-10</td><td></td></tr><tr><td>Uchwyt na igły</td><td>Fine Science Tools</td><td>12002-14</td><td></td></tr><tr><td>5-0 szew jedwabny</td><td>Fisher Scientific</td><td>MV-682</td><td>Można stosować inne niewchłanialne</td></tr><tr><td>szwy WillCo- szklane naczynie</td><td>denne WillCo</td><td>GWSt-5040</td><td></td></tr><tr><td>Olej do mikroskopu optycznego</td><td>Leica</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Stereotaktyczny wkład stopniowy&nbsp;</td><td>IU School of Medicine</td><td>Niestandardowy projekt</td><td></td></tr><tr><td>systemu mikroskopu konfokalnego Olympus FV1000&nbsp;</td><td>Olympus</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Olympus XLUMPLFL 20XW, NA 0.95 obiektyw&nbsp;</td><td>Olympus</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Mała poduszka grzewcza</td><td>Sklep</td><td></td> komercyjny <td>Poduszka grzewcza dla Zoo Med</td></tr><tr><td>Oprogramowanie do obrazowania Imaris 8.1</td><td>Oprogramowanie do wizualizacji i analizy obrazu</td> <td>Bitplane</td><td></td> 3/4 D</tr></tbody></table>

połączenie przyżyciowej mikroskopii fluorescencyjnej (ivfm) z modelami genetycznymi w celu zbadania dynamiki wszczepiania komórek krwiotwórczych do nisz szpiku kostnego

Combining Intravital Fluorescent Microscopy (IVFM) with Genetic Models to Study Engraftment Dynamics of Hematopoietic Cells to Bone Marrow Niches

Coraz więcej dowodów wskazuje, że normalna hematopoeza jest regulowana przez wyraźne sygnały mikrośrodowiskowe w BM, które obejmują wyspecjalizowane nisze komórkowe modulujące krytyczne funkcje hematopoetycznych komórek macierzystych (HSC)1,2. Rzeczywiście, obecnie wyłania się bardziej szczegółowy obraz mikrośrodowiska krwiotwórczego, w którym nisze śródkostne i śródbłonkowe tworzą jednostki funkcjonalne do regulacji prawidłowego HSC i ich potomstwa3,4,5. Nowe badania ujawniły znaczenie komórek okołonaczyniowych, adipocytów i komórek neuronalnych w utrzymaniu i regulacji funkcji HSC6,7,8. Ponadto istnieją dowody na to, że komórki z różnych linii, tj. komórki szpikowe i limfoidalne, domują i rezydują w określonych niszach w mikrośrodowisku BM. Jednak pełne mapowanie mikrośrodowiska BM i jego mieszkańców jest nadal w toku.
Transgeniczne szczepy myszy wykazujące ekspresję markerów fluorescencyjnych specyficznych dla linii lub myszy genetycznie zmodyfikowane tak, aby nie miały wybranych cząsteczek w określonych komórkach niszy BM są teraz dostępne. Modele knock-out i śledzenia linii, w połączeniu z metodami transplantacyjnymi, dają możliwość udoskonalenia wiedzy na temat roli określonych komórek "niszowych" w określonych populacjach krwiotwórczych, takich jak HSC, limfocyty B, limfocyty T, komórki szpikowe i komórki erytroidalne. Strategia ta może być dodatkowo wzmocniona przez połączenie użycia mikroskopii dwufotonowej kalwarii. Zapewniając obrazowanie in vivo w wysokiej rozdzielczości i renderowanie 3D kalwarii BM, możemy teraz precyzyjnie określić miejsce, w którym określone podzbiory krwiotwórcze znajdują się w BM i ocenić kinetykę ich ekspansji w czasie. W tym przypadku myszy transgeniczne Lys-GFP (oznaczające komórki szpikowe)<klasa sup = "xref">9 i myszy z nokautem RBPJ (bez kanonicznej sygnalizacji Notch) <klasa sup = "xref">10 są używane w połączeniu z IVFM w celu określenia wszczepienia komórek szpikowych do mikrośrodowiska BM z wadą Notch.

Kohorty składające się z 2 biorców RBPJKO oraz 2 biorców RBPJWT poddano obrazowaniu w ramach indywidualnych sesji w różnych punktach czasowych: 24 h oraz 2, 4 i 6 tygodni po transplantacji komórek BM Lys-GFP (schemat postępowania przedstawiono na Ryc. 1A).
U każdej myszy obrazy pozyskano z 6 standardowych obszarów sklepienia czaszki (BM calvarium), zidentyfikowanych na podstawie ich położenia względem rozwidleni...

Mikroskopia fluorescencyjna przyżyciowej (IVFM) calvarium jest stosowana w połączeniu z genetycznymi modelami zwierzęcymi do badania naprowadzania i wszczepiania komórek krwiotwórczych do nisz szpiku kostnego (BM).

Połączenie przyżyciowej mikroskopii fluorescencyjnej (IVFM) z modelami genetycznymi w celu zbadania dynamiki wszczepiania komórek krwiotwórczych do nisz szpiku kostnego

Increasing evidence indicates that normal hematopoiesis is regulated by distinct microenvironmental cues in the BM, which include specialized cellular ...

Ogólnym celem tej procedury jest wizualizacja i pomiar wszczepienia in vivo przeszczepionych komórek krwi do nisz szpiku kostnego biorcy. Główną zaletą tej techniki jest to, że umożliwia wizualizację procesów komórkowych, takich jak naprowadzanie, ekspansja i lokalizacja w różnych niszach szpiku kostnego komórek krwiotwórczych dawcy po przeszczepie. Podejście to, stosowane w połączeniu ze zmodyfikowanymi modelami zwierzęcymi, może pomóc w zdefiniowaniu szlaków molekularnych krytycznych dla regeneracji komórek krwiotwórczych.W przeciwieństwie do histologii lub innych technik obrazowania, mikroskopia przyżyteczkowa umożliwia uchwycenie interakcji międzykomórkowych u żywego zwierzęcia na poziomie komórkowym i w czasie rzeczywistym. Zdecydowaliśmy się zastosować tę metodę do określenia, czy mikrośrodowisko szpiku kostnego było początkowym miejscem rozwoju choroby mieloproliferacyjnej spowodowanej utratą sygnalizacji Notch. Wyzwania dla osób, które dopiero zaczynają przygodę z tą techniką, obejmują minimalizację artefaktów oddychania, optymalne ułożenie i stabilizację głowy oraz uniknięcie nasycenia obrazu.Na jedną do dwóch godzin przed przeszczepem spryskaj mysz EGFP zlizowaną 70% etan

combining-intravital-fluorescent-microscopy-ivfm-with-genetic-models

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Biologia rozwojowa

Opisujemy metodę obrazowania odpowiedzi na leczenie przeciwnowotworowe in vivo i w rozdzielczości pojedynczej komórki.

Obrazowanie na żywo odpowiedzi na leki w mikrośrodowisku guza w mysich modelach raka piersi

Złożone masy tkankowe, od organów po guzy, składają się z różnych elementów komórkowych. Wyjaśniliśmy udział fenotypów komórkowych w tkance przy użyciu wieloznakowanych fluorescencyjnych myszy transgenicznych w połączeniu z wieloparametrowym barwieniem immunofluorescencyjnym, a następnie rozmieszaniem widmowym w celu rozszyfrowania pochodzenia komórek, a także cech komórek na podstawie ekspresji białka.

Ilościowa analiza wielospektralna po przeszczepie tkanki fluorescencyjnej w celu wizualizacji pochodzenia, typów i interakcji komórek

Kombinatoryczne oznaczanie 5 fluorescencyjnych białek hematopoetycznych komórek macierzystych i progenitorowych pozwala na śledzenie klonów in vivo za pomocą mikroskopii konfokalnej i dwufotonowej, dostarczając wglądu w architekturę hematopoetyczną szpiku kostnego podczas regeneracji. Metoda ta umożliwia nieinwazyjne mapowanie losów kodowanych spektralnie komórek pochodzących z HSPC w nienaruszonych tkankach przez długi czas po przeszczepie.<br...

In vivo (in vivo) Klonalne śledzenie hematopoetycznych komórek macierzystych i progenitorowych oznaczonych pięcioma białkami fluorescencyjnymi przy użyciu mikroskopii konfokalnej i wielofotonowej

Natura interakcji między krwiotwórczymi komórkami macierzystymi i progenitorowymi (HSPC) a niszami szpiku kostnego jest słabo poznana. Niestandardowe modyfikacje sprzętowe i wieloetapowy protokół akwizycji pozwalają na wykorzystanie mikroskopii dwufotonowej i konfokalnej do obrazowania znakowanych ex vivo HSPC umieszczonych w obszarach szpiku kostnego, śledząc interakcje i ruch.

4-wymiarowe śledzenie in vivo hematopoetycznych komórek macierzystych i progenitorowych w dorosłym szpiku kostnym nazębnym myszy

Monocyty są kluczowymi regulatorami odporności wrodzonej i odgrywają kluczową rolę w odnowie obwodowego jednojądrzastego systemu fagocytarnego oraz w przypadku stanów zapalnych. W artykule opisano procedurę obrazowania w czasie rzeczywistym szpiku kostnego kalwarii myszy w celu zbadania mechanizmu mobilizacji monocytów.

Śledzenie monocytów szpiku kostnego myszy in vivo

Protokół opisuje nowatorski model komory okiennej kości udowej dla myszy, który może być używany do śledzenia ruchu komórek w szpiku kości udowej in vivo. Przyżyteczna mikroskopia fluorescencyjna wielofotonowa służy do obrazowania trzech składników szpiku kostnego kości udowej (układu naczyniowego, macierzy kolagenowej i neutrofili) w czasie.

Model komory okienka kości udowej do śledzenia komórek in vivo w mysim szpiku kostnym

Przedstawiono metodę tworzenia i obrazowania na żywo różnych humanizowanych nisz szpiku kostnego u myszy. W oparciu o niszę podporową utworzoną przez ludzkie komórki mezenchymalne, dodanie ludzkich komórek śródbłonka indukuje tworzenie ludzkich naczyń, podczas gdy dodanie rhBMP-2 indukuje tworzenie chimerycznej tkanki kostnej ludzko-mysi.

Bioinżynieria humanizowanych mikrośrodowisk szpiku kostnego u myszy i ich wizualizacja za pomocą obrazowania na żywo

Ten protokół opisuje doudowe wstrzyknięcie kilku krwiotwórczych lub białaczkowych komórek macierzystych, w tym komórek z edytowanymi genami, w mysich modelach ksenoprzeszczepów, co nie tylko umożliwi szybki i bezpieczny przeszczep komórek, ale także seryjne analizy szpiku kostnego.

Uproszczone iniekcje doudowe przy użyciu żywych myszy pozwalają na ciągłą analizę szpiku kostnego

Zastrzyki doudowe pozwalają na wszczepienie niewielkiej liczby hematopoetycznych komórek macierzystych i progenitorowych (HSPC), poprzez umieszczenie komórek bezpośrednio w jamie szpiku kostnego. Tutaj opisujemy eksperymentalny protokół wstrzykiwania do kości udowej ludzkich HSPC myszom z niedoborem odporności.

Wstrzyknięcie doudowe ludzkich hematopoetycznych komórek macierzystych i progenitorowych myszom z obniżoną odpornością

Mikroskopia przyżyciowa umożliwia badanie dynamicznych procesów biologicznych, takich jak regeneracja tkanek i rozwój guza. Szpik kostny kalwarii, wysoce dynamiczna tkanka, oferuje wgląd w hematopoezę i funkcję naczyń krwionośnych. Korzystanie z biokompatybilnego, wydrukowanego w 3D implantu mocującego głowę pozwala na powtarzalne obrazowanie podłużne, zwiększając naszą wiedzę na temat dynamiki tkanek i mikrośrodowiska guza.

Przyżyciowe obrazowanie podłużne dynamiki naczyń krwionośnych w szpiku kostnym kości nazębnej

Poznaj mikroskopię fluorescencyjną przyżyciową (IVFM) do badania wszczepiania komórek krwiotwórczych w nisze szpiku kostnego. Ta metoda umożliwia wizualizację procesów komórkowych w czasie rzeczywistym u żywych zwierząt.

Połączenie przyżyciowej mikroskopii fluorescencyjnej (IVFM) z modelami genetycznymi w celu zbadania dynamiki wszczepiania komórek krwiotwórczych do nisz szpiku kostnego (Wideo) | JoVE Journal

Połączenie przyżyciowej mikroskopii fluorescencyjnej (IVFM) z modelami genetycznymi w celu zbadania dynamiki wszczepiania komórek krwiotwórczych do nisz szpiku kostnego

Przeglądaj więcej filmów