Name: Prosta metoda cytometrii przepływowej do pomiaru wychwytu glukozy i ekspresji transportera glukozy dla subpopulacji monocytów we krwi pełnej (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-08-12T14:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 28 s
Description: Poznaj metodę cytometrii przepływowej do pomiaru wychwytu glukozy i ekspresji transportera glukozy w subpopulacjach monocytów we krwi pełnej. Ta technika umożliwia badanie metabolizmu komórek immunologicznych.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

To badanie zostało sfinansowane przez Australijskie Centrum Badań nad Wirusologią HIV i Wirusowym Zapaleniem Wątroby (ACH2) oraz grant rozwojowy z 2010 roku (CNIHR) z Centrum Badań nad AIDS Uniwersytetu Waszyngtońskiego (CFAR), programu finansowanego przez NIH pod numerem nagrody AI027757 który jest wspierany przez następujące instytuty i centra NIH (NIAID, NCI, NIMH, NIDA, NICHD, NHLBI, NIA). C.S.P jest beneficjentem grantu CNIHR i ACH2. SMC jest laureatem stypendium National Health and Medical Research Council of Australia (NHMRC) Principal Research Fellowship. Autorzy wyrażają wdzięczność za wkład w tę pracę Wiktoriańskiego Programu Wsparcia Infrastruktury Operacyjnej otrzymany przez Burnet Institute. Dziękujemy za pomoc Geza Paukovic i Evy Orlowski-Oliver z AMREP Flow Cytometry Core Facility w zakresie szkoleń z cytometrii przepływowej i porad technicznych. Dziękujemy Angusowi Morganowi za coaching medialny i organizację sesji zdjęciowej. Jesteśmy wdzięczni Jesse Massonowi i Jehadowi Abdulazizowi K. Alzahraniemu za pomoc laboratoryjną podczas kręcenia filmu. Dziękujemy za wysiłki dr Davida Simara ze Szkoły Nauk Medycznych UNSW w Australii, który udzielił krytycznych porad metodycznych. C.S.P pragnie podziękować <a href="http://www.nice-consultants.com/">www.nice-consultants.com</a> za konsultacje graficzne.
WKŁAD AUTORÓW:
C.S.P wymyślił projekt, zaprojektował i przeprowadził eksperymenty, przeanalizował i zinterpretował dane oraz napisał manuskrypt. J.J.A. zinterpretował dane i napisał manuskrypt. T.R.B napisał rękopis. J.M.M zinterpretował dane, przedstawił krytyczne sugestie intelektualne i zrecenzował manuskrypt. S.M.C zinterpretował dane, przedstawił krytyczne sugestie intelektualne i zrecenzował manuskrypt.

UWAGA: Osoby zakażone wirusem HIV i niezakażone wirusem HIV zostały zrekrutowane odpowiednio z Oddziału Chorób Zakaźnych w Szpitalu Alfred w Melbourne, VIC, Australia oraz z lokalnej społeczności. Uzyskano świadomą zgodę od wszystkich uczestników, a badanie zostało zatwierdzone przez Komitet ds. Badań i Etyki Szpitala Alfred.
1. Wykrywanie powierzchni komórek przesytu 1 w subpopulacjach monocytów i monocytów
<ol>
	<li>Zbierz krew w probówkach z antykoagulantem cytrynianowym ACD-B i rozpocznij eksperymenty w komorze bezpieczeństwa biologicznego w ciągu 1 godziny od pobrania.</li>
	<li>Dodaj 100 μl krwi do probówek polipropylenowych. Dodaj 2 ml 1x roztworu lizującego (patrz Tabela Materiałów) do probówek na lodzie, delikatnie pipetując, aby wymieszać. Inkubować przez 15 minut na lodzie. Wirować przy 220 x g przez 5 min.</li>
	<li>Zdekantować i przemyć dwukrotnie, dodając około 2-4 ml roztworu myjącego (0,5% BSA w 1x PBS) i odwirowując przy 220 x g przez 5 min.</li>
	<li>Użyj pipety, aby ostrożnie usunąć jak najwięcej roztworu myjącego. Umieścić probówki na lodzie i ponownie zawiesić w 100 μl roztworu do mycia.</li>
	<li>Aby zidentyfikować specyficzne subpopulacje monocytów, wybarwić komórki następującą objętością przeciwciał na 100 μl zawiesiny komórek przygotowanej w kroku 1.4: 5 μl anty-CD3-PE, 5 μl anty-CD14-APC, 5 μl anty-CD16-PECy7, 5 μl Glut1-FITC lub IgG2b-FITC (probówka kontrolna izotypu).</li>
	<li>Umieść na lodzie na 30 minut w ciemności. Umyć 2 razy roztworem myjącym. Utrwal za pomocą 200-300 μl 0,5% formaldehydu wyprodukowanego w 1x PBS.</li>
	<li>Analiza na cytometrze przepływowym zdolnym do wykrycia 4 kolorów w ciągu 24 godzin w ramach następującej długości fali wzbudzenia i emisji: FITC (488, 530), PE (488, 575), PECy7 (488, 780), APC (633, 660)10.</li>
</ol>
2. Wychwyt glukozy przez monocyty
<ol>
	<li>Pobrać pipetą 90 μl krwi pobranej w kroku 1.1 w probówkach polipropylenowych. Dodać 10 μl roztworu roboczego 2-NBDG o stężeniu 14,60 μM do 90 μl krwi (1,46 mM stężenie końcowe) i delikatnie strzepnąć, aby wymieszać. Bardzo ważne jest, aby ograniczyć ekspozycję 2-NBDG na światło poprzez przykrycie rurek folią aluminiową.</li>
	<li>Inkubować w temperaturze 37 °C w ciemności przez 15-30 minut, a następnie natychmiast umieścić na lodzie. Dodaj 4 ml 1x roztworu lizującego FACS do probówek na lodzie. Wirować przy 220 x g w temperaturze 4 °C przez 5 min.</li>
	<li>Umyć raz, dodając 4 ml roztworu myjącego (0,5% BSA w 1x PBS). Wirować przy 220 x g w temperaturze 4 °C przez 5 min. Zdekantować i umieścić na lodzie.</li>
	<li>Barwienie komórek z przeciwciałami: 5 μl anty-CD3-PE, 5 μl anty-CD14-APC i 5 μl anty-CD16-PECy7. Wymieszaj i umieść na lodzie na 30 minut w ciemności. 
	UWAGA: W tym okresie upewnij się, że cytometr przepływowy jest gotowy do natychmiastowej analizy. Pozyskaj ogniwa o następującej długości fali wzbudzenia i emisji: 2-NBDG (488, 530), PE (488, 575), PECy7 (488, 780), APC (633, 660).</li>
	<li>Dodaj 4 ml lodowatego buforu do płukania (0,5% BSA w 1x PBS) do probówek. Umyć raz przez odwirowanie w temperaturze 220 x g w temperaturze 4 °C przez 5 min. Zdekantuj i dodaj 200-300 μl starego lodowego PBS i trzymaj na lodzie w ciemności (przykryte folią aluminiową). Przeprowadzić analizę na cytometrze przepływowym w ciągu 10 minut, ustawiając długość fali wzbudzenia i emisji, jak w kroku 2.4.</li>
</ol>
3. Akwizycja i analiza danych

UWAGA: Zakłada się znajomość cytometrii przepływowej i analizy danych.
<ol>
	<li>Korzystając z cytometru przepływowego zdolnego do analizy co najmniej 4-kolorowej, ustaw kompensację przy użyciu niebarwionych i indywidualnie barwionych próbek. 
	UWAGA: Pojedyncze barwienie przy użyciu CD4 i CD14 z oznaczeniem FITC może być stosowane do kompensacji Glut1 i 2-NBDG.</li>
	<li>Skonfiguruj i oznacz odpowiednie okna przed pobraniem próbek. Narysuj bramkę wokół populacji monocytów i uzyskaj od 100 000 do 300 000 zdarzeń na próbkę w średnim tempie. Wystarczy 50 000 zdarzeń na próbkę kompensacji. 
	UWAGA: Kompensację można przeprowadzić przed pobraniem próbki lub w oprogramowaniu do analizy pojedynczych komórek, zgodnie ze standardowymi procedurami.</li>
	<li>Eksportuj i zapisuj dane w odpowiedniej lokalizacji. Otwórz oprogramowanie do analizy pojedynczych komórek, takie jak FlowJo lub inne oprogramowanie analityczne (rysunek uzupełniający 1), a następnie przeciągnij i upuść próbki zgodnie z opisem (rysunek uzupełniający 2).</li>
	<li>Kliknij dwukrotnie, aby otworzyć plik (Rysunek uzupełniający 3). Narysuj okrąg do bramek monocytów na podstawie właściwości rozpraszania do przodu i boku, jak pokazano na rysunku 1A i rysunku uzupełniającym 4. Kliknij dwukrotnie populację monocytów. Obserwuj i narysuj ramkę wokół populacji CD3- (Rysunek uzupełniający 4).</li>
	<li>Kliknij dwukrotnie populację CD3-. Aby obserwować subpopulacje monocytów, wybierz CD14-APC na osi "x" i CD16-PECy7 na osi "y" i odpowiednio oznacz (rysunek uzupełniający 5).</li>
	<li>W przypadku braku odrębnych populacji pozytywnych i ujemnych należy zmierzyć ekspresję wychwytu Glut1 lub 2-NBDG w określonych subpopulacjach monocytów. Określić średnią intensywność fluorescencji (MFI) Glut1 i 2-NBDG, odejmując izotyp i brak tła 2-NBDG (rysunek uzupełniający 6).</li>
	<li>Tam, gdzie istnieją zdefiniowane populacje, użyj IgG2b-FITC, aby ustawić bramkę i określić procent komórek dodatnich (ryc. 3). 
	UWAGA: Użyj tej procedury do analizy całkowitych monocytów CD14 +. Ponieważ wychwyt 2-NBDG jest zwykle oznaczony zmianą intensywności fluorescencji, dane najlepiej reprezentują MFI i histogramy.</li>
</ol>

<ol><li>Shi, C., Pamer, E. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Monocyte+recruitment+during+infection+and+inflammation%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Immunol%22%5BJournal%5D)">Monocyte recruitment during infection and inflammation.</a> Nat Rev Immunol. 11, 762-774 (2011).</li>
<li>Woollard, K. J., Geissmann, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Monocytes+in+atherosclerosis%3A+subsets+and+functions%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Cardiol%22%5BJournal%5D)">Monocytes in atherosclerosis: subsets and functions.</a> Nat Rev Cardiol. 7, 77-86 (2010).</li>
<li>Richards, D. M., Hettinger, J., Feuerer, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Monocytes+and+macrophages+in+cancer%3A+development+and+functions%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Microenviron%22%5BJournal%5D)">Monocytes and macrophages in cancer: development and functions.</a> Cancer Microenviron. 6, 179-191 (2013).</li>
<li>Anzinger, J. J., Butterfield, T. R., Angelovich, T. A., Crowe, S. M., Palmer, C. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Monocytes+as+regulators+of+inflammation+and+HIV-related+comorbidities+during+cART%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol+Res%22%5BJournal%5D)">Monocytes as regulators of inflammation and HIV-related comorbidities during cART.</a> J Immunol Res. 2014, 569819(2014).</li>
<li>Palmer, C., Cherry, C. L., Sada-Ovalle, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Glucose+Metabolism+in+T+Cells+and+Monocytes%3A+New+Perspectives+in+HIV+Pathogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22EBioMedicine%22%5BJournal%5D)">Glucose Metabolism in T Cells and Monocytes: New Perspectives in HIV Pathogenesis.</a> EBioMedicine. , (2016).</li>
<li>Cheng, S. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((mTOR-+and+HIF-1alpha-mediated+aerobic+glycolysis+as+metabolic+basis+for+trained+immunity%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">mTOR- and HIF-1alpha-mediated aerobic glycolysis as metabolic basis for trained immunity.</a> Science. 345, 1250684(2014).</li>
<li>Maratou, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Glucose+transporter+expression+on+the+plasma+membrane+of+resting+and+activated+white+blood+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Eur+J+Clin+Invest%22%5BJournal%5D)">Glucose transporter expression on the plasma membrane of resting and activated white blood cells.</a> Eur J Clin Invest. 37, 282-290 (2007).</li>
<li>Freemerman, A. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Metabolic+reprogramming+of+macrophages%3A+glucose+transporter+1+%28GLUT1%29-mediated+glucose+metabolism+drives+a+proinflammatory+phenotype%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Metabolic reprogramming of macrophages: glucose transporter 1 (GLUT1)-mediated glucose metabolism drives a proinflammatory phenotype.</a> J Biol Chem. 289, 7884-7896 (2014).</li>
<li>Gonnella, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Kaposi+sarcoma+associated+herpesvirus+%28KSHV%29+induces+AKT+hyperphosphorylation%2C+bortezomib-resistance+and+GLUT-1+plasma+membrane+exposure+in+THP-1+monocytic+cell+line%5BTitle%5D)+AND+%22J+Exp+Clin+Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">Kaposi sarcoma associated herpesvirus (KSHV) induces AKT hyperphosphorylation, bortezomib-resistance and GLUT-1 plasma membrane exposure in THP-1 monocytic cell line.</a> J Exp Clin Cancer Res. 32, 79(2013).</li>
<li>Palmer, C. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Glucose+transporter+1-expressing+proinflammatory+monocytes+are+elevated+in+combination+antiretroviral+therapy-treated+and+untreated+HIV%2B+subjects%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol%22%5BJournal%5D)">Glucose transporter 1-expressing proinflammatory monocytes are elevated in combination antiretroviral therapy-treated and untreated HIV+ subjects.</a> J Immunol. 193, 5595-5603 (2014).</li>
<li>Wong, K. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gene+expression+profiling+reveals+the+defining+features+of+the+classical%2C+intermediate%2C+and+nonclassical+human+monocyte+subsets%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Gene expression profiling reveals the defining features of the classical, intermediate, and nonclassical human monocyte subsets.</a> Blood. 118, e16-e31 (2011).</li>
<li>Ziegler-Heitbrock, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nomenclature+of+monocytes+and+dendritic+cells+in+blood%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Nomenclature of monocytes and dendritic cells in blood.</a> Blood. 116, e74-e80 (2010).</li>
<li>Belge, K. U., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+proinflammatory+CD14%2BCD16%2BDR%2B%2B+monocytes+are+a+major+source+of+TNF%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol%22%5BJournal%5D)">The proinflammatory CD14+CD16+DR++ monocytes are a major source of TNF.</a> J Immunol. 168, 3536-3542 (2002).</li>
<li>Frankenberger, M., Sternsdorf, T., Pechumer, H., Pforte, A., Ziegler-Heitbrock, H. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differential+cytokine+expression+in+human+blood+monocyte+subpopulations%3A+a+polymerase+chain+reaction+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Differential cytokine expression in human blood monocyte subpopulations: a polymerase chain reaction analysis.</a> Blood. 87, 373-377 (1996).</li>
<li>Ziegler-Heitbrock, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+CD14%2B+CD16%2B+blood+monocytes%3A+their+role+in+infection+and+inflammation%5BTitle%5D)+AND+%22J+Leukoc+Biol%22%5BJournal%5D)">The CD14+ CD16+ blood monocytes: their role in infection and inflammation.</a> J Leukoc Biol. 81, 584-592 (2007).</li>
<li>Ziegler-Heitbrock, L. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aZiegler-Heitbrock%2C+L+%22Macrophages%3A+Biology+and+Role+in+the+Pathology+of+Diseases%22">Macrophages: Biology and Role in the Pathology of Diseases</a>. , Springer. 3-36 (2014).</li>
<li>Dimitriadis, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evaluation+of+glucose+transport+and+its+regulation+by+insulin+in+human+monocytes+using+flow+cytometry%5BTitle%5D)+AND+%22Cytometry+A%22%5BJournal%5D)">Evaluation of glucose transport and its regulation by insulin in human monocytes using flow cytometry.</a> Cytometry A. 64, 27-33 (2005).</li>
<li>Fu, Y., Maianu, L., Melbert, B. R., Garvey, W. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Facilitative+glucose+transporter+gene+expression+in+human+lymphocytes%2C+monocytes%2C+and+macrophages%3A+a+role+for+GLUT+isoforms+1%2C+3%2C+and+5+in+the+immune+response+and+foam+cell+formation%5BTitle%5D)+AND+%22Blood+Cells+Mol+Dis%22%5BJournal%5D)">Facilitative glucose transporter gene expression in human lymphocytes, monocytes, and macrophages: a role for GLUT isoforms 1, 3, and 5 in the immune response and foam cell formation.</a> Blood Cells Mol Dis. 32, 182-190 (2004).</li>
<li>Stibenz, D., Buhrer, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Down-regulation+of+L-selectin+surface+expression+by+various+leukocyte+isolation+procedures%5BTitle%5D)+AND+%22Scand+J+Immunol%22%5BJournal%5D)">Down-regulation of L-selectin surface expression by various leukocyte isolation procedures.</a> Scand J Immunol. 39, 59-63 (1994).</li>
<li>Ahmed, N., Kansara, M., Berridge, M. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Acute+regulation+of+glucose+transport+in+a+monocyte-macrophage+cell+line%3A+Glut-3+affinity+for+glucose+is+enhanced+during+the+respiratory+burst%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem+J%22%5BJournal%5D)">Acute regulation of glucose transport in a monocyte-macrophage cell line: Glut-3 affinity for glucose is enhanced during the respiratory burst.</a> Biochem J. 327 (Pt 2), 369-375 (1997).</li>
<li>Cutfield, W. S., Luk, W., Skinner, S. J., Robinson, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Impaired+insulin-mediated+glucose+uptake+in+monocytes+of+short+children+with+intrauterine+growth+retardation%29%5BTitle%5D)+AND+%22Pediatr+Diabetes%22%5BJournal%5D)">Impaired insulin-mediated glucose uptake in monocytes of short children with intrauterine growth retardation).</a> Pediatr Diabetes. 1, 186-192 (2000).</li>
<li>Yoshioka, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+fluorescent+derivative+of+glucose+applicable+to+the+assessment+of+glucose+uptake+activity+of+Escherichia+coli%5BTitle%5D)+AND+%22Biochim+Biophys+Acta%22%5BJournal%5D)">A novel fluorescent derivative of glucose applicable to the assessment of glucose uptake activity of Escherichia coli.</a> Biochim Biophys Acta. 1289, 5-9 (1996).</li>
<li>Speizer, L., Haugland, R., Kutchai, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Asymmetric+transport+of+a+fluorescent+glucose+analogue+by+human+erythrocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Biochim+Biophys+Acta%22%5BJournal%5D)">Asymmetric transport of a fluorescent glucose analogue by human erythrocytes.</a> Biochim Biophys Acta. 815, 75-84 (1985).</li>
<li>Palmer, C. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Increased+glucose+metabolic+activity+is+associated+with+CD4%2B+T-cell+activation+and+depletion+during+chronic+HIV+infection%5BTitle%5D)+AND+%22AIDS%22%5BJournal%5D)">Increased glucose metabolic activity is associated with CD4+ T-cell activation and depletion during chronic HIV infection.</a> AIDS. 28, 297-309 (2014).</li>
<li>Palmer, C. S., Ostrowski, M., Balderson, B., Christian, N., Crowe, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Glucose+metabolism+regulates+T+cell+activation%2C+differentiation%2C+and+functions%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+immunology%22%5BJournal%5D)">Glucose metabolism regulates T cell activation, differentiation, and functions.</a> Frontiers in immunology. 6, (2015).</li>
<li>Palmer, C. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulators+of+glucose+metabolism+in+CD4+and+CD8+T+cells%5BTitle%5D)+AND+%22International+reviews+of+immunology%22%5BJournal%5D)">Regulators of glucose metabolism in CD4 and CD8 T cells.</a> International reviews of immunology. , 1-12 (2015).</li>
<li>Palmer, C. S., Crowe, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((How+does+monocyte+metabolism+impact+inflammation+and+aging+during+chronic+HIV+infection%3F%5BTitle%5D)+AND+%22AIDS+research+and+human+retroviruses%22%5BJournal%5D)">How does monocyte metabolism impact inflammation and aging during chronic HIV infection?</a> AIDS research and human retroviruses. 30, 335-336 (2014).</li>
<li>McFadden, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Metabolic+stress+is+a+barrier+to+Epstein-Barr+virus-mediated+B-cell+immortalization%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Metabolic stress is a barrier to Epstein-Barr virus-mediated B-cell immortalization.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113, E782-E790 (2016).</li>
<li>Gamelli, R. L., Liu, H., He, L. K., Hofmann, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Augmentations+of+glucose+uptake+and+glucose+transporter-1+in+macrophages+following+thermal+injury+and+sepsis+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+leukocyte+biology%22%5BJournal%5D)">Augmentations of glucose uptake and glucose transporter-1 in macrophages following thermal injury and sepsis in mice.</a> Journal of leukocyte biology. 59, 639-647 (1996).</li>
<li>Yin, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Glucose+Oxidation+Is+Critical+for+CD4%2B+T+Cell+Activation+in+a+Mouse+Model+of+Systemic+Lupus+Erythematosus%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+immunology%22%5BJournal%5D)">Glucose Oxidation Is Critical for CD4+ T Cell Activation in a Mouse Model of Systemic Lupus Erythematosus.</a> Journal of immunology. , 80-90 (2016).</li>
<li>Yang, Z., Matteson, E. L., Goronzy, J. J., Weyand, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((T-cell+metabolism+in+autoimmune+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Arthritis+research+%26+therapy%22%5BJournal%5D)">T-cell metabolism in autoimmune disease.</a> Arthritis research & therapy. 17, 29(2015).</li>
<li>Yin, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Normalization+of+CD4%2B+T+cell+metabolism+reverses+lupus%5BTitle%5D)+AND+%22Science+translational+medicine%22%5BJournal%5D)">Normalization of CD4+ T cell metabolism reverses lupus.</a> Science translational medicine. 7, 274ra218(2015).</li>
<li>Barbera Betancourt, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inhibition+of+Phosphoinositide+3-Kinase+p110delta+Does+Not+Affect+T+Cell+Driven+Development+of+Type+1+Diabetes+Despite+Significant+Effects+on+Cytokine+Production%5BTitle%5D)+AND+%22PloS+one%22%5BJournal%5D)">Inhibition of Phosphoinositide 3-Kinase p110delta Does Not Affect T Cell Driven Development of Type 1 Diabetes Despite Significant Effects on Cytokine Production.</a> PloS one. 11, e0146516(2016).</li>
<li>Barron, C. C., Bilan, P. J., Tsakiridis, T., Tsiani, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Facilitative+glucose+transporters%3A+Implications+for+cancer+detection%2C+prognosis+and+treatment%5BTitle%5D)+AND+%22Metabolism%3A+clinical+and+experimental%22%5BJournal%5D)">Facilitative glucose transporters: Implications for cancer detection, prognosis and treatment.</a> Metabolism: clinical and experimental. 65, 124-139 (2016).</li>
<li>Hegedus, A., Kavanagh Williamson, M., Huthoff, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((HIV-1+pathogenicity+and+virion+production+are+dependent+on+the+metabolic+phenotype+of+activated+CD4%2B+T+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Retrovirology%22%5BJournal%5D)">HIV-1 pathogenicity and virion production are dependent on the metabolic phenotype of activated CD4+ T cells.</a> Retrovirology. 11, 98(2014).</li>
<li>Taylor, H. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phospholipase+D1+Couples+CD4%2B+T+Cell+Activation+to+c-Myc-Dependent+Deoxyribonucleotide+Pool+Expansion+and+HIV-1+Replication%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Pathog%22%5BJournal%5D)">Phospholipase D1 Couples CD4+ T Cell Activation to c-Myc-Dependent Deoxyribonucleotide Pool Expansion and HIV-1 Replication.</a> PLoS Pathog. 11, e1004864(2015).</li>
<li>Loisel-Meyer, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Glut1-mediated+glucose+transport+regulates+HIV+infection%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Glut1-mediated glucose transport regulates HIV infection.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 109, 2549-2554 (2012).</li>
<li>Palmer, C. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Emerging+Role+and+Characterization+of+Immunometabolism%3A+Relevance+to+HIV+Pathogenesis%2C+Serious+Non-AIDS+Events%2C+and+a+Cure%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol%22%5BJournal%5D)">Emerging Role and Characterization of Immunometabolism: Relevance to HIV Pathogenesis, Serious Non-AIDS Events, and a Cure.</a> J Immunol. 196 (11), 4437-4444 (2016).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Opisany tutaj protokół szczegółowo opisuje prostą metodę badania ekspresji transportera glukozy i wychwytu fluorescencyjnego analogu glukozy przez monocyty i subpopulacje monocytów we krwi pełnej. Oceniając wychwyt 2-NBDG we krwi pełnej, technika ta pozwala na uzyskanie warunków podobnych do tych in vivo. W poprzednim badaniu zbadano wychwyt 6-NBDG w monocytach oddzielonych od krwi pełnej przez wirowanie gęstości17. Jednak w badaniu tym nie badano subpopulacji monocytów, a oddzielenie monocytów od krw...

Monocyty są głównym składnikiem ludzkiego wrodzonego układu odpornościowego, które są szybko mobilizowane do miejsc infekcji i stanów zapalnych1. Aktywacja monocytów ma kluczowe znaczenie dla ograniczenia ostrych uszkodzeń spowodowanych przez patogeny, a także ma kluczowe znaczenie dla patogenezy kilku chorób przewlekłych, w tym miażdżycy2, raka3 i HIV4,5.
Metabolizm monocytów spoczynkowych i aktywowanych różni się diametralnie, przy czym monocyty w stanie spoczynku wykorzystują metabolizm oksydacyjny, a monocyty aktywowane wykorzystują metabolizm glikolityczny (tj. fermentację glukozy do mleczanu)6. Aktywacja monocytów indukuje ekspresję transporterów glukozy, co pozwala na zwiększony wychwyt glukozy dla metabolizmu glikolitycznego7. Transporter glukozy monocytów 1 (Glut1) jest jednym z takich transporterów regulowanych w górę podczas aktywacji, a wykazano, że jego ekspresja prowadzi do produkcji cytokin prozapalnych in vitro i w tkance tłuszczowej otyłych myszy8. Zakażenie monocytowej linii komórkowej przez herpeswirusa związanego z mięsakiem Kaposiego prowadzi do regulacji w górę komórek Glut19, a ostatnio wykazaliśmy, że podczas przewlekłego zakażenia HIV zwiększony odsetek monocytów eksprymujących Glut1 jest obecny podczas infekcji nieleczonej i leczonej skojarzoną terapią przeciwretrowirusową10. Podsumowując, badania te pokazują, że wychwyt glukozy i metabolizm glikolityczny przez monocyty są ważnymi aspektami wielu chorób zapalnych. W związku z tym prosta metoda pomiaru ekspresji monocytów Glut1 i wychwytu glukozy podczas homeostazy i choroby zapalnej może być przydatna dla szerokiego grona badaczy.
Ludzkie monocyty są niejednorodne, składają się z trzech odrębnych podzbiorów, które mogą być badane przez różnicową ekspresję markerów powierzchniowych komórek CD14 i CD1611,12. Klasyczne monocyty wyrażają wysoki poziom CD14, ale nie wyrażają CD16 (CD14 + + CD16-), monocyty pośrednie wyrażają wysoki poziom CD14 i pośredni poziom CD16 (CD14 + + CD16 +), a nieklasyczne monocyty wyrażają niski poziom CD14 i wysoki poziom CD16 (CD14 + CD16 ++). Monocyty wykazujące ekspresję CD16 nazywane są monocytami CD16+, które w porównaniu z monocytami CD16 charakteryzują się wysoką ekspresją cytokin zapalnych i zdolnością do skuteczniejszego prezentowania antygenów13,14. Około 10% monocytów ulega ekspresji CD16 podczas homeostazy, przy czym wyższy odsetek obserwuje się podczas stanu zapalnego15. Subpopulacje monocytów są związane z pewnymi stanami chorobowymi i mogą być użytecznymi biologicznymi markerami choroby i postępu choroby16.
Naszym celem było zidentyfikowanie metody, która może mierzyć ekspresję transportera glukozy i wychwyt glukozy przez ludzkie monocyty i subpopulacje monocytów w warunkach jak najbardziej zbliżonych do warunków fizjologicznych. Poprzednie badania mierzyły ekspresję transportera glukozy monocytów i wychwyt glukozy17,18, chociaż metody te badały izolowane monocyty, które mogą mieć zmienioną ekspresję białka w porównaniu z warunkami fizjologicznymi19, a żadne wcześniejsze badanie nie badało subpopulacji ludzkich monocytów. Za pomocą wieloparametrycznej cytometrii przepływowej opisano metodę badania ekspresji transportera glukozy i wychwytu fluorescencyjnego analogu glukozy 2-NBDG przez całkowite monocyty i subpopulacje monocytów (na podstawie ekspresji CD14 i CD16) w pełnej krwi niezmanipulowanej.

<table><tbody><tr><td>Probówka VACUETT 9 ml Probówki przeciwzakrzepowe ACD-B</td><td>Greiner Bio-One GmbH</td><td>455094</td><td></td></tr><tr><td>5 ml sterylne probówki polipropylenowe</td><td>BD Biosciences</td><td>352063</td><td></td></tr><tr><td>Albumina z surowicy bydlęcej (BSA)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A7906</td><td></td></tr><tr><td>16% roztwór formaldehydu</td><td>Mikroskopia elektronowa Science</td><td>15710</td><td></td></tr><tr><td>BD FACS roztwór lizujący (10x)</td><td>BD Nauki biologiczne</td><td>349202</td><td>Rozcieńczony roztwór lizujący BD FACS 1/10 z wodą dejonizowaną do stężenia roboczego (przechowywać do 1 tygodnia w temperaturze 4 & st; C)</td></tr> <tr><td>anty-CD3-PE</td><td>BD Biosciences</td><td>555340</td><td></td></tr><tr><td>anty CD14-APC</td><td>BD Biosciences</td><td>555399</td><td></td></tr><tr><td>anty-CD16-PECy7</td><td>BD Biosciences</td><td>557744</td><td></td></tr><tr><td>anty-Glut1-FITC</td><td>R & Systemy D</td><td>FAB1418F</td><td></td></tr><tr><td>IgG2b-FITC</td><td>R & D Systems</td><td>IC0041F</td><td></td></tr><tr><td>2-NBDG</td><td>Life technologies</td><td>N13195</td><td>Zawiesić 5 mg 2-NBDG w 1 ml wody dejonizowanej, aby uzyskać roztwór podstawowy o stężeniu 14,60 mM (przechowywać do 6 miesięcy w temperaturze 4 & stopni; Aby uzyskać robocze stężenie 2-NBDG, rozcieńczyć materiał 1/100 za pomocą 1x DPBS. Przykryj folią. (przechowywać do 1 tygodnia w temperaturze 4 stopni C)</td></tr> <tr><td>Dulbecco' s Sól fizjologiczna buforowana fosforanami (1x)</td><td>Technologie życia</td><td>14190-144</td><td>Aby przygotować roztwór do mycia, dodać 0,5 g BSA na 100 ml DPBS (przechowywać do 2 tygodni w temperaturze 4 & C)</td></tr></tbody></table>

prosta metoda cytometrii przepływowej do pomiaru wychwytu glukozy i ekspresji transportera glukozy dla subpopulacji monocytów we krwi pełnej

A Simple Flow Cytometric Method to Measure Glucose Uptake and Glucose Transporter Expression for Monocyte Subpopulations in Whole Blood

Monocyty to wrodzone komórki odpornościowe, które mogą być aktywowane przez patogeny i stany zapalne związane z niektórymi przewlekłymi chorobami zapalnymi. Aktywacja monocytów indukuje funkcje efektorowe i jednoczesne przejście z metabolizmu oksydacyjnego do glikolitycznego, któremu towarzyszy zwiększona ekspresja transportera glukozy. Ten zwiększony metabolizm glikolityczny obserwuje się również w przypadku wytrenowanej odporności monocytów, która jest formą wrodzonej pamięci immunologicznej. Chociaż opisano protokoły in vitro badające ekspresję transportera glukozy i wychwyt glukozy przez monocyty, żaden z nich nie został zbadany za pomocą wieloparametrycznej cytometrii przepływowej we krwi pełnej. Opisano wieloparametryczny protokół cytometrii przepływowej do pomiaru wychwytu fluorescencyjnego analogu glukozy 2-NBDG we krwi pełnej przez monocyty ogółem oraz subpopulacje monocytów klasycznych (CD14 + + CD16-), pośrednich (CD14 + + CD16 +) i nieklasycznych (CD14 + CD16 ++). Metoda ta może być stosowana do badania ekspresji transportera glukozy i wychwytu glukozy dla całkowitych monocytów i subpopulacji monocytów podczas homeostazy i choroby zapalnej oraz może być łatwo modyfikowana w celu zbadania wychwytu glukozy dla innych leukocytów i subpopulacji leukocytów we krwi.

Kompensację należy przeprowadzić dla poszczególnych fluorochromów, aby zapobiec przesunięciu fluorescencji (spillover). Monocyty są najpierw wzbogacane poprzez bramkowanie w oparciu o rozproszenie przednie i boczne. Przedstawione wykresy są reprezentatywne dla co najmniej sześciu niezależnych eksperymentów przeprowadzonych na pełnej krwi od sześciu lub więcej uczestników, zgodnie z wcześniejszymi doniesieniami10. Rysunek 1A przedstawia wstępne bramkowanie monoc...

Monocyty są integralnymi składnikami ludzkiego wrodzonego układu odpornościowego, który polega na metabolizmie glikolitycznym po aktywacji. Opisujemy protokół cytometrii przepływowej do pomiaru ekspresji transportera glukozy i wychwytu glukozy przez całkowite monocyty i subpopulacje monocytów w świeżej krwi pełnej.

Prosta metoda cytometrii przepływowej do pomiaru wychwytu glukozy i ekspresji transportera glukozy dla subpopulacji monocytów we krwi pełnej

Monocytes are innate immune cells that can be activated by pathogens and inflammation associated with certain chronic inflammatory diseases. Activation of ...

Ogólnym celem tej metodologii jest pomiar poboru glukozy oraz aktywności jej transportera w różnych subpopulacjach monocytów. Metodę tę można wykorzystać do odpowiedzi na kluczowe pytania w dziedzinie immunologii, takie jak: jakie jest znaczenie metabolizmu komórek odpornościowych dla wyników choroby? Głównymi zaletami tych technik są: szybkość, łatwość wykonania, brak konieczności stosowania materiałów reaktywnych oraz potrzeba użycia jedynie niewielkiej objętości krwi.W ciągu godziny od pobrania próbek krwi do probówek z antykoagulantem cytrynianem ACD-B, należy umieścić próbki w komorze z laminarnym przepływem powietrza. Następnie do oddzielnych probówek polipropylenowych należy dodać 100 µL krwi z każdej próbki i poddać komórki działaniu 2 mL 1X roztworu lizującego w temperaturze 0°C, delikatnie mieszając za pomocą pipety. Po 15 minutach należy odwirować komórki, a następnie przeprowadzić dwie kolejne centrifugacje w buforze do płukania.Po drugim przemyciu, za pomocą pipety ostrożnie usuń jak największą ilość nadnadczynów, a następnie ponownie zawieś osady w 100 µL buforu do mycia na lodzie. Aby zidentyfikować specyficzne subpopulacje monocytów, zabarw komórki, stosując pięć µL

a-simple-flow-cytometric-method-to-measure-glucose-uptake-glucose

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologia i infekcje

Niniejszy protokół opisuje szybką technikę ilościowego oznaczania translokacji GLUT4 z cytoplazmy do błony plazmatycznej komórek za pomocą cytometrii przepływowej.

Ilościowy pomiar translokacji GLUT4 do błony komórkowej przy użyciu cytometrii przepływowej

Ten film demonstruje cytometrię przepływową do pomiaru wychwytu mikrogleju przez fluorescencyjne biocząstki po dostrzodowisku do ciała szklistego w oku myszy. Cytometria przepływowa wykrywa żywe komórki wykazujące ekspresję CD11b i odróżnia fagocytarne komórki mikrogleju wykazujące zieloną fluorescencję od innych komórek szpikowych, w tym monocytów eksprymujących Ly6C i neutrofili wykazujących ekspresję Ly6G.

Pomiar wychwytu mikrogleju przez cząstki fluorescencyjne dostarczane do ciała szklistkowego za pomocą cytometrii przepływowej

Ten film demonstruje technikę opartą na cytometrii przepływowej wykorzystującą dwa fluorochromy do identyfikacji limfocytów T CD4+ i CD8+, limfocytów T γδ, limfocytów B, komórek NK i monocytów w ludzkich komórkach jednojądrzastych krwi obwodowej (PBMC). Po inkubacji komórek z przeciwciałami sprzężonymi z fluorochromem przeciwko markerom powierzchniowym, podzbiory komórek są identyfikowane przy użyciu optymalnej strategii bramkowania cytometrycznego przepływu.

Test cytometrii przepływowej w celu identyfikacji podzbiorów komórek odpornościowych w komórkach jednojądrzastych krwi obwodowej

To badanie porównuje dwie różne metody izolacji ludzkich monocytów w celu uzyskania in vitro komórek dendrytycznych (DC). Monocyty są selekcjonowane przez przyleganie lub ujemnie wzbogacane przez separację magnetyczną. Wydajność i żywotność monocytów wraz z żywotnością, proliferacją MDDC i ekspresją markera powierzchniowego CD11c/CD14 zostaną porównane między obiema metodami.

Charakterystyka ludzkich komórek dendrytycznych pochodzących z monocytów za pomocą obrazowania cytometrii przepływowej: porównanie dwóch protokołów izolacji monocytów

Fagocytoza mikrogleju jest kluczowa dla utrzymania homeostazy tkanek, a nieodpowiednia funkcja fagocytarna została zamieszana w patologię. Jednak ocena funkcji mikrogleju in vivo jest technicznie trudna. Opracowaliśmy prostą, ale solidną technikę precyzyjnego monitorowania i ilościowego określania potencjału fagocytarnego mikrogleju w warunkach fizjologicznych.

Ocena funkcji fagocytarnej mikrogleju siatkówki in vivo przy użyciu testu opartego na cytometrii przepływowej

Ten protokół zapewnia analizę subpopulacji makrofagów w ośrodkowym układzie nerwowym dorosłej myszy za pomocą cytometrii przepływowej i jest pomocny w badaniu wielu markerów wyrażanych przez te komórki.

Analiza makrofagów pochodzących z mikrogleju i monocytów z ośrodkowego układu nerwowego za pomocą cytometrii przepływowej

Opisano test wiązania komórkowego oparty na cytometrii przepływowej, który jest używany głównie jako narzędzie przesiewowe do identyfikacji związków, które hamują wiązanie znakowanego fluorescencyjnie ligandu chemokiny CXC 12 (CXCL12) z receptorem chemokiny CXC 4 (CXCR4).

Test oparty na cytometrii przepływowej w celu identyfikacji związków, które zakłócają wiązanie znakowanego fluorescencyjnie ligandu chemokiny CXC 12 z receptorem chemokiny CXC 4

Tutaj prezentujemy protokół charakteryzowania podzbiorów monocytów za pomocą cytometrii przepływu krwi pełnej. Obejmuje to nakreślenie, w jaki sposób bramkować podzbiory i oceniać ich ekspresję markerów powierzchniowych oraz podanie przykładu oceny ekspresji markerów M1 (zapalnych) i M2 (przeciwzapalnych).

Charakterystyka podzbiorów ludzkich monocytów za pomocą analizy cytometrii przepływu krwi pełnej

Tutaj prezentujemy zintegrowany protokół, który mierzy transport subpopulacji monocytów w przepływie in vitro za pomocą specyficznych markerów powierzchniowych i konfokalnej mikroskopii fluorescencyjnej. Protokół ten może być wykorzystany do zbadania sekwencyjnych etapów rekrutacji, a także do profilowania innych podtypów leukocytów przy użyciu innych specyficznych markerów powierzchniowych.

Równoczesne badanie rekrutacji subpopulacji monocytów w warunkach przepływu in vitro

Tutaj prezentujemy dwa protokoły do ilościowego oznaczania pochłaniania mikrogleju przez synapsy vGLUT1-dodatnie oraz surowych synaptosomów pHRodo znakowanych na czerwono za pomocą cytometrii przepływowej.

Kwantyfikacja pochłaniania mikrogleju przez materiał synaptyczny za pomocą cytometrii przepływowej

Tutaj szczegółowo opisujemy metody ekstrakcji makrofagów ze szpiku kostnego, śledziony i serca po zawale serca, a następnie oceny przepływu metabolicznego w żywych komórkach.

Analiza przepływu metabolicznego ex vivo w makrofagach śledziony i serca oraz monocytach szpiku kostnego

Poznaj metodę cytometrii przepływowej do pomiaru wychwytu glukozy i ekspresji transportera glukozy w subpopulacjach monocytów we krwi pełnej. Ta technika umożliwia badanie metabolizmu komórek immunologicznych.

Prosta metoda cytometrii przepływowej do pomiaru wychwytu glukozy i ekspresji transportera glukozy dla subpopulacji monocytów we krwi pełnej (Wideo) | JoVE Journal

Prosta metoda cytometrii przepływowej do pomiaru wychwytu glukozy i ekspresji transportera glukozy dla subpopulacji monocytów we krwi pełnej

Przeglądaj więcej filmów