Prosta metoda cytometrii przepływowej do pomiaru wychwytu glukozy i ekspresji transportera glukozy dla subpopulacji monocytów we krwi pełnej

Ogólnym celem tej metodologii jest pomiar poboru glukozy oraz aktywności jej transportera w różnych subpopulacjach monocytów. Metodę tę można wykorzystać do odpowiedzi na kluczowe pytania w dziedzinie immunologii, takie jak: jakie jest znaczenie metabolizmu komórek odpornościowych dla wyników choroby? Głównymi zaletami tych technik są: szybkość, łatwość wykonania, brak konieczności stosowania materiałów reaktywnych oraz potrzeba użycia jedynie niewielkiej objętości krwi.

W ciągu godziny od pobrania próbek krwi do probówek z antykoagulantem cytrynianem ACD-B, należy umieścić próbki w komorze z laminarnym przepływem powietrza. Następnie do oddzielnych probówek polipropylenowych należy dodać 100 µL krwi z każdej próbki i poddać komórki działaniu 2 mL 1X roztworu lizującego w temperaturze 0°C, delikatnie mieszając za pomocą pipety. Po 15 minutach należy odwirować komórki, a następnie przeprowadzić dwie kolejne centrifugacje w buforze do płukania.

Po drugim przemyciu, za pomocą pipety ostrożnie usuń jak największą ilość nadnadczynów, a następnie ponownie zawieś osady w 100 µL buforu do mycia na lodzie. Aby zidentyfikować specyficzne subpopulacje monocytów, zabarw komórki, stosując pięć µL odpowiednich przeciwciał na 100 µL komórek, przez 30 minut na lodzie w ciemności. Po zakończeniu inkubacji przemyj próbki dwukrotnie roztworem do mycia i utrwal komórki za pomocą 200 µL 0,5% formaldehydu w PBS.

Następnie, w ciągu 24 godzin, przeanalizuj komórki na cytometrze przepływowym umożliwiającym detekcję czterech kolorów. Aby ocenić pobór glukozy przez subpopulacje monocytów, przenieś 90 µL krwi z każdej próbki do oddzielnych probówek polipropylenowych i dodaj do krwi 10 µL odpowiedniego fluorescencyjnego analogu glukozy. Delikatnie potrząśnij probówkami, aby wymieszać zawartość, a następnie osłoń próbki folią aluminiową.

Następnie inkubuj komórki w temperaturze 37 °C przez 15 do 30 minut, po czym natychmiast przenieś je na lód. Następnie dodaj do probówek 4 mL roztworu lizującego FACS i odwiruj komórki. Na koniec przeprowadź drugą wirowkę w buforze płuczącym.

Zlej supernatant i zabarw komórki odpowiednimi przeciwciałami przez 30 minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza w ciemności. Następnie przemyj próbki czterema mililitrami schłodzonego do temperatury lodowej buforu do płukania, resuspenduj osady w 200 do 300 mikrolitrach schłodzonego do temperatury lodowej PBS i przeanalizuj zawartość probówek w ciągu 10 minut. W przypadku analizy cytometrycznej najpierw wykorzystaj niebarwione i pojedynczo barwione próbki kontrolne w celu ustawienia kompensacji.

Następnie w odpowiednim oprogramowaniu do analizy pojedynczych komórek otwórz pierwszy próbkę na wykresie rozrzutu FSC vs SSC (forward scatter vs side scatter) i wyznacz bramkę dla monocytów zgodnie z ilustracją. Następnie dwukrotnie kliknij wyznaczoną populację monocytów i wyznacz bramkę dla populacji CD3-ujemnej. Teraz dwukrotnie kliknij populację CD3-ujemną i ustaw oś X tak, aby wyświetlała barwienie CD14, a oś Y tak, aby wyświetlała barwienie CD16.

Następnie, aby zmierzyć pobór glukozy lub jej transportera w konkretnej subpopulacji monocytów, należy wygenerować odpowiednie histogramy. Następnie, w przypadku występowania zdefiniowanych populacji komórek, należy użyć próbek kontrolnych FITC igG do ustawienia bramki i określenia całkowitego procentowego udziału monocytów CD14-dodatnich w każdej próbce. Tutaj przedstawiono początkową strategię bramkowania służącą do izolacji monocytów na podstawie rozrzutu komórek oraz wykluczeniu limfocytów T poprzez bramkowanie w obrębie populacji CD3-ujemnej.

Następnie monocyty są bramkowane pod kątem samej ekspresji CD14 lub w połączeniu z CD16 w celu zidentyfikowania całkowitej populacji monocytów lub ich subpopulacji. Można zaobserwować odrębne populacje monocytów CD14-dodatnich i Glut-1-dodatnich (transporter glukozy), szczególnie w krążących leukocytach pobranych od osób HIV-dodatnich. Komórki CD14-dodatnie i Glut-1-dodatnie mogą być również obserwowane w określonych podzbiorach monocytów u osób niezakażonych wirusem HIV, choć populacje te są bardziej wyraźne u pacjentów HIV-dodatnich.

Zgodnie z oczekiwaniami wynikającymi z danych dotyczących ekspresji transporterów glukozy, analog glukozy 2-NBDG jest również pobierany w większych ilościach przez komórki pochodzące od osób z HIV-dodatnim wynikiem testu. Po opanowaniu technika ta może zostać wykonana w ciągu półtorej godziny, jeśli zostanie przeprowadzona prawidłowo. Podczas realizacji tej procedury ważne jest ograniczenie ekspozycji na światło we wszystkich obszarach.

Po pobieraniu analogów glukozy komórki można barwić przeciwciałami powierzchniowymi w celu zidentyfikowania konkretnych populacji komórek odpornościowych, które są przedmiotem zainteresowania. Po opracowaniu metoda ta może być wykorzystywana do określenia, w jaki sposób HIV wpływa na metabolizm komórek odpornościowych, a także może być badana przez innych naukowców w różnych dziedzinach, takich jak immunologia, wirologia i badania nad nowotworami. Po obejrzeniu tego filmu powinni Państwo posiadać dobrą wiedzę na temat wykrywania transportera glukozy 1 oraz pobierania glukozy w komórkach odpornościowych.

Należy pamiętać, że podczas pracy z czynnikami zakaźnymi należy stosować standardowe procedury bezpieczeństwa.