Zautomatyzowane tworzenie dwuwarstwowej błony lipidowej za pomocą cienkiej warstwy polidimetylosiloksanu
10 lipca 2016
Demonstrujemy system tworzenia dwuwarstwowych lipidów, który można przechowywać, przenośny. Dwuwarstwowa błona lipidowa może powstać w ciągu 1 godziny z ponad 80% skutecznością, gdy zamrożony prekursor błony zostanie doprowadzony do temperatury otoczenia. System ten ograniczy pracochłonne procesy i wiedzę specjalistyczną związaną z kanałami jonowymi.
Ogólnym celem tej procedury jest opisanie metody, którą można wykorzystać do badania automatycznego tworzenia dwuwarstwowych lipidów przy użyciu cienkiej warstwy polidimetylosiloksanu. Metoda ta może pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytania w dziedzinie nanobiosensorów dotyczące interakcji błona-białko. Główną zaletą tej techniki jest to, że tworzenie dwuwarstwy lipidowej jest zautomatyzowane i powtarzalne.
Na początek przygotuj roztwór buforowy, łącząc chlorek potasu, trichlorowodorek i EDTA w wodzie destylowanej. Następnie dostosuj pH roztworu do 8,0. Następnie przefiltruj roztwór za pomocą filtra 0,2 mikrona i sterylizuj roztwór w autoklawie w temperaturze 121 stopni Celsjusza przez 15 minut.
Następnie przygotuj roztwór lipidów do wstępnego malowania, rozpuszczając 3% lipidu w mieszaninie składającej się z dwóch części undekanu i ośmiu części objętościowych heksadekanu. Mieszaj roztwór przez noc za pomocą rotatora. Przygotuj również roztwór lipidowy do tworzenia błony, rozpuszczając 0,1% lipidu w tej samej mieszaninie dwóch części undekanu i ośmiu części objętościowych heksadekanu.
Mieszaj ten roztwór przez noc również na rotatorze. Aby przygotować cienką warstwę PDMS, wymieszaj dziewięć części prepolimeru z jedną częścią utwardzacza w kubku do mieszania. Umieść pięć gramów tej mieszaniny na szalce Petriego i wiruj naczynie z prędkością 800 obr./min przez 10 sekund, aby utworzyć film o grubości od 200 do 250 mikronów.
Następnie umieść szalkę Petriego w eksykatorze próżniowym i przez dwie godziny podciśnij 100 militorów, aby usunąć resztki pęcherzyków powietrza. Następnie piecz cienką folię w piekarniku przez pięć godzin w temperaturze 70 stopni Celsjusza, aby spolimeryzować PDMS. Po schłodzeniu pokrój spolimeryzowaną cienką folię na kwadraty o wymiarach dwa centymetry na dwa centymetry i użyj stempla o średnicy 500 mikronów, aby zrobić mały otwór w środku kwadratu.
Następnie za pomocą mikropipety wstępnie pomaluj otwory jednym mikrolitrem 3% roztworu lipidów. Aby stworzyć czarną komorę z błoną lipidową, zaprojektuj dwa symetryczne bloki komory za pomocą oprogramowania do rysowania 3D. Następnie wyprodukuj komorę za pomocą bloku PTFE i maszyny CNC.
Aby zmontować komorę, umieść wstępnie pomalowaną cienką warstwę PDMS między dwoma blokami PTFE, tak aby otwór na cienkiej folii PDMS był wyśrodkowany z otworem w komorze. Użyj szkła nakrywkowego i smaru próżniowego, aby uszczelnić zewnętrzne krawędzie komory. Po uszczelnieniu unieruchamić zmontowaną komorę za pomocą nakrętek i.
Ważne jest, aby upewnić się, że komora jest dobrze uszczelniona, aby nie było wycieku cieczy. Za pomocą pipety nanieść 0,5 mikrolitra 0,1% roztworu lipidów na otwór cienkiej warstwy PDMS, połączonej z komorą. Następnie umieść komorę w chłodnym środowisku poniżej 10 stopni Celsjusza i przechowuj ją, aż będzie potrzebna.
Aby utworzyć czarną błonę lipidową z przyspieszonym samoorganizacją, wyjmij komorę z lodówki i dodaj dwa mililitry roztworu buforowego z każdej strony komory. Odstawić komorę na 10 minut, aż zamrożony prekursor błonowy rozmrozi się. Następnie umieść komorę na mikromanipulatorze, aby precyzyjnie kontrolować wysokość w stosunku do źródła światła i mikroskopu.
Za pomocą halogenowego oświetlacza światłowodowego oświetl jedną stronę komory, aby rozjaśnić aperturę cienkiej warstwy PDMS. Po drugiej stronie umieść obiektyw 20x w jednej linii z aperturą i obserwuj środek, w którym kolor staje się jaśniejszy niż pierścień. Do pomiaru elektrycznego przygotuj elektrody chlorku srebra, umieszczając srebrny drut o grubości 208 mikrometrów w roztworze podchlorynu sodu na co najmniej jedną minutę.
Następnie podłącz elektrody do wzmacniacza mikroelektrodowego. Następnie umieść elektrody chlorku srebra z każdej strony komory, tak aby znalazły się w roztworze buforowym. Korzystając z oprogramowania do elektrofizjologii, nałóż trójkątną falę o napięciu 10 miliwoltów w poprzek membrany, aby uzyskać falę prostokątną.
Zapisz właściwości elektryczne membrany, klikając przycisk nagrywania. Kontynuuj nagrywanie, aż zostanie zaobserwowana jednolita fala prostokątna. Następnie zakończ nagrywanie, klikając ikonę czarnego kwadratu.
Można zastosować dwie metody w celu włączenia gramicydyny A do dwuwarstwy lipidowej. Po pierwsze, gramicydynę A można dodać bezpośrednio do roztworu lipidowego przed rozprowadzeniem roztworu lipidowego na otworze cienkiej warstwy PDMS. Po drugie, roztwór gramicydyny A można dodać do komory, gdy utworzy się dwuwarstwa lipidowa.
Aby zaobserwować aktywność kanału gramicydyny A, należy przyłożyć 100 miliwoltów do membrany z częstotliwością próbkowania 5 kiloherców, aby zmierzyć potencjał zatrzymywania membrany. Zapisz właściwości elektryczne tak, jak poprzednio, klikając przycisk nagrywania. Gdy pokazane są aktywności kanałów jonowych, kontynuuj nagrywanie, aż zaobserwuje się różne skoki prądu, aby potwierdzić włączenie kanału jonowego.
Po potwierdzeniu zakończ nagrywanie, klikając ikonę czarnego kwadratu. Po zakończeniu nagrywania przefiltruj dane za pomocą dolnoprzepustowego filtra Bessela przy 100 Hz za pomocą oprogramowania do elektrofizjologii. Obserwuj bieżące skoki w przefiltrowanych danych o potencjale trzymania.
Skoki te reprezentują dimeryzację kanału jonowego gramicydyny A. Gdy zamrożony prekursor błonowy został wprowadzony do temperatury pokojowej w celu rozmrożenia, tworzenie dwuwarstwy lipidowej jest ułatwione dzięki ekstrakcji rozpuszczalnika hydrofobowego do cienkiej warstwy PDMS. Ta sekwencja obrazów pokazuje tworzenie się dwuwarstwy lipidowej, która samoczynnie składa się po ogrzaniu z zamrożonej formy.
W tym przypadku przewodność elektryczna ilustruje włączenie i dimeryzację gramicydyny A. Po dimeryzacji gramicydyna A tworzy kanał jonowy, a poziomy przewodności skaczą do 28 pikozymenów, co jest zgodne z wynikami poprzednich doniesień i wskazuje na natychmiastowe włączenie tego antybiotyku do dwuwarstwy. Nasza technika tworzenia błon zapewnia potężne narzędzie do badań błon komórkowych i nanokanałów, w przeciwieństwie do konwencjonalnych technik, które mają ograniczony potencjał praktycznego zastosowania. Nasz system nie wymaga specjalistycznej wiedzy ani w zakresie tworzenia błon, ani wprowadzania kanałów jonowych, dzięki czemu doskonale nadaje się do badań przesiewowych leków i zastosowań biosensorycznych.
Wyświetl pełny transkrypt i uzyskaj dostęp do tysięcy filmów naukowych
Przegląd
Niniejszy artykuł opisuje zautomatyzowaną metodę tworzenia lipidowych dwuwarstw z wykorzystaniem cienkiej warstwy polidimetylosiloksanu. Technika ta umożliwia powtarzalne formowanie błon w czasie jednej godziny, co znacząco upraszcza proces badania oddziaływań białek z błoną.
Kluczowe elementy badania
Dziedzina nauki
- Neuronauka
- Biofizyka
- Nanobiosensory
Wstęp
- B lipidowe są niezbędne do badania oddziaływań białko-błona.
- Tradycyjne metody tworzenia dwuwarstw mogą być czasochłonne i wymagać specjalistycznej wiedzy.
- Techniki zautomatyzowane mogą zwiększyć powtarzalność i wydajność.
- Niniejsze badanie przedstawia nowatorskie podejście z wykorzystaniem zamrożonego prekursora błony.
Cel badania
- Opracowanie systemu tworzenia lipidowych dwuwarstw, który nadaje się do przechowywania i transportu.
- Automatyzacja procesu tworzenia lipidowych dwuwarstw.
- Ułatwienie badań w dziedzinie nanobiosensorów.
Zastosowane metody
- Przygotowanie roztworu buforowego z chlorkiem potasu, hydrochlorkiem trisu i EDTA.
- Dostosowanie pH roztworu do wartości 8.0.
- Filtracja roztworu przy użyciu filtra 0.2 micron.
- Autoklawowanie roztworu w temperaturze 121 °C przez 15 minut.
Główne wyniki
- Blipidowe dwuwarstwy można formować z sukcesem przekraczającym 80%.
- Proces ten trwa mniej niż jedną godzinę.
- Metoda ta ogranicza zapotrzebowanie na czasochłonną pracę i specjalistyczną wiedzę.
- System ten nadaje się do różnych zastosowań badawczych.
Wnioski
- Zautomatyzowany system tworzenia lipidowych dwuwarstw jest skuteczny i wydajny.
- Technika ta może przyczynić się do rozwoju badań nad oddziaływaniami białek błonowych.
- Przyszłe zastosowania mogą obejmować badania w dziedzinie nanobiosensorów.
Najczęściej zadawane pytania
Znaczenie dla przemysłu
Automatyczne tworzenie lipidowych dwuwarstw z wykorzystaniem cienkich filmów PDMS rozwiązuje problem niskiej powtarzalności oraz wysokiej zależności od specjalistycznej wiedzy w badaniach nad oddziaływaniami białek błonowych. Umożliwiając przygotowanie stabilnych i transportowalnych prekursorów błon z sukcesem formowania przekraczającym 80% w czasie poniżej jednej godziny, metoda ta wspiera skalowalne procesy przesiewowe w obszarze nanobiosensorów oraz odkrywania leków modulujących kanały jonowe. Pozycjonuje to technologię jako predykcyjne narzędzie minimalizujące ryzyko wczesnej walidacji celów terapeutycznych w potokach badawczo-rozwojowych sektora biofarmaceutycznego.
Strategiczne zastosowania w badaniach i rozwoju biofarmaceutycznym
Wczesne etapy odkrywania i walidacja celu
- Wartość naukowa: Umożliwia funkcjonalną analizę celów terapeutycznych poprzez wbudowanie kanałów jonowych, takich jak gramicydyna A, w celu wyjaśnienia mechanizmu działania.
- Wartość operacyjna: Zmniejsza zmienność w tworzeniu błon, zwiększając wiarygodność danych dotyczących oddziaływania z celem w powtórzeniach doświadczalnych.
- Wartość prognostyczna: Wspiera podejmowanie decyzji o kontynuacji lub przerwaniu badań (go/no-go) poprzez dostarczanie powtarzalnych wyników elektrofizjologicznych, które korelują z aktywnością kanału.
Przesiewanie i opracowywanie testów
- Wartość naukowa: Generuje mierzalne wartości przewodnictwa (np. 28 picosiemens), które umożliwiają profilowanie zależności dawka-odpowiedź dla badanych związków.
- Wartość operacyjna: Standaryzuje grubość i skład membrany poprzez zastosowanie folii PDMS oraz protokołów roztworów lipidowych, co poprawia powtarzalność testu.
- Skalowalność: Prekursory membran mogą być przechowywane i transportowane, co pozwala na zdecentralizowany screening w wielu ośrodkach.
Badania translacyjne i przedkliniczne
- Ciągłość translacyjna: Łączy charakterystykę kanałów jonowych na etapie odkrywania z walidacją przedkliniczną z wykorzystaniem systemów istotnych dla danej jednostki chorobowej.
- Mechanistyczna redukcja ryzyka: Potwierdza zdolność związków do tworzenia porów (np. kanałów antybiotykowych) przed przejściem do złożonych modeli.
- Korelacja z biomarkerami: Umożliwia powiązanie sygnatur elektrofizjologicznych z wynikami funkcjonalnymi w badaniach przedklinicznych.
Integracja potoku i przepływu pracy
Metoda ta wpisuje się w kontinuum procesu odkrywania leków – od testowania hipotez dotyczących punktów uchwytu po identyfikację związków wiodących, zapewniając powtarzalną platformę do przesiewania kanałów jonowych przed optymalizacją w ramach chemii medycznej.
- Biologia odkrywcza: Wspiera testowanie hipotez poprzez umożliwienie kontrolowanej oceny oddziaływań białko-błona oraz tworzenia kanałów.
- Przesiewanie: Zapewnia gotowość do analizy dzięki stabilnym prekursorom błon, które można rozmrozić na żądanie, co gwarantuje powtarzalne wyniki.
- Analityka: Dostarcza danych o przewodnictwie elektrycznym i wzorcach skoków prądu, co pozwala na ilościowe porównanie warunków testowych.
- Badania translacyjne: Łączy się z pracami przedklinicznymi poprzez walidację efektów mechanistycznych zaobserwowanych w systemach redukcjonistycznych.
- Ponowne wykorzystanie w przedsiębiorstwie: Cienkie filmy PDMS i roztwory lipidów tworzą platformę wielokrotnego użytku, którą można dostosować do wielu celów i kampanii badawczych.
Wpływ operacyjny i przedsiębiorstwowy
- Wartość naukowa: Zwiększa pewność predykcyjną w walidacji celu poprzez redukcję wyników fałszywie ujemnych wynikających z niespójnego tworzenia błon.
- Wartość operacyjna: Poprawia powtarzalność i przepustowość dzięki automatyzacji oraz przechowywaniu prekursorów lipidowych.
- Wartość strategiczna: Poprawia efektywność kapitałową poprzez minimalizację nieudanych analiz i przyspieszenie potwierdzania trafień w kanałach jonowych.
- Wpływ na portfolio: Umożliwia priorytetyzację celów z uwzględnieniem ryzyka w oparciu o wiarygodne dane biofizyczne.
Wskazówki dotyczące wdrożenia
- Wymaga doświadczenia w obchodzeniu się z lipidami, w elektrofizjologii oraz w obróbce PDMS w warunkach pomieszczeń czystych.
- Zależność od dostępu do mikroinjektorów, desykatorów próżniowych, rotatorów oraz zestawów elektrofizjologicznych z wzmacniaczami niskoszumowymi.
- Konieczność standaryzacji składu roztworów lipidowych i protokołów utwardzania PDMS we wszystkich zespołach.
- Adaptacja do alternatywnych systemów modelowych może wymagać optymalizacji stosunków lipid:rozpuszczalnik oraz kinetyki rozmrażania.
- Ograniczenia praktyczne obejmują lotność rozpuszczalników oraz konieczność przechowywania w kontrolowanej temperaturze w celu zachowania integralności prekursorów.
Najczęściej zadawane pytania dotyczące biofarmacji
Chapters in this video
0:05
Title
0:32
Lipid Bilayer Solutions Preparation
1:38
Formation of a Polydimethylsiloxane (PDMS) Thin Film
2:45
Chamber Fabrication and Assembly
3:36
Membrane Formation and Verification
4:47
Electrical Recording of the Lipid Bilayer
5:42
Gramicidin A Ion Channel Incorporation
6:58
Results: Measuring the Incorporation of Gramicidin A into a Lipid Bilayer
7:46
Conclusion
