Name: Zautomatyzowane tworzenie dwuwarstwowej błony lipidowej za pomocą cienkiej warstwy polidimetylosiloksanu (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-07-10T13:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 23 s
Description: Poznaj zautomatyzowaną metodę tworzenia dwuwarstwowej błony lipidowej z wykorzystaniem cienkiej warstwy polidimetylosiloksanu. Technika ta umożliwia powtarzalne formowanie membran w ciągu godziny, znacząco upraszczając badanie interakcji białko-błonowych.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Ta praca była wspierana przez Program Centrum Badawczego Pionierów (NRF-2012-0009575) oraz granty Narodowej Fundacji Badawczej (NRF-2012R1A1B4002413, NRF-2014R1A1A2059341) z Narodowej Fundacji Badawczej Korei. Prace te były również częściowo wspierane przez Inha University Research Grant.

1. Przygotowanie roztworu
<ol>
	<li>Przygotowanie roztworu buforowego:
	<ol>
		<li>Aby sformułować roztwór buforowy, rozpuść 1 M KCl (chlorek potasu), 10 mM Tris-HCl (chlorowodorek tris) i 1 mM EDTA (kwas etylenodiaminotetraoctowy) w wodzie destylowanej i dostosuj pH do 8,0.</li>
		<li>Przefiltrować roztwór za pomocą filtra 0,20 μm. Aby wysterylizować, należy sterylizować roztwór w autoklawie w temperaturze 121 °C przez 15 minut.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Przygotowanie roztworu lipidowego do wstępnego malowania:
	<ol>
		<li>Aby przygotować roztwór lipidowy do wstępnego malowania, należy rozpuścić 3% lipid DPhPC (1,2-difitanoilo-sn-glicero-3-fosfatydylocholiny) (w:v) w mieszaninie 2:8 n-dekanu i heksadekanu (v:v). Mieszać przez noc za pomocą rotatora.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Przygotowanie roztworu lipidowego do tworzenia błony:
	<ol>
		<li>Aby sformułować roztwór lipidowy do tworzenia błony, rozpuść 0,1% lipid DPhPC (1,2-diphytanoyl-sn-glycero-3-fosfatydylocholina) (w:v) w mieszaninie skwalenu 2:8 i heksadekanu (v:v). Mieszaj przez noc za pomocą rotatora.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. Tworzenie cienkiej warstwy PDMS
<ol>
	<li>Wymieszaj PDMS i utwardzacz w proporcji 9:1 (w/w) w kubku do mieszania, aby utworzyć prepolimer PDMS. Dodać 5 g prepolimeru PDMS do szalki Petriego, aby utworzyć cienką warstwę PDMS (grubość 200 - 250 μm). Rozprowadzić prepolimer PDMS za pomocą powlekarki wirowej z prędkością 800 obr./min przez 10 sekund, aby utworzyć cienką warstwę.</li>
	<li>Umieścić szalkę Petriego w eksykatorze próżniowym pod ciśnieniem 100 mTorr na 2 godziny w celu usunięcia pęcherzyków powietrza. Aby spolimeryzować cienką warstwę prepolimeru, piecz w piekarniku przez 5 godzin w temperaturze 70 °C.</li>
	<li>Aby uzyskać kwadratową cienką folię PDMS, pokrój spolimeryzowaną cienką folię PDMS na kwadraty o wymiarach 2 x 2 cm2. Użyj mikrodziurkacza o średnicy 500 μm, aby zrobić otwór w środku cienkiej warstwy PDMS. Wstępnie pomaluj otwory 3% roztworem lipidowym DPhPC zmieszanym z n-dekanem i heksadekanem w proporcji 2:8.</li>
</ol>
3. Produkcja i montaż komór
<ol>
	<li>Aby wyprodukować komorę BLM, zaprojektuj dwa symetryczne bloki komory za pomocą oprogramowania do rysowania 3D o wymiarach zewnętrznych 4 cm x 1,5 cm x 1 cm i wymiarach studni wewnętrznej 1,5 cm x 1,3 cm x 0,8 cm17.</li>
	<li>Wykonaj komorę za pomocą bloku PTFE za pomocą maszyny CNC i postępuj zgodnie z instrukcjami producenta.</li>
</ol>
4. Zgromadzenie Izby
<ol>
	<li>Aby zmontować komorę, umieść wstępnie pomalowaną cienką warstwę PDMS między dwoma blokami PTFE tak, aby otwór na cienkiej folii PDMS był wyrównany z otworem w komorze.</li>
	<li>Uszczelnij zewnętrzne krawędzie komory za pomocą szkła nakrywkowego ze smarem (ułatwiającym obserwację optyczną). Unieruchomić zmontowaną komorę za pomocą nakrętek i. 
	UWAGA: Upewnij się, że komora jest dobrze uszczelniona, aby nie było wycieku płynu.</li>
</ol>
5. Tworzenie prekursora membranowego z przyspieszonym tworzeniem samoorganizacji (MPES)
<ol>
	<li>Za pomocą pipety nanieść 0,5 μl 0,1% lipidu DPhPC zmieszanego z n-dekan:heksadekanem w proporcji 2:8 na otwór cienkiej warstwy PDMS połączonej z komorą.</li>
	<li>Przed użyciem należy przechowywać komorę w zamrażarce lub lodówce w temperaturze poniżej 10 °C.</li>
</ol>
6. Tworzenie i weryfikacja membrany
<ol>
	<li>Aby utworzyć BLM z MPES, wyjmij komorę z lodówki i zawiesij 2 ml roztworu buforowego z każdej strony komory. Odstawić komorę na < 10 minut, aż zamrożony prekursor błonowy rozmrozi się.</li>
	<li>Umieść komorę na mikromanipulatorze, aby precyzyjnie kontrolować wysokość w stosunku do źródła światła i mikroskopu. Oświetl jedną stronę komory jako źródło światła za pomocą halogenowego oświetlacza światłowodowego, aby rozjaśnić aperturę cienkiej warstwy PDMS do optycznej obserwacji procesu powstawania BLM.</li>
	<li>Po drugiej stronie umieść mikroskop cyfrowy pionowo w stosunku do źródła światła, aby obserwować powstawanie BLM (powiększ 200X).</li>
	<li>Aby potwierdzić powstawanie BLM, obserwuj środek apertury, w którym kolor staje się jaśniejszy niż pierścień.</li>
</ol>
7. Zapis elektryczny
<ol>
	<li>Do pomiaru elektrycznego przygotuj elektrody Ag/Cl za pomocą srebrnego drutu o grubości 208 μm i wybielaj w podchlorynie sodu przez > 1 minutę. Umieść elektrody Ag/Cl z każdej strony komory na tyle głęboko, aby można je było zanurzyć w roztworze buforowym.</li>
	<li>Podłącz elektrody do mikroelektrody amplifier. Korzystając z oprogramowania do elektrofizjologii, zastosuj trójkątny kształt fali ±10 mV w poprzek membrany, aby uzyskać falę prostokątną. Ustaw napięcie zasilania, klikając strzałki wskazane na V_clamp (mV).</li>
	<li>Zapisz właściwości elektryczne membrany, klikając przycisk nagrywania (ikona czerwonej kropki). Kontynuuj nagrywanie, aż zostanie zaobserwowana jednolita fala prostokątna. Wyjdź z nagrywania, klikając ikonę czarnego kwadratu.</li>
</ol>
8. Włączenie kanału jonowego
UWAGA: Włączenie gramikadyny A (gA) następuje spontanicznie po utworzeniu BLM, ponieważ gA jest dodawana bezpośrednio do roztworu lipidowego.
<ol>
	<li>Aby zaobserwować aktywność kanału gA, należy przyłożyć 100 mV w poprzek membrany z częstotliwością próbkowania 5 kHz, aby zmierzyć potencjał utrzymywania membrany. Ustaw napięcie zasilania, klikając strzałki wskazane na V_clamp (mV).</li>
	<li>Zapisz właściwości elektryczne włączenia gA, klikając przycisk nagrywania (ikona czerwonej kropki). Kontynuuj nagrywanie, aż zostaną zaobserwowane bieżące skoki. Wyjdź z nagrywania, klikając ikonę czarnego kwadratu.</li>
	<li>Po zebraniu danych elektrycznych przefiltruj dane za pomocą dolnoprzepustowego filtra Bessela przy 100 Hz za pomocą oprogramowania do elektrofizjologii.</li>
	<li>Obserwuj skoki prądu w przefiltrowanych danych o potencjale utrzymywania (każdy skok prądu, ~0,15 nS, reprezentuje dimeryzację kanału jonowego gA), aby zweryfikować włączenie gA.</li>
</ol>

<ol><li>Hanke, W., Schulue, W. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aHanke%2C+W+%22Planar+lipid+bilayers%3A+methods+and+applications%22">Planar lipid bilayers: methods and applications</a>. , Academic Press. (2012).</li>
<li>Mirzabekov, T. A., Silberstein, A. Y., Kagan, B. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Use+of+planar+lipid+bilayer+membranes+for+rapid+screening+of+membrane+active+compounds%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Enzymol%22%5BJournal%5D)">Use of planar lipid bilayer membranes for rapid screening of membrane active compounds.</a> Methods Enzymol. 294, 661-674 (1999).</li>
<li>Bayley, H., Cremer, P. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stochastic+sensors+inspired+by+biology%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Stochastic sensors inspired by biology.</a> Nature. 413 (6852), 226-230 (2001).</li>
<li>Fang, Y., Lahiri, J., Picard, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((G+protein-coupled+receptor+microarrays+for+drug+discovery%5BTitle%5D)+AND+%22Drug.+Discov.+Today%22%5BJournal%5D)">G protein-coupled receptor microarrays for drug discovery.</a> Drug. Discov. Today. 8 (16), 755-761 (2003).</li>
<li>Majd, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Applications+of+biological+pores+in+nanomedicine%2C+sensing%2C+and+nanoelectronics%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Opin.+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Applications of biological pores in nanomedicine, sensing, and nanoelectronics.</a> Curr. Opin. Biotechnol. 21 (4), 439-476 (2010).</li>
<li>Kim, Y. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synthetic+Biomimetic+Membranes+and+Their+Sensor+Applications%5BTitle%5D)+AND+%22Sensors+%28Basel%29%22%5BJournal%5D)">Synthetic Biomimetic Membranes and Their Sensor Applications.</a> Sensors (Basel). 12 (7), 9530-9550 (2012).</li>
<li>Ryu, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Investigation+of+Ion+Channel+Activities+of+Gramicidin+A+in+the+Presence+of+Ionic+Liquids+Using+Model+Cell+Membranes%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Rep%22%5BJournal%5D)">Investigation of Ion Channel Activities of Gramicidin A in the Presence of Ionic Liquids Using Model Cell Membranes.</a> Sci Rep. 5, (2015).</li>
<li>Wood, C., Williams, C., Waldron, G. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Patch+clamping+by+numbers%5BTitle%5D)+AND+%22Drug.+Discov.+Today%22%5BJournal%5D)">Patch clamping by numbers.</a> Drug. Discov. Today. 9 (10), 434-441 (2004).</li>
<li>Mueller, P., Rudin, D. O., Tien, H. T., Wescott, W. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reconstitution+of+cell+membrane+structure+in+vitro+and+its+transformation+into+an+excitable+system%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Reconstitution of cell membrane structure in vitro and its transformation into an excitable system.</a> Nature. 194, 979-980 (1962).</li>
<li>Montal, M., Mueller, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Formation+of+bimolecular+membranes+from+lipid+monolayers+and+a+study+of+their+electrical+properties%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.+S.+A%22%5BJournal%5D)">Formation of bimolecular membranes from lipid monolayers and a study of their electrical properties.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 69, 3561-3566 (1972).</li>
<li>Baaken, G., Sondermann, M., Schlemmer, C., Ruhe, J., Behrends, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Planar+microelectrode-cavity+array+for+high-resolution+and+parallel+electrical+recording+of+membrane+ionic+currents%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+Chip%22%5BJournal%5D)">Planar microelectrode-cavity array for high-resolution and parallel electrical recording of membrane ionic currents.</a> Lab Chip. 8 (6), 938-944 (2008).</li>
<li>Costello, R., Peterson, I., Heptinstall, J., Byrne, N., Miller, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+robust+gel-bilayer+channel+biosensor%5BTitle%5D)+AND+%22Adv.+Mater.+Opt.+Electron%22%5BJournal%5D)">A robust gel-bilayer channel biosensor.</a> Adv. Mater. Opt. Electron. 8 (2), 47-52 (1998).</li>
<li>Ide, T., Yanagida, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+artificial+lipid+bilayer+formed+on+an+agarose-coated+glass+for+simultaneous+electrical+and+optical+measurement+of+single+ion+channels%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem.+Biophys.+Res.+Commun%22%5BJournal%5D)">An artificial lipid bilayer formed on an agarose-coated glass for simultaneous electrical and optical measurement of single ion channels.</a> Biochem. Biophys. Res. Commun. 265 (2), 595-599 (1999).</li>
<li>Jeon, T. J., Malmstadt, N., Schmidt, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hydrogel-encapsulated+lipid+membranes%5BTitle%5D)+AND+%22J+Am+Chem+Soc%22%5BJournal%5D)">Hydrogel-encapsulated lipid membranes.</a> J Am Chem Soc. 128 (1), 42-43 (2006).</li>
<li>Malmstadt, N., Jeon, T. J., Schmidt, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Long-Lived+Planar+Lipid+Bilayer+Membranes+Anchored+to+an+In+Situ+Polymerized+Hydrogel%5BTitle%5D)+AND+%22Adv.+Mater%22%5BJournal%5D)">Long-Lived Planar Lipid Bilayer Membranes Anchored to an In Situ Polymerized Hydrogel.</a> Adv. Mater. 20 (1), 84-89 (2008).</li>
<li>Jeon, T. J., Poulos, J. L., Schmidt, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Long-term+storable+and+shippable+lipid+bilayer+membrane+platform%5BTitle%5D)+AND+%22Lab.+Chip%22%5BJournal%5D)">Long-term storable and shippable lipid bilayer membrane platform.</a> Lab. Chip. 8 (10), 1742-1744 (2008).</li>
<li>Ryu, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Automated+Lipid+Membrane+Formation+Using+a+Polydimethylsiloxane+Film+for+Ion+Channel+Measurements%5BTitle%5D)+AND+%22Anal.+Chem%22%5BJournal%5D)">Automated Lipid Membrane Formation Using a Polydimethylsiloxane Film for Ion Channel Measurements.</a> Anal. Chem. 86 (18), 8910-8915 (2014).</li>
<li>Yaws, C. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aYaws%2C+C+%22Chemical+Properties+Handbooks%3A+Physical%2C+Thermodynamic%2C+Environmental%2C+Transport%2C+Safety%2C+and+Health+Related+Properties+for+Organic+and+Inorganic+Chemicals%22">Chemical Properties Handbooks: Physical, Thermodynamic, Environmental, Transport, Safety, and Health Related Properties for Organic and Inorganic Chemicals</a>. , MC GRAW HILL HANDBOOKS. (1999).</li>
<li>Windholz, M., Budavari, S., Stroumtsos, L. Y., Fertig, M. N. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aWindholz%2C+M+%22The+Merck+index.+An+encyclopedia+of+chemicals+and+drugs%22">The Merck index. An encyclopedia of chemicals and drugs</a>. , Merck & Co. (1976).</li>
<li>Miller, C. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aMiller%2C+C+%22Ion+Channel+Reconstitution%22">Ion Channel Reconstitution</a>. , Springer Science & Business Media. (1986).</li>
<li>Miller, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Open-state+substructure+of+single+chloride+channels+from+Torpedo+electroplax%5BTitle%5D)+AND+%22Philos.+Trans.+R.+Soc.+Lond.+B.+Biol.+Sci%22%5BJournal%5D)">Open-state substructure of single chloride channels from Torpedo electroplax.</a> Philos. Trans. R. Soc. Lond. B. Biol. Sci. 299 (1097), 401-411 (1982).</li>
<li>Benz, R., Frohlich, O., Lauger, P., Montal, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Electrical+capacity+of+black+lipid+films+and+of+lipid+bilayers+made+from+monolayers%5BTitle%5D)+AND+%22Biochim.+Biophys.+Acta%22%5BJournal%5D)">Electrical capacity of black lipid films and of lipid bilayers made from monolayers.</a> Biochim. Biophys. Acta. 394 (3), 323-334 (1975).</li>
<li>Priel, A., Gil, Z., Moy, V. T., Magleby, K. L., Silberberg, S. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ionic+requirements+for+membrane-glass+adhesion+and+giga+seal+formation+in+patch-clamp+recording%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys.+J%22%5BJournal%5D)">Ionic requirements for membrane-glass adhesion and giga seal formation in patch-clamp recording.</a> Biophys. J. 92 (11), 3893-3900 (2007).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Nasza technika tworzenia BLM stanowi potężne narzędzie do badań błon komórkowych i kanałów jonowych, w przeciwieństwie do konwencjonalnych technik, które mają ograniczony potencjał do zastosowań przemysłowych. Opracowaliśmy prekursor membranowy przy użyciu cienkiej warstwy PDMS i opracowaliśmy zamrożony prekursor membranowy z przyspieszoną samoorganizacją.
W przeciwieństwie do konwencjonalnych metod tworzenia błon z foliami hydrofobowymi, w których tworzenie błony następuje tylko poprzez inter...

Sztuczna dwuwarstwowa błona lipidowa, lub błona lipidowa (BLM), jest ważnym narzędziem do wyjaśnienia mechanizmów działania błon komórkowych i kanałów jonowych, a także do zrozumienia interakcji między kanałami jonowymi a jonami/cząsteczkami. 1-7 Chociaż metoda patch-clamp jest często uważana za złoty standard w badaniach błon komórkowych, jest pracochłonna i wymaga wysoko wykwalifikowanych operatorów do pomiarów kanałów jonowych. 8 Podczas gdy sztucznie odtworzone dwuwarstwowe błony lipidowe pojawiły się jako alternatywne narzędzia do badań kanałów jonowych,9,10 są one również związane z pracochłonnymi procesami i specyficzną wiedzą specjalistyczną. Ponadto membrany są podatne na zakłócenia mechaniczne. W związku z tym wprowadzone do tej pory technologie dwuwarstwowe lipidów mają ograniczone zastosowania praktyczne. 11
W celu zwiększenia wytrzymałości i trwałości dwuwarstwowych błon lipidowych, Costello i wsp.12, a Ide i Yanagida13 opracowały wolnostojącą dwuwarstwę lipidową wspartą hydrożelami. Pomimo zwiększonej trwałości (< 24 godzin), wytrzymałość dwuwarstwowa nie uległa poprawie. Jeon i wsp.W ramach projektu 14 opracowano hydrożelową membranę kapsułkowaną (HEM) z intymnym kontaktem hydrożelowo-lipidowym, co skutkuje wydłużeniem żywotności (do kilku dni). Aby jeszcze bardziej wydłużyć żywotność HEM, Malmstadt i Jeon i in. stworzyli membranę otoczoną hydrożelem z wiązaniem hydrożelowo-lipidowym poprzez koniugację kowalencyjną in-situ (cgHEM). 15 W obu systemach żywotność membrany znacznie się wydłużyła (> 10 dni). Jednak systemy tworzenia błon nie były wystarczająco wytrzymałe i nie mogły być przechowywane ani dostarczane tam, gdzie było to wymagane, aby uwolnić wiedzę specjalistyczną do wykorzystania dwuwarstw lipidowych.
Rozwój dwuwarstwowej platformy lipidowej koncentrował się przede wszystkim na zwiększeniu wytrzymałości i długowieczności BLM. Chociaż żywotność BLM została ostatnio znacznie zwiększona, ich zastosowania były ograniczone ze względu na brak możliwości transportu i przechowywania. Aby przezwyciężyć te problemy, Jeon i in. stworzyli system membranowy, który można przechowywać, i wprowadzili prekursor membranowy (MP). 16 Aby skonstruować MP, przygotowali mieszaninę n-dekanu i heksadekanu zawierającą 3% DPhPC (1,2-diphytanoyl-sn-glycero-3-fosfatydylocholiny) w celu kontrolowania temperatury zamarzania roztworu lipidowego w taki sposób, aby zamarzał on w temperaturze ~14 °C (poniżej temperatury pokojowej, powyżej typowej temperatury lodówki). W tym eksperymencie MP rozprowadzono na małym otworze na folii z politetrafluoroetylenu (PTFE), a następnie zamrożono w lodówce w temperaturze 4 °C. Kiedy MP został doprowadzony do temperatury pokojowej, MP rozmroził się i automatycznie utworzyła się dwuwarstwa lipidowa, eliminując wiedzę specjalistyczną zwykle związaną z tworzeniem błony. Jednak wskaźnik sukcesu BLM wykonanego z MP wynosił zaledwie ~27%, a czas tworzenia membrany był niespójny (od 30 minut do 24 godzin), co ograniczało jego praktyczne zastosowania.
W tym badaniu, zamiast konwencjonalnych hydrofobowych cienkich warstw (PTFE, polioksymetylen, polistyren) użyto cienkiej warstwy polidimetylosiloksanu (PDMS), aby (a) kontrolować czas produkcji i (b) zwiększyć wskaźnik sukcesu tworzenia BLM, jak wcześniej zgłaszali Ryu i inni.17 W tym przypadku tworzenie błony było ułatwione przez ekstrakcję rozpuszczalników ze względu na porowaty charakter PDMS, a czas potrzebny do utworzenia membrany był z powodzeniem kontrolowany w tym badaniu. W tym systemie, gdy roztwór lipidowy został wchłonięty przez cienką warstwę PDMS, osiągnięto stały czas tworzenia błony. Co więcej, żywotność membrany została wydłużona ze względu na powolną absorpcję rozpuszczalników do cienkiej warstwy PDMS, w wyniku dodania skwalenu do roztworu lipidowego. Przeprowadziliśmy pomiary optyczne i elektryczne, aby sprawdzić, czy membrany uformowane tą techniką nadają się do badań kanałów jonowych.

<table><tbody><tr><td>Chlorek potasu</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P9333</td><td>Do roztworu buforowego</td></tr><tr><td>Chlorowodorek trisu</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>1185-53-1</td><td>Do roztworu buforowego</td></tr><tr><td>Kwas etylenodiaminotetraoctowy</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>60-00-4</td><td>Do roztworu buforowego</td></tr><tr><td>n-dekan</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>44074-U</td><td>Do roztworu</td></tr> <tr><td>lipidowegoHexadecane</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>544-76-3</td><td>Do roztworu lipidów</td></tr><tr><td>Skwalen</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S3626</td><td>Do roztworu lipidów</td></tr><tr><td>Gramicidin A</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>11029-61-1</td><td>Białko błonowe</td></tr><tr><td>1,2-difitanoyl-sn-glicero-3-fosfocholina</td><td>Avanti Polar Lipids, Inc.</td><td>850356</td><td>Do tworzenia membrae</td></tr><tr><td>Sylgard 184a i 184b zestaw elastromerowy</td><td>Dow Corning Asia</td><td></td><td>Do produkcji cienkiej warstwy PDMS</td></tr><tr><td>0,2 i mu; m filtr</td><td>Satorius stedim</td><td>16534----------K</td><td>Do filtrowania roztworu buforowego</td></tr><tr><td>Rotator</td><td>FinePCR</td><td>AG</td><td>Do jednorodnego rozpuszczania lipidów</td></tr><tr><td>Autoklaw</td><td>Biofree</td><td>BF-60AC</td><td>Do sterylizacji roztworu buforowego</td></tr><tr><td>Powlekarka wirowa</td><td>Shinu Mst</td><td>SP-60P</td><td>Do rozprowadzania prepolimeru PDMS</td></tr><tr><td>Eksykator próżniowy</td><td>Welch</td><td>2042-22</td><td>Do usuwania pęcherzyków powietrza w prepolimerze PDMS</td></tr><tr><td>500 &mu; m&nbsp; dziurkacz</td><td>Harris Uni-Core</td><td>0.5</td><td>Aby utworzyć aperturę na cienkowarstwowej</td></tr><tr><td>maszynie CNC</td> PDMS <td>SME trading</td><td>SME 2518</td><td>Aby wyprodukować komorę do formowania membrany</td></tr><tr><td>Halogenowy oświetlacz światłowodowy</td><td>Motic</td><td>MLC-150C</td><td>Do oświetlania apertury cienkiej warstwy PDMS do obserwacji optycznej</td></tr><tr><td>Mikroskop cyfrowy</td><td>Cyfrowy niebieski</td><td>QX-5</td><td>Aby optycznie obserwować dwuwarstwową błonę lipidową Formacja</td></tr><tr><td>Elektroda</td> Systemy <td></td><td>A-M</td><td>Do elektrycznej obserwacji tworzenia się membrany</td></tr><tr><td>Wzmacniacz mikroelektrod (wzmacniacz Axopatch)</td><td>Axon Instruments</td><td>Wzmacniacz Axopatch 200B</td><td>Do pomiaru pojemności membrany (opisany w manuskrypcie jako wzmacniacz mikroelektrod)</td></tr></tbody></table>

zautomatyzowane tworzenie dwuwarstwowej błony lipidowej za pomocą cienkiej warstwy polidimetylosiloksanu

Automated Lipid Bilayer Membrane Formation Using a Polydimethylsiloxane Thin Film

Sztuczna dwuwarstwa lipidowa, czyli błona lipidowa (BLM), jest potężnym narzędziem do badania kanałów jonowych i interakcji białek, a także do zastosowań biosensorów. Jednak konwencjonalne techniki formowania BLM mają kilka wad i często wymagają specjalistycznej wiedzy i pracochłonnych procesów. W szczególności konwencjonalne BLM cierpią z powodu niskich wskaźników powodzenia formacji i niespójnego czasu tworzenia membrany. Tutaj demonstrujemy składowany i przenośny system tworzenia BLM z kontrolowanym czasem rozrzedzania i zwiększoną szybkością tworzenia BLM poprzez zastąpienie konwencjonalnie stosowanych folii (politetrafluoroetylen, polioksymetylen, polistyren) polidimetylosiloksanem (PDMS). W tym eksperymencie stosuje się polimer o porowatej strukturze, taki jak cienka warstwa PDMS. Ponadto, w przeciwieństwie do konwencjonalnie stosowanych rozpuszczalników o niskiej lepkości, zastosowanie skwalenu umożliwiło kontrolowany czas rozrzedzania poprzez powolną absorpcję rozpuszczalnika przez PDMS, co wydłużyło żywotność membrany. Ponadto, dzięki zastosowaniu mieszaniny skwalenu i heksadekanu, podwyższono temperaturę zamarzania roztworu lipidowego (~16 °C), ponadto wyprodukowano prekursory błonowe, które można przechowywać w nieskończoność i łatwo transportować. Te prekursory błonowe skróciły czas tworzenia BLM < 1 godzinę i osiągnęły szybkość tworzenia BLM na poziomie ~80%. Co więcej, eksperymenty z kanałami jonowymi z gramicydyną A wykazały wykonalność systemu membranowego.

Optymalizacja składu roztworu MPES 
Przetestowano różne składy lipidów i rozpuszczalników, aby skutecznie zrekonstytuować lipidowe błony dwuwarstwowe z MPES. System MP z mieszaniną n-dekanu i heksadekanu zawierającą 3% DPhPC14 wykazał niską skuteczność tworzenia błon (~27%). Ponadto, ponieważ film PDMS stale ekstrahował roztwór lipidowy, konieczna była optymalizacja składu rozpuszczalnika w celu utrzymania nienaruszonej lipidowej błony dwuwarstwowej...

Demonstrujemy system tworzenia dwuwarstwowych lipidów, który można przechowywać, przenośny. Dwuwarstwowa błona lipidowa może powstać w ciągu 1 godziny z ponad 80% skutecznością, gdy zamrożony prekursor błony zostanie doprowadzony do temperatury otoczenia. System ten ograniczy pracochłonne procesy i wiedzę specjalistyczną związaną z kanałami jonowymi.

Zautomatyzowane tworzenie dwuwarstwowej błony lipidowej za pomocą cienkiej warstwy polidimetylosiloksanu

An artificial lipid bilayer, or black lipid membrane (BLM), is a powerful tool for studying ion channels and protein interactions, as well as for ...

Ogólnym celem niniejszej procedury jest opisanie metody, która może być wykorzystana do badania zautomatyzowanego tworzenia lipidowej dwuwarstwy z wykorzystaniem cienkiej warstwy polidimetylosiloksanu. Metoda ta może pomóc w odpowiedzi na kluczowe pytania w dziedzinie nanobiosensorów dotyczące oddziaływań między błoną a białkami. Główną zaletą tej techniki jest to, że tworzenie lipidowej dwuwarstwy jest zautomatyzowane i powtarzalne.W pierwszej kolejności należy przygotować roztwór buforu, łącząc chlorek potasu, hydrochlororek trisu oraz EDTA w wodzie destylowanej. Następnie należy dostosować pH roztworu do wartości 8.0. Po tym roztwór należy przefiltrować przez filtr 0,2 µm, a następnie poddać autoklawowaniu w temperaturze 121 °C przez 15 minut.Następnie przygotuj roztwór lipidowy do wstępnego malowania, rozpuszczając 3% lipidu w mieszaninie składającej się z dwóch części undecanu i ośmiu części heksadekanu według objętości. Mieszaj roztwór przez noc za pomocą rotatora. Przygotuj również roztwór lipidowy do tworzenia błony, rozpuszczając 0,1% lipidu w tej samej mieszaninie dwóch części undecanu i ośmiu części heksadekanu według objętości.Tę substancję należy również mieszać przez noc na rotatorze. Aby przygotować cienką warstwę PDMS, wymieszaj w kubku do mieszania dziewięć części prepolimeru z jedną częścią utwardzacza. Umieść pięć gramów tej mieszaniny w szalce Petriego i poddaj procesowi spin coatingu przy 800 rpm przez 10 sekund, aby utworzyć warstwę o grubości od 200 do 250 mikronów.Następnie umieść szalkę Petriego w deskrykatore próżniowym i wytwórz próżnię o wartości 100 millitorr przez dwie godziny, aby usunąć pozostałe pęcherzyki powietrza. Następnie wypiecz cienką warstwę w piecu przez pięć godzin w temperaturze 70 °C, aby spolimeryzować PDMS. Po ochłodzeniu potnij spolimeryzowaną cienką warstwę na kwadraty o wymiarach 2 cm na 2 cm, a następnie użyj wycinaka o średnicy 500 µm, aby wykonać mały otwór w centrum kwadratu.Następnie za pomocą mikropipety nanieś jeden mikrolitr 3% roztworu lipidów na otwory. Aby stworzyć komorę do czarnej błony lipidowej, zaprojektuj dwa symetryczne bloki komory, korzystając z oprogramowania do rysowania 3D. Następnie wykonaj komorę z bloku PTFE przy użyciu maszyny CNC.Aby zmontować komorę, należy umieścić wcześniej pomalowaną cienką warstwę PDMS pomiędzy dwoma blokami PTFE w taki sposób, aby otwór w cienkiej warstwie PDMS znajdował się w centrum otworu w komorze. Do uszczelnienia zewnętrznych krawędzi komory należy użyć szkiełka podstawowego oraz smaru próżniowego. Po uszczelnieniu należy unieruchomić zmontowaną komorę za pomocą nakrętek i śrub.Należy upewnić się, że komora jest szczelna, aby zapobiec wyciekowi cieczy. Za pomocą pipety nanieś 0,5 µL 0,1% roztworu lipidów na otwór cienkiej błony PDMS zmontowanej z komorą. Następnie umieść komorę w schłodzonym środowisku poniżej 10 °C i przechowuj do momentu użycia.Aby utworzyć czarną błonę lipidową z przyspieszoną samoorganizacją, wyjmij komorę z lodówki i dodaj dwa mililitry roztworu buforu do każdej strony komory. Odstaw komorę na 10 minut, aż zamrożony prekursor błony się rozmrozi. Następnie umieść komorę w mikromanipulatorze, aby precyzyjnie kontrolować jej wysokość względem źródła światła i mikroskopu.Używając halogenowego iluminatora światłowodowego, oświetl jedną stronę komory, aby rozjaśnić aperturę cienkiej błony PDMS. Po drugiej stronie umieść obiektyw 20x w linii z aperturą i obserwuj środek, w którym kolor staje się jaśniejszy niż w obręczy. W celu wykonania pomiaru elektrycznego przygotuj elektrody z chlorku srebra, umieszczając srebrny drut o grubości 208 µm w roztworze podchlorynu sodu przez co najmniej jedną minutę.Następnie podłącz elektrody do wzmacniacza mikroelektrodowego. Potem umieść elektrody z chlorku srebra po każdej stronie komory, tak aby znajdowały się w roztworze buforowym. Używając oprogramowania do elektrofizjologii, przyłóż do błony falę trójkątną o amplitudzie 10 millivolt, aby uzyskać falę prostokątną.Zarejestruj właściwości elektryczne błony, klikając przycisk nagrywania. Kontynuuj rejestrację do momentu zaobserwowania jednorodnej fali kwadratowej. Następnie przerwij nagrywanie, klikając ikonę czarnego kwadratu.Do wbudowania gramicydyny A w dwuwarstwę lipidową można zastosować dwie metody. Po pierwsze, gramicydynę A można dodać bezpośrednio do roztworu lipidów przed naniesieniem go na otwór cienkiej błony PDMS. Po drugie, roztwór gramicydyny A można dodać do komory w momencie formowania się dwuwarstwy lipidowej.Aby zaobserwować aktywność kanałów gramicydyny A, należy przyłożyć 100 mV do błony przy częstotliwości próbkowania 5 kHz, aby zmierzyć potencjał spoczynkowy błony. Właściwości elektryczne należy rejestrować w sposób opisany wcześniej, klikając przycisk record. Po pojawieniu się aktywności kanałów jonowych należy kontynuować rejestrację do momentu zaobserwowania różnych skoków prądu, co potwierdzi wbudowanie kanałów jonowych.Po potwierdzeniu zakończ nagrywanie, klikając ikonę czarnego kwadratu. Po zakończeniu nagrywania przefiltruj dane za pomocą filtru Bessela dolnoprzepustowego o częstotliwości 100 hertz, korzystając z oprogramowania do elektrofizjologii. Obserwuj skoki prądu w przefiltrowanych danych potencjału utrzymującego.Skoki te reprezentują dimeryzację kanału jonowego gramicydyny A. Gdy zamrożony prekursor błony został doprowadzony do temperatury pokojowej w celu rozmrożenia, formowanie dwuwarstwy lipidowej zostało ułatwione dzięki ekstrakcji hydrofobowego rozpuszczalnika do cienkiej warstwy PDMS. Ta sekwencja obrazów pokazuje powstawanie dwuwarstwy lipidowej, która samoorganizuje się podczas ogrzewania z formy zamrożonej.W tym przypadku przewodnictwo elektryczne obrazuje wbudowywanie i dimeryzację gramicydyny A. Po dimeryzacji gramicydyna A tworzy kanał jonowy, a poziomy przewodnictwa gwałtownie wzrastają do 28 picosiemens, co jest zgodne z wynikami wcześniejszych doniesień i wskazuje na natychmiastowe wbudowanie tego antybiotyku w dwuwarstwę. Nasza technika formowania błon stanowi potężne narzędzie do badań nad błonami komórkowymi i nanokanałami, w przeciwieństwie do konwencjonalnych technik o ograniczonym potencjale praktycznego zastosowania. Nasz system nie wymaga specjalistycznej wiedzy ani w zakresie formowania błon, ani w procesie wbudowywania kanałów jonowych, co czyni go bardzo odpowiednim do zastosowań w przesiewaniu leków i biosensoryce.

automated-lipid-bilayer-membrane-formation-using-polydimethylsiloxane

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Bioinżynieria

Obsługiwane dwuwarstwy lipidowe i naturalne cząsteczki błony to wygodne systemy, które mogą przybliżać właściwości błon komórkowych i być włączane do różnych strategii analitycznych. W tym miejscu demonstrujemy metodę przygotowania mikromacierzy złożonych z podpartych dwuwarstwowych kulek SiO2 pokrytych dwuwarstwą lipidową, pęcherzyków fosfolipidowych lub naturalnych cząstek błonowych.

Tworzenie mikromacierzy biomembranowych metodą montażu opartą na ściągaczce

Mikroprzepływowe natryskiwanie dwuwarstwy lipidowej na granicy kropelek zapewnia niezawodny sposób generowania pęcherzyków z kontrolą nad asymetrią błony, włączeniem białek transbłonowych i enkapsulacją materiału. Technika ta może być stosowana do badania różnych systemów biologicznych, w których pożądane są biomolekuły podzielone na przedziały.

Wytwarzanie dwuwarstwowych pęcherzyków lipidowych za pomocą natryskiwania mikroprzepływowego

Przedstawiamy eksperymentalny protokół tworzenia dwuwarstwy lipidowej na stałych podłożach bez użycia pęcherzyków lipidowych. Demonstrujemy jednoetapową metodę tworzenia dwuwarstwy lipidowej na dwutlenku krzemu i złocie, a także na membranach nośnych z domeną wzbogaconą w cholesterol do różnych zastosowań biologicznych.

Wytwarzanie biomembrany metodą dwuwarstwy lipidowej wspomaganej rozpuszczalnikiem (SALB)

Mikroprzepływowe wytwarzanie podwójnych emulsji zazwyczaj obejmuje urządzenia o wzorzystej zwilżalności lub specjalnie wykonane elementy szklane. W tym miejscu opisujemy wytwarzanie i testowanie generatora podwójnej emulsji z polidimetylosiloksanu (PDMS), który nie wymaga obróbki powierzchni ani skomplikowanych procesów produkcyjnych i jest w stanie wytwarzać podwójne emulsje do 14 μm.

Podwójne wytwarzanie emulsji przy użyciu współosiowego urządzenia do ustawiania ostrości przepływu z polidimetylosiloksanu (PDMS)

Udostępniamy protokół do testów samoorganizacji MinD i MinE in vitro na podpartej dwuwarstwie lipidowej w otwartej komorze. Dodatkowo opisujemy, jak zamknąć test w mikrokompartmentach PDMS pokrytych lipidami, aby naśladować warunki in vivo poprzez uwięzienie reakcji.

In vitro Rekonstrukcja samoorganizujących się wzorców białkowych na podpartych dwuwarstwach lipidowych

Dwuwarstwowe membrany fosfolipidowe (DLBM) z solidnym wsparciem, wolne od białek, mogą być przekształcane w złożone i dynamiczne sieci nanorurek lipidowych i mogą służyć jako oddolne modele 2D retikulum endoplazmatycznego.

Spontaniczne powstawanie i rearanżacja sztucznych sieci nanorurek lipidowych jako model oddolny retikulum endoplazmatycznego

Przedstawiamy protokół wytwarzania hybrydowej błony lipidowej na granicy woda/powietrze poprzez domieszkowanie dwuwarstwy lipidowej cząsteczkami miedzi (II) 2,9,16,23-tetra-tert-butyl-29H,31H-ftalocyjaniny (CuPc). Powstała hybrydowa błona lipidowa ma strukturę warstwową lipid/CuPc/lipid. Protokół ten może być również stosowany do tworzenia innych funkcjonalnych nanomateriałów.

Samoorganizacja hybrydowych błon lipidowych domieszkowanych hydrofobowymi cząsteczkami organicznymi na granicy faz woda/powietrze

Ten protokół opisuje tworzenie się komórek naśladujących pęcherzyki jedno- i wielolipidowe, dwuwarstwy lipidowe wspierane i dwuwarstwy lipidowe zawieszone. Te modele in vitro można dostosować do różnych typów lipidów i można je wykorzystać do badania różnych interakcji molekuł i makrocząsteczek.

Montaż dwuwarstwowych modeli lipidowych naśladujących i zawieszonych w powietrzu do badania oddziaływań molekularnych

Tutaj przedstawiono protokół do wykonywania i analizy wiązania, mobilności i składania pojedynczych cząsteczek na sztucznych zatłoczonych błonach lipidowych za pomocą mikroskopii smTIRF (smTIRF) z wykorzystaniem pojedynczej cząsteczki całkowitego wewnętrznego odbicia.

Dyfuzja i montaż pojedynczych cząsteczek na błonach lipidowych stłoczonych w polimerach

Tutaj opracowano dwuwarstwowy system lipidowy oparty na nanobarach, aby zapewnić syntetyczną membranę o określonej krzywiźnie, która umożliwia charakteryzację białek z możliwością wykrywania krzywizny in vitro.

Dwuwarstwowy system lipidowy oparty na nanobarach do badania białek wykrywających krzywiznę błony in vitro

Obecny protokół opisuje montaż liposomów wspomagany oktanolem (OLA), technikę mikroprzepływową do generowania biokompatybilnych liposomów. OLA wytwarza monorozproszone liposomy o rozmiarach mikronów z wydajną enkapsulacją, co pozwala na natychmiastowe eksperymentowanie na chipie. Przewiduje się, że protokół ten będzie szczególnie przydatny w biologii syntetycznej i badaniach nad komórkami syntetycznymi.

Wbudowany zespół liposomów wspomagany oktanolem do bioinżynierii

Poznaj zautomatyzowaną metodę tworzenia dwuwarstwowej błony lipidowej z wykorzystaniem cienkiej warstwy polidimetylosiloksanu. Technika ta umożliwia powtarzalne formowanie membran w ciągu godziny, znacząco upraszczając badanie interakcji białko-błonowych.

Zautomatyzowane tworzenie dwuwarstwowej błony lipidowej za pomocą cienkiej warstwy polidimetylosiloksanu

Przeglądaj więcej filmów