Obrazowanie poklatkowe w wysokiej rozdzielczości i automatyczna analiza dynamiki mikrotubul w żywych ludzkich komórkach śródbłonka żyły pępowinowej
13 sierpnia 2016
Szczegółowo opisano protokoły hodowli ludzkich komórek śródbłonka żyły pępowinowej (HUVEC), przejściowej transfekcji znakowanych fluorescencyjnie markerów wzrostu mikrotubul, obrazowania żywych komórek i automatycznej analizy dynamiki wzrostu mikrotubul międzyfazowych.
Ogólnym celem tej procedury jest hodowla ludzkich komórek śródbłonka żyły pępowinowej oraz analiza dynamiki cytoszkieletu i migracji komórek za pomocą obrazowania poklatkowego żywych komórek. Metody opisane w tym filmie mogą pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytania z zakresu komórki, molekularne i mechanobiologii. Na przykład protokół ten może być wykorzystany do określenia, w jaki sposób kształt i ruchliwość komórek są modulowane przez zaangażowanie różnych ECM.
Demonstracja wizualna ma kluczowe znaczenie, ponieważ etapy przygotowania próbki są trudne do wykonania. Wymagają one precyzyjnego obchodzenia się z komórkami w odpowiednim czasie przez cały proces. Chociaż metoda ta może dostarczyć informacji na temat ruchliwości komórek śródbłonka podczas angiogenezy, może być również stosowana do badań mikroskopowych praktycznie każdego przylegającego systemu modelu komórkowego.
Za pomocą kleszczy podnieś szkiełko nakrywkowe ze słoika do przechowywania 100% etanolu i przepuść je przez płomień palnika Bunsena, aby je wysterylizować. Następnie umieść go na 35-milimetrowej szalce Petriego. Przygotować jedno szkiełko nakrywkowe dla każdej próbki.
Do 1,5 mililitrowej probówki wirówkowej dodaj 10 mikrolitrów jednego miligrama na mililitr roztworu podstawowego fibronektyny i 990 mikrolitrów PBS. Następnie odpipetować pipetą 250 mikrolitrów roztworu na każde szkiełko nakrywkowe. Rozprowadź roztwór równomiernie, aby pokryć powierzchnię.
Inkubować szkiełka nakrywkowe przez co najmniej trzy godziny w temperaturze 37 stopni Celsjusza. Przed użyciem spłucz każde szkiełko nakrywkowe trzykrotnie dwoma mililitrami PBS. Za pomocą hemocytometru określić liczbę hodowanych HUVEC i przenieść objętość zawierającą 100 000 komórek na szkiełko nakrywkowe w przypadku eksperymentów bez migracji lub 500 000 komórek na szkiełko nakrywkowe w przypadku eksperymentów migracyjnych do probówki mikrowirówkowej.
Obracaj komórki pod ciśnieniem 1 400 razy G przez cztery minuty, aby je ogarnąć. Po wirowaniu, dla każdego badanego stanu, należy ponownie zawiesić do miliona komórek w 100 mikrolitrach buforu do elektroporacji i połączyć je z jednym mikrogramem cDNA. Przenieś ogniwa do kuwety do elektroporacji.
Transfekcja mieszaniny komórek i DNA za pomocą programu przeznaczonego do elektroporacji HUVEC. Następnie uratuj transfekowane komórki, dodając 500 mikrolitrów kompletnego śródbłonka podłoża podstawnego. Następnie umieść odpowiednią objętość komórek na szkiełkach nakrywkowych pokrytych fibronektyną.
Inkubuj komórki w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez trzy do czterech godzin, aby dać czas na ekspresję konstruktów cDNA. Przygotowując się do obrazowania, weź dwa paski taśmy dwustronnej o wymiarach 2,5 cm na 0,65 centymetra i zabezpiecz je poziomo wzdłuż górnej i dolnej krawędzi czystego szkiełka. Należy pamiętać, że ważne jest, aby pozostawić niewielką ilość miejsca między taśmą a krawędzią prowadnicy w celu uszczelnienia komory.
Zamontuj szkiełko nakrywkowe stroną z komórką do dołu w taki sposób, aby dwie krawędzie szkiełka nakrywkowego spoczywały na taśmie. Użyj kleszczyków, aby delikatnie docisnąć, aby zabezpieczyć szkiełko nakrywkowe. Za pomocą mikropipety dodać 40 mikrolitrów podłoża do obrazowania między szkiełko nakrywkowe a szkiełko podstawowe.
Upewnij się, że przestrzeń między szkiełkiem nakrywkowym a szkiełkiem podstawowym jest całkowicie wypełniona nośnikiem do obrazowania. W razie potrzeby zetrzyj nadmiar podłoża chusteczką papierową. Uszczelnij wszystkie krawędzie prowadnicy ciepłym VALAP.
Sprawdź, czy nie ma wycieków, delikatnie naciskając szklane szkiełko nakrywkowe. Umieść zamontowane i uszczelnione szkiełko nakrywkowe na stoliku mikroskopowym podgrzanym do 37 stopni Celsjusza. Za pomocą mikroskopu konfokalnego z wirującym dyskiem uchwyć sekwencje obrazów poklatkowych, obrazy niebieskich białek fluorescencyjnych i obrazy DIC.
Przeanalizuj dynamikę mikrotubul i kolokalizację zgodnie z opisem w dokumencie towarzyszącym. Aby przeprowadzić test migracji komórek, po etapie elektroporacji, uratuj transfekowane komórki, dodając 80 mikrolitrów kompletnego śródbłonka podłoża podstawnego. Następnie odpipetować całą próbkę o objętości 80 mikrolitrów jako pojedynczą kroplę na środek wysuszonego szkiełka nakrywkowego pokrytego fibronektyną.
Nie rozprowadzaj kropli. Suszenie szkiełka nakrywkowego jest konieczne, aby zapobiec oddzielaniu się kropli o pojemności 80 mikrolitrów w kontakcie ze szkiełkiem nakrywkowym. Takie podejście pozwala na skoncentrowanie HUVEC na niewielkim obszarze szkiełka nakrywkowego, a tym samym sprzyja szybkiemu tworzeniu się zlewającej się monowarstwy komórek.
Inkubuj szkiełko nakrywkowe w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez trzy do czterech godzin, aby dać czas komórkom na przyleganie do zlewającej się monowarstwy. Następnie przepłucz szkiełka dwa razy w kompletnym śródbłonkowym podłożu podstawnym, aby usunąć wszelkie komórki, które nie są przyczepione. Aby utworzyć krawędź rany na monowarstwie HUVEC, użyj kleszczyków, aby delikatnie przytrzymać szkiełko nakrywkowe na miejscu i mocno przeciągnij żyletkę po środku monowarstwy komórek.
Pozwól komórkom zregenerować się w inkubatorze o temperaturze 37 stopni Celsjusza przez trzy godziny. Następnie zmontuj i zamontuj szkiełka nakrywkowe do obrazowania jak poprzednio. Uzyskuj obrazy z kontrastem fazowym w 10-minutowych odstępach przez 12 godzin za pomocą obiektywu fazowego z aperturą numeryczną 10X 0,45 i kondensorem z dużą odległością roboczą z aperturą numeryczną 0,52.
Użyj panelu ND Acquisition (Akwizycja ND) w oprogramowaniu do akwizycji obrazów. Na koniec należy określić ilościowo rozgałęzienia i migrację HUVEC zgodnie z opisem w dokumencie towarzyszącym. HUVEC transfekowano w celu ekspresji mApple znakowanego przez EB3, białka wiążącego koniec mikrotubul i wykonano obrazy poklatkowe w czasie.
Surowe obrazy EB3 są pokazane po lewej stronie. Niebieskie komety EB3 śledzone przez oprogramowanie plusTipTracker są pokazane po prawej stronie. Komety wykryte w każdej klatce zostały połączone na podstawie zmiany ich położenia z klatki na klatkę, aby wygenerować ścieżki EB3 i wizualną nakładkę toru EB3, jak pokazano tutaj.
Powolny, krótkotrwały wzrost mikrotubul jest pokazany na czerwono, powolny, długożyciowy wzrost mikrotubul jest pokazany na zielono, szybki, krótkotrwały wzrost mikrotubul jest pokazany na żółto, a szybki, długożyciowy wzrost mikrotubul jest pokazany na niebiesko. Aby przeanalizować rozgałęzienia komórek śródbłonka, wykonano DIC i fluorescencyjny obraz pojedynczego HUVEC w 60-krotnym powiększeniu. Na obrazie fluorescencyjnym wokół krawędzi komórki narysowano odręcznie.
Początki gałęzi zostały następnie zdefiniowane poprzez narysowanie linii prostej w poprzek gałęzi i przez największy kąt krzywizny po obu stronach gałęzi. Policzono gałęzie, które były dłuższe niż szerokie i miały co najmniej 10 mikronów długości, a długość mierzono od początku gałęzi do dystalnego końca gałęzi. Aby ocenić migrację krawędzi rany komórek śródbłonka, HUVEC hodowano w dużej gęstości i wykonano obrazowanie poklatkowe żywych komórek po zranieniu, jak opisano w tym filmie.
Jak pokazano tutaj, komórki śródbłonka na krawędzi rany migrowały kierunkowo w obszar rany. Ruch ten analizowano przy użyciu jąderka jako markera powierniczego do śledzenia prędkości migracji, trwałości i odległości. Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak hodować, transfekować i przygotowywać HUVEC do eksperymentów obrazowania kształtu komórki i dynamiki cytoszkieletu lub do badań migracji komórek na brzegu rany.
Po tej procedurze można przeprowadzić inne metody, takie jak koniugacja poliakrylamidu lub kolagenu, aby odpowiedzieć na dodatkowe pytania związane z zaangażowaniem komórek zmodyfikowanych ECM. Dziękujemy za oglądanie i życzymy powodzenia w eksperymentach.
Przegląd
W niniejszym artykule szczegółowo opisano protokoły hodowli ludzkich komórek śródbłonka żyły pępkowej (HUVECs) oraz analizy dynamiki mikrotubul z wykorzystaniem obrazowania żywych komórek. Przedstawione metody pozwalają na uzyskanie informacji na temat motywności komórkowej oraz zachowania cytoszkieletu w różnych kontekstach doświadczalnych.
Kluczowe komponenty badania
Dziedzina nauki
- Biologia komórki
- Biologia molekularna
- Mechanobiologia
Wstęp
- Ludzkie komórki śródbłonka żyły pępkowej są kluczowe dla badania angiogenezy.
- Zrozumienie dynamiki cytoszkieletu jest niezbędne do uzyskania wiedzy na temat migracji komórek.
- Techniki obrazowania żywych komórek umożliwiają obserwację procesów komórkowych w czasie rzeczywistym.
- Precyzyjne obchodzenie się z komórkami jest konieczne dla uzyskania pomyślnych wyników eksperymentów.
Cel badania
- W celu przeanalizowania, w jaki sposób kształt i ruchliwość komórek są pod wpływem oddziaływania z macierzą zewnątrzkomórkową.
- W celu zapewnienia wizualnej demonstracji złożonych technik przygotowania próbek.
- W celu ułatwienia zrozumienia zachowania komórek śródbłonka podczas angiogenezy.
Zastosowane metody
- Hodowla komórek HUVEC na szkiełkach podstawkowych pokrytych fibronektyną.
- Transfekcja przejściowa komórek markerami fluorescencyjnymi do obrazowania.
- Obrazowanie poklatkowe żywych komórek przy użyciu konfokalnego mikroskopu z dyskiem obrotowym.
- Zautomatyzowana analiza dynamiki wzrostu mikrotubul oraz migracji komórek.
Główne wyniki
- Obrazowanie poklatkowe ujawniło szczegółową dynamikę mikrotubul w komórkach HUVEC.
- Transfekowane komórki wykazywały wyraźne wzorce wzrostu mikrotubul.
- Testy migracji komórek wykazały wpływ ECM na zachowanie komórek.
- Analiza ilościowa dostarczyła informacji na temat rozgałęziania się komórek śródbłonka.
Wnioski
- Opracowane protokoły mają zastosowanie do różnych modeli komórek adherentnych.
- Techniki obrazowania na żywo są wartościowe w badaniu dynamiki cytoszkieletu.
- Zrozumienie zachowania komórek HUVEC może pomóc w opracowaniu strategii terapeutycznych w angiogenezie.
Najczęściej zadawane pytania
Znaczenie dla przemysłu
Wysokorozdzielcze obrazowanie time-lapse oraz zautomatyzowana analiza dynamiki mikrotubul w komórkach HUVEC umożliwiają precyzyjną kwantyfikację zachowania cytoszkieletu, które leży u podstaw rozgałęziania i migracji komórek śródbłonka. Możliwość ta jest kluczowa dla minimalizacji ryzyka przy badaniu celów angiogenezy we wczesnej fazie oraz wspiera pewność prognostyczną w programach biologii naczyniowej. Podejście to wzmacnia ciągłość translacyjną od etapu odkryć po rozwój modeli przedklinicznych w badaniach nad angiogenezą i mikrośrodowiskiem guza.
Strategiczne zastosowania w badaniach i rozwoju biofarmaceutycznym
Wczesne odkrywanie i walidacja celu
- Umożliwia bezpośrednią wizualizację i kwantyfikację dynamiki mikrotubul w żywych komórkach śródbłonka.
- Wspiera mechanistyczną ocenę ryzyka w odniesieniu do celów cytoszkieletowych zaangażowanych w angiogenezę.
- Ułatwia funkcjonalną walidację genów kandydackich lub szlaków wpływających na rozgałęzianie i migrację komórek.
- Zapewnia ilościowe punkty końcowe dla analizy celów i selekcji portfolio.
Przesiewy i opracowywanie testów
- Ustanawia zwalidowane testy obrazowania żywych komórek w celu badania dynamiki cytoszkieletu i motylości komórkowej.
- Umożliwia uzyskanie powtarzalnych, ilościowych pomiarów prędkości wzrostu i czasu życia mikrotubul.
- Umożliwia zautomatyzowane śledzenie i analizę fluorescencyjnie znakowanych końców plus mikrotubul.
- Przygotowuje stabilne platformy testowe do przesiewania związków ukierunkowanych na funkcje komórek śródbłonka.
Badania translacyjne i przedkliniczne
- Ujednolica zachowanie komórek endotelialnych in vitro z modelami angiogenezy istotnymi dla przebiegu choroby.
- Zapewnia ciągłość od poziomu mechanizmów komórkowych do przedklinicznej walidacji strategii antyangiogennych.
- Dostarcza istotnych translacyjnie wskaźników do oceny potencjalnych interwencji w przebudowie naczyniowej.
- Zmniejsza niepewność biologiczną przy opracowywaniu czynników modulujących angiogenezę.
Integracja potoku i przepływu pracy
Niniejsza metodologia integruje etapy od wczesnego odkrywania, poprzez identyfikację związków wiodących, aż po walidację przedkliniczną w procesach badawczych z zakresu biologii naczyniowej i onkologii.
- Biologia odkrywcza: Ilościowe obrazowanie i analiza wyjaśniają mechaniczną rolę dynamiki mikrotubul w rozgałęzianiu i migracji komórek śródbłonka.
- Przesiewanie: Zautomatyzowane, powtarzalne testy umożliwiają wysokoprzepustową ocenę zaburzeń genetycznych lub farmakologicznych.
- Analityka: Zapewnia rzetelne wyniki statystyczne dotyczące tempa wzrostu, czasu życia mikrotubul oraz parametrów migracji komórek.
- Badania translacyjne: Łączy dynamikę cytoszkieletu in vitro z istotnymi dla chorób procesami angiogenezy.
- Zastosowanie w przedsiębiorstwie: Przepływ pracy można dostosować do innych modeli komórek adherentnych i innych celów cytoszkieletowych.
Wpływ operacyjny i przedsiębiorczy
- Wartość naukowa: Zwiększa pewność predykcyjną w walidacji celów cytoszkieletowych oraz w mechanicznym zrozumieniu angiogenezy.
- Wartość operacyjna: Standaryzuje obrazowanie żywych komórek i zautomatyzowaną analizę w celu generowania powtarzalnych i skalowalnych danych.
- Wartość strategiczna: Wspiera decyzje o kontynuacji lub przerwaniu badań (go/no-go) poprzez dostarczenie ilościowych punktów końcowych opartych na mechanizmach.
- Wpływ na portfolio: Umożliwia priorytetyzację programów dotyczących angiogenezy i migracji komórek z uwzględnieniem analizy ryzyka.
Wskazówki dotyczące wdrożenia
- Wymaga doświadczenia w obrazowaniu żywych komórek, transfekcji oraz ilościowej analizie obrazu.
- Wymaga dostępu do wysokorozdzielczego konfokalnego mikroskopu dyskowego (spinning disk) oraz narzędzi do analizy komputerowej.
- Wymaga rygorystycznej standaryzacji protokołów obrazowania i analizy pomiędzy zespołami.
- Możliwość adaptacji do różnych typów komórek adherentnych i markerów cytoszkieletu po optymalizacji protokołu.
- Przygotowanie próbek i warunki obrazowania muszą być ściśle kontrolowane w celu zapewnienia powtarzalności.
Najczęściej zadawane pytania dotyczące biofarmacji
Chapters in this video
0:05
Title
1:03
Coverslip Preparation Prior to Human Umbilical Vein Endothelial Cell (HUVEC) Culture
2:06
cDNA Transfection and HUVEC Culture on Coverslip
3:36
Preparation of Specimen for Imaging
5:14
Cell Migration Assay
7:24
Representative Imaging Results
9:41
Conclusion
![Opracowanie i charakterystyka sieci mikronaczyń in vitro oraz pomiary ilościowe produkcji śródbłonka [Ca2+]i i tlenku azotu](/_next/image?url=https%3A%2F%2Fcloudfront.jove.com%2FCDNSource%2Fteasers%2F54014.jpg%3Fv%3D2026-08-11T08%253A27%253A18.166Z&w=384&q=75)
