Name: Obrazowanie poklatkowe w wysokiej rozdzielczości i automatyczna analiza dynamiki mikrotubul w żywych ludzkich komórkach śródbłonka żyły pępowinowej (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-08-13T13:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 25 s
Description: Poznaj metodę obrazowania poklatkowego w żywych komórkach śródbłonka żyły pępowinowej HUVEC do analizy dynamiki mikrotubul i migracji komórkowej. Technika ta umożliwia badanie zachowań cytoszkieletowych w czasie rzeczywistym.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Specjalne podziękowania dla dr Clare M. Waterman za mentoring i dyskusje, Michelle Baird i Mike'a Davidsona za dostarczenie wielu fluorescencyjnych konstruktów cDNA używanych w tych badaniach, oraz Kathryn Applegate i Gaudenz Danuser za opracowanie oprogramowania do analizy plusTipTracker MT. Prace te były częściowo wspierane przez grant dla K.A.M z National Heart Lung and Blood Institute (NHLBI) oraz National Institutes of Health (NIH). (Dotacja: 4K22HL113069).

Autorzy oświadczają, że nie mają konkurencyjnych interesów finansowych.

Wykorzystanie HUVEC w eksperymentach morfologicznych i migracyjnych. Obrazowanie żywych komórek dynamiki wzrostu MT znakowanej EB3 w HUVEC wymaga odpowiednich i powtarzalnych warunków hodowli komórek w celu pomiaru i oceny zmian we wzroście MT i morfologii HUVEC, tak aby można je było następnie przypisać do sygnału sygnalizacyjnego ECM. HUVEC stanowią doskonały model do badania kształtu i ruchliwości komórek. Są wysoce podatne na transfekcję za pomocą znakowanych fluorescencyjnie cDNA, wykazują dramatyczną morfologię w odpowiedzi zarówno na rozpuszczalne, jak i fizyczne sygnały sygnalizacyjne i zachowują zdolność do organizowania się w rurki naczyniowe, gdy zapewnione są odpowiednie warunki hodowli komórkowej65-70. Pierwotne hodowle komórkowe, takie jak HUVEC, wymagają ostrożnego obchodzenia się i monitorowania liczby pasaży komórkowych w celu zapewnienia, że komórki są zdrowe i że będą zachowywać się normalnie podczas eksperymentów. Na przykład, podczas przeprowadzania eksperymentów badających cytoszkielet i/lub morfologię komórki, HUVEC nie powinny być używane do eksperymentów poza dziesiątym pasażem hodowli komórkowej, ponieważ HUVEC zazwyczaj zaczynają wykazywać niejednorodne morfologie około pasażu od dwunastego do piętnastego.
Gęstość komórek jest również krytycznym regulatorem zdrowia i proliferacji HUVEC. Badania rozgałęzień HUVEC (patrz Protokół 10.1-10.4 powyżej) wykorzystują hodowle o stosunkowo niskiej gęstości komórek, aby zapewnić komórkom fizyczną przestrzeń do interakcji z ich ECM i rozszerzenia rozgałęzionych wypukłości. W przeciwieństwie do tego, w badaniach migracji ran na krawędzi (patrz Protokół 10.5-10.8), HUVEC są hodowane w monowarstwie przed zranieniem. W związku z tym HUVEC na krawędzi rany wykazują stosunkowo nierozgałęzioną morfologię, wydłużają wypukłości krawędzi natarcia i wykazują interakcje komórka-komórka ze swoimi bezpośrednimi sąsiadami podczas migracji do rany.
Zastrzeżenia i zalety śledzenia dynamiki MT w żywych HUVEC. Mikroskopia wirującego dysku jest doskonałym podejściem do testowania hipotez eksperymentalnych, które wymagają konfokalnej klarowności obrazu z wysoką rozdzielczością czasową. Dzięki odpowiedniej kamerze i modułowi laserowemu, to podejście mikroskopowe jest czułe na fluorescencję o niskiej emisji i może pomóc w zmniejszeniu fotowybielania w porównaniu z innymi rodzajami mikroskopii fluorescencyjnej. Co ważne, podejście to doskonale nadaje się również do obrazowania w umiarkowanej i wysokiej rozdzielczości czasowej, ponieważ jest wymagane do generowania kompleksowych pomiarów dynamiki wzrostu MT przy użyciu metody znakowania EB3 w wielu różnych typach komórek.
Chociaż metodologia EB3 oznaczania rosnących końcówek MT ma wyraźne zalety w porównaniu z innymi metodami fluorescencyjnego znakowania MT, ma również unikalne wady. Na przykład istnieje pewna część macierzy MT, która nie rośnie aktywnie w danym momencie, w tym zarówno populacja demontujących MT, jak i populacja stabilnych, niedynamicznych MT71-74. EB3 nie oznaczałby tych dwóch populacji MT, a zatem wkład tych dwóch populacji nie zostałby uwzględniony w analizie danych eksperymentalnych. Alternatywne metodologie oceny całej macierzy MT koncentrowały się na ekspresji tubuliny znakowanej fluorescencyjnie, która włącza się do wszystkich populacji MT i pozwala na identyfikację rosnących, kurczących się i stabilnych MT. Jednak ze względu na stosunkowo dużą gęstość matrycy MT w pobliżu środka komórki i w sąsiedztwie centrum organizowania mikrotubul (MTOC), znakowanie całej macierzy MT stwarza niedogodność w przeprowadzaniu analizy obrazu końców MT, które nie znajdują się w pobliżu obrzeży komórki75-77. Eksperymenty wykorzystujące dwukolorowe znakowanie MT z fluorescencyjną tubuliną i fluorescencyjnym EB3 w żywych komórkach ujawniły jakościowo, że zdecydowana większość MT znakowanych tubuliną jest również znakowana EB378. Ponadto nie istnieje skuteczna metoda automatycznego śledzenia MT znakowanych tubuliną fluorescencyjną. Oznacza to, że gromadzenie danych i pomiary dynamiki MT w komórkach wykazujących ekspresję tubuliny fluorescencyjnej wymagają ręcznego śledzenia poszczególnych MT, co jest procesem podatnym na błędy i żmudnym. W rezultacie, zautomatyzowana analiza obliczeniowa MT znakowanych EB3 stała się preferowaną metodologią pomiaru dynamiki MT, ponieważ może być stosowana w eksperymentach z dynamiką MT na wielu typach komórek i w różnych reżimach eksperymentalnych35,79.
Powiązanie dynamiki wzrostu MT z morfologią i migracją HUVEC. Z punktu widzenia badacza cytoszkieletu, niezwykle przydatną adaptacją automatycznej analizy śledzenia plusTipTracker jest możliwość pomiaru i oceny zarówno całych komórek, jak i regionalnych zmian w dynamice wzrostu MT. Wymóg, aby komórka stała się spolaryzowana, jest niezbędnym warunkiem wstępnym kierunkowej migracji komórki. W związku z tym spolaryzowane sygnały sygnalizacyjne od dawna są znane jako kluczowe czynniki napędzające kierunkową migrację komórek30,31,51,54,56,80,81. Na przykład rozpuszczalne cząsteczki sygnałowe, takie jak VEGF, indukują polimeryzację aktyny i wzrost MT w kierunku sygnału VEGF w typach komórek śródbłonka2,82-87. Dodatkowo, w odpowiedzi na fizyczne interakcje z ECM (na przykład mechanosensing zgodności i wymiarowości), HUVEC modulują swoją dynamikę MT poprzez lokalną regulację MAP w celu promowania wzrostu MT w wydłużonych rozgałęzionych wypukłościach, a to służy do kierowania migracją HUVEC w kierunku wskazówki5,31,88. Tak więc polaryzacja w odpowiedzi na sygnały sygnalizacji zewnątrzkomórkowej podkreśla potrzebę eksperymentalnej oceny zlokalizowanych zmian w dynamice cytoszkieletu.
Jednoczesne obrazowanie dynamiki wzrostu MT na żywych komórkach (przy użyciu podejścia EB3) i migracji komórek HUVEC jest niezwykle trudne do przeprowadzenia, ponieważ MT rosną w skali sekund, podczas gdy zmiany w morfologii komórek i migracji kierunkowej zachodzą w skali godzin. Oba procesy są jednak ze sobą ściśle powiązane. Co więcej, ciągłe, szybkie obrazowanie znakowanego fluorescencyjnie EB3 w drugiej skali czasowej prowadzi do fotowybielania sygnału EB3. Próby przezwyciężenia tego problemu poprzez przeprowadzanie krótkich serii obrazowania EB3 (1-2 minutowa seria akwizycji) co 30 minut zakończyły się sukcesem, ale można było to osiągnąć tylko w niewielkiej liczbie EC, które miały optymalną ekspresję EB3 i które nie wykazywały niekorzystnych skutków dla powtarzającego się oświetlenia laserowego5.
Alternatywnym podejściem, które pozwala na interpretację, w jaki sposób dynamika wzrostu MT przyczynia się do zmian w morfologii i migracji komórek, jest narzędzie plusTipTracker Region of Interest (ROI)35 (patrz Protokół 6.6). Metodologia ta pozwala na podział ścieżek wzrostu MT całych komórek na regiony zdefiniowane przez użytkownika, z których można następnie wyodrębnić i przeanalizować ścieżki wzrostu MT. Na przykład porównania "rozgałęzionych" i "nierozgałęzionych" regionów komórki ujawniły, że MT rosną wolniej i trwalej w rozgałęzionych regionach w porównaniu z nierozgałęzionymi obwodami komórek5. W spolaryzowanych HUVEC z krawędzią nawiniętą porównanie dynamiki wzrostu MT krawędzi natarcia i krawędzi spływu wykazało, że demontaż MT wywołany przez MCAK jest hamowany specyficznie w obrębie krawędzi natarcia, ale nie krawędzi spływu. Regionalna ocena dynamiki wzrostu MT krawędzi natarcia i spływu w HUVEC eksprymujących mutanty Rac1 i / lub fosforylacji MCAK ujawniła ponadto, że indukowana przez Rac1 aktywacja kinazy Aurora-A specyficznie i lokalnie hamuje aktywność MCAK w obrębie krawędzi natarcia, aby napędzać polaryzację HUVEC i migrację kierunkową31. W związku z tym połączenie automatycznego śledzenia dynamiki wzrostu MT i regionalnej oceny dynamiki wzrostu MT w obrębie rozgałęzionych występów i/lub krawędzi czołowej HUVEC na krawędzi rany, pozwoliło nam powiązać dynamikę wzrostu MT z morfologią i migracją HUVEC.
Opisane protokoły mają na celu zapewnienie ogólnie prostej i wysoce powtarzalnej metodologii hodowli HUVEC i badań eksperymentalnych. Niemniej jednak wiele szczegółów protokołu jest złożonych i czasochłonnych, co z kolei stwarza możliwość wystąpienia błędów lub trudności w przeprowadzeniu metodologii eksperymentalnej. Chociaż podjęto próbę rozwiązania potencjalnych problemów w całym protokole, tutaj przedstawiono dodatkowe, szczegółowe rozwiązywanie potencjalnych problemów, które są mniej powszechne lub w inny sposób skrócone jako uwagi w protokołach metodologicznych.
W odniesieniu do powlekania szkiełek nakrywkowych podłożami poliakrylamidowymi (Protokół 2.2), częstym problemem, który się pojawia, jest złożony charakter aktywacji szkiełek nakrywkowych, sprzęgania poliakrylamidu ze szkłem, aktywacji poliakrylamidu, a następnie sprzęgania ECM z poliakrylamidem. Jednym ze szczególnie trudnych i potencjalnie problematycznych etapów jest hodowla HUVEC na żelu fibronektynowo-poliakrylamidowym po wystawieniu szkiełek nakrywkowych pokrytych poliakrylamidem na działanie 2 mM sulfo-SANPAH (krok 2.2.2.6 powyżej). Kluczowe znaczenie dla powodzenia hodowli HUVEC na tych substratach ma całkowite usunięcie sulfo-SANPAH z systemu eksperymentalnego po koniugacji ECM. Najlepszym sposobem na osiągnięcie tego celu jest przemywanie ddH2O i inkubacja szkiełek nakrywkowych w ddH2O na wytrząsarce przez noc. Jeśli komórki hodowane na ECM z poliakrylamidu nie przeżywają lub jeśli żywotność jest mniejsza niż oczekiwano, zaleca się zwiększone i wielokrotne płukanie sulfo-SANPAH po koniugacji z fibronektyną (krok 2.2.2.9) w celu potencjalnego złagodzenia tego problemu.
W odniesieniu do Protokołu 3 (transfekcja cDNA i hodowla HUVEC na szkiełku nakrywkowym), głównym czynnikiem wpływającym na powodzenie procedury elektroporacji jest obchodzenie się z HUVEC zarówno podczas trypsynizacji komórek w celu usunięcia ich z plastikowej kolby, jak i po zakończeniu elektroporacji (kroki 3.3-3.4 powyżej). Bardzo ważne jest, aby uważnie monitorować HUVEC podczas przebywania w trypsynie i nie przekraczać czasu potrzebnego do "zaokrąglenia" komórek na powierzchni kolby (zwykle 1-2 min). Zbyt długi czas spędzony w trypsynie jest główną przyczyną śmierci HUVEC, która zwykle nie jest uświadamiana, dopóki komórki nie zostaną posiane na szkiełkach nakrywkowych pokrytych fibronektyną (krok 3.4), a następnie nie przyczepią się do substratu.
Co równie ważne, HUVEC (i większość pierwotnych typów ogniw) nie radzą sobie dobrze, gdy są zawieszone przez długi czas w buforze do elektroporacji. Podczas eksperymentów na większą skalę, na przykład, gdy użytkownik ma pięć lub więcej stanów wymagających elektroporacji, lepiej jest trzymać ogniwa w pojedynczych probówkach (1 probówka na transfekcję) i mieszać je, pojedynczo, w buforze do elektroporacji bezpośrednio przed elektroporacją. Takie podejście minimalizuje czas inkubacji w buforze do elektroporacji i maksymalizuje przeżywalność HUVEC. Ponadto krytyczne znaczenie ma również natychmiastowe uratowanie w kompletnych pożywkach hodowlanych po elektroporacji. Opóźnienia w akcji ratunkowej wynoszące jedną minutę lub więcej po elektroporacji mogą spowodować prawie całkowitą śmierć HUVEC i dlatego należy ich unikać.
Powiązany test migracji komórek (Protokół 9), technika hodowli HUVEC o bardzo dużej gęstości zależy od krytycznej modyfikacji (opisanej w kroku 9.2) tradycyjnej metodologii hodowli komórkowej HUVEC (opisanej w Protokole 3), która wymaga wysuszenia szkiełka nakrywkowego pokrytego fibronektyną w celu umożliwienia hodowli HUVEC na bardzo małym obszarze szkiełka nakrywkowego. Często, jeśli szkiełko nakrywkowe nie jest całkowicie wysuszone lub jeśli wcześniejsze pokrycie szkiełka nakrywkowego fibronektyną (kroki 2.1 lub 2.2) nie było skuteczne, komórki zawierające podłoże, które są umieszczane na szkiełku nakrywkowym, tracą napięcie powierzchniowe i rozszerzają się do krawędzi szkiełka nakrywkowego, zmniejszając w ten sposób gęstość komórek na szkiełku nakrywkowym. Jedną z metod rozwiązania tego potencjalnego problemu jest zassanie podłoża z szkiełka nakrywkowego, a następnie umieszczenie szkiełka nakrywkowego (nadal w naczyniu 35 mm) z tyłu szafy bezpieczeństwa biologicznego na 5-10 minut. Ta adaptacja może pomóc w umożliwieniu przepływu powietrza w szafce, aby pomóc w suszeniu naczynia. Jeśli po wyschnięciu na powietrzu na szkiełku nakrywkowym pozostanie widoczny płyn, odessać plamy płynu i ponownie pozostawić do wyschnięcia na powietrzu przez dodatkowe 5-10 minut w komorze bezpieczeństwa biologicznego. Ważne jest, aby pamiętać, że nie ma sposobu, aby całkowicie uniknąć tego potencjalnego problemu, ale staje się on mniejszym problemem przy wielokrotnym stosowaniu protokołu. Jest to również zalecenie dotyczące rozwiązywania problemów, aby podczas przygotowywania szkiełek nakrywkowych do testu migracji komórek (lub ogólnie dowolnego testu) przygotować dodatkowe szkiełka nakrywkowe i mieć dodatkowe HUVEC gotowe do użycia na wypadek problemów po drodze.
Mając na uwadze te rozważania dotyczące rozwiązywania problemów, ważne jest również, aby podkreślić użyteczność omawianych protokołów i ich implikacje w przyszłych badaniach nad biologią komórki. Możliwości zastosowania podejścia poliakryloamidowego są szerokie i obejmują nie tylko dwuwymiarowe badania zaangażowania komórki-ECM (opisane powyżej), ale także badania trójwymiarowe5. To zastosowanie ma kluczowe znaczenie dla pogłębienia naszej wiedzy na temat tego, w jaki sposób HUVEC regulują kształt i migrację komórek w środowiskach fizjologicznych i powinno zapewnić badaczom podstawową wiedzę na temat tego, w jaki sposób zmiany morfologiczne są koordynowane ze zmianami cytoszkieletu. Podczas gdy opisane tutaj protokoły koncentrują się na pomiarach dynamiki wzrostu MT, większość protokołów może i powinna być dostosowana do pomiaru dowolnej liczby innych mikroskopijnie mierzalnych aspektów interakcji komórka-ECM. Jeśli chodzi o dynamikę MT, istnieje wiele MAP, w tym co najmniej 14 rodzin kinezyn89, z których każda może odgrywać potencjalną rolę w przyczynianiu się do polaryzacji HUVEC i ukierunkowanej migracji, a wszystkie z nich można badać przy użyciu przedstawionych protokołów.
Przyszłe badania powinny być również ukierunkowane na zaangażowanie komórki w ECM w stanach normalnych i chorobowych. Przedstawione tutaj protokoły HUVEC mają zastosowanie do badań prawidłowych procesów homeostatycznych naczyń krwionośnych, a także do stanów chorobowych, w tym chorób serca, retinopatii, wzrostu guza i przerzutów, by wymienić tylko kilka. Sprzężenie widocznie przezroczystych ECM i substratów poliakrylamidowych o podatnej zgodności z badaniami mikroskopowymi pozwoli na przeprowadzenie badań zaangażowania komórka-ECM, dzięki czemu można monitorować angiogenezę naczyniową komórek śródbłonka z wysoką rozdzielczością przestrzenną i czasową. Tego typu podejścia eksperymentalne zaczęły już ujawniać istotne różnice w kształcie komórek śródbłonka, polarności, migracji i wpływie białek, które regulują te procesy5,31,90. Przyszłe wysiłki powinny mieć na celu określenie, w jaki sposób połączenie zgodności z ECM i mechanosensacji wymiarowej może służyć do lokalnego kontrolowania białek, które kierują i regulują dynamikę cytoszkieletu.

Angiogeneza jest wywoływana przez zewnątrzkomórkowe sygnały sygnalizacyjne, które promują komórki śródbłonka (EC) do polaryzacji, migracji z kierunkową specyficznością i tworzenia nowego układu naczyniowego w tkankach wymagających dopływu krwi. Uważa się, że czynnikami przyczyniającymi się do angiogenezy są sygnały z macierzy zewnątrzkomórkowej (ECM). W odpowiedzi na sygnały fizyczne, EC rozszerzają nowe gałęzie ze specyficznością kierunkową, aby kierować ruchem kierunkowym w tworzeniu sieci naczyniowej1,2. Architektura morfologii i rozgałęzień EC jest definiowana przez miejscową regulację cytoszkieletu mikrotubul (MT) w sposób skoordynowany z regulacją kurczliwości aktoomiozyny3. Aby mogły powstać gałęzie EC, miozyna-II musi być lokalnie obniżona, co powoduje miejscowe wypukłości błony4. W tym samym czasie i w tym samym miejscu w komórce, dynamika wzrostu MT ulega modyfikacji, co skutkuje powolnym i trwałym wzrostem MT, co sprzyja wydłużaniu gałęzi i stabilności5. Ta skoordynowana regulacja cytoszkieletu pozwala EC na polaryzację ich morfologii w celu ułatwienia migracji kierunkowej.
Rozwój spolaryzowanej morfologii komórek wymaga spolaryzowanego montażu MT6. W migrujących komórkach nabłonkowych MT rosną powoli i uporczywie, szczególnie na krawędzi czołowej komórki7-9; podczas gdy w neuronach inicjacja i wydłużanie aksonów lub dendrytów wymaga, aby MT były nie tylko obecne, ale także dynamicznie przechodziły procesy składania i demontażu10-15. W ten sposób zlokalizowana kontrola dynamiki wzrostu MT determinuje architekturę komórki i pozwala na szybką przebudowę morfologii komórki, gdy EC poruszają się po swoim ECM.
MT dynamika wzrostu jest regulowana przez rodziny molekularnych białek motorycznych i białek niemotorycznych, zwanych Białkami Związanymi z Mikrotubulami lub Białkami Oddziałującymi z Mikrotubulami (zwanymi dalej MAP). MAP mogą być lokalnie aktywowane lub dezaktywowane, zazwyczaj poprzez kaskady sygnalizacyjne inicjowane na granicy faz komórka-ECM16,17. Po aktywacji, MAP działają poprzez wiązanie się z MT i zmianę kinetyki montażu i demontażu MT; w ten sposób działa w celu lokalnej regulacji dynamiki MT w celu promowania kształtu i polaryzacji komórki18-20. Kinezyna związana z centromerami mitotycznymi (MCAK) to MAP z rodziny Kinezyny-13, która wiąże się z końcami MT i łączy hydrolizę ATP z demontażem MT21-23. Wiadomo, że ta funkcjonalna rola MCAK jest krytyczna we wrzecionie mitotycznym24-28, a także podczas interfazy29,30. W obrębie interfazowych EC demontaż MT za pośrednictwem MCAK jest regulowany przez zlokalizowaną fosforylację MCAK indukowaną przez Aurora-A w odpowiedzi na indukowaną przez krawędź rany aktywację małej GTPazy Rac1. Wynikiem tej kaskady sygnalizacyjnej jest zahamowanie MCAK na krawędzi natarcia EC, co skutkuje spolaryzowanym wzrostem MT w kierunku krawędzi natarcia i indukowanym przez MCAK demontażem MT na krawędzi spływu migrujących EC31.
Tradycyjne metodologie pomiaru dynamiki wzrostu MT zazwyczaj wykorzystywały ręczne śledzenie albo fluorescencyjnie znakowanej tubuliny, albo, ostatnio, znakowanej fluorescencyjnie białka MT End Binding 1 lub 3 (odpowiednio EB1 lub EB3). Podejście oparte na tubulinie fluorescencyjnej ma tę zaletę, że znakuje całą matrycę MT. Ponieważ jednak większość typów komórek mitotycznych utrzymuje promienisty układ MT podczas interfazy8,32,33, MT w pobliżu centrosomu są bardzo gęste, w wyniku czego śledzenie wzrostu i demontażu MT za pomocą tubuliny fluorescencyjnej jest zwykle ograniczone do peryferyjnych regionów komórki. Ze względu na te ograniczenia, wykorzystanie znakowanych fluorescencyjnie białek EB (EB1 lub EB3) jest bardziej powszechnym podejściem do pomiaru dynamiki MT. Ponieważ EB oznaczają tylko rosnące plus-końce MT, wyglądają one jak małe (1-3 μm), jasno fluorescencyjne komety, zapewniając w ten sposób łatwo rozpoznawalny marker polimeryzacji MT z bardzo ograniczoną fluorescencją tła34-37. Chociaż fakt, że EB oznaczają tylko podzbiór tablicy MT, stanowi główną zaletę podejścia EB, podkreśla on również jedno ważne ograniczenie, że nierosnące MT nie są oznaczane przez podejście EB3. Niemniej jednak, możliwość mierzenia i śledzenia komet EB3 w czasie oraz wizualizacji wzrostu MT w regionach subkomórkowych sprawia, że podejście to jest idealne do zastosowań, które wymagają regionalnej oceny organizacji MT.
Kolejnym krytycznym ograniczeniem tradycyjnych metodologii pomiaru dynamiki wzrostu MT były bardzo duże zbiory danych i czas potrzebny na analizę danych. Ograniczenie to wynika z konieczności ręcznego śledzenia setek komet EB w wysokiej rozdzielczości czasowej. Co więcej, pomiary te muszą być wykonywane w statystycznie istotnej liczbie komórek, a także w różnych warunkach kontrolnych i eksperymentalnych. Ostatnio ograniczenia te zostały przezwyciężone dzięki technikom analizy obliczeniowej ukierunkowanym na śledzenie komet EB3 za pomocą mikroskopii poklatkowej w żywych komórkach35. To podejście obliczeniowe, przy odpowiednim zastosowaniu, służy zarówno ograniczeniu potencjalnego błędu ludzkiego związanego ze śledzeniem wskazówek, jak i zapewnieniu wysokoprzepustowej metody pomiaru polimeryzacji MT. Obliczeniowa analiza dynamiki MT przy użyciu pakietu oprogramowania opartego na MatLab, plusTipTracker, pozwala na pomiary wzrostu MT poprzez śledzenie znakowanych fluorescencyjnie komet EB35,31,35,38. Dodatkowo, oprogramowanie plusTipTracker pozwala na obliczenia zdarzeń katastroficznych MT (a.k.a. demontażu) na podstawie zniknięcia komet EB3 w obrębie rosnącej ścieżki MT oraz pozwala na subkomórkową (czyli regionalną) analizę dynamiki wzrostu MT w zdefiniowanych przez użytkownika regionach zainteresowania. W naszych badaniach dynamika wzrostu MT została porównana w regionach rozgałęzionych i nierozgałęzionych lub w obrębie krawędzi komórek wiodących i końcowych. Dane wyjściowe z oprogramowania plusTipTracker mogą być również wykorzystywane do generowania kolorowych nakładek ścieżek dla poszczególnych komórek i regionów subkomórkowych.
Tutaj opisujemy metodologię użytą do zbadania roli MCAK w modulowaniu dynamiki wzrostu MT oraz wkładu tej depolimerazy MT w regulację morfologii rozgałęzień EC i migracji kierunkowej. W naszym podejściu wykorzystaliśmy pierwotną ludzką linię komórkową, ludzkie komórki śródbłonka żyły pępowinowej (HUVEC), które są łatwe w hodowli i wysoce podatne na indukowaną elektroporacją, przejściową transfekcję plazmidowego cDNA. Następnie użyliśmy poklatkowej mikroskopii fluorescencyjnej o wysokiej rozdzielczości HUVEC transfekowanych białkiem wiążącym koniec MT 3 (EB3) i konstruktami cDNA specyficznymi dla mitotycznej kinezyny związanej z centromerami (MCAK), aby ocenić wpływ na dynamikę transfekowanych HUVEC MT. Oparta na PlusTipTracker obliczeniowa analiza obrazu końcówek MT plus znakowanych EB3 miała na celu zmierzenie prędkości wzrostu MT i czasu życia MT na obrazach poklatkowych, aby zmierzyć i porównać wpływ manipulacji eksperymentalnych na dynamikę wzrostu MT. Metodologia ta pozwala na badanie dynamiki MT i określenie, w jaki sposób zlokalizowana regulacja dynamiki MT w regionach subkomórkowych przyczynia się do angiogennych procesów rozgałęziania i migracji EC. Techniki te mają zastosowanie do badań dowolnego MAP, który może być znakowany fluorescencyjnie i wyrażany w żywych komórkach.

<table><tbody><tr><td>Aurora A Inhibitor I</td><td>Selleck Chemicals</td><td>S1451</td><td></td></tr><tr><td>2% roztwór Bis</td><td>Bio-Rad</td><td>1610142</td><td></td></tr><tr><td>3-aminopropylotrimetyloksyloksysilan</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A3648</td><td></td></tr><tr><td>40% akryloamid</td><td>Bio-Rad</td><td>1610140</td><td></td></tr><tr><td>405, 488, 561, 640 nm moduł sumatora laserowego MLC400 dużej mocy</td><td>Agilent Technologies</td><td>99462</td><td></td></tr><tr><td>Nadsiarczan amonu</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A3678</td><td></td></tr><tr><td>anty&ndash; mysie kulki immunoprecypitacyjne IgG</td><td>Odczynniki TrueBlot; Rockland Inc.</td><td>88-1688-31</td><td></td></tr><tr><td>anty&ndash; kulki immunoprecypitacyjne królików IgG</td><td>Odczynniki TrueBlot; Rockland Inc.</td><td>88-7788-31</td><td></td></tr><tr><td>ET455/50m, Filtr emisji DAPI-ET</td><td>Chroma Technology Corp.</td><td>ET455/50m</td><td></td></tr><tr><td>ET525/36m Filtr emisyjny</td><td>Chroma Technology Corp.</td><td>ET525/36m</td><td></td></tr><tr><td>ET605/70m Filtr emisyjny</td><td>Chroma Technology Corp.</td><td>ET605/70m</td><td></td></tr><tr><td>ET700/75m Filtr emisyjny</td><td>Chroma Technology Corp.</td><td>ET700/75m</td><td></td></tr><tr><td>Surowica bydlęca Albumina frakcja V</td><td>Produkty RPI</td><td>A30075-100.0</td><td></td></tr><tr><td>Clara chłodzona kamera urządzenia ze sprzężeniem ładunkowym</td><td>Andor Technology</td><td>77026010</td><td></td></tr><tr><td>Cy3 osioł anty-królik</td><td>Jackson ImmunoResearch</td><td>711-165-152</td><td></td></tr><tr><td>DPBS</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>14190250</td><td></td></tr><tr><td>Dyelight 649 kozi antyszczur</td><td>Jackson ImmunoResearch</td><td>112-496-068</td><td></td></tr><tr><td>EGM-MV SingleQuot Dostawa i Czynniki wzrostu (zawartość pokazana poniżej)</td><td>Lonza</td><td>CC-4143</td><td></td></tr><tr><td>Płodowa surowica bydlęca 25 ml</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Ekstrakt z mózgu bydlęcego 2,0 ml</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Siarczan gentamycyny 0,5 ml</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Naskórkowy czynnik wzrostu 0,5 ml</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Hydrokortyzon 0,5 ml</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Penicylina/Streptomycyna (10 000 j.m. Pen/ml, 10 000 &#181; g Strep/ml)&nbsp; 10,0 ml</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>EGTA</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E3884-100G</td><td></td></tr><tr><td>Migawka elektroniczna</td><td>Instrument Sutter</td><td>77016099</td><td></td></tr><tr><td>Fibronektyna</td><td>EMD Milipore</td><td>FC010</td><td></td></tr><tr><td>Aldehyd glutarowy</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>S80026</td><td></td></tr><tr><td>HALT Inhibitor proteazy</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>PI-78425</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H4034</td><td></td></tr><tr><td>HRP koza anty-mysia</td><td>Jackson ImmunoResearch</td><td>115-036-062</td><td></td></tr><tr><td>HRP koza anty-królik</td><td>Jackson ImmunoResearch</td><td>111-036-045</td><td></td></tr><tr><td>Membrana PVDF Immuno-Blot</td><td>Bio-Rad</td><td>162-0174</td><td></td></tr><tr><td>Lanolina</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>8006-54-0</td><td></td></tr><tr><td>Magnez siarczan</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M2643-500G</td><td></td></tr><tr><td>Mikroskop</td><td>Nikon TiE</td><td>MEA53100</td><td></td></tr><tr><td>Stopień zmotoryzowany</td><td>ASI Technologies</td><td>MS-2000</td><td></td></tr><tr><td>Medium montażowe</td><td>Dako</td><td>CS70330-2</td><td></td></tr><tr><td>Mysz anty-Aurora A</td><td>Abcam</td><td>ab130156</td><td></td></tr><tr><td>Mysz anty-GAPDH</td><td>Abcam</td><td>ab9484</td><td></td></tr><tr><td>Mysz anty-MCAK</td><td>Abcam</td><td>ab50778</td><td></td></tr><tr><td>Mysia antytubulina (DM1A)</td><td>Technologia sygnalizacji komórkowej</td><td>3873S</td><td></td></tr><tr><td>Lakier do paznokci</td><td>Mikroskopia elektronowa Sciences</td><td>72180</td><td></td></tr><tr><td>Oprogramowanie NIS Elements</td><td>Nikon</td><td>MQS310000</td><td></td></tr><tr><td>Nucleofector Kit V</td><td>Lonza</td><td>VACA-1003</td><td>Zawiera bufor do elektroporacji</td></tr><tr><td>Parafina</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>P31-500</td><td></td></tr><tr><td>Penicylina-Streptomycyna (10 000 IU Pen/ml, 10 000 &#181; g Strep/ml)</td><td>MP Biomedicals</td><td>91670249</td><td></td></tr><tr><td>Wazelina</td><td>Dow Corning</td><td>2021854-1113</td><td></td></tr><tr><td>Rury</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P6757-100G</td><td></td></tr><tr><td>plusTipTracker</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Królik anty-GFP</td><td>Abcam</td><td>ab290</td><td></td></tr><tr><td>Królik anty&ndash; pT288&ndash; Aurora A</td><td>Abcam</td><td>ab18318</td><td></td></tr><tr><td>Szczur anty&ndash; &alpha;-tubulina</td><td>AbD Serotec</td><td>MCA78G</td><td></td></tr><tr><td>Borowodorek sodu</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>678-10</td><td></td></tr><tr><td>Krążek przędzalniczy&nbsp;</td><td>Andor Technology</td><td>Yokagawa CSU-X1</td><td></td></tr><tr><td>Sulfo-SANPAH</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>PI-22589</td><td></td></tr><tr><td>SuperSignal West Pico Podłoże chemiluminescencyjne</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>34080</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>BP151-500</td><td></td></tr><tr><td>Trypsyna</td><td>Corning</td><td>MT25053CI</td><td></td></tr><tr><td>Tween-20</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>BP337</td><td></td></tr></tbody></table> powiedział:

obrazowanie poklatkowe w wysokiej rozdzielczości i automatyczna analiza dynamiki mikrotubul w żywych ludzkich komórkach śródbłonka żyły pępowinowej

High-resolution Time-lapse Imaging and Automated Analysis of Microtubule Dynamics in Living Human Umbilical Vein Endothelial Cells

Fizjologiczny proces, w którym nowe naczynia krwionośne tworzą się z istniejących naczyń krwionośnych, wymaga specyficznych zdarzeń sygnalizacyjnych, które wywołują zmiany morfologiczne w obrębie poszczególnych komórek śródbłonka (EC). Procesy te mają kluczowe znaczenie dla utrzymania homeostazy, takiego jak gojenie się ran, a także mają kluczowe znaczenie w promowaniu wzrostu guza i przerzutów. Morfologia EC jest definiowana przez organizację cytoszkieletu, ściśle regulowanego systemu dynamiki aktyny i mikrotubul (MT), o którym wiadomo, że kontroluje rozgałęzianie EC, polarność i migrację kierunkową, podstawowe składniki angiogenezy. Aby zbadać dynamikę MT, zastosowaliśmy mikroskopię fluorescencyjną o wysokiej rozdzielczości w połączeniu z obliczeniową analizą obrazu znakowanych fluorescencyjnie końców MT w celu zbadania dynamiki wzrostu MT oraz regulacji morfologii rozgałęzień EC i migracji kierunkowej. Obrazowanie poklatkowe żywych ludzkich komórek śródbłonka żyły pępowinowej (HUVEC) przeprowadzono po transfekcji z fluorescencyjnie znakowanym białkiem wiążącym koniec MT 3 (EB3) i mitotycznym kinezyną związaną z centromerami (MCAK) w celu oceny wpływu na dynamikę MT. Oprogramowanie PlusTipTracker zostało wykorzystane do śledzenia końcówek MT plus z oznaczeniem EB3 w celu zmierzenia prędkości wzrostu MT i czasu życia MT na zdjęciach poklatkowych. Metodologia ta pozwala na badanie dynamiki MT i określenie, w jaki sposób zlokalizowana regulacja dynamiki MT w regionach subkomórkowych przyczynia się do angiogennych procesów rozgałęziania i migracji EC.

Szczegółowo opisano protokoły hodowli ludzkich komórek śródbłonka żyły pępowinowej (HUVEC), przejściowej transfekcji znakowanych fluorescencyjnie markerów wzrostu mikrotubul, obrazowania żywych komórek i automatycznej analizy dynamiki wzrostu mikrotubul międzyfazowych.

Obrazowanie poklatkowe w wysokiej rozdzielczości i automatyczna analiza dynamiki mikrotubul w żywych ludzkich komórkach śródbłonka żyły pępowinowej

The physiological process by which new vasculature forms from existing vasculature requires specific signaling events that trigger morphological changes ...

Ogólnym celem tej procedury jest hodowla ludzkich komórek śródbłonka żyły pępkowej oraz analiza dynamiki cytoszkieletu i migracji komórek przy użyciu obrazowania poklatkowego żywych komórek. Metody opisane w tym filmie mogą pomóc w odpowiedzi na kluczowe pytania w dziedzinie biologii komórki, molekularnej i mechanobiologii. Na przykład niniejszy protokół można wykorzystać do zidentyfikowania, w jaki sposób kształt i ruchliwość komórek są modulowane przez oddziaływanie z różnymi ECM.Demonstracja wizualna jest kluczowa, ponieważ etapy przygotowania próbek są trudne do wykonania. Wymagają one precyzyjnego obchodzenia się z komórkami w odpowiednim czasie na każdym etapie procesu. Chociaż metoda ta może dostarczyć wglądu w ruchomość komórek śródbłonka podczas angiogenezy, może ona zostać zastosowana również w badaniach mikroskopowych praktycznie każdego przylegającego modelu systemowego komórek.Używając pęsety, wyjmij szkiełko nakrywkę ze słoika z 100% etanolem i przełóż ją przez płomień palnika Bunsena w celu sterylizacji. Następnie umieść ją w 35 milimetrowej płytce Petriego. Przygotuj jedną szkiełko nakrywkę dla każdej próbki.Do probówki do mikrowirówki o pojemności 1,5 ml dodać 10 µL roztworu zapasowego fibronektyny o stężeniu 1 mg/ml oraz 990 µL PBS. Następnie nanieść pipetą 250 µL roztworu na każdą szkiełko nakrywkę. Równomiernie rozprowadzić roztwór, aby pokrył całą powierzchnię.Inkubuj szkiełka nakrywki przez minimum trzy godziny w temperaturze 37°C. Przed użyciem wypłucz każde szkiełko nakrywkę trzykrotnie za pomocą 2 ml PBS. Za pomocą hemocytometru określ liczbę hodowlanych HUVECs i przenieś do probówki do mikrowirówki objętość zawierającą 100 000 komórek na szkiełko nakrywkę dla eksperymentów bez migracji lub 500 000 komórek na szkiełko nakrywkę dla eksperymentów migracyjnych.Wirować komórki przy 1 400 ×g przez cztery minuty w celu ich osadzenia. Po wirowaniu, dla każdego testowanego warunku, resuspender do jednego miliona komórek w 100 µL buforu do elektroporacji i połączyć je z jednym mikrogramem cDNA. Przenieść komórki do kuwety do elektroporacji.Przeprowadź transfekcję mieszaniny komórek i DNA, korzystając z programu przeznaczonego do elektroporacji HUVEC. Następnie odzyskaj transfekowane komórki, dodając 500 µL kompletnego pożywki podstawowej dla komórek śródbłonka. Następnie wysiej odpowiednią objętość komórek na zakrywki pokryte fibronektyną.Inkubuj komórki w temperaturze 37 °C przez trzy do czterech godzin, aby umożliwić ekspresję konstruktów cDNA. W ramach przygotowania do obrazowania weź dwa paski dwustronnej taśmy o wymiarach 2,5 cm na 0,65 cm i przymocuj je poziomo wzdłuż górnej i dolnej krawędzi czystego szkiełka przedmiotowego. Należy pamiętać, że ważne jest pozostawienie niewielkiej przerwy między taśmą a krawędzią szkiełka w celu uszczelnienia komory.Zamocuj szkiełko nakrywkę stroną z komórkami do dołu, tak aby dwa brzegi szkiełka opierały się o taśmę. Używając pęsety, delikatnie dociśnij szkiełko, aby je zabezpieczyć. Za pomocą mikropipety dodaj 40 µL medium obrazującego pomiędzy szkiełko nakrywkę a preparat.Należy upewnić się, że przestrzeń między szkiełkiem nakrywką a preparatem jest całkowicie wypełniona medium obrazującym. W razie potrzeby usunąć nadmiar medium za pomocą ręcznika papierowego. Wszystkie krawędzie preparatu należy uszczelnić ciepłym VALAP.Sprawdzić szczelność, delikatnie naciskając szkiełko nakrywkę. Umieścić zamontowaną i uszczelnioną nakrywkę na stole mikroskopu wstępnie podgrzanym do 37 °C. Używając konfokalnego mikroskopu z dyskiem wirującym, zarejestrować sekwencje obrazów time-lapse, obrazy białka fluorescencyjnego niebieskiego oraz obrazy DIC.Przeanalizuj dynamikę mikrotubul oraz ko-lokalizację zgodnie z opisem w dołączonym dokumencie. Aby przeprowadzić test migracji komórek, po etapie elektroporacji należy uratować transfekowane komórki, dodając 80 µL pełnego podłoża podstawowego dla komórek śródbłonka. Następnie pipetą nanieś całą próbkę o objętości 80 µL w postaci pojedynczej kropli na środek wysuszonego zakrywa przedmiotu szkiełka powleczonego fibronektyną.Nie rozprzestrzeniać kropli. Osuszenie szkiełka nakrywki jest niezbędne, aby zapobiec rozdzieleniu kropli o objętości 80 µL w momencie kontaktu ze szkiełkiem. Takie podejście pozwala na skoncentrowanie komórek HUVEC na niewielkiej powierzchni szkiełka nakrywki, co sprzyja szybkiemu tworzeniu się konfluencyjnej monowarstwy komórek.Inkubuj szkiełko cover-slip w temperaturze 37 °C przez trzy do czterech godzin, aby umożliwić komórkom przytwierdzenie się i utworzenie konfluencyjnej warstwy jednowarstwowej. Następnie wypłucz preparaty dwukrotnie w pełnej podstawowej pożywce dla komórek endotelialnych, aby usunąć komórki, które nie przytwierdziły się do powierzchni. Aby stworzyć krawędź rany w warstwie HUVEC, użyj pincety do delikatnego przytrzymania szkiełka i zdecydowanie przeciągnij żyletką przez środek warstwy komórek.Pozostaw komórki do regeneracji w inkubatorze w temperaturze 37 °C przez trzy godziny. Następnie przygotuj i zamocuj szkiełka cover-slip do obrazowania w sposób opisany wcześniej. Pozyskuj obrazy w kontraście fazowym w odstępach 10 minut przez 12 godzin, używając obiektywu fazowego 10X o aperturze numerycznej 0,45 oraz kondensora z długim dystansem roboczym o aperturze numerycznej 0,52.Użyj panelu ND Acquisition w programie do akwizycji obrazów. Na koniec dokonaj ilościowej oceny rozgałęziania i migracji komórek HUVEC zgodnie z opisem w załączonym dokumencie. Komórki HUVEC poddano transfekcji w celu ekspresji białka EB3 znakowanego mApple, które jest białkiem wiążącym końce mikrotubul, a następnie wykonano zdjęcia w technice time-lapse.Po lewej stronie przedstawiono surowe obrazy EB3. Po prawej stronie widoczne są niebieskie komety EB3 śledzone za pomocą oprogramowania plusTipTracker. Komety wykryte w każdej klatce zostały powiązane na podstawie zmiany ich pozycji między klatkami w celu wygenerowania ścieżek EB3 oraz wizualnej nakładki ścieżek EB3, tak jak pokazano tutaj.Wolny, krótkotrwały wzrost mikrotubul zaznaczono kolorem czerwonym, wolny, długotrwały wzrost mikrotubul kolorem zielonym, szybki, krótkotrwały wzrost mikrotubul kolorem żółtym, a szybki, długotrwały wzrost mikrotubul kolorem niebieskim. Aby przeanalizować rozgałęzianie komórek śródbłonka, wykonano obraz DIC oraz obraz fluorescencyjny pojedynczej komórki HUVEC przy 60-krotnym powiększeniu. Na obrazie fluorescencyjnym ręcznie wyrysowano obrys krawędzi komórki.Początki odgałęzień zdefiniowano następnie poprzez narysowanie linii prostej poprzecznie do odgałęzienia, przechodzącej przez największy kąt zakrzywienia po obu stronach odgałęzienia. Policzono odgałęzienia, których długość była większa niż szerokość i wynosiła co najmniej 10 µm, a długość mierzono od początku odgałęzienia do jego dystalnego końca. Aby ocenić migrację komórek śródbłonka z brzegu rany, HUVECs hodowano przy wysokiej gęstości, a po zadaniu rany przeprowadzono obrazowanie time-lapse żywych komórek, zgodnie z opisem w tym filmie.Jak pokazano tutaj, komórki śródbłonka z brzegu rany migrowały kierunkowo w obszar rany. Ruch ten analizowano, wykorzystując jąderko jako marker referencyjny do śledzenia prędkości, trwałości oraz dystansu migracji. Po obejrzeniu tego filmu powinieneś mieć dobrą wiedzę na temat tego, jak hodować, transfekować i przygotowywać HUVEC do eksperymentów z obrazowania kształtu komórek i dynamiki cytoszkieletu lub do badań migracji komórek z brzegu rany.Po zastosowaniu tej procedury można przeprowadzić inne metody, takie jak konjugacja z poliakrylamidem lub kolagenem, aby odpowiedzieć na dodatkowe pytania dotyczące oddziaływań komórek z zmodyfikowanymi ECM. Dziękujemy za oglądanie i życzymy powodzenia w badaniach.

high-resolution-time-lapse-imaging-automated-analysis-microtubule

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Niniejszy protokół wideo przedstawia izolację i hodowlę ludzkich komórek śródbłonka żyły pępekowej (HUVEC) z ludzkiej pępowiny. Po izolacji komórki te mogą być wykorzystywane w testach angiogenezy in vitro, takich jak zoptymalizowany test kulek z żelu fibrynowego, zaprezentowany również przez laboratorium Hughesa.<br...

Izolacja ludzkich komórek śródbłonka żyły pępowinowej (HUVEC)

Niniejszy artykuł opisuje najpierw procedurę izolacji ludzkich komórek śródbłonka z żył pępkowych, a następnie pokazuje, jak wykorzystać te komórki do badania transmigracji neutrofili w warunkach przepływu. Dzięki zastosowaniu komory przepływowej o małej objętości, wykonanej z polimeru o właściwościach optycznych szkła, możliwe jest również obrazowanie fluorescencyjne żywych komórek rzadkich populacji komórkowych.

Izolacja ludzkich komórek śródbłonka żyły pępkowej oraz ich zastosowanie w badaniu transmigracji neutrofili w warunkach przepływu

Tutaj zademonstrowany jest nowatorski protokół analizy interesujących regionów, oparty na sortowaniu najlepiej dopasowanych elips przypisanych do regionów pozytywnego sygnału w dwuwymiarowych sekwencjach obrazów poklatkowych. Algorytm ten może umożliwić badaczom kompleksową analizę fizjologicznych sygnałów Ca2 + przy minimalnym wkładzie użytkownika i stronniczości.

Automatyczna analiza dynamicznych sygnałów Ca2+ w sekwencjach obrazów

Leukocyty przenikają przez monowarstwę śródbłonka drogą parakomórkową lub transkomórkową. Opracowaliśmy prosty test do śledzenia rozkładu endogennej złączowej VE-kadheryny i PECAM-1 podczas transśródbłonkowej migracji leukocytów pod przepływem fizjologicznym, aby rozróżnić dwie drogi transmigracji.

Obrazowanie w czasie rzeczywistym połączeń komórka-komórka śródbłonka podczas transmigracji neutrofili pod wpływem przepływu fizjologicznego

Pierwotne ludzkie komórki śródbłonka żyły pępowinowej (HUVEC) zostały wyhodowane do zbiegu w mikroprzepływowym urządzeniu sieciowym. Zilustrowano połączenie komórkowe śródbłonka i rozkład F-aktyny, a zmiany w wewnątrzkomórkowym stężeniu wapnia i produkcji tlenku azotu w odpowiedzi na adenozynotrójfosforan (ATP) określono ilościowo w czasie rzeczywistym na poszczególnych poziomach komórek.

Opracowanie i charakterystyka sieci mikronaczyń in vitro oraz pomiary ilościowe produkcji śródbłonka [Ca2+]i i tlenku azotu

Ten protokół opisuje użycie mikroskopii wielofotonowej do wykonywania rozszerzonego obrazowania poklatkowego interakcji wielokomórkowych w czasie rzeczywistym, in vivo w rozdzielczości pojedynczej komórki.

Rozszerzone poklatkowe obrazowanie przyżyciowe dynamiki wielokomórkowej w czasie rzeczywistym w mikrośrodowisku guza

Aby określić ilościowo przepływ mikronaczyniowy na podstawie sekwencji obrazów przepływu kapilarnego o dużej prędkości, opracowaliśmy oprogramowanie STAFF (Spatial Temporal Analysis of Fieldwise Flow). Na całym polu obrazu i w czasie STAFF ocenia prędkości przepływu i generuje sekwencję oznaczonych kolorami map przestrzennych do wizualizacji i tabelarycznych danych wyjściowych do analiz ilościowych.

Przestrzenna analiza czasowa przepływu w terenie w mikrokrążeniu

Ten protokół jest dedykowany do wizualizacji mikrotubul plus-end poprzez transfekcję białka EB3 w celu zbadania ich dynamicznych właściwości w pierwotnej hodowli komórkowej. Protokół został wdrożony na ludzkich pierwotnych fibroblastach skóry uzyskanych od pacjentów z chorobą Huntingtona.

Wizualizacja dynamiki plus-end mikrotubul w modelu choroby Huntingtona opartym na pierwotnych fibroblastach skóry człowieka

Obecne badanie opisuje protokół monitorowania zmian w ludzkich komórkach śródbłonka żyły pępowinowej (HUVEC) podczas infekcji wirusowej za pomocą systemu analizy komórek w czasie rzeczywistym (RTCA).

Monitorowanie zmian w komórkach śródbłonka żyły pępowinowej po zakażeniu wirusowym za pomocą analizy komórek w czasie rzeczywistym opartej na impedancji

W niniejszej pracy opisujemy podstawowy protokół obrazowania i kwantyfikacji czasu trwania mitozy w żywych komórkach ssaków hodowlanych po transfekcji siRNA.

Obrazowanie time-lapse mitozy po transfekcji siRNA

Poznaj metodę obrazowania poklatkowego w żywych komórkach śródbłonka żyły pępowinowej HUVEC do analizy dynamiki mikrotubul i migracji komórkowej. Technika ta umożliwia badanie zachowań cytoszkieletowych w czasie rzeczywistym.

Obrazowanie poklatkowe w wysokiej rozdzielczości i automatyczna analiza dynamiki mikrotubul w żywych ludzkich komórkach śródbłonka żyły pępowinowej (Wideo) | JoVE Journal

Obrazowanie poklatkowe w wysokiej rozdzielczości i automatyczna analiza dynamiki mikrotubul w żywych ludzkich komórkach śródbłonka żyły pępowinowej

Przeglądaj więcej filmów