Szczegółowy protokół charakteryzujący mysią linię komórkową C1498 i związany z nią mysi model białaczki

Ogólnym celem tej procedury jest scharakteryzowanie mysich komórek C1498 i ostrej białaczki, którą wywołują po wstrzyknięciu dożylnym myszom. Główną zaletą tej procedury jest to, że mysia białaczka mielomonocytowa wywołana po wstrzyknięciu komórek C1498 wykazuje wiele cech choroby człowieka. Ten model zwierzęcy może pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytania w dziedzinie hematologii, takie jak mechanizm, który prowadzi do rozwoju białaczki i niedoboru odporności.

Implikacje tego modelu zwierzęcego rozciągają się w kierunku leczenia białaczki, ponieważ ułatwia on testowanie nowych chemioterapii i środków immunotereputowych. Zacznij od przeniesienia pięcio- do sześciotygodniowej samicy kongenicznej myszy C57 black 6 do sterylnego kaptura z przepływem laminarnym. Następnie umieść zwierzę w unieruchomieniu.

Następnie załaduj strzykawkę o średnicy jednego milileta wyposażoną w igłę o rozmiarze 29 ze 100 mikrolitrami komórek. Chwyć ogon dystalnego końca i zdezynfekuj skórę ogona gazą nasączoną 70% etanolem. Kontynuuj powolne wstrzykiwanie jednej razy 10 do szóstej komórki do bocznej żyły ogonowej.

Gdy wszystkie komórki zostaną dostarczone, należy zdjąć igłę i delikatnie uciskać na widok wstrzyknięcia sterylną gazą. Następnie wróć zwierzę do klatki z dokładnym monitorowaniem przez następne kilka tygodni. 17 do 19 dni później włóż rurkę kapilarną do przyśrodkowej kantu oka znieczulonego zwierzęcia białaczkowego.

Od 100 do 200 mikrolitrów krwi zostanie pobranych z zatoki zębatej do rurki kapilarnej. Wyjmij rurkę i zatamuj krwawienie, delikatnie nakładając sterylną gąbkę z gazy na oko. Następnie przenieś krew do probówki EDTA i przechowuj probówkę na lodzie do czasu izolacji komórki jednojądrzastej.

Aby wyizolować komórki jednojądrzaste krwi, najpierw dodaj PBS uzupełniony jednym milimolowym EDTA do końcowej objętości 500 mikrolitrów. Następnie przenieś próbkę do probówki mikrowirówkowej. Następnie użyj jednomililitrowej strzykawki wyposażonej w igłę o rozmiarze 30, aby ostrożnie umieścić 500 mikrolitrów roztworu oddzielającego pod krwią, uważając, aby nie wymieszać warstw.

Oddzielić komórki przez odwirowanie i za pomocą pipety przenieść nieprzezroczystą białą warstwę komórek jednojądrzastych do nowej probówki do mikrowirówki. Następnie umyj komórki odpornościowe w jednym mililitrze PBS. Odwirować je i ponownie zawiesić osad w 600 mikrolitrach buforu FACS w celu barwienia i analizy za pomocą cytometrii przepływowej.

Aby odizolować szpik kostny, umieść mysz na plecach na plastikowej desce i zabezpiecz kończyny zwierzęcia. Zdezynfekuj zwierzę 70% etanolem. Następnie odetnij każdą nogę w górnej części kości udowej nad stawem i delikatnie pociągnij za piszczele, aby odłączyć je od kości udowych.

Użyj kleszczy i nożyczek, aby usunąć skórę i mięśnie z kości, a następnie przenieś kości na szalkę Petriego na lodzie. Użyj nożyczek, aby usunąć kończyny. Następnie włóż igłę o rozmiarze 26 dołączoną do 10-mililitrowej strzykawki zawierającej pięć mililitrów zimnego PBS do końca jednej kości na raz i przepłucz szpik kostny do naczynia.

Przepuść zawiesinę komórkową przez końcówkę igły kilka razy, aby rozbić komórki szpiku kostnego. Następnie przefiltruj komórki przez nowy filtr o grubości 70 mikronów do stożkowej rurki o pojemności 50 mililitrów, aby uzyskać zawiesinę pojedynczej komórki. Odwirować komórki i ponownie zawiesić osad w dwóch mililitrach buforu do lizy.

Natychmiast napełnij probówkę do 50 mililitrami zimnego PBS i odwiruj komórki. Następnie ponownie zawiesić osad szpiku kostnego na raz od 10 do szóstych komórek na mililitr w zimnym buforze FACS. Aby przygotować komórki szpiku kostnego do barwienia, najpierw umieść szkiełka w jednorazowych komorach z wstępnie dołączonymi kartami filtracyjnymi i umieść komory w cytowirówce.

Dodać 100 mikrolitrów buforu FACS do każdej komory karty filtracyjnej i krótko odwirować szkiełka. Pod koniec wirowania dodaj 100 mikrolitrów komórek do każdej komory i odwiruj komórki. Następnie ostrożnie wyjmij szkiełka z komór w celu wysuszenia na powietrzu.

Aby wybarwić komórki szpiku kostnego, zanurz szkiełka w słoiku z kopiną zawierającym roztwór Maya-Grunwalda na pięć minut. Następnie przenieś szkiełka do słoika z roztworem buforowym o pH 6,8 na jedną minutę. Następnie przenieś szkiełka do roztworu Giemsa R na 10 minut.

Następnie 10-sekundowe mycie wodą o neutralnym pH. Po umyciu pozostaw szkiełka do wyschnięcia na powietrzu i nałóż jedną kroplę podłoża montażowego na każdą próbkę. Następnie umieść jedną krawędź szkła nakrywkowego na szkiełku podstawowym i ostrożnie opuść szkło nakrywkowe na komórki, delikatnie dociskając, aby usunąć wszelkie pęcherzyki powietrza.

W porównaniu ze zwierzętami kontrolnymi, zwierzęta, którym wstrzyknięto komórkę C1498, wykazują masywną infiltrację komórek C1498 w szpiku kostnym, co obserwuje się po wyglądzie komórek przypominającym wybuch. Komórki C1498 naciekające szpik kostny wykazują fenotypy monocytowe i granulocytarne wskazujące odpowiednio na komórki monoblastyczne i mieloblastyczne, charakterystyczne dla ostrej białaczki mielomonocytowej. Analiza cytometryczna przepływowa częstości występowania komórek jednojądrzastych w próbkach krwi od myszy, którym wstrzyknięto C1498, wskazuje, że około jedna czwarta całej populacji białych krwinek składa się z komórek białaczkowych.

Częstość występowania limfocytów T i B jest podobna u zwierząt kontrolnych i zwierząt, którym wstrzyknięto C1498. Częstość występowania monocytów obserwuje się jednak na wyższych poziomach u myszy, którym wstrzyknięto C1498, co jest cechą ostrej białaczki mielomonocytowej. Podczas wykonywania zabiegów cytochemicznych i May-Grunwald Giemsa należy pamiętać o zachowaniu odpowiednich wartości pH, temperatur i czasów inkubacji.

Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak scharakteryzować ostrą białaczkę mielomonocytową. Po jej opracowaniu, technika ta utorowała drogę naukowcom w dziedzinie hematologii do zbadania natury spontanicznej i indukowanej ostrej białaczki w innych modelach zwierzęcych.