Name: Szczegółowy protokół charakteryzujący mysią linię komórkową C1498 i związany z nią mysi model białaczki (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-10-14T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min
Description: Poznaj szczegółowy protokół charakteryzacji mysiej linii komórkowej C1498 i związanego z nią modelu ostrej białaczki szpikowej. Metoda obejmuje cytometrię przepływową i barwienie cytochemiczne.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Autorzy chcieliby podziękować "Ligue Nationale contre le Cancer" (Comité du Septentrion), SIRIC ONCOLille (Grant INCa-DGOS-INSERM 6041) oraz Institut pour la Recherche sur le Cancer de Lille (IRCL) za wsparcie tej pracy. Chcieliby podziękować Delphine Taillieu i personelowi ośrodka dla zwierząt za zapewnienie schronienia myszom i utrzymanie ich dobrostanu. Dziękujemy również Raphaëlle Caillerez i Nathalie Jouy za ich pomoc w mikroskopii i cytometrii przepływowej.

<ol><li>Forthun, R. B., Hinrichs, C., Dowling, T. H., Bruserud, Ø, Selheim, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+past%2C+present+and+future+subclassification+of+patients+with+acute+myeloid+leukemia%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Pharm.+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">The past, present and future subclassification of patients with acute myeloid leukemia.</a> Curr. Pharm. Biotechnol. 17 (1), 6-19 (2016).</li>
<li>Goldie, H., Butler, C. H., Anderson, M. M., Maxwell, M. C., Hahn, P. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Growth+characteristics+of+free+C1498+%28granulocytic+leukemia%29+tumor+cells+in+the+peritoneal+fluid+and+the+blood+of+C57+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">Growth characteristics of free C1498 (granulocytic leukemia) tumor cells in the peritoneal fluid and the blood of C57 mice.</a> Cancer Res. 13 (2), 125-129 (1953).</li>
<li>Tanaka, K. K., Roberts, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biological+studies+of+E.L.4+lymphoma+and+C+Leukemia+in+susceptible+%28C57BL%29+and+resistant+%28B10.D2%29+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">Biological studies of E.L.4 lymphoma and C Leukemia in susceptible (C57BL) and resistant (B10.D2) mice.</a> Cancer Res. 24 (1498), 1785-1797 (1964).</li>
<li>Law, L. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+an+influence+affecting+growth+of+transplantable+leukemias+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">Characterization of an influence affecting growth of transplantable leukemias in mice.</a> Cancer Res. 4, 257-260 (1944).</li>
<li>Graham, J. D., McMahon Welch, C., Patchen, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Studies+of+an+implanted+murine+myelogenous+leukemia+C1498%5BTitle%5D)+AND+%22Ohio+J.+Sci%22%5BJournal%5D)">Studies of an implanted murine myelogenous leukemia C1498.</a> Ohio J. Sci. 75 (4), 202-208 (1975).</li>
<li>Boyer, M. W., Orchard, P. J., Gorden, K. B., Anderson, P. M., Mclvor, R. S., Blazar, B. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dependency+on+intercellular+adhesion+molecule+recognition+and+local+interleukin-2+provision+in+generation+of+an+in+vivo+CD8%2B+T-cell+immune+response+to+murine+myeloid+leukemia%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Dependency on intercellular adhesion molecule recognition and local interleukin-2 provision in generation of an in vivo CD8+ T-cell immune response to murine myeloid leukemia.</a> Blood. 85 (9), 2498-2506 (1995).</li>
<li>Labelle, J. L., Truitt, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+a+murine+NKT+cell+tumor+previously+described+as+an+acute+myelogenous+leukemia%5BTitle%5D)+AND+%22Leuk.+Lymphoma%22%5BJournal%5D)">Characterization of a murine NKT cell tumor previously described as an acute myelogenous leukemia.</a> Leuk. Lymphoma. 43 (8), 1637-1644 (2002).</li>
<li>Bradner, W. T., Pindell, M. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Myeloid+leukemia+as+a+screen+for+cancer+chemotherapeutic+agents%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">Myeloid leukemia as a screen for cancer chemotherapeutic agents.</a> Cancer Res. 26 (4), Pt 2 375-390 (1966).</li>
<li>Lin, J. M., Li, B., Rimmer, E., VanRoey, M., Jooss, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enhancement+of+the+anti-tumor+efficacy+of+a+GM-CSF-secreting+tumor+cell+immunotherapy+in+preclinical+models+by+cytosine+arabinoside%5BTitle%5D)+AND+%22Exp.+Hematol%22%5BJournal%5D)">Enhancement of the anti-tumor efficacy of a GM-CSF-secreting tumor cell immunotherapy in preclinical models by cytosine arabinoside.</a> Exp. Hematol. 36 (3), 319-329 (2008).</li>
<li>Robinson, J. P. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aRobinson%2C+JP+%22Handbook+of+Flow+Cytometry+Methods%22">Handbook of Flow Cytometry Methods</a>. , Wiley-Liss, Inc. New York, NY. (1993).</li>
<li>Xu, Y., McKenna, R. W., Wilson, K. S., Karandikar, N. J., Schultz, R. A., Kroft, S. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immunophenotypic+identification+of+acute+myeloid+leukemia+with+monocytic+differentiation%5BTitle%5D)+AND+%22Leukemia%22%5BJournal%5D)">Immunophenotypic identification of acute myeloid leukemia with monocytic differentiation.</a> Leukemia. 20 (7), 1321-1324 (2006).</li>
<li>Hassan, K., Qureshi, M., Shafi, S., Ikram, N., Akhtar, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Acute+myeloid+leukemia-FAB+classification+and+its+correlation+with+clinico-haematological+features%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Pak.+Med.+Assoc%22%5BJournal%5D)">Acute myeloid leukemia-FAB classification and its correlation with clinico-haematological features.</a> J. Pak. Med. Assoc. 43 (10), 200-203 (1993).</li>
<li>Quesenberry, P. J., Rappeport, J. M., Fountebouni, A., Sullivan, R., Zuckerman, K., Ryan, M. Inhibition of normal murine hematopoiesis by leukemic cells. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aQuesenberry%2C+PJ+%22N.Engl.J.+Med%22">N.Engl.J. Med</a>. 299 (2), 71-75 (1978).</li>
<li>Youn, J. I., Nagaraj, S., Collazo, M., Gabrilovich, D. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Subsets+of+myeloid-derived+suppressor+cells+in+tumor-bearing+mice%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Subsets of myeloid-derived suppressor cells in tumor-bearing mice.</a> J. Immunol. 181 (8), 5791-5802 (2008).</li>
<li>Loder, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((B+cell+development+in+the+spleen+takes+place+in+discrete+steps+and+is+determined+by+the+quality+of+B+cell+receptor-derived+signals%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Exp.+Med%22%5BJournal%5D)">B cell development in the spleen takes place in discrete steps and is determined by the quality of B cell receptor-derived signals.</a> J. Exp. Med. 190 (1), 75-89 (1999).</li>
<li>Robbins, C. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Extramedullary+hematopoiesis+generates+Ly-6C%28high%29+monocytes+that+infiltrate+atherosclerotic+lesions%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation%22%5BJournal%5D)">Extramedullary hematopoiesis generates Ly-6C(high) monocytes that infiltrate atherosclerotic lesions.</a> Circulation. 125 (2), 364-374 (2012).</li>
</ol>

Autorzy oświadczają, że nie mają konkurencyjnych interesów finansowych.

W poprzednich badaniach linia komórkowa C1498 była opisywana jako induktor ostrej białaczki granulocytarnej5, mielomonocytarnej6 lub NKT7 . Jednak dane demonstracyjne w literaturze były albo nieobecne, albo niekompletne. Przedstawiony tutaj protokół wykorzystuje różne techniki, takie jak cytometria przepływowa, immunofluorescencja, barwienie MGG i testy cytochemiczne, w celu scharakteryzowania hodowanych komórek C1498 i określenia charakteru białaczki, która jest indukowana u myszy po ich wstrzyknięciu.
Kiedy fenotypowaliśmy komórki C1498 hodowane in vitro po przeprowadzeniu analiz barwienia immunologicznego i cytometrii przepływowej, zaobserwowaliśmy pewne ograniczenia, ponieważ komórki te wyrażały niewiele markerów krwiotwórczych na powierzchni komórki, które zostały wcześniej opisane w literaturze6,7. Zgodnie z naszymi wynikami, Labelle i in. nie zaobserwowali ekspresji powierzchni komórek dojrzałego TCR na komórkach C1498 za pomocą barwienia cytometrią przepływową. Jednak uznali je za linię komórkową NKT po wykryciu mRNA CD3ε i TCRVβ8,27. Zaobserwowaliśmy również wewnątrzkomórkową ekspresję łańcuchów TCRVβ i cząsteczek CD3ε w większości komórek (> 70%), ale nie można było określić ich linii krwiotwórczych, ponieważ jednocześnie występowała wewnątrzkomórkowa ekspresja cząsteczki Mac-3.
Barwienie mieloperoksydazą, MGG i oceny w celu analizy esterazy funkcjonalnych za pomocą cytochemii wykazały, że linia komórkowa C1498 miała pochodzenie szpikowe i składała się z monoblastów i mieloblastów. Wyniki te były zgodne z procentem komórek Mac-3 + , które uzyskano w analizie barwienia cytometrią przepływową. Chociaż nie są to kroki ilościowe, stanowią kluczowe eksperymenty, które należy przeprowadzić. Rzeczywiście, pozostają one, jak dotąd, najlepszymi istniejącymi metodami charakteryzowania linii i etapu różnicowania komórek krwiotwórczych, które nie wyrażają żadnych lub niewiele specyficznych markerów fenotypowych.
Barwienie cytometrią przepływową było pomocne w wykazaniu rozwoju ostrej białaczki u myszy kongenicznych po dożylnym wstrzyknięciu komórek C1498. Komórki CD45.2 + C1498, które przeniknęły do krwi obwodowej i różnych narządów, zostały wyizolowane, a ich częstotliwości określono . Przeprowadzono również kwantyfikację w celu analizy nieodłącznych komórek rdzenia i śledziony po immunofenotypowaniu. Napotkano ograniczenia, gdy fenotyp komórek C1498 był badany w narządach, ponieważ wyrażały one niewiele markerów krwiotwórczych (tylko kilka z nich było B220+). W celu określenia charakteru obserwowanej ostrej białaczki przeprowadzono barwienie metodą Maya-Grünwalda Giemsa oraz analizę aktywności esterazy monocytowych i granulocytarnych przy użyciu szpiku kostnego. Wyniki wykazały, że komórki C1498 zachowały swoją morfologię i funkcję mieloblastyczną i monoblastyczną, ujawniając początek białaczki mielomonocytowej.
Biorąc pod uwagę krytyczne etapy opisane w niniejszym protokole, należy zwrócić szczególną uwagę na pH podczas przeprowadzania reakcji cytochemicznych i barwienia MGG, ponieważ błędy w pH mogą prowadzić do nieprawidłowej interpretacji wyników. Na przykład aktywność esterazy maślanu α-naftylu jest specyficzna dla komórek monocytowych tylko przy pH 6,0, ponieważ granulocyty i limfocyty mogą również barwić się dodatnio w tym teście przy wyższych wartościach pH. Utrwalanie komórek nie jest zalecane przed wykonaniem barwienia MGG, a wykazaliśmy, że tylko utrwalenie CAF dało zadowalające wyniki podczas wykonywania reakcji cytochemicznych esterazy z użyciem komórek C1498. Aby zachować ekspresję cząsteczki CD115 i jej wykrycie za pomocą cytometrii przepływowej, wszystkie próbki (np. krew, komórki szpiku kostnego i śledziony) powinny być przechowywane w lodzie podczas zabiegu. Jeżeli w doświadczeniach cytometrii przepływowej i/lub immunofluorescencji nie obserwuje się barwienia, należy sprawdzić odniesienie przeciwciał, zalecenia dotyczące ich przechowywania i ich rozcieńczenia. Odniesienia określone w tabeli materiałów/sprzętu zostały wybrane do zastosowań cytometrii przepływowej lub immunofluorescencji. Przeciwciała pierwszorzędowe/drugorzędowe lub ich sprzężone fluorofory mogły utracić swoją aktywność z powodu niewłaściwego przechowywania (np. ekspozycji na światło lub ciepło), niewłaściwego rozcieńczenia, intensywnego zamrażania/rozmrażania lub stosowania zanieczyszczonych. Uruchom kontrole pozytywne, aby upewnić się, że działają prawidłowo. Użyj mysich komórek pochodzących ze szpiku kostnego lub śledziony, o których wiadomo, że wyrażają interesujące nas białka. Aby uniknąć barwienia o wysokim tle i niespecyficznym, upewnij się, że komórki są odpowiednio umyte i przechowywane w wysokiej wilgotności (w celu immunofluorescencji) oraz że przeciwciała są rozcieńczone zgodnie z instrukcją. Użyć tego samego stężenia i rozcieńczenia dla przeciwciała kontrolnego izotypu i przeciwciała pierwszorzędowego, aby dokładnie określić poziom tła w próbce. W przypadku eksperymentów cytochemicznych esterazy odczynniki można testować przy użyciu dodatnich i ujemnych szkiełek kontrolnych zawierających oczyszczone komórki granulocytowe (Ly6G+) i monocytowe (CD115+) śledziony myszy.
Procedura opisana w tym badaniu wykazała, że wiele cech białaczki obserwowanych u myszy po wstrzyknięciu komórek C1498 ma wspólne cechy z ostrą ludzką białaczką mielomonocytową11,12. Zaatakowane komórki białaczkowe spowodowały redukcję dojrzałych i niedojrzałych (progenitorów i prekursorów) komórek rdzeniastych krwiotwórczych. Komórki C1498 są obecne z dużą częstotliwością (> 20%) we krwi obwodowej, podobnie jak komórki monocytowe. Zaobserwowano, że hepatomegalia i splenomegalia wynikają z naciekania komórek białaczkowych, a znaczny wzrost limfocytów B i komórek szpikowych towarzyszy splenomegalii. Trombopenię obserwowano również po oszacowaniu liczby płytek krwi za pomocą analizatora hematologicznego.
Wykazano, za pomocą eksperymentów in vitro , że komórki C1498 hamują normalną mysią hematopoezę poprzez wydzielanie rozpuszczalnych czynników13. W kilku mysich modelach nowotworowych wykazano również, że niedojrzałe komórki szpikowe (w tym komórki monocytowe i granulocytarne) migrują ze szpiku kostnego do śledziony, gdzie hamują aktywację i proliferację limfocytów T specyficznych dla nowotworu14. Tak więc zmniejszenie liczby komórek krwiotwórczych, które zaobserwowano w szpiku kostnym, mogło wynikać albo z niedoboru hematopoezy, albo z ich emigracji. Ten ostatni mechanizm może wyjaśniać obecność monocytozy we krwi obwodowej lub obserwację powiększonych frakcji szpikowych w śledzionie. Możliwe jest również, że komórki te mogły pochodzić z ulepszonej hematopoezy śledziony. Rzeczywiście, w warunkach stanu stacjonarnego niektóre podzbiory limfocytów B śledziony zostały zidentyfikowane jako prekursory dojrzałych limfocytów B15. Ponadto wykazano, że w stanach zapalnych rdzeniaste komórki macierzyste i progenitorowe przemieszczają się do śledziony w celu indukowania produkcji dojrzałych monocytów16. Protokół ten nie pozwala nam na wyciąganie wniosków dotyczących mechanizmów, które są zaangażowane w rozwój białaczki i należy w tym celu zastosować dodatkowe testy funkcjonalne i molekularne. Dane te zawierają jednak szczegółowe informacje na temat cech klinicznych ostrej białaczki mielomonocytowej i pomogą naukowcom ocenić i zrozumieć działanie nowych środków terapeutycznych.

Ostra białaczka szpikowa (AML) charakteryzuje się niekontrolowaną proliferacją krwiotwórczych komórek szpikowych, które są blokowane na różnych etapach dojrzewania. Ta dysregulacja może wpływać na szlaki różnicowania granulocytarnego, monocytowego, erytrocytarnego lub megaryocytarnego1. Komórki AML gromadzą się w szpiku kostnym, co prowadzi do upośledzenia hematopoezy, co skutkuje trombopenią, limfopenią i niedokrwistością. Komórki białaczkowe atakują również krew i narządy nielimfoidalne.
Model myszy C1498 był używany przez dziesięciolecia jako model ostrej białaczki, odkąd komórki rakowe zostały wyizolowane z białaczki 10-miesięcznej myszy C57BL/6 (H-2b) w 1941 roku. Literatura opisuje inwazję do krwi, narządów krwiotwórczych (np. śledziony i węzłów chłonnych) i narządów niekrwiotwórczych (np. wątroby, płuc, jajników i nerek) przez wysoce proliferacyjne komórki C1498 po ich wstrzyknięciu drogą dożylną, podskórną lub dootrzewnową do podatnych myszy2-4. Jednak doniesiono, że ten model mysi indukuje białaczkę granulocytarną2,5 lub mielomonocytarną6. Niedawno badanie opublikowane w 2002 roku opisało ten typ raka jako mysią białaczkę z komórek NKT7. W związku z tym literatura różni się co do charakteru tej linii komórkowej C1498 i związanej z nią białaczki, którą wywołuje u myszy. Rozbieżności te wynikają głównie z braku szczegółowych i aktualnych opublikowanych informacji na temat komórek i ogólnie choroby białaczkowej, ponieważ wiele badań przeprowadzono w latach 1950-70.
Tutaj udostępniamy szczegółowy protokół opisujący, jak scharakteryzować komórki C1498 i przeanalizować naturę choroby białaczkowej, która jest wywoływana przez ich dożylne wstrzyknięcie myszom. Pierwsza sekcja tego protokołu poświęcona jest opisowi komórek C1498, które zostały wyhodowane in vitro. Przeciwciała fluorescencyjne skierowane przeciwko powierzchniowym i wewnątrzkomórkowym markerom krwiotwórczym wykorzystano do określenia ich fenotypu za pomocą cytometrii przepływowej. Obecność mieloperoksydazy oceniano za pomocą mikroskopii immunofluorescencyjnej, ich linię krwiotwórczą i stopień różnicowania oceniano za pomocą cytochemii w celu oceny aktywności esterazy oraz przeprowadzono barwienie Maya-Grünwalda Giemsa. Komórki C1498 zostały następnie wstrzyknięte myszom, a wywołana ostra białaczka została opisana w drugiej części tego manuskryptu. Te same techniki zastosowano do określenia częstości występowania i fenotypów komórek białaczkowych i wrodzonych w szpiku kostnym, krwi obwodowej, śledzionie i narządach niekrwiotwórczych (wątroba i płuca).
Ten protokół jest wysoce powtarzalny, a przedstawione tutaj dane pomogą badaczom ocenić efekty nowych strategii terapeutycznych. Ten mysi model białaczki został już wykorzystany do testowania podejść do immunoterapii i różnych chemioterapeutyków przeciwnowotworowych8,9. Ich skuteczność oceniano, określając ewolucję obciążenia guzem i wskaźników przeżycia. Protokół ten może być wykorzystany do dostarczenia dodatkowych informacji na temat rozmieszczenia i utrzymania populacji komórek białaczkowych i innych komórek krwiotwórczych podczas leczenia.

<table><tbody><tr><td>Linia komórkowa C1498</td><td>ATCC</td><td>TIB 49</td><td></td></tr><tr><td>C57BL/6J-Ly5.1</td><td>Charles River</td><td>B6.SJL-Ptprc a Pep3 b / BoyCrl</td><td></td></tr><tr><td>Cells odczynniki do hodowli</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>2-merkaptoetanol, Gibco</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>21985</td><td></td></tr><tr><td>Płodowa surowica bydlęca (FBS)</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>10270</td><td></td></tr><tr><td>HEPES, Gibco (1 m)</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>15630</td><td></td></tr><tr><td>Roztwór aminokwasów endogennych, Gibco&nbsp; &nbsp;</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>11140</td><td></td></tr><tr><td>Penicylina-Streptomycyna, Gibco&nbsp;</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>15140</td><td></td></tr><tr><td>RPMI 1640 Medium (Gibco, Suplement GlutaMAX)</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>61870</td><td></td></tr><tr><td>Pirogronian sodu, Gibco (100 mM)</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>11360</td><td></td></tr><tr><td>Cytometria przepływowa odczynniki barwiące</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>anty-mysie B220 APC (1)</td><td>ebiosciences</td><td>17-0452</td><td>klon RA3-6B2, końcowe rozcieńczenie 1/100</td></tr><tr><td>anty-mysia B220 biotyna (2)</td><td>ebiosciences</td><td>13-0452</td><td>klon RA3-6B2, 1/400</td></tr><tr><td>anty-mysi CD3 eFluor450 (1)</td><td>ebiosciences</td><td>48-0032</td><td>klon 17A2, 1/100</td></tr><tr><td>anty-mysi CD3 PE (2)</td><td>BD biosciences</td><td>555275</td><td>klon 17A2, 1/100</td></tr><tr><td>anty-mysz CD3 PE-Cy5 (3)</td><td>ebiosciences</td><td>15-0031</td><td>klon 145-2C11, 1/100</td></tr><tr><td>anty-mysie CD4 APC (1)</td><td>ebiosciences</td><td>17-0041</td><td>klon GK1.5, 1/500</td></tr><tr><td>anty-mysie CD4 PE (2)</td><td>ebiosciences</td><td>12-0041</td><td>klon GK1.5, 1/200</td></tr><tr><td>anty-mysia biotyna CD8 (1)</td><td>ebiosciences</td><td>13-0081</td><td>klon 53-6,7, 1/100</td></tr><tr><td>anty-mysi CD8 eFluor450 (2)</td><td>ebiosciences</td><td>48-0081</td><td>klon 53-6,7, 1/500</td></tr><tr><td>anty-mysia biotyna</td> <td>CD11aebiosciences</td><td>13-0111</td><td>klon M17/4, 1/100</td></tr><tr><td>anty-mysz CD11b PE&nbsp;</td><td>ebiosciences</td><td>12-0112</td><td>klon M1/70, 1/200</td></tr><tr><td>anty-mysia CD16/32 biotyna</td><td>ebiosciences</td><td>13-0161</td><td>klon 93, 1/400</td></tr><tr><td>oczyszczony anty-mysz CD16/32 (blokowanie FcR)&nbsp;</td><td>BD biosciences</td><td>553141</td><td>klon 2.4G2</td></tr><tr><td>anty-mysia biotyna CD18 (1)</td><td>ebiosciences</td><td>13-0181</td><td>klon M18/2, 1/100</td></tr><tr><td>anty-mysi CD18 FITC (2)</td><td>ebiosciences</td><td>11-0181</td><td>klon M18/2, 1/50</td></tr><tr><td>anty-mysi CD19 PE</td><td>ebiosciences</td><td>12-0193</td><td>klon 1D3, 1/200</td></tr><tr><td>anty-mysz CD21/35 PE</td><td>ebiosciences</td><td>12-0211</td><td>klon 8D9, 1/50</td></tr><tr><td>anty-mysie CD31 PE</td><td>ebiosciences</td><td>12-0311</td><td>klon 390, 1/100</td></tr><tr><td>anty-mysie CD34 eFluor660</td><td>ebiosciences</td><td>50-0341</td><td>klon RAM34, 1/20</td></tr><tr><td>anty-mysie CD44 PE</td><td>BD biosciences</td><td></td><td>553134 klon IM7, 1/50</td></tr><tr><td>anty-mysie CD45.2 FITC&nbsp;</td><td>ebiosciences</td><td>11-0454</td><td>klon 104, 1/100</td></tr><tr><td>anty-mysz CD49b/Pan NK PE</td><td>&nbsp; BD biosciences</td><td>553858</td><td>klon DX5, 1/50</td></tr><tr><td>anty-mysia CD80 biotyna</td><td>ebiosciences</td><td>13-0801</td><td>klon 16-10A1, 1/200</td></tr><tr><td>anty-mysia CD86 biotyna</td><td>ebiosciences</td><td>13-0862</td><td>klon GL1, 1/200</td></tr><tr><td>anty-mysz CD107b (Mac-3) PE</td><td>ebiosciences</td><td>12-5989</td><td>klon M3/84, 1/40</td></tr><tr><td>anty-mysz CD115 PE</td><td>ebiosciences</td><td>12-1152</td><td>klon AFS98, 1/100</td></tr><tr><td>anty-mysie CD117 eFluor450</td><td>ebiosciences</td><td>48-1171</td><td>klon 2B8, 1/100</td></tr><tr><td>anty-mysie CD127 PE</td><td>ebiosciences</td><td>12-1271</td><td>klon A7R34, 1/100</td></tr><tr><td>anty-mysie CD150 APC</td><td>ebiosciences</td><td>17-1501</td><td>klon 9D1, 1/20</td></tr><tr><td>anty-mysi CD274 (PD-L1) biotyna</td><td>ebiosciences</td><td>13-5982</td><td>klon MIH5, 1/200</td></tr><tr><td>anty-mysi Ly-6A/E (Sca-1) PE</td><td>ebiosciences</td><td>12-5981</td><td>klon D7, 1/100</td></tr><tr><td>anty-mysz Ly-6C APC</td><td>ebiosciences</td><td>17-5932</td><td>klon HK1.4, 1/200</td></tr><tr><td>anty-mysz Ly-6G&nbsp; (Gr-1) biotyna (1)</td> <td>ebiosciences</td><td>13-5931</td><td>klon RB6-8C5, 1/400</td></tr><tr><td>anty-mysie Ly-6G FITC (2)</td><td>ebiosciences</td><td>11-9668</td><td>klon 1A8, 1/50</td></tr><tr><td>anty-mysie MHC klasa I (H-2Db) biotyna</td><td>ebiosciences</td><td>13-5999</td><td>klon 28-14-8, 1/50</td></tr><tr><td>anty-mysie MHC klasa II (I-A/I-E) PE-Cy5</td><td>ebiosciences</td><td>15-5321</td><td>klon M5/114.15.2, 1/1000</td></tr><tr><td>anty-mysz NK1.1 PE</td><td>BD biosciences</td><td>557391</td><td>klon PK136, 1/50</td></tr><tr><td>anty-mysie TCRVb FITC</td><td>BD biosciences</td><td>553170</td><td>klon H57-597, 1/50</td></tr><tr><td>streptawidyna PE-Cy5</td><td>ebiosciences</td><td>15-4317</td><td>&nbsp; &nbsp; 1/200</td></tr><tr>Odczynniki <td></td><td></td><td></td><td>do barwienia immunofluorescencyjnego</td></tr><tr><td>Anty-mysia mieloperoksydaza (przeciwciało o łańcuchu ciężkim)&nbsp;</td><td>Santa Cruz Biotechnology</td><td>sc-16129</td><td>1/10 (20 &mikro; g/ml)</td></tr><tr><td>&nbsp; przeciwciało przeciw kozom IgG (Texas Red sprzężone przeciwciało)</td><td>Jackson Immunoresearch</td><td>705-076-147</td><td>1/250</td></tr><tr><td>Normalna surowica osła</td><td>Jackson Immunoresearch</td><td>017-000-001</td><td></td></tr><tr><td>Roztwór Hoechst</td><td>BD Biosciences</td><td>561908</td><td>1/1000</td></tr><tr><td>Podłoże montażowe 1 (Fluoromount)&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F4680</td><td></td></tr><tr><td>Aceton</td><td>VWR&nbsp;</td><td>20066</td><td></td></tr><tr><td>Metanol</td><td>Merck Millipore</td><td>106009</td><td></td></tr><tr><td>Esterazy cytochemiczne odczynniki barwiące</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Naphtol AS-D roztwór chlorooctanu</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>911</td><td></td></tr><tr><td>Roztwór barwnika (roztwór Fast Red Violet LB Base)</td>Koncentrat buforowy <td>Sigma-Aldrich</td><td>912</td><td></td></tr><tr><td>pH6,3 (TRIZMAL)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>913</td><td></td></tr><tr><td>Roztwór azotynu sodu</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>914</td><td></td></tr><tr><td>Roztwór cytrynianu</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>915</td><td></td></tr><tr><td>Roztwór hematoksyliny</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>GHS3</td><td></td></tr><tr><td>Aceton</td><td>VWR&nbsp;</td><td>20066</td><td></td></tr><tr><td>Roztwór formaldehydu, 37%</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F1635</td><td></td></tr><tr><td>&alfa;-roztwór maślanu naftylu</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>1801</td><td></td></tr><tr><td>Bufor fosforanowy</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>1805</td><td></td></tr><tr><td>Tabletka azotynu sodu</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>1809</td><td></td></tr><tr><td>Roztwór pararozaniliny</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>1804</td><td></td></tr><tr><td>Roztwór błękitu metylenowego</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>1808</td><td>1/10</td></tr><tr><td>podłoże montażowe 2 (Clearmount)</td><td>Invitrogen</td><td>00-8010</td><td></td></tr><tr><td>May-Gr&uuml; odczynniki barwiące do Walda Giemsa</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>May-Gr&uuml; nwald solution</td><td>RAL Diagnostics</td><td>320070</td><td></td></tr><tr><td>Giemsa R solution&nbsp;</td><td>Diagnostyka RAL</td><td>320310</td><td>&nbsp; &nbsp; Roztwór buforowy 1/20</td></tr><tr><td>pH 6,8</td><td>RAL Diagnostyka 330368</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Inne materiały, odczynniki i sprzęt</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Ketamina 1000 (100 mg/ml)</td><td>VIRBAC</td><td>3597132111010</td><td></td></tr><tr><td>Ksylazyna SEDAXYLAN (20 mg/ml)</td><td>CEVA</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Surowica albuminy Bovin (BSA) w proszku</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>BP671</td><td></td></tr><tr><td>Roztwór PBS (1x koncentrat)</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>14190</td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldehyd (PFA)&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>158127</td><td></td></tr><tr><td>Saponin&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>47036</td><td></td></tr><tr><td>Ultra Pure 0,5 M roztwór EDTA, pH 8,0</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>15575</td><td></td></tr><tr><td>Roztwór separujący (Mysz Pancoll)</td><td>PANBIOTECH</td><td>P04-64100</td><td></td></tr><tr><td>Bufor do lizy (bufor lizujący czerwone krwinki) (10x)</td><td>BD Biosciences</td><td>555899</td><td>1/10</td></tr><tr><td>NaOH 10 N</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>SS267</td><td></td></tr><tr><td>Roztwór błękitu trypanowego (0,4 %)</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>15250-061</td><td>1/2</td></tr><tr><td>probówka 50 ml (Falcon)</td><td>Fisher Scientific</td><td>14-432-22</td><td></td></tr><tr><td>70 &micro; m Sitko do komórek (Falcon)&nbsp;</td><td>Corning Nauki Przyrodnicze</td><td>352350</td><td></td></tr><tr><td>&nbsp; Izba & karta filtracyjna (EZ Cytofunnel Shandon)</td><td>Okulary</td><td></td> nakrywkowe do mikroskopu Thermo Scientific A78710003<td></td></tr><tr><td>, 24 x 24 mm</td><td>Knittel Glass</td><td>VD1 2424 Y100</td><td></td></tr><tr><td>Szkiełka (Starfrost - szlifowane krawędzie 90)</td><td>Knittel Glass</td><td>VS1137# 077FKB</td><td></td></tr><tr><td>EDTA Rurka</td><td>Greiner Bio-One</td><td>454034</td><td></td></tr><tr><td>Pasteur Pipeta 150 mm (rurka kapilarna)</td><td>Fisherbrand</td><td>1154-6963</td><td></td></tr><tr><td>Igła 26 G</td><td>Terumo</td><td>NN-2613R</td><td></td></tr><tr><td>&nbsp; strzykawka insulinowa z igłą 29 G</td><td>Terumo</td><td>BS05M2913</td><td></td></tr><tr><td>30 G&nbsp;</td><td>Becton & Dickinson</td><td>304000</td><td></td></tr><tr><td>Rurki do cytometrii przepływowej (niebieskie)</td><td>Długopis hydrofobowy Beckman Coulter</td><td>2523749</td><td></td></tr> (<tr><td>Dakopen)</td><td>Dako</td><td>S200230</td><td></td></tr><tr><td>Ostre sterylne nożyczki&nbsp;</td><td>Nessi-care</td><td>SCI-01</td><td></td></tr><tr><td>Sterylne kleszcze</td><td>Dominique Dutscher</td><td>956506</td><td></td></tr><tr><td>Komora zliczania komórek Thoma</td><td>VWR</td><td>631-0397</td><td></td></tr><tr><td>Szalki Petriego (Fisherbrand Plastic)</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>S33580A</td><td></td></tr><tr><td>Probówka do mikrowirówek (1,5 ml)</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>05-408-129</td><td></td></tr><tr><td>Cylindryczny ogranicznik 15 - 30 g</td><td>Stoelting</td><td>51338</td><td></td></tr><tr><td>Shandon Cytospin 3 Cytospin 3 Cytowirówka</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>10 ml strzykawka</td><td>Terumo</td><td>SS-10L</td><td></td></tr><tr><td>Strzykawka 1 ml</td><td>Terumo</td><td>SS-01T</td><td></td></tr><tr><td>Etanol</td><td>Merck</td><td>1.08543</td><td></td></tr><tr><td>Sterylne gąbki z gazy</td><td>URGO</td><td>501580</td><td></td></tr></tbody></table>

szczegółowy protokół charakteryzujący mysią linię komórkową c1498 i związany z nią mysi model białaczki

A Detailed Protocol for Characterizing the Murine C1498 Cell Line and its Associated Leukemia Mouse Model

Dożylne wstrzykiwanie komórek C1498 myszom syngenicznym lub kongenicznym jest wykonywane od 1941 roku. Zastrzyki te powodują rozwój ostrej białaczki. Jednak charakter tej choroby nie został dobrze udokumentowany w literaturze. W tym miejscu przedstawiamy protokół techniczny do charakteryzowania komórek C1498 in vitro i określania charakteru indukowanej białaczki in vivo. Pierwsza część tej procedury koncentruje się na określeniu linii krwiotwórczej i stadium różnicowania hodowanych komórek C1498. Aby to osiągnąć, stosuje się wieloparametryczne barwienie cytometryczne przepływowe do wykrywania markerów komórek krwiotwórczych. Następnie przeprowadza się mikroskopię immunofluorescencyjną, cytochemię i barwienie Maya-Grünwalda Giemsy w celu oceny ekspresji mieloperoksydazy, aktywności esterazy i morfologii komórki. Druga część tego protokołu poświęcona jest opisowi choroby białaczkowej, która jest wywoływana in vivo. To ostatnie można osiągnąć, określając częstość występowania komórek białaczkowych i wrodzonych we krwi, narządach krwiotwórczych (np. szpiku kostnym i śledzionie) oraz tkankach nielimfatycznych (np. wątrobie i płucach) za pomocą specyficznych analiz barwienia i cytometrii przepływowej. Charakter białaczki jest następnie potwierdzany za pomocą barwienia Maya-Grünwalda Giemsy i barwienia dla określonych esterazy w szpiku kostnym. Tutaj przedstawiamy wyniki, które uzyskano przy użyciu tego protokołu u myszy z wstrzyknięciem C1498 i PBS w dopasowanym wieku.

Aby scharakteryzować mysi model C1498, przeprowadzono dwa główne etapy. Po pierwsze, scharakteryzowano komórki C1498 w celu określenia ich linii hematopoetycznej oraz stopnia dojrzewania in vitro (Rycina 1). Następnie komórki te wstrzyknięto myszom kongenicznym, a charakter indukowanej choroby białaczkowej oceniono pod kątem różnych cech: infiltracji komórek białaczkowych, ich fenotypu, ilości komórek hematopoetycznych (dojrzałych oraz progenitorów/prekursorów) w szpiku kostnym, częstości występowania komórek C1498 i dojrzałych komórek hematopoetycznych we krwi oraz oceny obrzęku narządów (śledziony, wątroby i płuc) i ich składu komórkowego.
W celu charakterystyki fenotypów komórek C1498 in vitro, komórki znakowano przeciwciałami skierowanymi przeciwko cząsteczkom wyrazanym przez prekursory hematopoetyczne i dojrzałe komórki (Tabela 1), a wyniki analizowano przy użyciu cytometrii przepływowej. Komórki C1498 wykazano jako dodatnie pod względem ekspresji powierzchniowej Mac-1 (CD11b/CD18) (∼ 7%), B220 (&gt; 25%), a także stwierdzono ich wewnątrzkomórkową ekspresję CD3ε, łańcuchów Vβ receptora komórek T (TCR) oraz Mac-3 (Ryc. 2A i B). Komórki były ujemne pod kątem markerów powierzchniowych Ly6G, Ly6C, CD115, CD21/CD35, CD19, CD3, CD4, CD8, NK1.1 i cząsteczek pan-NK, a także pod kątem wewnątrzkomórkowej ekspresji CD4 i CD8 (dane nie pokazano). Następnie sprawdzono obecność markerów komórek macierzystych i progenitorów hematopoetycznych (Tabela 1). Wykazano również brak ekspresji powierzchniowej CD117, CD34, Sca-1, CD150 i CD16/32 (dane nie pokazano). Następnie badano te komórki białaczkowe w celu określenia ekspresji cząsteczek adhezyjnych, prezentacji antygenu i cząsteczek kostymulujących. Komórki wykazano jako dodatnie dla markerów powierzchniowych LFA-1 (CD11a/CD18), CD44, CD31 (PECAM-1) oraz H-2Db , natomiast były ujemne dla MHC klasy II, CD80, CD86 i CD274 (dane nie pokazano). Komórki C1498 wyrazowały zatem zarówno markery mieloidalne (Mac-1, Mac-3), jak i limfoidalne (B220, CD3, TCR).
Aby lepiej scharakteryzować linię krwiotwórczą komórek, oceniono ekspresję mieloperoksydazy za pomocą mikroskopii immunofluorescencyjnej. Wszystkie komórki były dodatnie pod kątem mieloperoksydazy, co potwierdziło ich pochodzenie mieloidalne (Rycina 3A). Większość komórek wybarwiła się również dodatnio na esterazy α-naftylobutyranu (Rycina 3B, panel lewy), a niektóre z nich na esterazy chloroacetanu naftolu AS-D (czarne strzałki) (Rycina 3B, panel prawy). Wyniki wskazują, że populacja składała się z mieszaniny komórek monocytycznych i granulocytycznych. Po wykonaniu barwienia metodą May-Grünwalda Giemsy zaobserwowano, że komórki C1498 wykazują morfologię blastocytarną z wysokim stosunkiem jądra do cytoplazmy, obecnością 3 do 5 jąderzek w jądrze, otoczką okołojądrową, licznymi wakuolami oraz bazofilną cytoplazmą (Rycina 3C). Zatem linia komórkowa C1498 składa się z monoblastów i mieloblastów.
Komórki C1498 (CD45.2+) wstrzyknięto następnie dożylnie myszom CD45.1+ . Myszy padły od 17 do 19 dni po wstrzyknięciu komórek. Myszy te uśmiercono, aby przed śmiercią z powodu choroby można było przeanalizować typ białaczki. Myszy kontrolne, którym wstrzyknięto PBS, przeanalizowano w tych samych punktach czasowych w celu porównania. U myszy, którym wstrzyknięto komórki C1498, zaobserwowano masywną infiltrację komórek C1498 do szpiku kostnego, co potwierdził blastowy wygląd komórek po przeprowadzeniu barwienia May-Grünwalda i Giemsy (Rycina 4A). Zachowały one również swój fenotyp monocytowy i granulocytowy (Rycyna 4B i C), co wykazało akumulację komórek monoblastycznych i mieloblastycznych charakterystyczną dla ostrej białaczki mielomonocytowej.
Aby ustalić, czy liczba szpiku kostnego komórek krwiotwórczych była niższa po inwazji komórek białaczkowych, CD45.2+ Populacje komórek C1498, limfocytów B, monocytów oraz granulocytów (w tym progenitorów, prekursorów i komórek dojrzałych) poddano ilościowemu oznaczeniu z wykorzystaniem barwienia immunofluorescencyjnego i wieloparametrycznej analizy cytometrii przepływowej. Komórki białaczkowe stanowiły od 16 do 36% komórek krwiotwórczych (dane nie zostały przedstawione). Pozostałe typy komórek występowały w znacznie mniejszej liczbie u myszy wstrzykniętych komórkami C1498 niż u myszy wstrzykniętych PBS (średnio 5-krotnie mniej w przypadku subpopulacji limfocytów B, 4-krotnie mniej dla komórek granulocytowych i 3-krotnie mniej dla subpopulacji monocytowych) (Rycina 5A–C).
Badanie częstości występowania komórek jednojądrowych w próbkach krwi myszy leukemicznych i kontrolnych wykazało, że zawierały one porównywalny procent limfocytów (Ryc. 6A), ale wyższą częstość występowania komórek monocytowych i leukemicznych. Cechy te są reprezentatywne dla ostrej białaczki mielomonocytowej11 (Ryc. 6B).
Wśród innych cech ostrej białaczki mielomonocytowej12, u myszy wstrzykniętych linią C1498 wystąpił obrzęk wątroby (hepatomegalia), płuc i śledziony (splenomegalia) (Rysunek 7A). Za pomocą barwienia immunofluorescencyjnego i analizy cytometrii przepływowej w organach tych wykryto różną częstotliwość występowania komórek C1498 CD45.2+ (Rysunek 7B). Ponieważ splenomegalia może być wynikiem wysokiej liczby naciekających monocytów, oszacowano również proporcje populacji śledzionowych. Liczba komórek w frakcjach limfocytów B, monocytów i granulocytów była w śledzionach białaczkowych znacząco większa niż w śledzionach kontrolnych, średnio odpowiednio 2-krotnie, 2,5-krotnie i 3-krotnie (Rysunek 7C).
<img alt="Schemat badania białaczki in vitro/ex vivo; cytometria przepływowa, wstrzyknięcie komórek, morfologia, ilościowe oznaczanie komórek białaczkowych" src="/files/ftp_upload/54270/54270fig1.jpg" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Rycina 1"> 
Rycina 1. Schematyczny przebieg protokołu służącego do charakterystyki linii komórkowych C1498 hodowanych in vitro oraz opisów ostrej białaczki in vivo. W pierwszej kolejności określono linię krwiotwórczą i stopień różnicowania komórek C1498 hodowanych tkankowo. Następnie komórki C1498 wstrzyknięto myszom kongenicznym w celu indukowania rozwoju ostrej białaczki. Przeprowadzono izolację szpiku kostnego, krwi obwodowej, śledziony, wątroby i tkanek płuc, aby określić częstość występowania, fenotypy i zmiany morfologiczne po infiltracji komórek C1498. IV: dożylnie, MGG: May-Grünwald Giemsa. <a href="https://cloudfront.jove.com/files/ftp_upload/54270/54270fig1large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.</a>
<img alt="Wykresy kropkowe cytometrii przepływowej analizujące powierzchniowe i wewnątrzkomórkowe markery różnicowania w komórkach C1498." src="/files/ftp_upload/54270/54270fig2.jpg" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Rycina 2"> 
Rycina 2. Analiza fenotypowa komórek C1498 po hodowli in vitro. Przedstawiono reprezentatywne wykresy kropkowe i histogramy cytometrii przepływowej dla cząsteczek ekspresyjne przez C1498 na powierzchni komórki (A) oraz wewnątrzkomórkowo (B), które są związane z różnicowaniem dojrzałych komórek krwiotwórczych. Komórki C1498 pobrano z hodowli, przemyto i znakowano za pomocą przeciwciał fluorescencyjnych specyficznych dla markerów powierzchniowych CD11b, CD18 i B220 lub ich kontroli izotypowych. Do barwienia wewnątrzkomórkowego komórki utrwalono, permeabilizowano i znakowano przeciwciałami skierowanymi przeciwko Mac-3, CD3ε oraz wspólnemu epitopowi łańcucha Vβ TCR (T-Cell Receptor) lub ich kontrolom izotypowym. Analizy przeprowadzono z zastosowaniem bramkowania dla żywych komórek. <a href="https://cloudfront.jove.com/files/ftp_upload/54270/54270fig2large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.</a>
<img alt="Barwienie na mieloperoksydazę, obrazy mikroskopowe; analiza cytochemiczna NBE, CAE, MGG, powiększenie x20 i x100." src="/files/ftp_upload/54270/54270fig3.jpg" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Rysunek 3"> 
Rysunek 3. Charakterystyka funkcjonalna i morfologiczna hodowlanych komórek C1498. Komórki C1498 zostały zebrane z kultur i odwirowane na szkiełkach do analizy mikroskopowej. (A) Barwienie na ekspresję mieloperoksydazy wykonano z wykorzystaniem immunofluorescencji. (B) Do analizy aktywności α-naftylobutyranowej esterazy (NBE) oraz naftol AS-D chloroacetylowej esterazy (CAE) w komórkach C1498 zastosowano reakcje cytochemiczne. Komórki uznano za pozytywne dla każdego znacznika w przypadku zaobserwowania odpowiednio dużych, brązowych i czerwono-fioletowych granulek cytoplazmatycznych. (C) Barwienie komórek C1498 metodą May-Grünwalda Giemsy (MGG). Dla każdego eksperymentu barwienia podano powiększenie obiektywu mikroskopu. Każdy obraz jest reprezentatywny dla trzech oddzielnych eksperymentów. <a href="https://cloudfront.jove.com/files/ftp_upload/54270/54270fig3large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.</a>
<img alt="Analiza szpiku kostnego; komórki PBS vs C1498; porównawcze metody barwienia; obrazy mikroskopowe x100." src="/files/ftp_upload/54270/54270fig4.jpg" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Rysunek 4"> 
Rysunek 4. Morfologia szpiku kostnego u myszy wstrzykniętych PBS oraz komórkami C1498. Komórki szpiku kostnego wyizolowano od myszy po wstrzyknięciu PBS oraz komórek C1498, a następnie odwirowano na szkiełkach do analizy mikroskopowej. (A) Barwienie metodą May-Grünwalda-Giemsy (MGG). (B) Aktywność α-naftylobutyrany esterazy (NBE) oraz (C) naftol AS-D chloroacetaty esterazy (CAE) oceniono za pomocą cytochemii. Na panelu A neutrofile prążkowane (niedojrzałe) lub segmentowane (dojrzałe) są mniej widoczne w szpiku kostnym myszy po wstrzyknięciu C1498 niż u myszy po wstrzyknięciu PBS. Panele B i C wskazują na akumulację komórek monocytycznych i granulocytarnych w leukemicznym szpiku kostnym w porównaniu do liczby obserwowanej w kontrolnym szpiku kostnym. Wszystkie analizy mikroskopowe wykonano z użyciem obiektywu o powiększeniu 100X. <a href="https://cloudfront.jove.com/files/ftp_upload/54270/54270fig4large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.</a>
<img alt="Analiza cytometryczna subpopulacji komórek szpiku kostnego; schematy komórek B, granulocytarnych i monocytarnych, PBS vs C1498." src="/files/ftp_upload/54270/54270fig5.jpg" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Rysunek 5"> 
Rysunek 5. Analiza ilościowa populacji szpiku w myszach wstrzykniętych PBS i C1498. Komórki szpiku kostnego wyizolowano z myszy wstrzykniętych PBS oraz komórkami C1498, a następnie oszacowano ich liczbę po wykonaniu zliczenia komórek. Częstość występowania różnych populacji komórek określono po barwieniu immunologicznym i analizie cytometrycznej z bramkowaniem żywych komórek. (A) Subpopulacje limfocytów B obejmowały komórki CD19+B220+ na etapach od pro-B do dojrzałych limfocytów B; (B) komórki granulocytarne w liniach CD3- i CD11b+Ly6G+, obejmujące prekursory oraz granulocyty niedojrzałe i dojrzałe; (C) subpopulacje monocytarne zdefiniowano jako CD3-CD115+, obejmujące komórki od etapu progenitora do dojrzałego monocytu. n = 7 myszy/grupa; dane przedstawiono w formie histogramów wykazujących średnie ± SEM. ***, p&lt; 0.0001 i **, p&lt; 0.01, nieparowany test t Studenta porównujący myszy wstrzyknięte PBS i C1498. <a href="https://cloudfront.jove.com/files/ftp_upload/54270/54270fig5large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.</a>
<img alt="Wykresy z cytometrii przepływowej przedstawiające komórki B, T i monocyty; bramkowanie CD45.2 dla analizy komórek białaczkowych." src="/files/ftp_upload/54270/54270fig6.jpg" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Rysunek 6"> 
Rysunek 6. Analiza krwi pod kątem podzbiorów komórek mononuklearnych u myszy wstrzykniętych PBS oraz C1498. Reprezentatywne wykresy kropkowe z cytometrii przepływowej przedstawiające (A) procentowy udział limfocytów T i B, zdefiniowanych odpowiednio jako komórki CD3+ i B220+ u myszy wstrzykniętych PBS oraz komórkami C1498. (B) Częstość występowania komórek monocytarnych u myszy białaczkowych C1498 i kontrolnych (PBS) określono poprzez analizę komórek CD115+Ly6C- oraz CD115+Ly6Chigh. Analizę przeprowadzono poprzez bramkowanie żywych komórek. W celu porównania myszy białaczkowych i kontrolnych wykluczono komórki CD45.2+ C1498. <a href="https://cloudfront.jove.com/files/ftp_upload/54270/54270fig6large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.</a>
<img alt="Wyniki analizy organów: wątroba, płuca, śledziona w PBS, C1498; analiza komórek białaczkowych i komórek śledziony; wykresy." src="/files/ftp_upload/54270/54270fig7.jpg" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Rysunek 7"> 
Rysunek 7. Oszacowanie populacji śledziony u myszy z białaczką oraz w grupie kontrolnej. (A) Reprezentatywne fotografie powiększenia wątroby, płuc i śledziony u myszy z białaczką w porównaniu z myszami kontrolnymi. Śledziony zostały pobrane i zważone, a następnie, po rozbiciu tkanek, dokonano zliczenia splenocytów. (B) Histogram przedstawiający częstość występowania komórek białaczkowych w różnych organach po przeprowadzeniu immunostainingu na CD45.2+ komórki, a wyniki przeanalizowano przy użyciu cytometrii przepływowej. (C) Szacowanie liczby komórek B, granulocytów i monocytów śledziony po barwieniu immunocytochemicznym i bramkowaniu w analizie cytometrii przepływowej przeprowadzono w celu identyfikacji żywych komórek CD19+B220+, CD3-CD11b+Ly6G+, CD3-CD11b+Ly6C- oraz CD3-CD11b+Ly6Cwysoki komórki. Paski skali przedstawione dla płuc, śledzion i wątrób oznaczają 1 cm. n = 5–8 myszy/grupa, a dane przedstawiono na histogramach jako średnie ± SEM. *, p&lt; 0.05; **, p= 0,0033, nieparowany test t Studenta t-test porównujący myszy po wstrzyknięciu PBS oraz C1498. <a href="https://cloudfront.jove.com/files/ftp_upload/54270/54270fig7large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.</a>
<table fo:keep-together.within-page="1">
	<tbody >
		<tr >
			<td >Typ komórki</td>
			<td >Cząsteczki błonowe lub wewnątrzkomórkowe</td>
		</tr >
		<tr >
			<td ></td>
			<td ></td>
		</tr >
		<tr >
			<td >Prekursory i komórki dojrzałe</td>
			<td ></td>
		</tr >
		<tr >
			<td >komórki NK</td>
			<td >NK1.1+, pan-NK+</td>
		</tr >
		<tr >
			<td >komórki NKT</td>
			<td >NK1.1+, pan-NK+, TCR Vbeta+(8.2), CD3+</td>
		</tr >
		<tr >
			<td >limfocyty T</td>
			<td >TCR Vbeta+, CD3+, CD4+, CD8+</td>
		</tr >
		<tr >
			<td >prekursory komórek B i limfocyty B</td>
			<td >B220+, CD19+, CD21/35+</td>
		</tr >
		<tr >
			<td >prekursory granulocytowe i granulocyty</td>
			<td >Ly6G+, Mac-1+, CD11b+</td>
		</tr >
		<tr >
			<td >prekursory monocytowe i monocyty/makrofagi</td>
			<td >CD11b+, Mac-1+, Mac-3+, CD21/35+, CD115+, Ly6Chi</td>
		</tr >
		<tr >
			<td ></td>
			<td ></td>
		</tr >
		<tr >
			<td >Progenitory</td>
			<td ></td>
		</tr >
		<tr >
			<td >multipotentne progenitory</td>
			<td >CD117+ Sca-1+ CD34+ (Lin- CD150-)</td>
		</tr >
		<tr >
			<td >limfoidalnie ukierunkowane multipotentne progenitory</td>
			<td >CD117hi Sca-1hi CD127+ (Lin- )</td>
		</tr >
		<tr >
			<td >wspólne progenitory limfoidalne</td>
			<td >CD117lo Sca-1lo CD127+ (Lin- )</td>
		</tr >
		<tr >
			<td >wspólne progenitory mieloidalne</td>
			<td >CD16/32lo CD117+ CD34int (Lin- Sca-1-)</td>
		</tr >
		<tr >
			<td >progenitory granulocytowo-makrofagowe</td>
			<td >CD16/32hi CD117+ CD34hi (Lin- Sca-1-)</td>
		</tr >
		<tr >
			<td >progenitory megakariocytowo-erytroidalne</td>
			<td >CD16/32lo CD117+ CD34lo (Lin- Sca-1-)</td>
		</tr >
		<tr >
			<td ></td>
			<td ></td>
		</tr >
		<tr >
			<td >Hematopoetyczne komórki macierzyste</td>
			<td >CD117+ Sca-1+ CD150+ (Lin- CD34-)</td>
		</tr >
	</tbody >
</table>
Tabela 1. Markery linii komórek hematopoetycznych i różnicowania. 
CD: klaster różnicowania; Lin: markery dojrzałych komórek; lo: niska ekspresja; hi: wysoka ekspresja; int: ekspresja pośrednia; NK: komórki natural killer; TCR: receptor komórek T.

Ten manuskrypt zawiera procedurę techniczną, która może być użyta do scharakteryzowania hodowli komórek C1498 in vitro oraz ostrej białaczki wywołanej u myszy po ich wstrzyknięciu. Analizy fenotypowe i funkcjonalne wykonywane są za pomocą cytometrii przepływowej, mikroskopii immunofluorescencyjnej, cytochemii i barwienia Maya-Grünwalda Giemsy.

Szczegółowy protokół charakteryzujący mysią linię komórkową C1498 i związany z nią mysi model białaczki

The intravenous injection of C1498 cells into syngeneic or congenic mice has been performed since 1941. These injections result in the development of ...

Ogólnym celem niniejszej procedury jest charakterystyka mysich komórek C1498 oraz ostrej białaczki, którą wywołują one po wstrzyknięciu dożylnym u myszy. Główną zaletą tej procedury jest fakt, że mysia białaczka mielomonocytowa indukowana po wstrzyknięciu komórek C1498 wykazuje wiele cech charakterystycznych dla tej choroby u ludzi. Ten model zwierzęcy może pomóc w udzieleniu odpowiedzi na kluczowe pytania z dziedziny hematologii, takie jak mechanizmy prowadzące do rozwoju białaczki i niedoboru odporności.Znaczenie tego modelu zwierzęcego rozciąga się na leczenie białaczki, ponieważ ułatwia on testowanie nowych środków chemioterapeutycznych i immunoterapeutycznych. Należy rozpocząć od przeniesienia pięcio- lub sześciotygodniowej samicy myszy kongenicznej C57 black 6 do sterylnej komory z laminarnym przepływem powietrza. Następnie zwierzę należy umieścić w stabilizatorze.Następnie należy napełnić strzykawkę o pojemności 1 ml wyposażoną w igłę o rozmiarze 29 G 100 µL zawiesiny komórek. Chwycić ogon w jego dystalnej części i zdezynfekować skórę ogona gazą nasączoną 70% etanolem. Następnie powoli wstrzyknąć 1 × 10⁶ komórek do bocznej żyły ogonowej.Po podaniu wszystkich komórek należy wyjąć igłę i delikatnie ucisnąć miejsce wstrzyknięcia sterylną gazą. Następnie należy umieścić zwierzę z powrotem w klatce, monitorując jego stan przez kolejne kilka tygodni. Po 17–19 dniach należy wprowadzić kapilarę do kąta wewnętrznego oka znieczulonego zwierzęcia z białaczką.Z zatoki oczodołowej pobierze się od 100 do 200 µL krwi do kapilary. Należy wyjąć kapilarę i zahamować krwawienie, delikatnie przykładając do oka sterylną gazikową gąbkę. Następnie krew należy przenieść do probówki z EDTA i przechowywać ją w lodzie do momentu izolacji komórek mononuklearnych.Aby wyizolować mononuklearne komórki krwi, najpierw dodać PBS uzupełniony o 1 mM EDTA do uzyskania końcowej objętości 500 µL. Następnie przenieść próbkę do probówki do mikrocentryfugi. W dalszej kolejności, używając strzykawki o pojemności 1 ml z igłą 30G, ostrożnie nanieść 500 µL roztworu separującego pod krew, dbając o to, aby nie zmieszać warstw.Oddziel komórki poprzez wirowanie, a następnie za pomocą pipety przenieś nieprzezroczystą, białą warstwę komórek jednojądrowych do nowej probówki do mikrocentryfugi. Następnie przemyj komórki odpornościowe w 1 ml PBS. Odwiruj je i resuspenduj osad w 600 µl buforu FACS w celu przeprowadzenia barwienia oraz analizy metodą cytometrii przepływowej.Aby wyizolować szpik kostny, należy położyć mysz na plecach na plastikowej płytce i unieruchomić kończyny zwierzęcia. Zdezynfekować zwierzę 70% etanolem. Następnie należy przeciąć każdą kończynę w górnej części kości udowej powyżej stawu i delikatnie pociągnąć za kości piszczelowe, aby oddzielić je od kości udowych.Za pomocą pęsety i nożyczek usuń skórę oraz mięśnie z kości, a następnie przenieś kości do szalki Petriego umieszczonej na lodzie. Użyj nożyczek, aby usunąć kończyny. Następnie wprowadź igłę o rozmiarze 26 G połączoną z strzykawką 10 ml zawierającą 5 ml zimnego PBS do końcówki każdej z kości po kolei i wypłucz szpiki kostne do szalki.Przeciągnij zawiesinę komórkową przez końcówkę igły kilka razy, aby rozbić komórki szpiku kostnego. Następnie przefiltruj komórki przez nowy filtr 70 micron do probówki stożkowej o pojemności 50 milliliter, aby uzyskać zawiesinę pojedynczych komórek. Odwiruj komórki i ponownie zawieś osad w dwóch mililitrach buforu do lizy.Natychmiast napełnij probówkę do 50 mililitrów zimnego PBS i odwiruj komórki. Następnie resuspenduj osad szpiku kostnego w stężeniu 1×10⁶ komórek na mililitr w zimnym buforze FACS. Aby przygotować komórki szpiku kostnego do barwienia, najpierw umieśćt slajdy w jednorazowych komorach z dołączonymi kartami filtrującymi, a następnie umieść komory w cytocentry fudze.Do każdej komory karty filtracyjnej dodać 100 µL buforu FACS, a następnie krótko odwirować preparaty. Po zakończeniu wirowania dodać 100 µL komórek do każdej komory i odwirować komórki. Następnie ostrożnie wyjąć preparaty z komór w celu wysuszenia ich na powietrzu.Aby zabarwić komórki szpiku kostnego, zanurz preparaty w naczyniu Coplina zawierającym roztwór May-Grünwalda na pięć minut. Następnie przenieś preparaty do naczynia z roztworem buforowym o pH 6,8 na jedną minutę. Potem przenieś preparaty do roztworu Giemsa R na 10 minut.Następnie należy przeprowadzić 10-sekundowe płukanie wodą o neutralnym pH. Po płukaniu pozwolić preparatom wyschnąć na powietrzu, a następnie nanieść jedną kroplę medium montażowego na każdą próbkę. Następnie przyłożyć jedną krawędź szkiełka nakrywki do slajdu i ostrożnie opuścić nakrywkę na komórki, lekko dociskając, aby usunąć pęcherzyki powietrza.W porównaniu z zwierzętami kontrolnymi, zwierzęta z wstrzykniętymi komórkami C1498 wykazują masywną infiltrację szpiku kostnego przez komórki C1498, co objawia się blastopodobnym wyglądem komórek. Komórki C1498 infiltrujące szpik kostny wykazują fenotypy monocytowe i granulocytowe, wskazujące odpowiednio na komórki monoblastyczne i mieloblastyczne, charakterystyczne dla ostrej białaczki mielomonocytowej. Analiza cytometryczna częstotliwości występowania komórek mononuklearnych w próbkach krwi myszy z wstrzykniętymi komórkami C1498 wskazuje, że około jedna czwarta całej populacji białych krwinek składa się z komórek białaczkowych.Częstości limfocytów T i B są podobne u zwierząt z grupy kontrolnej oraz u zwierząt po wstrzyknięciu linii C1498. Jednakże w przypadku myszy po wstrzyknięciu C1498 obserwuje się wyższe poziomy monocytów, co jest cechą ostrej białaczki mielomonocytowej. Podczas przeprowadzania procedur cytochemicznych oraz barwienia metodą May-Grünwalda-Giemsy ważne jest pamiętanie o zachowaniu odpowiednich wartości pH, temperatur i czasów inkubacji.Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze rozumieć, jak charakteryzować ostrą białaczkę mielomonocytową. Po opracowaniu technika ta utorowała drogę badaczom z dziedziny hematologii do zbadania natury spontanicznej i indukowanej ostrej białaczki w innych modelach zwierzęcych.

a-detailed-protocol-for-characterizing-murine-c1498-cell-line-its

Research

JoVE Journal

Cancer Research

Badania nad rakiem

Opisano metodę analizy rozkładu progenitorów krwiotwórczych szpiku kostnego w cytometrii przepływowej, a także efektywnej izolacji wysoko oczyszczonych komórek macierzystych krwiotwórczych (HSCs). Procedura izolacji opiera się przede wszystkim na magnetycznym wzbogaceniu komórek c-Kit+ oraz sortowaniu komórek w celu oczyszczenia HSCs do badań komórkowych i molekularnych.

Analiza fenotypowa i izolacja mysich hematopoetycznych komórek macierzystych oraz progenitorów zadeklarowanych do określonej linii

Krążące komórki nowotworowe (CTC) są prognostyczne w kilku nowotworach przerzutowych. Ten manuskrypt opisuje złoty standard systemu CellSearch (CSS) platformy wyliczania CTC i zwraca uwagę na typowe błędy błędnej klasyfikacji. Ponadto opisano dwa dostosowane protokoły do definiowanej przez użytkownika charakterystyki markerów CTC i liczenia CTC w przedklinicznych mysich modelach przerzutów przy użyciu tej technologii.

Adaptacja półautomatycznych testów na krążące komórki nowotworowe (CTC) do zastosowań klinicznych i przedklinicznych

Kombinatoryczne oznaczanie 5 fluorescencyjnych białek hematopoetycznych komórek macierzystych i progenitorowych pozwala na śledzenie klonów in vivo za pomocą mikroskopii konfokalnej i dwufotonowej, dostarczając wglądu w architekturę hematopoetyczną szpiku kostnego podczas regeneracji. Metoda ta umożliwia nieinwazyjne mapowanie losów kodowanych spektralnie komórek pochodzących z HSPC w nienaruszonych tkankach przez długi czas po przeszczepie.<br...

In vivo (in vivo) Klonalne śledzenie hematopoetycznych komórek macierzystych i progenitorowych oznaczonych pięcioma białkami fluorescencyjnymi przy użyciu mikroskopii konfokalnej i wielofotonowej

Transfer limfocytów bm12 do biorcy C57BL/6 jest ustalonym modelem tocznia rumieniowatego układowego. Tutaj opisujemy, jak zainicjować chorobę za pomocą tego modelu i jak scharakteryzować komórki pomocnicze pęcherzyków T, komórki B centrum rozrodczego i komórki plazmatyczne za pomocą cytometrii przepływowej.

Indukowany model tocznia rumieniowatego układowego (SLE) bm12 u myszy C57BL/6

Ten manuskrypt zawiera opis metodologii użytej do ustanowienia modeli myszy transdukcyjno-transplantacyjnych. Przedstawiono szczegółowe informacje na temat błędów technicznych, których należy unikać podczas wykonywania przeszczepów szpiku kostnego. Należy uzyskać jasne zrozumienie znaczenia wysokiego miana wirusa, transfekcji/transdukcji i napromieniania.

Mysi model transdukcyjno-transplantacyjny nowotworu mieloproliferacyjnego

Tutaj opisujemy protokoły genetycznej i chemicznej walidacji c-Fos i Dusp1 jako celu terapeutycznego w białaczce, używając genetycznych i humanizowanych modeli mysich in vitro i in vivo. Metodę tę można zastosować do dowolnego celu walidacji genetycznej i rozwoju terapeutycznego.

Metody oceny roli c-fos i dusp1 w zależności onkogenu

Opisujemy metodę użycia wieloparametrowej cytometrii przepływowej do wykrywania mitochondrialnych reaktywnych form tlenu (ROS) w mysich zdrowych hematopoetycznych komórkach macierzystych i progenitorowych (HSPC) oraz komórkach białaczkowych z mysiego modelu ostrej białaczki szpikowej (AML) sterowanej przez MLL-AF9.

Analiza cytometryczna przepływowa mitochondrialnych reaktywnych form tlenu w mysich hematopoetycznych komórkach macierzystych i progenitorowych oraz białaczka napędzana przez MLL-AF9

Ten protokół opisuje izolację podwójnie ujemnych tymocytów z grasicy myszy, a następnie transdukcję retrowirusową i kohodowlę w systemie kohodowli linii komórek zrębu szpiku kostnego z ekspresją delta 4 (OP9-DL4) w celu dalszej analizy funkcjonalnej.

Współhodowla i transdukcja mysich tymocytów na komórkach zrębowych z ekspresją 4 podobną do delta w celu badania onkogenów w białaczce z komórek T

Tutaj dootrzewnowe wstrzykiwanie komórek białaczkowych jest wykorzystywane do wykrywania i rozprzestrzeniania ostrej białaczki szpikowej (AML) u myszy. Ta nowa metoda jest skuteczna w seryjnym przeszczepianiu komórek AML i może służyć jako alternatywa dla osób, które mogą doświadczać trudności i niespójności podczas wstrzykiwania dożylnego myszom.

Przeszczep dootrzewnowy w celu wywołania ostrej białaczki szpikowej u myszy

Tutaj przedstawiono szczegółowy protokół izolowania i charakteryzowania mikrośrodowiskowych populacji szpiku kostnego z mysich modeli zespołów mielodysplastycznych i ostrej białaczki szpikowej. Technika ta identyfikuje zmiany w niekrwiotwórczej niszy szpiku kostnego, w tym w komórkach śródbłonka i mezenchymalnych komórek zrębu, wraz z postępem choroby.

Identyfikacja mikrośrodowiskowych populacji szpiku kostnego w zespole mielodysplastycznym i ostrej białaczce szpikowej

Protokół ma na celu opisanie mysiego modelu generującego nawroty ostrej białaczki limfoblastycznej, oparty na dynamice odpowiedzi na chemioterapię indukcyjną.

Model myszy nawrotu białaczki do indukcyjnej chemioterapii ostrej białaczki limfoblastycznej

Poznaj szczegółowy protokół charakteryzacji mysiej linii komórkowej C1498 i związanego z nią modelu ostrej białaczki szpikowej. Metoda obejmuje cytometrię przepływową i barwienie cytochemiczne.

Szczegółowy protokół charakteryzujący mysią linię komórkową C1498 i związany z nią mysi model białaczki

Przeglądaj więcej filmów