Name: Genetyczne i biochemiczne podejścia do oceny oligomeryzacji białek in vivo i in vitro: studium przypadku receptora ryanodyny (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-07-27T14:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 43 s
Description: Poznaj metody oceny oligomeryzacji białek in vivo i in vitro na przykładzie receptora ryanodyny. Wykorzystaj test dwuhybrydowy, koimmunoprecypitację i chemiczne retikulacje do badania interakji białkowych.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Ta praca była wspierana przez British Heart Foundation Fellowships dla SZ (FS/08/063 i FS/15/30/31494).

<ol><li>Seidel, M., Lai, F. A., Zissimopoulos, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structural+and+functional+interactions+within+ryanodine+receptor%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem+Soc+Trans%22%5BJournal%5D)">Structural and functional interactions within ryanodine receptor.</a> Biochem Soc Trans. 43 (3), 377-383 (2015).</li>
<li>Zissimopoulos, S., Marsh, J., Stannard, L., Seidel, M., Lai, F. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Amino-terminus+oligomerisation+is+conserved+in+intracellular+calcium+release+channels%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem+J%22%5BJournal%5D)">Amino-terminus oligomerisation is conserved in intracellular calcium release channels.</a> Biochem J. 459 (2), 265-273 (2014).</li>
<li>Zissimopoulos, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((N-terminus+oligomerization+regulates+the+function+of+cardiac+ryanodine+receptors%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Sci%22%5BJournal%5D)">N-terminus oligomerization regulates the function of cardiac ryanodine receptors.</a> J Cell Sci. 126 (Pt 21), 5042-5051 (2013).</li>
<li>Seidel, M., Thomas, N. L., Williams, A. J., Lai, F. A., Zissimopoulos, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dantrolene+rescues+aberrant+N-terminus+inter-subunit+interactions+in+mutant+pro-arrhythmic+cardiac+ryanodine+receptors%5BTitle%5D)+AND+%22Cardiovasc+Res%22%5BJournal%5D)">Dantrolene rescues aberrant N-terminus inter-subunit interactions in mutant pro-arrhythmic cardiac ryanodine receptors.</a> Cardiovasc Res. 105 (1), 118-128 (2015).</li>
<li>Stewart, R., Zissimopoulos, S., Lai, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Oligomerization+of+the+cardiac+ryanodine+receptor+C-terminal+tail%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem+J%22%5BJournal%5D)">Oligomerization of the cardiac ryanodine receptor C-terminal tail.</a> Biochem J. 376, 795-799 (2003).</li>
<li>Deane, C. M., Salwinski, L., Xenarios, I., Eisenberg, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protein+interactions%3A+two+methods+for+assessment+of+the+reliability+of+high+throughput+observations%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell+Proteomics%22%5BJournal%5D)">Protein interactions: two methods for assessment of the reliability of high throughput observations.</a> Mol Cell Proteomics. 1 (5), 349-356 (2002).</li>
<li>Fashena, S. J., Serebriiskii, I., Golemis, E. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+continued+evolution+of+two-hybrid+screening+approaches+in+yeast%3A+how+to+outwit+different+preys+with+different+baits%5BTitle%5D)+AND+%22Gene%22%5BJournal%5D)">The continued evolution of two-hybrid screening approaches in yeast: how to outwit different preys with different baits.</a> Gene. 250 (1-2), 1-14 (2000).</li>
<li>Stynen, B., Tournu, H., Tavernier, J., Van Dijck, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Diversity+in+genetic+in+vivo+methods+for+protein-protein+interaction+studies%3A+from+the+yeast+two-hybrid+system+to+the+mammalian+split-luciferase+system%5BTitle%5D)+AND+%22Microbiol+Mol+Biol+Rev%22%5BJournal%5D)">Diversity in genetic in vivo methods for protein-protein interaction studies: from the yeast two-hybrid system to the mammalian split-luciferase system.</a> Microbiol Mol Biol Rev. 76 (2), 331-382 (2012).</li>
<li>Yang, M., Wu, Z., Fields, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protein-peptide+interactions+analyzed+with+the+yeast+two-hybrid+system%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">Protein-peptide interactions analyzed with the yeast two-hybrid system.</a> Nucleic Acids Res. 23 (7), 1152-1156 (1995).</li>
<li>Elion, E. A. Chapter 8, Detection of protein-protein interactions by coprecipitation. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aElion%2C+EA+%22Curr+Protoc+Immunol%22">Curr Protoc Immunol</a>. , (2007).</li>
<li>Kingston, R. E., Chen, C. A., Rose, J. K. Chapter 9, Calcium phosphate transfection. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aKingston%2C+RE+%22Curr+Protoc+Mol+Biol%22">Curr Protoc Mol Biol</a>. , (2003).</li>
<li>Lam, A. K., Galione, A., Lai, F. A., Zissimopoulos, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hax-1+identified+as+a+two-pore+channel+%28TPC%29-binding+protein%5BTitle%5D)+AND+%22FEBS+letters%22%5BJournal%5D)">Hax-1 identified as a two-pore channel (TPC)-binding protein.</a> FEBS letters. , (2013).</li>
<li>Zissimopoulos, S., Lai, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interaction+of+FKBP12.6+with+the+cardiac+ryanodine+receptor+C-terminal+domain%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Interaction of FKBP12.6 with the cardiac ryanodine receptor C-terminal domain.</a> J Biol Chem. 280, 5475-5485 (2005).</li>
<li>Zissimopoulos, S., Thomas, N. L., Jamaluddin, W. W., Lai, F. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((FKBP12.6+binding+of+ryanodine+receptors+carrying+mutations+associated+with+arrhythmogenic+cardiac+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem+J%22%5BJournal%5D)">FKBP12.6 binding of ryanodine receptors carrying mutations associated with arrhythmogenic cardiac disease.</a> Biochem J. 419 (2), 273-278 (2009).</li>
<li>Jordan, M., Wurm, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transfection+of+adherent+and+suspended+cells+by+calcium+phosphate%5BTitle%5D)+AND+%22Methods%22%5BJournal%5D)">Transfection of adherent and suspended cells by calcium phosphate.</a> Methods. 33 (2), 136-143 (2004).</li>
<li>Kaboord, B., Perr, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+of+proteins+and+protein+complexes+by+immunoprecipitation%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Isolation of proteins and protein complexes by immunoprecipitation.</a> Methods Mol Biol. 424, 349-364 (2008).</li>
<li>Sambrook, J., Fritsch, E. F., Maniatis, T. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aSambrook%2C+J+%22Molecular+cloning%3A+a+laboratory+manual%22">Molecular cloning: a laboratory manual</a>. , 2nd, Cold Spring Harbor Laboratory Press. (1989).</li>
<li>Yang, W., Steen, H., Freeman, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Proteomic+approaches+to+the+analysis+of+multiprotein+signaling+complexes%5BTitle%5D)+AND+%22Proteomics%22%5BJournal%5D)">Proteomic approaches to the analysis of multiprotein signaling complexes.</a> Proteomics. 8 (4), 832-851 (2008).</li>
<li>Migneault, I., Dartiguenave, C., Bertrand, M. J., Waldron, K. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Glutaraldehyde%3A+behavior+in+aqueous+solution%2C+reaction+with+proteins%2C+and+application+to+enzyme+crosslinking%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechniques%22%5BJournal%5D)">Glutaraldehyde: behavior in aqueous solution, reaction with proteins, and application to enzyme crosslinking.</a> Biotechniques. 37 (5), 790-796 (2004).</li>
<li>Wine, Y., Cohen-Hadar, N., Freeman, A., Frolow, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Elucidation+of+the+mechanism+and+end+products+of+glutaraldehyde+crosslinking+reaction+by+X-ray+structure+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechnol+Bioeng%22%5BJournal%5D)">Elucidation of the mechanism and end products of glutaraldehyde crosslinking reaction by X-ray structure analysis.</a> Biotechnol Bioeng. 98 (3), 711-718 (2007).</li>
<li>Zissimopoulos, S., Lai, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Central+domain+of+the+human+cardiac+muscle+ryanodine+receptor+does+not+mediate+interaction+with+FKBP12.6%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Biochem+Biophys%22%5BJournal%5D)">Central domain of the human cardiac muscle ryanodine receptor does not mediate interaction with FKBP12.6.</a> Cell Biochem Biophys. 43, 203-220 (2005).</li>
<li>Zissimopoulos, S., West, D., Williams, A., Lai, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ryanodine+receptor+interaction+with+the+SNARE-associated+protein+snapin%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Sci%22%5BJournal%5D)">Ryanodine receptor interaction with the SNARE-associated protein snapin.</a> J Cell Sci. 119, 2386-2397 (2006).</li>
<li>Zissimopoulos, S., Docrat, N., Lai, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Redox+sensitivity+of+the+ryanodine+receptor+interaction+with+FK506-binding+protein%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Redox sensitivity of the ryanodine receptor interaction with FK506-binding protein.</a> J Biol Chem. 282, 6976-6983 (2007).</li>
<li>Zissimopoulos, S., Seifan, S., Maxwell, C., Williams, A. J., Lai, F. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Disparities+in+the+association+of+the+ryanodine+receptor+and+the+FK506-binding+proteins+in+mammalian+heart%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Sci.+125%22%5BJournal%5D)">Disparities in the association of the ryanodine receptor and the FK506-binding proteins in mammalian heart.</a> J Cell Sci. 125. 125 (Pt 7), 1759-1769 (2012).</li>
<li>Ali, M. H., Imperiali, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protein+oligomerization%3A+how+and+why%5BTitle%5D)+AND+%22Bioorg+Med+Chem%22%5BJournal%5D)">Protein oligomerization: how and why.</a> Bioorg Med Chem. 13 (17), 5013-5020 (2005).</li>
<li>Hashimoto, K., Panchenko, A. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanisms+of+protein+oligomerization%2C+the+critical+role+of+insertions+and+deletions+in+maintaining+different+oligomeric+states%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Mechanisms of protein oligomerization, the critical role of insertions and deletions in maintaining different oligomeric states.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 107 (47), 20352-20357 (2010).</li>
<li>Haass, C., Selkoe, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Soluble+protein+oligomers+in+neurodegeneration%3A+lessons+from+the+Alzheimer%27s+amyloid+beta-peptide%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Mol+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Soluble protein oligomers in neurodegeneration: lessons from the Alzheimer's amyloid beta-peptide.</a> Nat Rev Mol Cell Biol. 8 (2), 101-112 (2007).</li>
<li>Chi, E. Y., Krishnan, S., Randolph, T. W., Carpenter, J. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Physical+stability+of+proteins+in+aqueous+solution%3A+mechanism+and+driving+forces+in+nonnative+protein+aggregation%5BTitle%5D)+AND+%22Pharm+Res%22%5BJournal%5D)">Physical stability of proteins in aqueous solution: mechanism and driving forces in nonnative protein aggregation.</a> Pharm Res. 20 (9), 1325-1336 (2003).</li>
<li>Gell, D. A., Grant, R. P., Mackay, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+detection+and+quantitation+of+protein+oligomerization%5BTitle%5D)+AND+%22Adv+Exp+Med+Biol%22%5BJournal%5D)">The detection and quantitation of protein oligomerization.</a> Adv Exp Med Biol. 747, 19-41 (2012).</li>
<li>Kaczor, A. A., Selent, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Oligomerization+of+G+protein-coupled+receptors%3A+biochemical+and+biophysical+methods%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Med+Chem%22%5BJournal%5D)">Oligomerization of G protein-coupled receptors: biochemical and biophysical methods.</a> Curr Med Chem. 18 (30), 4606-4634 (2011).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do zadeklarowania.

Powstawanie białkowych homooligomerów jest podstawowym procesem biologicznym, który reguluje aktywność czynników transkrypcyjnych, enzymów, kanałów jonowych i receptorów25,26. Co ważne, oligomeryzacja białek ma również patologiczne implikacje, w tym neurodegenerację i arytmogenną chorobę serca4,27. Metodologie przedstawione w tym artykule służą do identyfikacji interakcji domena-domena, pośredniczących w samoasocjacji białek i oligomeryzacji. Poniżej wskazujemy krytyczne kroki w ramach każdego protokołu i omawiamy ważne kwestie, ograniczenia i rozwiązywanie problemów.
System Y2H może być stosowany w pierwszej kolejności do badań przesiewowych pod kątem potencjalnych oddziałujących partnerów białkowych ze względu na stosunkowo wysoką przepustowość badań przesiewowych, łatwość użycia i wysoce powtarzalne wyniki. Procedury Y2H przeprowadza się w laboratorium mikrobiologicznym ze standardowymi inkubatorami (płytkowymi lub wytrząsarkami) i urządzeniami do przechowywania pomieszczeń. Wykorzystanie świeżo przygotowanych kompetentnych komórek (krok 1.1.8) ma kluczowe znaczenie dla wysokowydajnej transformacji drożdży, natomiast w celu uzyskania najlepszych wyników w testach β-Gal należy użyć świeżo wyhodowanych kolonii drożdży (w wieku do 5 dni) (krok 1.2.3). Dostępne są systemy oparte na czynnikach transkrypcyjnych innych niż GAL4 i/lub dodatkowe/alternatywne geny reporterowe, dlatego plazmidy przynęty i ofiary powinny być dopasowane do odpowiedniego szczepu Y2H.
Niektóre szczepy powinny być hodowane w obecności 3-amino-1,2,4-triazolu, konkurencyjnego inhibitora białka HIS3, w celu wygaszenia jakiejkolwiek konstytutywnej ekspresji genu reporterowego HIS3 7,8. Ekspresja przynęty i docelowych białek fuzyjnych powinna być weryfikowana za pomocą immunoblottingu17. W przypadku, gdy białka fuzyjne przynęty i ofiary są toksyczne dla drożdży, niższe tolerowane poziomy białka można osiągnąć poprzez klonowanie w różnych wektorach, w których ekspresja przynęty/ofiary jest napędzana przez inny promotor. Ponadto konieczne jest zapewnienie, że białka fuzyjne przynęty i ofiary nie wykazują autonomicznej aktywności genu reporterowego. Autonomiczną aktywację genu reporterowego można uratować poprzez modyfikację konstruktu w celu usunięcia odpowiedzialnego regionu lub poprzez zamianę fuzji GAL4 DNA-BD i AD na dwa badane białka. Co więcej, domeny transbłonowe lepiej pominąć w konstruktach przynęty / ofiary, ponieważ mogą one indukować nieprawidłowe fałdowanie lub błędną lokalizację białek fuzyjnych w wewnątrzkomórkowych przedziałach błonowych. Rzeczywiście, główną wadą systemu Y2H jest to, że przynęta i białka docelowe są zlokalizowane w jądrze drożdży z dala od ich fizjologicznej lokalizacji subkomórkowej i potencjalnie pozbawione specyficznych modyfikacji potranslacyjnych, co skutkuje fałszywie dodatnimi lub fałszywie ujemnymi interakcjami6-9.
Heterologiczne systemy ekspresji ssaków lepiej nadają się do badania integralnych białek błonowych ssaków pod względem konformacji, modyfikacji potranslacyjnych i lokalizacji subkomórkowej. Jedną z najczęściej stosowanych metod transfekcji komórek jest wytrącanie fosforanu wapnia, głównie ze względu na minimalną wymaganą ilość sprzętu i odczynników11,15. Metody alternatywne, a mianowicie elektroporacja, liposomy, lipidy kationowe i polimery, mogą zapewnić wyższą wydajność transfekcji w zależności od użytej linii komórkowej i konstrukcji. Ogólnie rzecz biorąc, głównymi czynnikami wpływającymi na skuteczność transfekcji są jakość plazmidowego DNA oraz zdrowie/żywotność komórek. Najlepsze wyniki osiąga się, gdy wykorzystuje się plazmidowe DNA o najwyższej czystości (współczynnik absorbancji 260nm/280nm ~1,8) oraz aktywnie dzielące się komórki. Komórki powinny być zatem transfekowane przy nie więcej niż 60 - 70% zbiegu (krok 2.1.2), ponieważ zdolność do wchłaniania obcego DNA jest związana z powierzchnią komórki wystawionej na działanie pożywki11. Ponadto nie zaleca się włączania antybiotyków do pożywki hodowlanej podczas transfekcji (etap 2.1.3) ze względu na zwiększoną śmierć komórek15.
W szczególności w przypadku wytrącania fosforanu wapnia, staranne przygotowanie i dostosowanie pH (dokładnie do 7,05) roztworu 2x HBS (krok 2.1.1) oraz prawidłowe tworzenie kompleksów plazmidowego DNA/wapń/fosforan poprzez energiczne mieszanie (krok 2.1.5) są krytycznymi etapami dla wysokiej wydajności transfekcji. Zazwyczaj ekspresja białka przez przejściową transfekcję osiąga szczyt w ciągu 24 - 72 godzin.
Po pobraniu komórek należy przeprowadzić kolejne zabiegi w temperaturze 4°C, aby zminimalizować aktywność proteazy, i zaleca się dodanie inhibitorów proteazy. Po homogenizacji komórek powinien nastąpić etap wirowania w celu usunięcia jąder, ponieważ chromosomalne DNA może zwiększać lepkość roztworu i wzmacniać niespecyficzne wiązanie. Dlatego preferowana jest homogenizacja środkami mechanicznymi w buforze izoosmotycznym, zwykle w (0,3 M) sacharozie lub (150 mM) NaCl. Ogólnie rzecz biorąc, na bazie sacharozy są znane z tego, że zwiększają stabilność białka i zmniejszają potencjalną agregację białek nienatywnych, ale ze względu na preferencyjne uwodnienie na powierzchni białka faworyzowane są elektrostatyczne interakcje białko-białko. I odwrotnie, na bazie soli wpływają na ładunek netto naładowanych grup bocznych aminokwasów na powierzchni białka, mając w ten sposób skłonność do bardziej hydrofobowych interakcji28.
Co-IP jest najczęściej stosowanym testem biochemicznym do oceny interakcji białko-białko, zwłaszcza z tkanki natywnej. Jego główną wadą jest wymóg wysoce specyficznych przeciwciał zwalidowanych do stosowania w IP i immunoblottingu10,16,18. W związku z tym rekombinowane białka są często znakowane epitopem peptydowym, np. hemaglutyniną grypy (YPYDVPDYA) lub ludzkim cMyc (EQKLISEEDL), dla których na rynku dostępne są przeciwciała specyficzne dla wysokiego powinowactwa. W razie potrzeby przeciwciało immunoprecypitujące może być chemicznie sprzężone z żywicą Protein-A, aby uniknąć jego elucji i wykrycia na etapie immunoblottingu, który może zasłaniać współwytrącone białko16; Aby to osiągnąć, z powodzeniem zastosowaliśmy chemiczny środek sieciujący 3,3'-dithiobis (sulfosuccinimidylpropionian)24. Konieczne jest, aby odpowiedni detergent był zawarty w buforze IP, a nierozpuszczalny materiał homogenizowanych komórek został usunięty przez odwirowanie w celu zminimalizowania niespecyficznego wiązania (krok 3.1.3). Wybór i stężenie detergentu są ważnymi czynnikami: silniejsze detergenty i/lub wyższe stężenia znacznie zmniejszą niespecyficzne wiązanie, ale mogą również znieść interakcję białka X:Y, podczas gdy niższe stężenia lub łagodniejsze detergenty mogą pozwolić na zaobserwowanie słabej interakcji, ale mogą skutkować nadmiernym niespecyficznym wiązaniem. Preferowane są detergenty o średniej mocy, np. Triton X-100 o stężeniu 0,5 - 1%. Aby jeszcze bardziej zmniejszyć niespecyficzne wiązanie, do buforu IP można włączyć neutralne białko (np . albuminę surowicy bydlęcej w stężeniu 100 μg/ml) i/lub lizat komórkowy można wstępnie oczyścić po uprzedniej inkubacji z samą żywicą Protein-A. Liczba prań powinna być zoptymalizowana dla testowanej pary X:Y, zazwyczaj trzy 10-minutowe mycia z buforem IP (krok 3.1.9). W każdym przypadku próbka co-IP z nieimmunologiczną IgG jako przeciwciałem immunoprecypitującym powinna być zawsze przetwarzana równolegle, aby służyła jako kontrola ujemna (etap 3.1.6).
Główną zaletą sieciowania chemicznego jest to, że informuje o składzie stechiometrycznym homo-oligomeru białka. Aldehyd glutarowy jest powszechnie stosowanym środkiem sieciującym, ponieważ nie wymaga specjalistycznego sprzętu i generuje stabilne termicznie i chemicznie wiązania krzyżowe między oddziałującymi białkami19,20. Związki z wolnymi grupami aminowymi należy pominąć w testowych (krok 3.2.1), ponieważ będą one wygaszać reakcję chemiczną. Stężenie aldehydu glutarowego i czas reakcji (krok 3.2.4) powinny być zoptymalizowane dla interesującego nas oligomerycznego kompleksu białkowego. Główną wadą tej techniki, zwłaszcza gdy jest wykonywana na preparatach z całych komórek, jest niespecyficzność reakcji chemicznej, która może prowadzić do powstania sztucznych agregatów białkowych, które nie mają znaczenia biologicznego.
Dostępne są alternatywne techniki in vivo (np. transfer energii rezonansu fluorescencyjnego, fluorescencja dwucząsteczkowa lub komplementacja luminescencji) oraz techniki in vitro (np. chromatografia wykluczania wielkości, ultrawirowanie analityczne, kalorymetria miareczkowa izotermiczna) do charakterystyki samoasocjacji białek i oceny stechiometrii oligomeryzacji 29,30. Każda metoda ma swoje zalety i wady i może być bardziej odpowiednia do badania określonego białka w zależności od oczyszczania/stabilności białka i dostępności sprzętu/odczynników. Trzy komplementarne metody opisane tutaj szczegółowo, a mianowicie Y2H, co-IP i sieciowanie, zostały wykorzystane w połączeniu, aby dostarczyć przekonujących dowodów na tworzenie się homo-oligomerów RyR2 w izolacji i w żywej komórce.

Skurcz mięśnia szkieletowego i mięśnia sercowego jest wywoływany przez uwalnianie Ca2+ w retikulum sarkoplazmatycznym za pośrednictwem RyR. Istnieją trzy ssacze izoformy RyR z kanałem funkcjonalnym złożonym z czterech identycznych podjednostek. Każda podjednostka RyR składa się z dużej cytoplazmatycznej regulatorowej części N-końcowej i małej C-końcowej części zawierającej domeny transbłonowe, które tworzą pory Ca2+ o wysokiej przewodności. Nieprawidłowe interakcje wewnątrz i między podjednostkami leżą u podstaw dysfunkcji kanału RyR i skutkują zaburzeniami nerwowo-mięśniowymi i sercowymi1. Identyfikacja i charakterystyka konkretnych domen zaangażowanych w zależność struktura-funkcja RyR jest zatem kluczowa dla zrozumienia patofizjologii RyR.
Tradycyjne techniki biochemicznej interakcji białko-białko wymagają znacznych ilości oczyszczonego białka, często wytwarzanego przez bakterie. Nie jest to możliwe w przypadku RyR, bardzo dużego białka błonowego złożonego z ~5000 aminokwasów, podczas gdy jego rekombinowane fragmenty nie są łatwo podatne na ekspresję i oczyszczanie bakteryjne. W związku z tym alternatywne systemy ekspresji obejmujące eukariotyczne komórki gospodarza są wymagane dla integralnych białek błonowych ssaków. Wcześniej zastosowaliśmy testy Y2H, co-IP i sieciowania, aby wspólnie wykazać, że tetrameryzacja N-końca jest cechą strukturalną, która jest zachowana w trzech izoformach RyR ssaków2,3. Co ważne, odkryliśmy, że pojedyncza mutacja punktowa związana z arytmogenną chorobą serca zaburza samoasocjację N-końca i skutkuje dysfunkcyjnym kanałem RyR4. Zastosowaliśmy również te techniki do badań oligomeryzacji cytoplazmatycznego C-końcowego ogona5 RyR, a także N-końca homologicznego wewnątrzkomórkowego kanału uwalniania Ca2 +, receptora trifosforanu inozytolu 1,4,5 2.
W teście Y2H, interakcja między dwoma białkami (X i Y) jest mierzona przez rekonstytucję funkcjonalnego czynnika transkrypcyjnego (GAL4) i wynikającą z tego aktywację genów reporterowych6-9. Dwa różne wektory klonowania są używane do generowania fuzji dwóch badanych białek z dwiema fizycznie rozdzielnymi, niezależnymi domenami GAL4: domeną wiążącą DNA (DNA-BD)/fuzją białka X (przynęta) i domeną aktywacji (AD)/fuzją białka Y (cel). Y2H można wykorzystać do sprawdzenia, czy białko oddziałuje ze sobą, generując fuzje GAL4 DNA-BD i AD tego samego białka. Genetycznie modyfikowane szczepy Y2H mają niedobór GAL4 i GAL80 (białko GAL80 jest represorem GAL4), a także niedobory TRP1 i LEU2 (w celu zapewnienia selekcji żywieniowej odpowiednio plazmidów przynęty i ofiary). W jądrze drożdży rekombinowane peptydy DNA-BD i AD są zbliżane do siebie fizycznie, aby wytworzyć hybrydowy czynnik transkrypcyjny GAL4 tylko poprzez interakcję X:Y ich fuzji. Podejście to umożliwia szybkie genetyczne badania przesiewowe w celu wykrycia interakcji białko-białko poprzez równoległą transkrypcyjną aktywację genów reporterowych prototroficznych (HIS3 kodujących enzym niezbędny do biosyntezy histydyny) i chromogennych (kodowanie LacZ dla β-galaktozydazy (β-Gal)) genów. Główną zaletą Y2H jest to, że jest to test in vivo, który wykrywa nawet słabe lub przejściowe interakcje białko-białko. Co więcej, wykrywanie polega na prostym zastosowaniu selekcji wzrostu (w pożywce pozbawionej histydyny) lub testu kolorymetrycznego (β-Gal) bez konieczności oczyszczania przynęty i białek docelowych lub wytwarzania specyficznych przeciwciał. Dodatkowo, Y2H może być wykorzystany do badania przesiewowego kolekcji losowych nieznanych klonów (klony biblioteki cDNA połączone z GAL4 AD) pod kątem nowych partnerów wiążących białko przynęty, dając również bezpośredni dostęp do cDNA białka bibliotecznego.
Aby rozszerzyć obserwacje Y2H, można zastosować niezależne techniki biochemiczne. Testy Co-IP i sieciowania w połączeniu z immunoblottingiem to metody stosowane do wykrywania asocjacji białek w złożonych mieszaninach próbek, np. lizatach całych komórek10. Ich główną zaletą jest to, że informują o interakcjach białko-białko z tkanki natywnej, w przeciwieństwie do innych metod, które wymagają użycia białek rekombinowanych. Można również stosować białka rekombinowane, zwykle ulegające ekspresji w linii komórkowej ssaków, gdzie prawdopodobnie mają prawidłową konformację i modyfikacje potranslacyjne, a także lokalizację subkomórkową. Ponieważ jednak co-IP i sieciowanie są testami in vitro wykorzystującymi homogenizowane komórki, konieczne jest potwierdzenie, czy dwaj partnerzy białkowi są kolokalizowani w nienaruszonej komórce11. Rutynowo stosujemy transfekcję komórek HEK293 ssaków do przejściowej ekspresji integralnej błony i białek cytozolowych ssaków przy użyciu metody wytrącania fosforanu wapnia2-4,12-14, opisanej tutaj szczegółowo. Jest to niedrogi sposób na efektywne dostarczenie plazmidowego DNA do komórek, ale zależy to od konkretnej użytej linii komórkowej i zbiegania komórek, a także czystości plazmidowego DNA11,15.
Test co-IP polega na izolacji natywnego lub rekombinowanego białka będącego przedmiotem zainteresowania z lizatów komórkowych w warunkach niedenaturujących, umożliwiając ko-oczyszczanie domniemanych partnerów interakcji10,16. Wymaga użycia dwóch niezależnych przeciwciał, przeciwciała immunoprecypitującego do izolacji białka X i przeciwciała immunoblottingowego do wykrywania partnera białkowego Y. Można go użyć do sprawdzenia, czy białko oddziałuje ze sobą, generując dwie różne fuzje z dwoma różnymi znacznikami epitopów (np. HA i cMyc). Przeciwciało immunoprecypitujące jest wiązane przez region Fc na białku-A (lub białku-G, w zależności od gatunku zwierzęcia, w którym przeciwciało zostało wyhodowane), które jest sprzężone z żywicą agarozy (lub sefalozy). Białko X jest wytrącane przez żywicę przeciwciała: białka-A po inkubacji z lizatem komórkowym, a mianowicie rozpuszczalną w detergentach frakcją homogenizowanych komórek. Immunokompleksy białkowe są eluowane buforem zawierającym SDS, a następnie analizowane za pomocą SDS-PAGE i immunoblottingu przy użyciu przeciwciała w celu wykrycia obecności białka Y17. Co-IP należy przeprowadzać z białkami rozpuszczalnymi w detergentach, aby uniknąć nadmiernego niespecyficznego wiązania. Wybór detergentu i jego stężenie, a także ilość prań powinny być zoptymalizowane dla każdej pary X:Y10,16,18.
Sieciowanie jest wykorzystywane do określenia stechiometrii oligomerycznego kompleksu białkowego. Opiera się na reakcji chemicznej mającej na celu wytworzenie wiązań kowalencyjnych między sąsiednimi oddziałującymi protomerami, a zatem umożliwia zachowanie oligomerycznego statusu białka podczas separacji SDS-PAGE. Istnieje wiele odczynników sieciujących o różnej długości i składzie chemicznym, które są ukierunkowane na różne grupy reaktywne na białkach, zazwyczaj aminy pierwszorzędowe, grupy karboksylowe lub tiolowe. Tutaj opisujemy zastosowanie aldehydu glutarowego (OHC(CH2)3CHO), homo-bi-funkcjonalnego środka sieciującego z dwiema grupami aldehydowymi na obu końcach, które reagują z wolnymi grupami aminowymi obecnymi w resztach lizyny19,20. Sieciowanie odbywa się w sposób zależny od stężenia lub czasu, co prowadzi do powstania adduktu. Reakcja aldehydu glutarowego jest zatrzymywana za pomocą hydrazyny (H2NNH2), a próbki białek są następnie analizowane za pomocą SDS-PAGE i immunoblottingu17 w celu oceny ich stanu oligomeryzacji. Powinniśmy zauważyć, że sieciowanie nie indukuje oligomeryzacji, a jedynie tworzy stabilne mosty między wcześniej istniejącymi kompleksami białkowymi. Ważnymi kwestiami przy przeprowadzaniu eksperymentów sieciowania są wybór środka sieciującego, jego stężenie i czas reakcji19,20.

<table><tbody><tr><td>PART 1 drożdżowy dwuhybrydowy</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Inkubator płytkowy</td><td>Hereaus</td><td>B6120</td><td>Używany w temperaturze 30 &; C</td></tr><tr><td>Inkubator z wytrząsarką orbitalną</td><td>New Brunswick Scientific</td><td>INNOVA 4300</td><td>Używany przy 30 & stopni; C z wytrząsaniem przy 230 - 250 obr./min</td></tr><tr><td>Spektrofotometr</td><td>Perkin Elmer</td><td>Lambda Bio+</td><td>Do pomiaru OD600 kultury drożdży; do pomiaru absorbancji przy 420 nm w cieczy test b-Gal</td></tr><tr><td>Matchmaker Two-Hybrid System 2 Kit</td><td>Takara Clontech</td><td>K1604-1</td><td>Zawiera wektor przynęty pGBKT7, wektor ofiary pACT2&nbsp; i szczep drożdży Y190&nbsp;</td></tr><tr><td>Drożdżowa baza azotowa</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Y0626</td><td>Do przygotowania minimalnej ilości SD growh podłoża&nbsp;</td></tr><tr><td>Suplement na rurkę bez leucyny i tryptofanu</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Y0750</td><td>Aby przygotować minimalną ilość SD growh medium&nbsp;</td></tr><tr><td>Suplement dropout bez leucyny, tryptofanu, histydyny</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Y2001</td><td>Aby przygotować minimalną pożywkę do uprawy SD&nbsp;</td></tr><tr><td>DNA nosiciela jąder śledzia&nbsp;</td><td>Takara Clontech</td><td>630440</td><td>Do przemiany drożdży</td></tr><tr><td>Bibuła filtracyjna Whatman Klasa 5&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>WHA1005070</td><td>do stosowania w teście b-Gal bibuły filtracyjnej z pgłębieniem kolonii</td></tr><tr><td>X-Gal (5-bromo-4-chloro-3-indolyl-&beta;-D-galaktopiranozyd)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>B4252</td><td>do stosowania w teście b-Gal z bibuły filtracyjnej typu colony-lift</td></tr><tr><td>ONPG (o-nitrofenylo-&beta;-D-galaktopiranozyd)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>N1127</td><td>do stosowania w płynnym teście</td></tr> <tr><td>b-Gal<silny>CZĘŚĆ 2. Ekspresja białek w linii komórkowej ssaków</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>HEK293</td><td>linii</td> komórkowej <td>ATCC ATCC&reg; &nbsp; CRL-1573 i handel;</td><td></td></tr><tr><td>Nawilżany inkubator (5% CO2, 37 &deg; C)</td> <td>SANYO</td><td>MCO-18AIC</td><td>Do hodowli komórek ssaków</td></tr><tr><td>DMEM (zmodyfikowana pożywka Dulbecco's Eagle's Medium)</td> <td>Invitrogen (ThermoFisher)</td> <td>41966</td><td>Do przygotowania pożywki wzrostowej dla komórek ssaków</td></tr><tr><td>Płodowa surowica bydlęca</td><td>Invitrogen (ThermoFisher)</td><td>10500</td><td>Do przygotowania pożywki wzrostowej dla komórek ssaków</td></tr><tr><td>Koraliki szklane</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G8772</td><td>Do homogenizacji komórek</td></tr><tr><td>Igła 23 G (0,6 x 30 mm)</td><td>BD Microlance</td><td>300700</td><td>Do homogenizacji komórek</td></tr><tr><td>Koktajl inhibitorów proteazy (kompletny)&nbsp;</td><td>Roche</td><td>11873508001</td><td>Aby zapobiec proteolizie</td></tr><tr><td>CZĘŚĆ 3. Metody biochemiczne in vitro&nbsp; </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Mini-PROTEAN Tetra Cell (system SDS-PAGE)</td><td>Bio-Rad</td><td>1658000EDU&nbsp;</td><td>Do elektroforezy w żelu poliakrylamidowym</td></tr><tr><td>Trans-Blot SD (Semi-dry transfer system)</td><td>Bio-Rad</td><td>1703940</td><td>Do transferu elektroforetycznego</td></tr><tr><td>Kompaktowy procesor filmów rentgenowskich</td><td>Xograph</td><td>X4</td><td>Do stosowania w immunoblottingu</td></tr><tr><td>Aldehyd glutarowy</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G5882</td><td>Do stosowania w chemicznym sieciowaniu</td></tr><tr><td>kulek sefarozy Protein-A&nbsp;</td><td>GE Healthcare Nauki Przyrodnicze</td><td>17-5280-01&nbsp;</td><td>Do stosowania w teście co-IP</td></tr><tr><td>Anti-HA (Y-11 poliklonalne IgG królika)</td><td>Santa Cruz Biotechnology</td><td>sc-805</td><td>Do stosowania w teście co-IP</td></tr><tr><td>Nieimmunologiczne królicze IgG</td><td>Santa Cruz Biotechnology&nbsp;</td><td>sc-2027</td><td>Do stosowania w teście co-IP</td></tr><tr><td>Anti-cMyc (9E10 mysia monoklonalna IgG)</td> <td>Santa Cruz Biotechnology&nbsp;</td><td>sc-40</td><td>Do stosowania w immunoblottingu</td></tr><tr><td>Anty-HA (16B12 mysi monoklonalny IgG)</td><td>Covance</td><td>MMS-101P</td><td>Do stosowania w immunoblottingu</td></tr><tr><td>Anty-mysie IgG-HRP</td><td>Santa Cruz Biotechnology</td><td>sc-2005</td><td>Do stosowania w immunoblottingu</td></tr><tr><td>Hyperfilm ECL</td><td>GE Healthcare Life Sciences</td><td>28906836</td><td>Do stosowania w immunoblottingu</td></tr><tr><td>ECL Western Blotting Substrate</td><td>Pierce ( ThermoFisher)</td><td>32106</td><td>Do stosowania w immunoblottingu</td></tr></tbody></table>

genetyczne i biochemiczne podejścia do oceny oligomeryzacji białek in vivo i in vitro: studium przypadku receptora ryanodyny

Genetic and Biochemical Approaches for In Vivo and In Vitro Assessment of Protein Oligomerization: The Ryanodine Receptor Case Study

Oligomeryzacja jest często wymogiem strukturalnym dla białek, aby spełniały swoje specyficzne funkcje komórkowe. Na przykład tetrameryzacja receptora ryanodine (RyR) jest niezbędna do wytworzenia funkcjonalnego pora kanału uwalniającego Ca2+. W tym miejscu opisujemy szczegółowe protokoły oceny samoasocjacji białek, w tym drożdże dwuhybrydowe (Y2H), koimmunoprecypitacyjne (co-IP) i chemiczne testy sieciowania. W układzie Y2H samooddziaływanie białek jest wykrywane za pomocą testu β-galaktozydazy w drożdżach wykazujących współekspresję przynęty GAL4 i docelowych fuzjach badanego białka. Samointerakcja białek jest dalej oceniana za pomocą co-IP przy użyciu znakowanych HA i cMyc fuzji badanego białka ulegającego koekspresji w komórkach HEK293 ssaków. Precyzyjna stechiometria homo-oligomeru białka jest badana za pomocą sieciowania i analizy SDS-PAGE po ekspresji w komórkach HEK293. Korzystając z tych różnych, ale uzupełniających się technik, konsekwentnie obserwowaliśmy samoasocjację N-końcowej domeny RyR i wykazaliśmy jej wewnętrzną zdolność do tworzenia tetramerów. Metody te mogą być stosowane do badań interakcji białko-białko i homooligomeryzacji innych integralnych białek błonowych ssaków.

W systemie Y2H interakcję przynęta:ofiara (bait:prey) testuje się początkowo poprzez selekcję wzrostu drożdży na pożywce pozbawionej (tryptofanu, leucyny i) histydyny, a następnie ocenia za pomocą testów aktywności enzymatycznej β-Gal (Rysunek 1). Drożdże hodowane na pożywce pozbawionej histydyny wykazują powolne tempo wzrostu, które zależy od siły interakcji białkowej przynęta:ofiara. Test β-Gal przeprowadza się na drożdżach (hodowanych na pożywce pozbawionej jedynie tryptofanu i leucyny) rosnących albo na podłożu stałym (płytki agarowe), albo w kulturze płynnej, przy czym ta druga pozwala na uzyskanie wyników ilościowych. Z powodzeniem wykorzystaliśmy system Y2H do identyfikacji interakcji domena-domena w obrębie RyR2, a także nowych partnerów białkowych2-4,12,21,22. Na przykład, przesiewowo przebadaliśmy serię nakładających się konstruktów obejmujących całą długość sekwencji peptydowej RyR2 pod kątem interakcji z fragmentem N-końcowym (AD4L: reszty 1 - 906 RyR2 połączone z GAL4 AD)3. Testy β-Gal z użyciem papieru filtracyjnego (colony-lift) dały intensywnie niebieskie kolonie drożdży tylko dla pary BT4L:AD4L (Rysunek 2A), co wykazało, że AD4L oddziałuje z samym sobą, a konkretnie z konstruktem BT4L (reszty 1 - 906 RyR2 połączone z GAL4 DNA-BD). Blado niebieskie kolonie wykryto dla pary BT8:AD4L, co sugeruje wtórną, słabszą asocjację z skrajną domeną C-końcową (BT8), podczas gdy drożdże kotransformowane jakimkolwiek innym konstruktem pozostały białe, a zatem ujemne pod kątem interakcji białkowej przynęta:ofiara. Wyniki ilościowe, uzyskane w płynnych testach β-Gal (Rysunek 2B), wskazały na silną interakcję BT4L:AD4L, równoważną pod względem siły znanej asocjacji między białkiem p53 (pVA3) a dużym antygenem T wirusa SV40 (pTD1), podczas gdy interakcja BT8:AD4L była znacznie słabsza (&lt;10% w porównaniu do kontroli).
Regularnie przeprowadzamy eksperymenty ko-immunoprecypitacji (Rysunek 3) po ekspresji przejściowej w linii komórkowej ssaków (HEK293), jako niezależny test biochemiczny w celu potwierdzenia wyników uzyskanych w systemie Y2H2-4,12-14,21-24Aby zweryfikować samooddziaływanie N-końca RyR2, do komórek HEK293 współtransfekowano, metodą wytrącania z fosforanem wapnia, dwa oddzielne plazmidy kodujące aminokwasy 1–906 RyR2, znakowane odpowiednio epitopami peptydowymi cMyc lub HA (odpowiednio BT4L i AD4L).3Frakcję ponuklearną zhomogenizowanych komórek solubilizowano za pomocą detergentu CHAPS, a materiał nierozpuszczalny usunięto poprzez wirowanie w celu otrzymania lizatu komórkowego. Lizat komórkowy, po potraktowaniu środkiem redukującym – ditiotreitolem, inkubowano następnie z Abkwas hialuronowy or kulek sepharose Protein-A w celu immunoprecypitacji AD4L z tagiem HA. Próbki z ko-immunoprecypitacji (Co-IP), elutowane buforem zawierającym SDS, naniesiono na dwa oddzielne żele SDS-PAGE (1/10th oraz 9/10th (rozdzielono) i przeanalizowano metodą immunoblottingu z użyciem przeciwciał (Ab)Kwas hialuronowy oraz przeciwciała (Ab)cMycodpowiednio. Pomyślna bezpośrednia immunoprecypitacja (IP) AD4L (~100 kDa) za pomocą AbKwas hialuronowy potwierdzono metodą immunoblotingu, lecz nie w kontroli negatywnej z użyciem nieimmunologicznego IgG królika (Rycina 4A). Co istotne, BT4L z etykietą cMyc (~100 kDa) odzyskano wyłącznie w AbKwas hialuronowy IP, a nie w kontroli negatywnej w przypadku braku immunoprecypitowanego AD4L (Rycina 4B).
Testy Y2H i co-IP dostarczyły spójnych dowodów na autointerakcję N-końca RyR2, ale nie pozwoliły określić stanu oligomeryzacji domeny N-końcowej, a konkretnie tego, czy tworzy ona wyłącznie dimery, czy większe kompleksy. Należy zauważyć, że kompleksy ulegną dysocjacji i za pomocą SDS-PAGE zostaną wykryte jedynie poszczególne podjednostki, ponieważ denaturacja białek indukowana przez SDS i ciepło znosi oddziaływania białko-białko. Aby temu zaradzić, zastosowaliśmy sieciowanie (Rysunek 5), które chemicznie i stabilnie łączy istniejące oligomery białek, których masę cząsteczkową można następnie zbadać poprzez rozdział wielkościowy w SDS-PAGE2-5. Na przykład homogenat komórek HEK293 wykazujących ekspresję cMyc-BT4L, traktowany reduktorem ditiotreitolem, poddano reakcji z glutaraldehydem, a następnie analizowano za pomocą SDS-PAGE i immunoblottingu z użyciem AbcMyc (Rysunek 6). Oprócz monomeru (~100 kDa), w sposób zależny od czasu wykryto prążek białkowy o wysokiej masie cząsteczkowej ~400 kDa, co wskazuje na tworzenie tetramerów N-końca RyR23. Co istotne, tetramer był dominującą formą oligomeryczną, przy minimalnej liczbie obserwowanych prążków dimerów i trimerów. Aby określić jego pozorną masę cząsteczkową, oligomer BT4L rozdzielono na żelach SDS-PAGE z gradientem 4 - 15%3. Przygotowaliśmy krzywą wzorcową masy cząsteczkowej/oporu w żelu, korzystając ze standardów białkowych w zakresie 30 - 460 kDa, i obliczyliśmy, że masa oligomeru wynosi 358 kDa 15 (n = 4). Ta pozorna masa cząsteczkowa jest zgodna z tetramerem BT4L ułożonym w zamknięty okrąg, a nie w formie liniowej, co jest zgodne z rozmieszczeniem czterech podjednostek w natywnym kanale RyR2.
<img alt="Schemat systemu drożdżowego dwuhybrydowego, metoda testu β-Gal, oddziaływanie białek, kotransformacja plazmidowa." src="/files/ftp_upload/54271/54271fig1.jpg" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Rycina 1"> 
Rycina 1. Schemat blokowy Y2H. Drożdże, kotransformowane plazmidami przynętą i celem, są selekcjonowane pod kątem wzrostu na podłożu pozbawionym histydyny i/lub poddawane analizie aktywności enzymatycznej β-Gal. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54271/54271fig1large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.</a>
<img alt="Schemat mapowania białka RyR2 i wykres testu Y2H β-Gal; wizualizacja oddziaływań domen." src="/files/ftp_upload/54271/54271fig2.jpg" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Rycina 2"> 
Rycina 2. System Y2H sugeruje samoddziaływanie domeny N-końcowej RyR2. (A) Schemat przedstawiający serię nakładających się fragmentów białka RyR2 człowieka (przynęta), przetestowanych w systemie Y2H pod kątem oddziaływania z konstruktem AD4L N-końcowym RyR2 (ofiara). Jakościowe wyniki uzyskane za pomocą testów β-Gal na papierze filtracyjnym z odlewów kolonii są oznaczone wielokrotnymi znakami „+” lub znakiem „-” dla braku oddziaływania. (B) Ilościowe testy β-Gal w fazie ciekłej znormalizowane względem kontroli pozytywnej (pVA3 koduje fuzję DNA-BD GAL4 z białkiem p53; pTD1 koduje fuzję AD GAL4 z dużym antygenem T SV40). Zmodyfikowano na podstawie3. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54271/54271fig2large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić większą wersję tej ryciny.</a>
<img alt="Schemat ekspresji w komórkach ssaków, kotransfekcji, co-IP, SDS-PAGE i detekcji oddziaływań białkowych." src="/files/ftp_upload/54271/54271fig3.jpg" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Rycina 3"> 
Rycina 3. Schemat blokowy co-IP. Komórki ssaków, kotransfekowane plazmidami X i Y, są homogenizowane i solubilizowane detergentem w celu uzyskania lizatu komórkowego wykorzystanego w analizie co-IP, po czym przeprowadzane są SDS-PAGE i immunoblotting. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54271/54271fig3large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.</a>
<img alt="Analiza Western blot; detekcja białek; Ab HA i Ab cMyc; markery kDa; wyniki immunoprecypitacji." src="/files/ftp_upload/54271/54271fig4.jpg" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Rycina 4"> 
Rycina 4. Co-IP wskazuje na samoddziaływanie domeny N-końcowej RyR2 w komórkach ssaków. Komórki HEK293 poddano kotransfekcji w celu przejściowej koekspresji domeny N-końcowej RyR2 (pozostałości 1 - 906) znakowanej cMyc (BT4L) oraz znakowanej HA (AD4L). AD4L został immunoprecypitowany za pomocą AbHA z lizatu komórek HEK293 solubilizowanego w CHAPS i traktowanego ditiotreitolem, natomiast jako kontrolę negatywną przeprowadzono analizy co-IP z użyciem nieimmunologicznego królika IgG. Immunoprecypitowane białka podgrzano do 85 °C przez 5 min i rozdzielono prądem 20 mA przez 3 hr na osobnych żelach SDS-PAGE 6% z naniesionymi próbkami IP w ilości 1/10tej lub 9/10tej. Po transferze białek przy 80 V przez 2 hr na membranę z difluorku poliwinylydenu, przeprowadzono analizę immunoblotting z użyciem odpowiednio AbHA (A) lub AbcMyc (B) (rozcieńczenie 1:1 000), a następnie przeciwciał anty-mysich IgG sprzężonych z peroksydazą chrzanową (rozcieńczenie 1:10 000) i detekcją za pomocą wzmocnionej chemiluminescencji (ekspozycja 1 min). Włączono również alikwot lizatu komórkowego, stanowiący 1/50tą objętości przetworzonej w próbkach IP, aby służył jako standard masy cząsteczkowej. Zmodyfikowano z3. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54271/54271fig4large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.</a>
<img alt="Ekspresja w komórkach ssaków, transfekcja plazmidem, SDS-PAGE, schemat oligomeryzacji białek." src="/files/ftp_upload/54271/54271fig5.jpg" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Rysunek 5"> 
Rysunek 5. Schemat blokowy sieciowania. Komórki ssaków, transfekowane plazmidem X, są homogenizowane i poddawane reakcji z glutaraldehydem w teście sieciowania, a następnie analizowane za pomocą SDS-PAGE i immunoblottingu. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54271/54271fig5large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.</a>
<img alt="Eksperyment sieciowania; elektroforeza białek w żelu; analiza monomeru i tetrameru; badanie zależności od czasu." src="/files/ftp_upload/54271/54271fig6.jpg" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Rycina 6"> 
Rycina 6. Sieciowanie wskazuje na tworzenie tetramerów domeny N-końcowej RyR2. Komórki HEK293 poddano transfekcji w celu przejściowej ekspresji domeny N-końcowej RyR2 (aminokwasy 1 - 906) z tagiem cMyc (BT4L). Homogenat komórkowy, potraktowany reduktorem ditiotreitolem, inkubowano z glutaraldehydem przez wskazane punkty czasowe. Próbki podgrzewano w 85 °C przez 5 min i rozdzielano metodą SDS-PAGE (żel 6%) przy 20 mA przez 3 h. Po transferze białek przy 80 V przez 2 h na membranę z polifluorowodorku winylidenu przeprowadzono analizę immunoblotting z użyciem przeciwciała AbcMyc (rozcieńczenie 1:1 000), a następnie przeciwciała anty-IgG mysiego sprzężonego z peroksydazą chrzanową (rozcieńczenie 1:10 000) i detekcją za pomocą wzmocnionej chemiluminescencji (naświetlanie 1 min). Formy monomerowe (M: ~100 kDa) i tetramerowe (T) zaznaczono strzałkami. Zmodyfikowano z3. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54271/54271fig6large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.</a>

Oligomeryzacja receptora ryanodyny, homo-tetramerycznego kanału jonowego pośredniczącego w uwalnianiu Ca2+ z wewnątrzkomórkowych magazynów, jest krytyczna dla skurczu mięśnia szkieletowego i sercowego. W tym artykule przedstawiono komplementarne metody in vivo i in vitro do wykrywania samoasocjacji białek i wyznaczania stechiometrii homo-oligomerów.

Genetyczne i biochemiczne podejścia do oceny oligomeryzacji białek in vivo i in vitro: studium przypadku receptora ryanodyny

Oligomerization is often a structural requirement for proteins to accomplish their specific cellular function. For instance, tetramerization of the ...

Ogólnym celem tych trzech komplementarnych technik eksperymentalnych, a mianowicie: systemu drożdżowego dwuhybrydowego, koimmunoprecypitacji oraz sieciowania chemicznego, jest ocena oddziaływań białko-białko, w szczególności samoasocjacji, oraz określenie składu stechiometrycznego homo-oligomerów białkowych. Metody te mogą pomóc w odpowiedzi na kluczowe pytania w dziedzinie kardiopatii, takie jak oligomeryzacja receptorów ultra-dry, leżąca u podstaw arytmii serca i nagłej śmierci sercowej. Głównymi zaletami tych technik są stosunkowo wysoka przepustowość przesiewania, łatwość użycia i wysoką powtarzalność wyników, przy minimalnych wymaganiach dotyczących sprzętu i odczynników.Znaczenie tych technik wykracza poza teorię i obejmuje terapię chorób arytmogennych serca, ponieważ pomagają one określić molekularny mechanizm działania leków przeciwarytmicznych. Zazwyczaj osoby rozpoczynające pracę z koimmunoprecypitacją mogą napotkać trudności związane z ryzykiem przypadkowego usunięcia kuleczek agarozowych z białkiem, które są bardzo małe, podczas odsysania nadsączu w etapach wirowania. W tym teście dwuhybrydowym drożdży do transformacji wykorzystuje się komórki drożdży w średniej fazie logarytmicznej.Zbierz komórki poprzez wirowanie, resuspenduj każdy osad w pięciu mililitrach sterylnej wody i połącz zawiesiny komórkowe. Odwiruj zawiesinę komórkową. Po odlaniu nadsączu, resuspenduj osad drożdży w jednym mililitrze świeżo przygotowanego, sterylnego 1x octanu litu i TE. Kompetentne komórki drożdży należy wykorzystać w ciągu jednej godziny od przygotowania.Przygotować próbki plazmidów poprzez zmieszanie DNA z przynętą i DNA docelowego z osocza z 100 µg DNA nośnikowego z jąder śledzia. Do każdej probówki 1,5 ml dodać 100 µl zawiesiny kompetentnych drożdży oraz 600 µl 1x roztworu octanu litu i PEG, a następnie mieszać w wortexie przez około 30 sekund. Inkubować w temperaturze 30 °C przez 30 minut, z wytrząsaniem.Dodaj 80 µL dimetylosulfotlenku i dokładnie wymieszaj, delikatnie odwracając probówkę. Prowadź szok termiczny przez 15 minut w kąpieli wodnej o temperaturze 42 °C, mieszając zawiesinę co dwie do trzech minut. Schłodź zawiesinę komórkową na lodzie przez dwie minuty, a następnie odwiruj w celu odzyskania drożdży.Każdy osad komórkowy zawiesić w 100 µL buforu 1X TE. Wysiać komórki na odpowiednie płytki z minimalnym podłożem SD, aby utrzymać presję selekcyjną dla plazmidów przynęty i celu. Inkubować płytki w pozycji odwróconej w temperaturze 30 °C przez cztery do pięciu dni. Kolonie drożdży są gotowe do tego testu, gdy osiągną średnicę około 2 mm.Do czystej szalki 100 mm pipetujemy 2,5 ml świeżo przygotowanego roztworu buforu Z i X-gal, a następnie umieszczamy w niej papier filtracyjny z celulozy. Na powierzchnię szalki z koloniami drożdży przeznaczonymi do analizy nakładamy nowy papier filtracyjny. Za pomocą pęsety delikatnie dociskamy papier filtracyjny do powierzchni szalki i pozostawiamy na około pięć minut, aby kolonie mogły przylgnąć.Stosując odpowiednie środki ochrony osobistej, ostrożnie podnieś papier filtracyjny i zanurz go w ciekłym azocie na 30 sekund. Pozostaw zamrożony papier filtracyjny do rozmrożenia w temperaturze pokojowej przez dwie minuty. Umieść papier filtracyjny stroną z koloniami do góry na powierzchni uprzednio namoczonego papieru filtracyjnego wewnątrz płytki 100-milimetrowej i inkubuj w temperaturze 30 stopni Celsjusza do czasu pojawienia się niebieskich kolonii.Na dzień przed transfekcją należy dokarmić komórki HEK293 w szalce Petriego o średnicy 100 mm, aby następnego dnia osiągnęły one 60 do 70% konfluencji. Inkubować przez 16 do 18 godzin w inkubatorze z nawilżaniem. W dniu transfekcji rozpuścić 24 µg plazmidowego DNA w 60 µL 2,5 M chlorku wapnia i sterylnej wodzie dejonizowanej, aby uzyskać całkowitą objętość 600 µL.Wymieszać w wirówce typu vortex. Roztwór DNA plazmidowego z wapniem dodawać kroplowo do probówki o pojemności 50 ml zawierającej 600 µL 2X soli buforowanej HEPES, cały czas intensywnie mieszając w wirówce typu vortex. Inkubować przez 20 minut w temperaturze pokojowej, aby umożliwić utworzenie kompleksów DNA plazmidowego z fosforanem wapnia.Po 20 minutowej inkubacji krótko wymieszaj na wirówce i dodawaj roztwór kroplami do komórek HEK293, aby pokryć całą powierzchnię szalki Petriego. Inkubuj komórki w temperaturze 37 °C w atmosferze pięciu procent dwutlenku węgla. Po około sześciu godzinach wymień pożywkę wzrostową i umieść komórki z powrotem w inkubatorze.24 godziny po transfekcji zebrać komórki zgodnie z opisem w tekście protokołu. Osad komórkowy zawiesić w 500 µL lodowatego buforu do homogenizacji i przenieść zawiesinę komórkową do probówki 1,5 ml zawierającej szklane koraliki. Do homogenizacji komórek na lodzie użyć cienkiej igły przymocowanej do strzykawki 1 ml.Przy zamkniętej zakrętce probówki przekłuj ją igłą i energicznie zdysperguj zawiesinę komórkową przez koraliki szklane. Wiruj z prędkością 1500 ×g przez 10 minut w temperaturze 4 °C, aby usunąć jądra komórkowe i niezniszczone komórki. Zbierz nadsącz reprezentujący frakcję ponuklearną do wykorzystania w eksperymentach koimmunoprecypitacji lub sieciowania.Aby rozpocząć tę procedurę, należy solubilizować post-jądrową frakcję subkomórkową w 0,5% chaps i inkubować przez co najmniej dwie godziny w temperaturze 4°C przy ciągłym mieszaniu. Następnie odwirować z prędkością 20 000 ×g przez 10 minut w temperaturze 4°C, aby osadzić materiał nierozpuszczalny. Należy zachować nadsącz.Otrzymany materiał określa się mianem lizatu komórkowego. Przygotować kulki agarozy z białkiem A w buforze do immunoprecypitacji zgodnie z opisem w tekście protokołu. Do jednej probówki zawierającej białko A dodać jeden mikrogram przeciwciała immunoprecypitującego.Jako kontrolę negatywną, dodaj jeden mikrogram nieimmunologicznego IGG do drugiej probówki zawierającej białko A. Inkubuj przez co najmniej dwie godziny w temperaturze czterech stopni Celsjusza, przy ciągłym mieszaniu. Odzyskaj kuleczki poprzez wirowanie i ostrożnie usuń nadsącz za pomocą pipety.Przenieś 200 µL lizatu komórkowego do każdej z dwóch probówek zawierających przeciwciało i kulki Protein A. Inkubuj przez co najmniej dwie godziny w temperaturze 4 °C przy ciągłym mieszaniu, aby umożliwić wiązanie antygen-przeciwciało. Odzyskaj kulki i przemyj je 200 µL buforu do immunoprecypitacji.Inkubować przez 10 minut w temperaturze 4°C przy mieszaniu. Po trzykrotnym przemyciu ostrożnie usunąć nadsącz za pomocą pipety. Do kulek dodać 30 µL buforu do ładowania białek i wirować z prędkością 1500 ×g przez dwie minuty w temperaturze 4°C.Należy zachować nadsącz zawierający wspomnianą próbkę co-IP do późniejszej elektroforezy SDS-PAGE i immunoblottingu. Aby przeprowadzić sieciowanie chemiczne, należy odwirować ponuklearną frakcję subkomórkową w celu osadzenia agregatów białkowych. Nadsącz należy zachować i podzielić na osiem aliquotów po 20 µL każdy.Do tylko jednej próbki dodaj glutaraldehyd w stężeniu 0,0025% obj. Uruchom stoper i pozostaw glutaraldehyd do reakcji w temperaturze pokojowej przez określony czas. Przerwij reakcję glutaraldehydu w wyznaczonym czasie, dodając 2% obj. hydrazyny, a następnie dodaj 5 µL 5X buforu do ładowania białek, aby zdenaturować białka.W celu przesiewania nakładających się konstruktów obejmujących całą długość sekwencji peptydowej receptora ryonadynowego pod kątem interakcji z AD4L oraz fragmentem końcowym zastosowano system drożdżowego dwuhybrydowego. Testy beta-gal z wykorzystaniem przeniesienia kolonii na papier filtracyjny wykazały intensywnie niebieskie kolonie wyłącznie dla pary BT4L/AD4L, co wskazuje, że AD4L oddziałuje z samym sobą. Bladoniebieskie kolonie zaobserwowano dla pary BT8/AD4L, co sugeruje wtórne, słabsze powiązanie z ekstremalną domeną C-końcową.Wyniki ilościowe z płynnych testów beta-gal wskazały na silną interakcję BT4L/AD4L, równoważną pod względem siły znanej asocjacji między białkiem P53, pVA3, a dużym antygenem T SV40, pTD1. Interakcja BT8/AD4L była znacznie słabsza. Wyniki systemu drożdżowego dwuhybrydowego zostały potwierdzone w eksperymentach ko-immunoprecypitacji po przejściowej ekspresji AD4L z tagiem HA oraz BT4L z tagiem cMyc w linii komórkowej ssaków.Zaobserwowano bezpośrednią immunoprecypitację AD4L z tagiem HA za pomocą przeciwciała 2 HA, natomiast BT4L z tagiem cMyc odzyskano wyłącznie w immunoprecypitacji przeciwko HA. Przeprowadzono chemiczne sieciowanie homogenatu komórkowego wykazującego ekspresję cMyc BT4L, a następnie wykonano elektroforezę SDS-PAGE i immunoblotting z wykorzystaniem przeciwciała przeciwko cMyc. Oprócz monomeru o masie 100 kilodalton, w sposób zależny od czasu wykryto prążek białkowy o wysokiej masie cząsteczkowej wynoszącej około 400 kilodaltonów, co wskazuje na tworzenie tetramerów receptora ryzydynowego i terminuś.Podczas próby transfekcji komórek ssaków metodą wytrącania fosforanu wapnia należy pamiętać o ciągłym i intensywnym mieszaniu buforu fosforanowego w wirówce w dużej probówce w celu zapewnienia wydajnego napowietrzania, przy jednoczesnym bardzo powolnym dodawaniu roztworu plazmidowego DNA. Po zastosowaniu tych procedur można przeprowadzić inne metody, takie jak mikroskopia konfokalna w obrazowaniu wapnia. Techniki te powinny pomóc w udzieleniu odpowiedzi na dodatkowe pytania, takie jak lokalizacja i właściwości uwalniania wapnia przez kanały receptora ryanodynowego w żywych komórkach.Po opracowaniu techniki te utorowały drogę badaczom z różnych dziedzin sygnalizacji komórkowej do oceny homo-oligomeryzacji białek, fundamentalnego procesu biologicznego regulującego aktywność czynników transkrypcyjnych, enzymów, kanałów jonowych i receptorów.

genetic-biochemical-approaches-for-vivo-vitro-assessment-protein

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Ten film demonstruje test dwóch hybryd drożdży do wykrywania specyficznych interakcji między białkami. W tym teście białko będące przedmiotem zainteresowania jest znakowane do dwóch domen czynnika transkrypcyjnego, który koduje enzym β-galaktozydazy. Kiedy te dwa białka wchodzą w interakcję, powoduje to transkrypcję i translację, które tworzą enzym, który jest następnie wykrywany za pomocą testu biochemicznego.

Test dwuhybrydowy drożdży w celu określenia samoasocjacji białek w komórkach drożdży

Tutaj prezentujemy systematyczne podejście do opracowywania fizjologicznie istotnych, czułych i specyficznych testów in vivo do interpretacji zmienności w ludzkiej patologii. Przejściowa manipulacja genetyczna poprzez mikrowstrzyknięcie WT i zmutowanych ludzkich oligonukleotydów antysensownych mRNA i morfoliny (MO) wykorzystuje podatność rozwijającego się zarodka danio pręgowanego do szybkiego oznaczania mutacji patogennych, zwłaszcza, ale nie wyłącznie, w kontekście zaburzeń rozwojowych...

In vivo (in vivo) Modelowanie chorobliwego genomu ludzkiego przy użyciu Danio rerio

Opisujemy metody obrazowania, których używamy do badania dystrybucji i ruchliwości transfekowanych białek fluorescencyjnych rezydujących w retikulum endoplazmatycznym (ER) za pomocą konfokalnego obrazowania żywych komórek. Analizujemy również ultrastrukturalnie wpływ ich ekspresji na architekturę tego przedziału subkomórkowego.

Wizualizacja subdomen retikulum endoplazmatycznego w hodowanych komórkach

Ten artykuł opisuje konkretne metody uzyskiwania biochemicznych ilości TRPV1 rozpuszczonego w detergentach do analizy spektroskopowej. Połączone protokoły zapewniają narzędzia biochemiczne i biofizyczne, które można dostosować w celu ułatwienia badań strukturalnych i funkcjonalnych kanałów jonowych ssaków w środowisku kontrolowanym przez błonę.

Oczyszczanie i rekonstytucja TRPV1 do analizy spektroskopowej

W tym artykule opisujemy protokoły ekspresji, oczyszczania, krystalizacji i określania struktury N-końcowej domeny receptora ryanodine z diamentowej (Plutella xylostella).

Struktura krystaliczna domeny N-końcowej receptora Ryanodine z Plutella xylostella

Tutaj opisaliśmy metodę obrazowania o wysokiej zawartości do ilościowego określenia transportu mutantów rodopsyny związanych z barwnikowym zwyrodnieniem siatkówki. Do ilościowego określenia białka rodopsyny na powierzchni komórki lub w całej komórce wykorzystano analizę punktacji na wielu długościach fali.

Test transportu rodopsyny za pomocą analizy obrazowania o wysokiej zawartości

Tutaj opisujemy protokół wykrywania i lokalizacji białka zarodka Drosophila i RNA od pobrania do wstępnego osadzenia i osadzenia, barwienia immunologicznego i hybrydyzacji mRNA in situ.

Protokół immunohistochemii i dystrybucji RNA in-situ we wczesnym zarodku Drosophila

Tutaj opisane są metody używane do badania funkcjonalnego efektu mutacji RYR1 endogennie wyrażanych w wirusie Epsteina-Barra, unieśmiertelnionych ludzkich limfocytach B oraz komórkach satelitarnych pochodzących z biopsji mięśni, zróżnicowanych w miotuby.

Charakterystyka funkcjonalna endogennych wariantów ludzkiego RYR1

Intherentnie nieuporządkowane regiony (IDR) to elastyczne domeny białkowe, które modyfikują swoją konformację w odpowiedzi na zmiany środowiskowe. Zespołowy transfer energii rezonansu fluorescencji (FRET) może oszacować wymiary białka w różnych warunkach. Przedstawiamy podejście FRET do oceny wrażliwości strukturalnej IDR w żywych komórkach Saccharomyces cerevisiae w warunkach stresu hiperosmotycznego.

Oszacowanie wrażliwości strukturalnej regionów wewnętrznie nieuporządkowanych w odpowiedzi na stres hiperosmotyczny w żywych komórkach za pomocą FRET

Testowanie wrażliwości wizualnej u jaszczurek przy operant paradygmat klimatyzacji, która zatrudnia odtwarzania wideo losowych punktów, kinematograms i generowanych komputerowo bezkręgowców.

Badania wizualne Wrażliwość na prędkość i kierunek ruchu w Jaszczurki

Poznaj metody oceny oligomeryzacji białek in vivo i in vitro na przykładzie receptora ryanodyny. Wykorzystaj test dwuhybrydowy, koimmunoprecypitację i chemiczne retikulacje do badania interakji białkowych.

Genetyczne i biochemiczne podejścia do oceny oligomeryzacji białek in vivo i in vitro: studium przypadku receptora ryanodyny

Przeglądaj więcej filmów