Genetyczne i biochemiczne podejścia do oceny oligomeryzacji białek in vivo i in vitro: studium przypadku receptora ryanodyny

Ogólnym celem tych trzech uzupełniających się technik eksperymentalnych, a mianowicie dwuhybrydowego drożdży, koimmunoprecypitacji i chemicznego sieciowania, jest ocena interakcji białko-białko, a w szczególności samoasocjacji, oraz określenie składu stechiometrycznego homo-oligomerów białkowych. Metody te mogą pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytania w dziedzinie kardiopatii, takie jak oligomeryzacja ultrasuchych receptorów, leżące u podstaw zaburzenia rytmu serca i nagła śmierć. Głównymi zaletami tych technik są stosunkowo wysoka przepustowość badań przesiewowych, łatwość użycia i wysoce powtarzalne wyniki, przy minimalnym zużyciu sprzętu i odczynników.

Implikacje tych technik rozciągają się na terapię arytmogennych chorób serca, ponieważ pomagają one ustalić molekularny mechanizm działania leków antyarytmicznych. Ogólnie rzecz biorąc, osoby, które dopiero zaczynają przygodę z koimmunoprecypitacją, będą miały trudności z potencjalnym odrzuceniem kulek agarozy białkowej, które są bardzo małe, podczas zasysania supernatantu podczas etapów wirowania. W tym teście dwuhybrydowym drożdży komórki drożdży w środkowej fazie logarytmicznej są używane do transformacji.

Zbierz komórki przez odwirowanie, ponownie zawieś każdą granulkę w pięciu mililitrach sterylnej wody i połącz zawiesiny komórek. Odwirować zawiesinę komórkową. Po odrzuceniu supernatantu ponownie zawiesić osad drożdży w jednym mililitrze świeżo przygotowanego, sterylnego octanu litu one-x i TE. Właściwe komórki drożdży należy wykorzystać w ciągu jednej godziny od przygotowania.

Przygotuj próbki plazmidu, mieszając przynętę i DNA osocza docelowego ze 100 mikrogramami DNA nosiciela jąder śledzia. Do każdej 1,5 mililitrowej probówki dodaj 100 mikrolitrów właściwej zawiesiny drożdży i 600 mikrolitrów roztworu octanu litu i PEG one-X i wiruj przez około 30 sekund. Inkubować w temperaturze 30 stopni Celsjusza przez 30 minut, wstrząsając.

Dodaj 80 mikrolitrów dimetylosulfotlenku i dobrze wymieszaj przez delikatną inwersję. Szok termiczny przez 15 minut w łaźni wodnej o temperaturze 42 stopni Celsjusza, mieszając co dwie do trzech minut. Schłodzić zawiesinę komórkową na lodzie przez dwie minuty, a następnie odwirować w celu odzyskania drożdży.

Zawiesić każdą osadkę komórkową w 100 mikrolitrach one-X TE. Umieść komórki na odpowiednich minimalnych płytkach z podłożem SD, aby utrzymać selektywny nacisk zarówno na przynętę, jak i docelowe plazmidy. Inkubuj płytki do góry nogami w temperaturze 30 stopni Celsjusza przez cztery do pięciu dni. Kolonie drożdży są gotowe do tego testu, gdy mają około dwóch milimetrów średnicy.

Odpipetować 2,5 mililitra świeżo przygotowanego buforu Z i roztworu X-gal na czystą 100-milimetrową płytkę i umieścić w niej celulozową bibułę filtracyjną. Umieścić nową bibułę filtracyjną na powierzchni płytki z koloniami drożdży, które mają być oznaczone. Za pomocą kleszczy delikatnie wetrzyj bibułę filtracyjną w płytkę i pozostaw na około pięć minut, aby kolonie się przyczepiły.

Używając odpowiedniego wyposażenia ochrony osobistej, ostrożnie podnieś bibułę filtracyjną i zanurz ją w kałuży ciekłego azotu na 30 sekund. Pozwól zamrożonej bibule filtracyjnej rozmrozić się w temperaturze pokojowej przez dwie minuty. Umieść bibułę filtracyjną stroną z kolonią do góry na wstępnie nasączonej bibule filtracyjnej wewnątrz 100-milimetrowej płytki i inkubuj w temperaturze 30 stopni Celsjusza, aż pojawią się niebieskie kolonie.

Dzień przed transfekcją nakarm komórki HEK293 na 100-milimetrowej szalce Petriego, aby następnego dnia komórki zlewały się w 60 do 70 procentach. Hodowla przez 16 do 18 godzin w wilgotnym inkubatorze. W dniu transfekcji rozcieńczyć 24 mikrogramy DNA osocza 60 mikrolitrami 2,5 molowego chlorku wapnia i sterylną wodą dejonizowaną, aby uzyskać całkowitą objętość 600 mikrolitrów.

Wirować do mieszania. Dodaj kroplami roztwór DNA osocza i wapnia do 50-mililitrowej probówki zawierającej 600 mikrolitrów soli fizjologicznej buforowanej 2X HEPES, stale i energicznie mieszając przez wirowanie. Inkubować przez 20 minut w temperaturze pokojowej, aby umożliwić utworzenie kompleksów DNA osocza fosforanu wapnia.

Po 20-minutowej inkubacji krótko zwirować i dodawać roztwór kroplami na komórki HEK293, aby pokryć całą powierzchnię szalki Petriego. Inkubuj komórki w temperaturze 37 stopni Celsjusza w pięciu procentach dwutlenku węgla. Po około sześciu godzinach zmień pożywkę wzrostową i umieść komórki z powrotem w inkubatorze.

24 godziny po transfekcji należy pobrać komórki zgodnie z opisem w tekście protokołu. Ponownie zawiesić osad komórkowy w 500 mikrolitrach lodowatego buforu homogenizacyjnego i przenieść zawiesinę komórek do 1,5 mililitrowej probówki zawierającej szklane kulki. Użyj cienkiej igły przymocowanej do jednomilimetrowej strzykawki, aby homogenizować komórki na lodzie.

Przy zamkniętej nasadce rurki przekłuć nasadkę igłą i energicznie rozprowadzić zawiesinę komórek przez szklane kulki. Wirować w temperaturze 1500 razy G przez 10 minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza, aby usunąć jądra i nieuszkodzone komórki. Zachowaj supernatant reprezentujący frakcję pojądrową do wykorzystania w eksperymentach z koimmunoprecypitacją lub sieciowaniem.

Aby uzyskać tę procedurę, rozpuścić postjądrową frakcję subkomórkową za pomocą 0,5 procent chapów i inkubować przez co najmniej dwie godziny w temperaturze czterech stopni Celsjusza przy ciągłym mieszaniu. Wirować przy 20 000 razy G przez 10 minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza, aby osadzać nierozpuszczalny materiał. Uratuj supernatant.

Nazywa się to lizatem komórkowym. Przygotować kulki agarozy białko-A w buforze immunoprecypitacyjnym zgodnie z opisem w tekście protokołu. Dodać jeden mikrogram przeciwciała immunoprecypitującego do jednej probówki zawierającej białko A.

Jako kontrolę ujemną dodać jeden mikrogram nieimmunologicznego IGG do drugiej probówki zawierającej białko A. Inkubować przez co najmniej dwie godziny w temperaturze czterech stopni Celsjusza, stale mieszając. Odzyskać kulki przez odwirowanie i ostrożnie wyrzucić supernatant przez pipetowanie.

Przenieś 200 mikrolitrów lizatu komórkowego do każdej z dwóch probówek zawierających przeciwciało i kulki białka-A. Inkubować przez co najmniej dwie godziny w temperaturze czterech stopni Celsjusza ze stałym mieszaniem, aby umożliwić wiązanie antygenu z przeciwciałem. Odzyskaj kulki i przemyj 200 mikrolitrami buforu immunoprecypitacyjnego.

Inkubować przez 10 minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza z mieszaniem. Po trzech przetarciach ostrożnie wyrzucić supernatant przez pipetowanie. Dodać 30 mikorliterów buforu ładującego białko do kulek i wirować w temperaturze 1500 razy G przez dwie minuty w temperaturze czterech stopni Celsjusza.

Zachowaj supernatant zawierający wspomnianą próbkę co-IP do następnej strony SDS i immunoblottingu. Aby przeprowadzić sieciowanie chemiczne, odwiruj postjądrową frakcję subkomórkową w celu osadzenia agregatów białkowych. Zachowaj supernatant i podziel na osiem porcji po 20 mikrolitrów każda.

Dodaj 0,0025 procent objętości aldehydu glutarowego tylko do jednej próbki. Uruchom minutnik i pozwól aldehydowi glutarowemu reagować w temperaturze pokojowej przez wskazany czas. Zatrzymaj reakcję aldehydu glutarowego w określonym czasie za pomocą hydrazyny o zawartości dwóch procent objętości na objętość i dodaj pięć mikrolitrów 5-krotnego buforu ładującego białko w celu denaturacji białek.

Drożdżowe dwie hybrydy wykorzystano do badania przesiewowego nakładających się na siebie konstruktów obejmujących całą długość sekwencji peptydowej receptora ryanodine pod kątem interakcji z AD4L i końcowym fragmentem końcowym. Testy beta-galu z bibuły filtracyjnej do podnoszenia kolonii wykazały żywe niebieskie kolonie tylko dla pary BT4L / AD4L, co pokazuje, że AD4L oddziałuje ze sobą. Wykryto bladoniebieskie kolonie dla pary BT8 / AD4L, co sugeruje wtórny, słabszy związek z ekstremalną domeną C-końcową.

Wyniki ilościowe z ciekłych testów beta-galu wykazały silną interakcję BT4L/AD4L, równoważną pod względem siły znanemu związkowi między białkiem P53, pVA3 a dużym antygenem T SV40, pTD1. Interakcja BT8/AD4L była znacznie słabsza. Wyniki dotyczące dwóch hybryd drożdży są wzmacniane przez eksperymenty z koimmunoprecypitacją po przejściowej ekspresji AD4L znakowanego HA i BT4L znakowanego cMyc w linii komórkowej ssaków.

Zaobserwowano bezpośrednie immunoprecypitację AD4L znakowanego HA przez przeciwciało 2 HA, a BT4L znakowany cMyc został odzyskany tylko w immunoprecypitacji anty-HA. Chemiczne sieciowanie przeprowadzono na homogenacie komórkowym eksprymującym cMyc BT4L, a następnie na stronie SDS i immunoblottingu, używając przeciwciała przeciwko cMyc. Oprócz monomeru o mocy 100 kilodaltonów, w sposób zależny od czasu wykryto pasmo białkowe o masie cząsteczkowej wynoszące około 400 kilodaltonów, co wskazuje na tworzenie się receptora ryanodine i tetrameru końcowego.

Próbując transfekcji komórek ssaków przez wytrącanie fosforanu wapnia, ważne jest, aby pamiętać o ciągłym i energicznym wirowaniu buforu fosforanowego w dużej probówce w celu skutecznego napowietrzania, jednocześnie bardzo powoli dodając roztwór zużywający DNA w osoczu. Po tych procedurach można wykonać inne metody, takie jak konfokalne w mikroskopii w obrazowaniu wapnia. Techniki te powinny pomóc odpowiedzieć na dodatkowe pytania, takie jak lokalizacja i właściwości uwalniania wapnia kanałów receptora ryanodine w żywych komórkach.

Po ich opracowaniu, techniki te utorowały drogę naukowcom z różnych dziedzin sygnalizacji komórkowej do oceny homooligomeryzacji białek, podstawowego procesu biologicznego, który reguluje aktywność czynników transkrypcyjnych, enzymów, kanałów jonowych i receptorów.