Produkcja kardiomiocytów na dużą skalę z ludzkich pluripotencjalnych komórek macierzystych przy użyciu wysoce powtarzalnego protokołu różnicowania opartego na małych cząsteczkach

Ogólnym celem tego eksperymentu jest różnicowanie ludzkich pluripotencjalnych komórek macierzystych w kardiomiocyty z wysoką wydajnością i odtwarzalnością. Protokół ten można zwiększyć w bioreaktorze lub zmodyfikować w celu różnicowania linii komórkowych, które są wrażliwe na hodowlę pojedynczych komórek. Metoda ta może pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytania w modelowaniu chorób serca przy użyciu ludzkich indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych.

Głównymi zaletami tej techniki jest to, że jest opłacalna i ma wysoką wydajność, powtarzalność i możliwość zastosowania zarówno w przypadku ludzkich embrionalnych, jak i indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych. Naszym dzisiejszym demonstratorem jest Hananeh Fonoudi, obecnie doktorantka w Victor Chang Cardiac Research Institute, która przyjechała do nas z Royan Institute. Przed powlekaniem użyj szczoteczki do czyszczenia i wody destylowanej, aby dokładnie usunąć kurz lub pozostałości kultur z 100-mililitrowej kolby obrotowej ze szklanym wahadłem.

Następnie napełnij kolbę 70% etanolem. Po 30 minutach przepłukać kolbę wodą destylowaną i napełnić ją pięciomolowym wodorotlenkiem sodu. Następnego ranka płucz lampę błyskową pod bieżącą wodą przez pięć minut i napełnij ją jednym molowym kwasem solnym.

Po 15 minutach płukać kolbę pod bieżącą wodą przez kolejne pięć minut, a następnie dwukrotnie przepłukać wodą podwójnie destylowaną. Umieść kolbę w komorze bezpieczeństwa biologicznego do wyschnięcia. Następnie dodaj 1,5 mililitra roztworu silikonowego do kolby i obróć kolbę poziomo, aby pokryć wszystkie powierzchnie krzemem.

Podgrzewać powlekaną kolbę w suchym piekarniku przez godzinę w temperaturze 100 stopni Celsjusza. Gdy kolba ostygnie, przepłukać ją trzykrotnie przez 15 minut wodą dejonizowaną. Następnie sterylizuj pojemnik w autoklawie w temperaturze 121 stopni Celsjusza przez 20 minut.

Po pasażowaniu niezróżnicowanych sferoid, stosując metodę pasażu jednokomórkowego co najmniej trzy razy, użyj pięciomililitrowej pipety, aby przenieść wszystkie niezróżnicowane sferoidy do 15-mililitrowej stożkowej probówki. Umyj studzienki jednym mililitrem pożywki z ludzkich embrionalnych komórek macierzystych, aby zebrać wszelkie pozostałe sferoidy, a następnie połącz płukanie z zebranymi sferoidami. Pozwól sferoidom osiąść przez pięć minut, aby utworzyły luźny osad.

Następnie odessać supernatant, uważając, aby nie usunąć żadnych sferoid. Następnie przepłucz sferoidy jednym mililitrem PBS przez pięć minut i inkubuj je w 5 mililitrach trypsyny EDTA w temperaturze 37 stopni Celsjusza. Po czterech do pięciu minutach zatrzymaj reakcję za pomocą jednego mililitra pożywki z ludzkich embrionalnych komórek macierzystych i użyj pipety P1000, aby zdysocjować sferoidy na zawiesinę pojedynczej komórki.

Po zliczeniu przez wykluczenie błękitu trypanowego, ponownie zawieś komórki w stężeniu 200 000 komórek na mililitr, w kondycjonowanym podłożu uzupełnionym podstawowym czynnikiem wzrostu fibroblastów i inhibitorem ROCK i przenieś 100 mililitrów zawiesiny komórkowej do silikonowanej kolby bioreaktora. Umieścić kolbę na mieszadle z prędkością 35 obr./min. Po 24 godzinach zwiększ mieszanie do 40 obr./min.

Po 48 godzinach należy przerwać mieszanie na pięć do dziesięciu minut, aż wszystkie zreformowane sferoidy osiądą na dnie kolby i zastąpić połowę pożywki kondycjonowaną pożywką uzupełnioną podstawowym czynnikiem wzrostu fibroblastów. Następnie uruchom ponownie mieszadło przy 40 obr./min na kolejne 24 godziny, zastępując połowę pożywki tym samym procesem codziennie przez następne trzy dni. Piątego dnia zatrzymaj mieszadło na pięć do dziesięciu minut.

Następnie przenieś wszystkie sferoidy do 50-mililitrowej rurki w 50 mililitrach pożywki lub mniej. Odrzucić pozostałą pożywkę w kolbie, uważając, aby w naczyniu nie pozostały żadne sferoidy. Następnie ostrożnie usuń supernatant z osiadłych sferoid i umyj skupiska komórek w 25 mililitrach PBS wapniem i magnezem.

Po pięciu do dziesięciu minutach usuń płukanie i ponownie zawieś sferoidy w 40 mililitrach pożywki RPMI-B27 uzupełnionej inhibitorem kinazy syntazy glikogenu-3, inhibitorem ROCK i alkoholem poliwinylowym. Przenieść wszystkie sferoidy z powrotem do kolby bioreaktora. Następnie dodaj świeżą pożywkę RPMI-B27 do całkowitej objętości 100 mililitrów i wznów mieszanie przy 40 obr./min.

Po 24 godzinach postępuj zgodnie z tym samym procesem, aby zmienić nośnik z medium RPMI-B27. Po dodatkowych 24 godzinach postępuj zgodnie z tym samym procesem i zmień pożywkę za pomocą RPMI-B27 plus IWP2, purmorfaminy i SB43. Pozostaw na 48 godzin.

Pierwsze pobicie obserwuje się zwykle po siedmiu dniach. W celu szybkiego różnicowania ludzkich pluripotencjalnych linii komórek macierzystych, które nie zostały przystosowane do hodowli pojedynczej komórki, najpierw potraktuj 70 do 80% zlewającej się hodowli ludzkich pluripotencjalnych komórek macierzystych, hodowanych na mysich komórkach fibroblastów embrionalnych, z 5 mililitrami roztworu dysocjacyjnego przez 30 do 60 sekund. Roztwór dysocjacyjny należy pozostawić tylko do momentu, gdy MEF-y zaokrąglą się, a krawędzie kolonii hPSC staną się czyste.

Jeśli komórki zostaną pozostawione zbyt długo, nie będą się prawidłowo różnicować. W odpowiednim czasie szybko zastąp roztwór dysocjacyjny 75 mililitrami kolagenazy typu IV i inkubuj komórki przez pięć do 15 minut w temperaturze 37 stopni Celsjusza, sprawdzając hodowlę pod mikroskopem co kilka minut. Kiedy całe kolonie zaczną się odłączać, zastąp kolagenazę 1,5 mililitra pożywki z ludzkimi embrionalnymi komórkami macierzystymi i użyj pipety P1000, aby delikatnie oderwać całe kolonie komórek od dna płytki.

Komórki należy ostrożnie odłączyć, aby kolonie nie rozpadły się na małe kawałki. Następnie użyj pięciomililitrowej pipety, aby przenieść komórki do 15-mililitrowej stożkowej probówki i umyj studzienki jednym mililitrem pożywki z ludzkich embrionalnych komórek macierzystych, gromadząc wszelkie pozostałe komórki w 15-mililitrowej probówce. Po pięciu minutach sedymentacji ostrożnie zastąp supernatant dwoma mililitrami świeżej pożywki z ludzkich embrionalnych komórek macierzystych uzupełnionej podstawowym czynnikiem wzrostu fibroblastów.

Używając nowej pipety o pojemności pięciu mililitrów, przenieś komórki na płytkę o bardzo niskim mocowaniu i inkubuj kolonie przez sześć do 12 godzin. Pod koniec inkubacji użyj pięciomililitrowej pipety, aby ostrożnie przenieść agregaty kolonii do nowej 15-mililitrowej probówki i zebrać pozostałe agregaty za pomocą pożywki RPMI-B27. Gdy kolonie osiądą, zastąp supernatant świeżą pożywką RPMI-B27 uzupełnioną inhibitorem kinazy syntazy glikogenu-3 i ostrożnie przenieś kolonie na płytki pokryte lamininą w celu przyłączenia w temperaturze 37 stopni Celsjusza.

Po 24 godzinach zmień pożywkę na pożywkę RPMI-B27. Po kolejnych 24 godzinach zmień podłoże na RPMI-B27 zawierające IWP2, purmorfaminę i SB43. Pierwsze pobicie obserwuje się zwykle po siedmiu dniach.

Do tej pory protokół różnicowania zawiesiny statycznej został przetestowany na pięciu liniach ludzkich embrionalnych komórek macierzystych i czterech indukowanych przez człowieka pluripotencjalnych komórek macierzystych, w wyniku czego ponad 90% pokonało sferoidy z każdej linii, co świadczy o wysokiej odtwarzalności tego protokołu wśród różnych linii ludzkich pluripotencjalnych komórek macierzystych. Różnicujące się sferoidy wykazują podobne zachowanie w środowisku bioreaktora z mieszaną zawiesiną, jak w układzie statycznym, przy czym około 100% sferoid obserwuje się bicie w 10 dniu. Rzeczywiście, bijące skrawki sferoidalne zebrane w 30 dniu ujawniają cytoplazmatyczną i jądrową ekspresję sercowej troponiny T i sercowego czynnika transkrypcyjnego NKX2,5 odpowiednio.

Co więcej, gdy niezróżnicowane sferoidy są zastępowane niezróżnicowanymi agregatami komórkowymi, bijące skupiska pojawiają się siedem dni po różnicowaniu. Z 42 testowanymi indukowanymi przez człowieka liniami pluripotencjalnych komórek macierzystych, generującymi średnio ponad 60% populacji komórek sercowych T z troponiną T do 15 dnia. Klastry dudniące wykazują również podobną ekspresję cytoplazmatyczną troponiny T i NKX2,5 w sercu, jak obserwowano w przypadku sferoid generowanych przez bioreaktor z mieszaną zawiesiną.

Podejmując tę procedurę, należy pamiętać o użyciu hPSC, które zostały przystosowane do hodowli pojedynczej komórki przez co najmniej trzy pasaże przed różnicowaniem w bioreaktorze. Procedura ta może być łączona z innymi metodami wzbogacania kardiomiocytów w celu uzyskania czystej populacji komórek. Technika ta utorowała drogę do komercjalizacji kardiomiocytów pochodzących z hPSC.

Ma potencjał do wykorzystania w zastosowaniach klinicznych, farmaceutycznych, inżynierii tkankowej oraz rozwoju narządów lub organoidów. Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak skutecznie różnicować ludzkie pluripotencjalne komórki macierzyste w kardiomiocyty i zwiększać skalę hodowli w bioreaktorze.