Produkcja kardiomiocytów na dużą skalę z ludzkich pluripotencjalnych komórek macierzystych przy użyciu wysoce powtarzalnego protokołu różnicowania opartego na małych cząsteczkach

Ogólnym celem niniejszego eksperymentu jest wydajna i powtarzalna różnicowanie ludzkich pluripotencjalnych komórek macierzystych w kardiomiocyty. Protokół ten można skalować w bioreaktorze lub zmodyfikować dla różnicowania linii komórkowych wrażliwych na hodowlę pojedynczych komórek. Metoda ta może pomóc w odpowiedzi na kluczowe pytania w modelowaniu chorób serca z wykorzystaniem ludzkich indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych.

Głównymi zaletami tej techniki są jej niski koszt oraz wysoka wydajność, powtarzalność i możliwość zastosowania zarówno w przypadku ludzkich embrionalnych, jak i indukowanych pluripotentnych komórek macierzystych. Naszym dzisiejszym demonstratorem jest Hananeh Fonoudi, obecnie doktorantka w Victor Chang Cardiac Research Institute, współpracująca z nami z Instytutu Royan. Przed powlekaniem należy użyć szczoteczki czyszczącej i wody destylowanej, aby dokładnie usunąć wszelki kurz lub pozostałości hodowli z 100 mililitrowej kolby do hodowli w zawiesinie z szklanym wahadłem.

Następnie napełnij kolbę 70% etanolem. Po 30 minutach wypłucz kolbę wodą destylowaną i napełnij ją pięciomolarnym wodorotlenkiem sodu. Następnego dnia rano płucz kolbę pod bieżącą wodą przez pięć minut, a następnie napełnij ją jednomolarnym kwasem solnym.

Po 15 minutach płucz kolbę pod bieżącą wodą przez kolejne pięć minut, a następnie dwukrotnie przepłucz ją wodą dwukrotnie destylowaną. Umieść kolbę w komorze z laminarnym przepływem powietrza w celu wysuszenia. Następnie wlej do kolby 1,5 milliliters roztworu do silikonizacji i obracaj kolbę w płaszczyźnie poziomej, aby pokryć wszystkie powierzchnie silikonem.

Podgrzewaj powleczoną kolbę w suchym piekarniku przez jedną godzinę w temperaturze 100 °C. Po ostygnięciu kolby płucz ją trzy razy przez 15 minut wodą dejonizowaną. Następnie wysterylizuj naczynie w autoklawie w temperaturze 121 °C przez 20 minut.

Po co najmniej trzykrotnym pasażowaniu niezróżnicowanych sferoidów przy użyciu metody pasażowania pojedynczych komórek, za pomocą pipety pięciomililitrowej przenieś wszystkie niezróżnicowane sferoidy do 15-mililitrowej probówki stożkowej. Przemyj studzienki jednym mililitrem pożywki dla ludzkich embrionalnych komórek macierzystych, aby zebrać pozostałe sferoidy, a następnie połącz płuczkę z zebranymi sferoidami. Pozostaw sferoidy na pięć minut w celu sedymentacji i utworzenia luźnego osadu.

Następnie odessaj supernatant, uważając, aby nie usunąć sferoidów. Dalej przepłucz sferoidy jednym mililitrem PBS przez pięć minut, a następnie inkubuj je w 5 mililitrach Trypsyny EDTA w temperaturze 37 °C. Po czterech do pięciu minutach zatrzymaj reakcję, dodając jeden mililitr pożywki dla ludzkich embrionalnych komórek macierzystych, i użyj pipety P1000, aby rozbić sferoidy do postaci zawiesiny pojedynczych komórek.

Po policzeniu komórek metodą wykluczania błękitu trypanu, zawiesić je ponownie w stężeniu 200 000 komórek na mililitr w medium warunkowanym uzupełnionym o podstawowy czynnik wzrostu fibroblastów i inhibitor ROCK, a następnie przenieść 100 mililitrów zawiesiny komórkowej do silikonizowanej kolby bioreaktora. Umieścić kolbę na mieszadle przy 35 RPM. Po 24 godzinach zwiększyć prędkość mieszania do 40 RPM.

Po 48 godzinach przerwać mieszanie na pięć do dziesięciu minut, aż wszystkie odtworzone sferoidy opadną na dno kolby, a następnie zastąpić połowę medium medium warunkowanym uzupełnionym o podstawowy czynnik wzrostu fibroblastów. Następnie ponownie uruchomić mieszadło przy 40 RPM na kolejne 24 godziny, wymieniając połowę medium w ten sam sposób każdego dnia przez następne trzy dni. Piątego dnia przerwać pracę mieszadła na pięć do dziesięciu minut.

Następnie przenieś wszystkie sferoidy do probówki o pojemności 50 ml w 50 ml lub mniejszej objętości medium. Wylej pozostałe medium z kolby, upewniając się, że w naczyniu nie pozostały żadne sferoidy. Następnie ostrożnie usuń supernatant znad osiadłych sferoidów i przemyj skupiska komórek w 25 ml PBS z dodatkiem wapnia i magnezu.

Po pięciu do dziesięciu minutach usunąć płuczkę i ponownie zawiesić sferoidy w 40 mililitrach pożywki RPMI-B27 uzupełnionej o inhibitor kinazy syntazy glikogenu-3, inhibitor ROCK oraz alkohol poliwinylowy. Przenieść wszystkie sferoidy z powrotem do kolby bioreaktora. Następnie dodać świeżą pożywkę RPMI-B27 do uzyskania całkowitej objętości 100 mililitrów i ponownie uruchomić mieszanie z prędkością 40 RPM.

Po 24 godzinach powtórz tę samą procedurę w celu wymiany pożywki na medium RPMI-B27. Po kolejnych 24 godzinach powtórz tę samą procedurę i wymień pożywkę na RPMI-B27 z dodatkiem IWP2, purmorfaminy i SB43. Pozostaw na 48 godzin.

Pierwsze skurcze są zazwyczaj obserwowane po siedmiu dniach. W celu szybkiej różnicowania linii ludzkich pluripotencjalnych komórek macierzystych, które nie zostały przystosowane do hodowli pojedynczych komórek, należy najpierw potraktować hodowlę ludzkich pluripotencjalnych komórek macierzystych o stopniu konfluencji od 70 do 80%, hodowanych na komórkach zarodkowych fibroblastów mysich, 5 ml roztworu dysocjującego przez 30 do 60 sekund. Roztwór dysocjujący należy pozostawić tylko do momentu, gdy MEF przyjmą kształt kulisty, a krawędzie kolonii hPSC staną się wyraźne.

Jeśli komórki pozostaną w tej fazie zbyt długo, nie zróżnicują się prawidłowo. W odpowiednim momencie szybko zastąp roztwór dysocjujący 75 ml kollagenazy typu IV i inkubuj komórki od 5 do 15 minut w temperaturze 37 °C, kontrolując kulturę pod mikroskopem co kilka minut. Gdy całe kolonie zaczną się odrywać, zastąp kollagenazę 1,5 ml pożywki dla ludzkich embrionalnych komórek macierzystych i za pomocą pipety P1000 delikatnie oddziel całe kolonie komórek od dna płytki.

Komórki należy ostrożnie odseparować, aby kolonie nie rozpadły się na małe fragmenty. Następnie, za pomocą pipety o pojemności pięciu mililitrów, przenieść komórki do probówki stożkowej o pojemności 15 mililitrów i przemyć dołki jednym mililitrem pożywki dla ludzkich embrionalnych komórek macierzystych, zbierając pozostałe komórki do probówki 15 ml. Po pięciu minutach sedymentacji ostrożnie zastąpić supernatant dwoma mililitrami świeżej pożywki dla ludzkich embrionalnych komórek macierzystych uzupełnionej o podstawowy czynnik wzrostu fibroblastów.

Za pomocą nowej pipety 5 ml przenieś komórki do płytki o ultra niskiej adhezji i inkubuj kolonie przez 6 do 12 godzin. Po zakończeniu inkubacji użyj pipety 5 ml, aby ostrożnie przenieść agregaty kolonii do nowej probówki 15 ml, a pozostałe agregaty zbierz, przepłukując podłożem RPMI-B27. Po osiadaniu kolonii zastąp supernatant świeżym podłożem RPMI-B27 uzupełnionym o inhibitor kinazy syntazy glikogenu-3 i ostrożnie przenieś kolonie na płytki powlekane lamininą w celu adhezji w temperaturze 37 °C.

Po 24 godzinach należy wymienić medium na medium RPMI-B27. Po kolejnych 24 godzinach należy wymienić medium na RPMI-B27 zawierające IWP2, purmorfaminę i SB43. Pierwsze skurcze zazwyczaj obserwuje się po siedmiu dniach.

Do tej pory protokół różnicowania w statycznej zawiesinie przetestowano na pięciu liniach ludzkich embrionalnych komórek macierzystych i czterech liniach ludzkich indukowanych pluripotentnych komórek macierzystych, co pozwoliło uzyskać ponad 90% bijących sferoidów z każdej linii, wykazując wysoką powtarzalność tego protokołu w różnych liniach ludzkich pluripotentnych komórek macierzystych. Różnicujące się sferoidy wykazują podobne zachowanie w środowisku bioreaktora z mieszaną zawiesiną, co w systemie statycznym, przy czym w 10. dniu zaobserwowano bicie około 100% sferoidów. Co więcej, sekcje bijących sferoidów pobrane w 30. dniu wykazują odpowiednio cytoplazmatyczną i jądrową ekspresję troponiny T serca oraz czynnika transkrypcyjnego serca NKX2.5.

Ponadto, gdy niediferencjonowane sferoidy zostaną zastąpione niediferencjonowanymi agregatami komórkowymi, bijące skupiska pojawiają się siedem dni po rozpoczęciu różnicowania. W 42 badanych liniach ludzkich indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych wygenerowano średnio ponad 60% populacji komórek wykazujących pozytywną ekspresję troponiny T serca do 15. dnia. Bijące skupiska wykazują również podobną cytozmatyczną ekspresję troponiny T serca oraz jądrową ekspresję NKX2.5, jaką zaobserwowano w przypadku sferoidów wytworzonych w bioreaktorze z mieszanym zawieszeniem.

Podczas wykonywania tej procedury należy pamiętać o użyciu hPSC, które były adaptowane do hodowli pojedynczych komórek przez co najmniej trzy pasaże przed różnicowaniem w bioreaktorze. Procedurę tę można połączyć z innymi metodami wzbogacania kardiomiocytów w celu uzyskania czystej populacji komórek. Technika ta utorowała drogę do komercjalizacji kardiomiocytów pochodzących z hPSC.

Metoda ta ma potencjał do zastosowania w badaniach klinicznych, farmaceutycznych, inżynierii tkankowej oraz w rozwoju organów lub organoidów. Po obejrzeniu tego filmu powinni Państwo posiąść rzetelną wiedzę na temat efektywnego różnicowania ludzkich pluripotencjalnych komórek macierzystych w kardiomiocyty oraz skalowania ich hodowli w bioreaktorze.