Name: Oparte na interferencji RNA badanie funkcji białka szoku cieplnego 27 podczas gojenia się ran nabłonka rogówki (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-09-27T12:30:00.000+00:00
Duration: 8 min 34 s
Description: Poznaj metodę interferencji RNA w badaniu funkcji białka HSP27 podczas gojenia ran nabłonka rogówki. Technika ta pozwala ocenić rolę białka szoku cieplnego w procesie regeneracji tkanek.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

To badanie było wspierane przez Student Research Grant (13-14) University of Ulsan College of Medicine, Seul, Korea oraz grant (2014-464) od Asan Institute for Life Sciences, Seul, Korea.

1. Linia komórkowa
<ol>
	<li>Hodowla 106 unieśmiertelnionych telomerazą ludzkich komórek nabłonka rogówki (HCEC) na 6-dołkowej płytce (gęstość: 1039,9 komórki/mm2) w inkubatorze o temperaturze 37 °C z atmosferą 5%CO2 przy użyciu pożywki do wzrostu nabłonka oskrzeli (BEGM), aż osiągną 95% zbieżności.</li>
</ol>
2. Analiza Western Blot po utworzeniu nabłonkowych ran po zadrapaniach
<ol>
	<li>Sterylną końcówkę pipety o pojemności 200 μl przetoczyć po powierzchni studzienki z nalewającymi się kulturami HCEC cztery razy na szalkę w komorze bezpieczeństwa biologicznego (klasa II, typ A2) i oddzielnie inkubować HCEC w inkubatorze o temperaturze 37 °C w atmosferze 5%CO2 przez 1, 5, 10, 30, 60 i 120 minut.</li>
	<li>Użyj jednej płytki 6-dołkowej do sześciu różnych próbek w zależności od czasu inkubacji po zranieniu nabłonka rogówki.</li>
	<li>Przemyć zranione monowarstwy HCEC trzykrotnie 1x PBS, a następnie dodać 2,0 ml BEGM do każdej studzienki.</li>
	<li>Odłączyć HCEC, używając 2 ml 0,25% kwasu trypsynowo-etylenodiaminotetraoctowego (EDTA) na studzienkę przez 5 minut, odwirować przy 900 x g przez 5 minut w probówce o pojemności 15 ml i odessać trypsynę-EDTA za pomocą pipety o pojemności 1 ml.</li>
	<li>Zawiesić HCEC za pomocą 1 ml 1x PBS i przenieść je do probówki o pojemności 1,5 ml.</li>
	<li>Odwirować HCEC przy 10 000 x g przez 15 sekund i odessać 1x PBS za pomocą pipety o pojemności 1 ml.</li>
	<li>Zawiesić HCEC w 100 μl lodowatego buforu do lizy (10 mM Tris, 10 mM NaCl, 2 mM EDTA, 25 mM NaF, 2 mM Na3VO4, 1 mM fluorku fenylometanosulfonylu [PMSF], inhibitorach proteazy [1 μM pepstatyna A, 1 μM leupeptyna i 0,1 μM aprotynina] oraz 0,5% Triton X-100 [pH 7]) i dobrze je wymieszać.</li>
	<li>Inkubuj komórki przez 30 minut na lodzie, aby wywołać lizę komórek.</li>
	<li>Odwirować lizaty w temperaturze 4 °C przy 10 000 x g przez 15 minut, a następnie przenieść supernatanty do świeżych probówek o pojemności 1,5 ml (podwielokrotności 90 μl) i przechowywać je w temperaturze -80 °C.</li>
	<li>Określ całkowite stężenia białek w lizatach komórkowych za pomocą testu białek Bradforda. 9</li>
	<li>Załaduj 30 μg całkowitych białek komórkowych do 10% lub 12% żelu akrylowego do elektroforezy w żelu dodecylosiarczanowo-poliakrylamidowym dodecylu sodu (SDS-PAGE), a następnie elektroforetycznie przenieś oddzielone pasma białkowe do filtrów nitrocelulozowych prądem 200 mA przez 1 godzinę w temperaturze 4 °C do użycia w testach western blot.</li>
	<li>Zablokować nitrocelulozowe membrany filtracyjne 5% odtłuszczonym mlekiem w soli fizjologicznej buforowanej Tris z Tween 20 (TBST) na 1 godzinę, dodać pierwszorzędowe królicze przeciwciała poliklonalne przeciwko niefosforylowanemu HSP27 (rozcieńczenie 1:1,000) lub pierwotnemu króliczemu przeciwciału poliklonalnemu przeciwko fosforylowanemu HSP27 (rozcieńczenie 1:1,000) w 5% albuminie surowicy bydlęcej (BSA) i inkubować błony przez noc w temperaturze 4 °C na shakerze.</li>
	<li>Wykryj prążki immunoreaktywne za pomocą kozich przeciwciał anty-króliczych sprzężonych z peroksydazą chrzanową (rozcieńczenie 1:10 000) w 5% BSA po przemyciu przez 10 minut 3 razy TBST.</li>
	<li>Inkubować błonę w odczynnikach western blotting luminol (6-7 ml na 10 cm × 5 cm membrany) przez 1 minutę w temperaturze pokojowej.</li>
	<li>Usuń membranę z roztworu odczynnika, usuń nadmiar płynu chłonnym ręcznikiem i umieść w plastikowym ochraniaczu na arkusz.</li>
	<li>Pracując w ciemnym pomieszczeniu z bezpiecznym światłem, umieść zakrytą membranę w kasecie z filmem stroną z białkiem skierowaną do góry.</li>
	<li>Umieść film rentgenowski na membranie i naświetlaj przez 1 minutę.</li>
</ol>
3. Test transfekcji siRNA10
<ol>
	<li>Hodowla HCEC w 5×105 komórek/basenik na 6-dołkowej płytce w inkubatorze o temperaturze 37 °C z 5% atmosferą CO2 przy użyciu BEGM aż do osiągnięcia 95% konfluencji.</li>
	<li>Rozcieńczyć odczynnik do transfekcji (2,5 lub 7,5 μl) 100 μl zredukowanej pożywki surowicy do transfekcji (współczynnik rozcieńczenia wynosił 41 lub 14,3) i rozpuścić specyficzne dla HSP27 i zakodowane kontrolne siRNA w 100 μl zredukowanej pożywki surowicy, aby wytworzyć 10 lub 50 nM specyficznego dla HSP27 i zakodowanego kontrolnego siRNA.</li>
	<li>Zmieszać 100 μl roztworu siRNA ze 100 μl rozcieńczonego odczynnika do transfekcji (stosunek 1:1) i inkubować mieszaninę przez 15 minut w temperaturze pokojowej.</li>
	<li>Dodaj kompleksy siRNA-lipid do komórek. Następnie, po 4 godzinach, zmienić pożywkę, aby zakończyć BEGM i inkubować komórki przez 2 dni w temperaturze 37 °C.</li>
	<li>Analizować transfekowane komórki metodą western blot, zgodnie z opisem w punktach 4.1 do 4.7.</li>
</ol>
4. Test Western Blot dla komórek transfekowanych siRNA11
<ol>
	<li>Ekstrahować HCEC transfekowane siRNA specyficzne dla HSP27 i zaszyfrowane w komorze bezpieczeństwa biologicznego przy użyciu 100 μl lodowatego buforu do lizy (10 mM Tris, 10 mM NaCl, 2 mM kwas etylenodiaminotetraoctowy (EDTA), 25 mM NaF, 2 mM Na3VO4, 1 mM fluorek fenylometanosulfonylu (PMSF), inhibitory proteazy i 0,5% Triton X-100, pH 7).</li>
	<li>Inkubuj komórki przez 30 minut na lodzie, aby wywołać lizę komórek.</li>
	<li>Granulki lizaty w ilości 10 000 x g przez 15 minut, a następnie przenieść supernatanty do świeżych probówek o pojemności 1,5 ml (podwielokrotności 90 μl) i przechowywać je w temperaturze -80 °C.</li>
	<li>Określ stężenia białek w lizatach komórkowych za pomocą testu białka Bradforda. 9</li>
	<li>Załadować próbki z równymi ilościami wszystkich białek komórkowych na 10% lub 12% żelu akrylowym, poddać żel SDS-PAGE i elektroforetycznie przenieść oddzielone pasma białkowe do filtrów nitrocelulozowych prądem 200 mA przez 1 godzinę w temperaturze 4 °C do stosowania w testach western blot.</li>
	<li>Zablokuj nitrocelulozowe membrany filtracyjne z 5% odtłuszczonym mlekiem w soli fizjologicznej buforowanej Tris z Tween 20 (TBST) przez 1 godzinę, dodaj pierwszorzędowe przeciwciała przeciwko fosforylowanemu i niefosforylowanemu HSP27 (rozcieńczenie 1:1,000), fosforylowanemu Aktowi (rozcieńczenie 1:1,000), niefosforylowanemu Aktowi (rozcieńczenie 1:1,000, stosowane jako marker przeżycia komórki), białku X związanemu z Bcl-2 (rozcieńczenie 1:1,000, stosowane jako białko proapoptotyczne) i dehydrogenazie 3-fosforanowej aldehydu glicerynowego (GAPDH; rozcieńczenie 1:200, stosowany jako kontrola obciążenia) w 5% albuminie surowicy bydlęcej (BSA) i inkubować błony przez noc w temperaturze 4 °C na wytrząsarce.</li>
	<li>Wykryj prążki immunoreaktywne za pomocą kozich przeciwciał anty-króliczych sprzężonych z peroksydazą chrzanową (rozcieńczenie 1:10 000) w 5% BSA po 3-krotnym umyciu TBST, 10 minut każde pranie.</li>
	<li>Inkubować błonę w odczynnikach western blotting luminol (6-7 ml na 10 cm × 5 cm membrany) przez 1 minutę w temperaturze pokojowej.</li>
	<li>Usuń membranę z roztworu odczynnika, usuń nadmiar płynu chłonnym ręcznikiem i umieść w plastikowym ochraniaczu na arkusz.</li>
	<li>Pracując w ciemnym pomieszczeniu z bezpiecznym światłem, umieść zakrytą membranę w kasecie z folią stroną z białkiem skierowaną do góry.</li>
	<li>Umieść film rentgenowski na membranie i naświetlaj przez 1 minutę.</li>
</ol>
5. Test kierunkowego zranienia wywołanego zadrapaniami Ocena migracji komórek12
<ol>
	<li>W komorze bezpieczeństwa biologicznego wykonaj ranę, przeciągając sterylną końcówkę pipety po powierzchni studzienki z konfluentnymi kulturami HCEC transfekowanych siRNA specyficznych dla HSP27 lub zakodowanych HCEC transfekowanych siRNA w kontroli.</li>
	<li>Natychmiast po zranieniu przemyć komórki dwukrotnie solą fizjologiczną buforowaną 1x fosforanem (PBS) i utrzymywać je w kulturach BEGM w inkubatorze o temperaturze 37 °C z atmosferą 5%CO2 przez 24 godziny po zranieniu.</li>
	<li>Fotografuj obrazy HCEC za pomocą mikroskopu pionowego w powiększeniu 100x 24 godziny po zranieniu i wykonaj spłaszczanie tła za pomocą polecenia Filtruj w oprogramowaniu do analizy obrazu.</li>
	<li>Za pomocą polecenia Wybierz pomiary zdefiniuj obszar zainteresowania (AOI) o kształcie wielokąta o tym samym rozmiarze, który może pokrywać się prostopadle od końca do końca początkowej rany, i określ trzy różne obszary zainteresowania w zranionym obszarze każdej próbki.</li>
	<li>Automatycznie zliczaj liczbę komórek w każdym polu, korzystając z opcji menu Miara liczby/rozmiaru.</li>
</ol>
6. Analiza apoptozy metodą cytometrii przepływowej
<ol>
	<li>Hodowla swoistych dla HSP27 komórek transfekowanych siRNA i kontrola transfekowanych siRNA HCEC zawierających każde 10 nM siRNA w stężeniu 5×105 komórek/dołek na płytkach 6-dołkowych, aż komórki osiągną 95% konfluencji w inkubatorze o temperaturze 37 °C z 5% atmosferą CO2 w BEGM.</li>
	<li>Odłączyć HCEC, używając 2 ml 0,25% trypsyny-EDTA na studzienkę przez 5 minut, odwirować przy 900 x g przez 5 minut w probówce o pojemności 15 ml i odessać trypsynę-EDTA za pomocą pipety o pojemności 1 ml.</li>
	<li>Umyj komórki dwukrotnie zimnym PBS, a następnie ponownie zawieś komórki w 1x buforze wiążącym (0,1 M HEPES/NaOH [pH 7,4], 1,4 M NaCl i 25 mM CaCl2) w stężeniu 106 komórek/ml.</li>
	<li>Przenieść 100 μl zawiesiny komórek (1 x 105 komórek) do probówki hodowlanej o pojemności 5 ml.</li>
	<li>Dodać 5 μl aneksyny V sprzężonej z izotiocyjanianem fluoresceiny i 5 μl jodku propidyny.</li>
	<li>Delikatnie zwiruj komórki i inkubuj je przez 15 minut w temperaturze pokojowej w ciemności.</li>
	<li>Dodaj 200 μl 1x buforu wiążącego do każdej probówki i przeanalizuj komórki za pomocą cytometru przepływowego w ciągu 1 godziny.</li>
</ol>

<ol><li>Dua, H. S., Gomes, J. A., Singh, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Corneal+epithelial+wound+healing%5BTitle%5D)+AND+%22Br.+J.+Ophthalmol%22%5BJournal%5D)">Corneal epithelial wound healing.</a> Br. J. Ophthalmol. 78 (5), 401-408 (1994).</li>
<li>Estil, S., Primo, E. J., Wilson, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Apoptosis+in+shed+human+corneal+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Invest.+Ophthalmol.+Vis.+Sci%22%5BJournal%5D)">Apoptosis in shed human corneal cells.</a> Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 41 (11), 3360-3364 (2000).</li>
<li>Guay, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+actin+filament+dynamics+by+p38+map+kinase-mediated+phosphorylation+of+heat+shock+protein+27%5BTitle%5D)+AND+%22J.+cell.+Sci%22%5BJournal%5D)">Regulation of actin filament dynamics by p38 map kinase-mediated phosphorylation of heat shock protein 27.</a> J. cell. Sci. 110, Pt 3 357-368 (1997).</li>
<li>Park, J. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differential+expression+of+heat+shock+protein+mRNAs+under+in+vivo+glutathione+depletion+in+the+mouse+retina%5BTitle%5D)+AND+%22Neurosci.+Lett%22%5BJournal%5D)">Differential expression of heat shock protein mRNAs under in vivo glutathione depletion in the mouse retina.</a> Neurosci. Lett. 413 (3), 260-264 (2007).</li>
<li>Rane, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Heat+shock+protein+27+controls+apoptosis+by+regulating+Akt+activation%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">Heat shock protein 27 controls apoptosis by regulating Akt activation.</a> J. Biol. Chem. 278 (30), 27828-27835 (2003).</li>
<li>Shin, K. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Blocking+tumor+cell+migration+and+invasion+with+biphenyl+isoxazole+derivative+KRIBB3%2C+a+synthetic+molecule+that+inhibits+Hsp27+phosphorylation%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">Blocking tumor cell migration and invasion with biphenyl isoxazole derivative KRIBB3, a synthetic molecule that inhibits Hsp27 phosphorylation.</a> J. Biol. Chem. 280 (50), 41439-41448 (2005).</li>
<li>Jain, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expression+of+phosphorylated+heat+shock+protein+27+during+corneal+epithelial+wound+healing%5BTitle%5D)+AND+%22Cornea%22%5BJournal%5D)">Expression of phosphorylated heat shock protein 27 during corneal epithelial wound healing.</a> Cornea. 31 (7), 820-827 (2012).</li>
<li>Alekseev, O. M., Richardson, R. T., Alekseev, O., O'Rand, M. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+gene+expression+profiles+in+HeLa+cells+in+response+to+overexpression+or+siRNA-mediated+depletion+of+NASP%5BTitle%5D)+AND+%22Reprod.+Biol.+Endocrinol%22%5BJournal%5D)">Analysis of gene expression profiles in HeLa cells in response to overexpression or siRNA-mediated depletion of NASP.</a> Reprod. Biol. Endocrinol. 7, 45(2009).</li>
<li>Park, H. Y., Kim, J. H., Lee, K. M., Park, C. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effect+of+prostaglandin+analogues+on+tear+proteomics+and+expression+of+cytokines+and+matrix+metalloproteinases+in+the+conjunctiva+and+corea%5BTitle%5D)+AND+%22Exp.+Eye.+Res%22%5BJournal%5D)">Effect of prostaglandin analogues on tear proteomics and expression of cytokines and matrix metalloproteinases in the conjunctiva and corea.</a> Exp. Eye. Res. 94 (1), 13-21 (2012).</li>
<li>Voegeli, T. S., Currie, R. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((siRNA+knocks+down+Hsp27+and+increases+angiotensin+II-induced+phosphorylated+NF-kappaB+p65+levels+in+aortic+smooth+muscle+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Inflamm.+Res%22%5BJournal%5D)">siRNA knocks down Hsp27 and increases angiotensin II-induced phosphorylated NF-kappaB p65 levels in aortic smooth muscle cells.</a> Inflamm. Res. 58 (6), 336-343 (2009).</li>
<li>Shi, B., Isseroff, R. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Arsenite+pre-conditioning+reduces+UVB-induced+apoptosis+in+corneal+epithelial+cells+through+the+anti-apoptotic+activity+of+27+kDa+heat+shock+protein+%28HSP27%29%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cell.+Physiol%22%5BJournal%5D)">Arsenite pre-conditioning reduces UVB-induced apoptosis in corneal epithelial cells through the anti-apoptotic activity of 27 kDa heat shock protein (HSP27).</a> J. Cell. Physiol. 206 (2), 301-308 (2006).</li>
<li>Shen, E. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparison+of+corneal+epitheliotrophic+capacity+among+different+human+blood-derived+preparations%5BTitle%5D)+AND+%22Cornea%22%5BJournal%5D)">Comparison of corneal epitheliotrophic capacity among different human blood-derived preparations.</a> Cornea. 30 (2), 208-214 (2011).</li>
<li>Song, I. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Heat+shock+protein+27+phosphorylation+is+involved+in+epithelial+cell+apoptosis+as+well+as+epithelial+migration+during+corneal+epithelial+wound+healing%5BTitle%5D)+AND+%22Exp+Eye+Res%22%5BJournal%5D)">Heat shock protein 27 phosphorylation is involved in epithelial cell apoptosis as well as epithelial migration during corneal epithelial wound healing.</a> Exp Eye Res. 118 (1), 36-41 (2014).</li>
</ol>

Autorzy nie mają żadnych interesów finansowych ani majątkowych w odniesieniu do jakichkolwiek materiałów lub metod wymienionych w niniejszym opracowaniu.

W niniejszym badaniu oceniliśmy potencjalną rolę HSP27 w zranianiu nabłonka rogówki przy użyciu metod in vitro . Kluczowe etapy obejmowały transfekcję siRNA w celu knock-down HSP27 w celu obserwacji funkcji HSP27 w komórkach poddanych stresowi. Warto zauważyć, że rola HSP27 została ujawniona w tych eksperymentach w migracji komórek nabłonka i apoptozie podczas gojenia się ran nabłonka rogówki. W przeciwieństwie do poprzednich badań10 , w których wykorzystano siRNA specyficzne dla HSP27 szczurów do tra...

Komórki nabłonka rogówki (CEC) są nieustannie zrzucane do filmu łzowego, podczas gdy są jednocześnie zastępowane przez komórki z warstwy podstawnej rąbka i nabłonka rogówki. 1 Różne zewnętrzne czynniki stresogenne mogą indukować apoptozę i złuszczanie CEC. 2 Białka szoku cieplnego (HSP) są wysoce konserwatywne i można je podzielić na dwie rodziny w zależności od wielkości cząsteczki. 3 Największa rodzina HSP obejmuje HSP90, HSP70 i HSP60, a mniejsza rodzina HSP27. 4 Wiadomo, że fosforylacja HSP27 odgrywa ważną rolę w przetrwaniu komórek i jest niezbędna do migracji komórek ze względu na rolę tego białka w przebudowie aktyny. 5-7 Dlatego podjęliśmy próbę przetestowania potencjalnej roli fosforylacji HSP27 w migracji CEC i apoptozie w modelu gojenia się ran nabłonkowych in vitro.
Interferencja RNA (RNAi) wykorzystująca małe lub krótkie interferujące RNA (siRNA) wzbudziła zainteresowanie zarówno w biologii podstawowej, jak i stosowanej, ponieważ potencjalnie pozwala na obniżenie ekspresji dowolnego interesującego genu. 8 W niniejszym artykule wykorzystano siRNA specyficzne dla HSP27 do oceny udziału HSP27 w gojeniu się ran i apoptozie CEC. Tradycyjne metody RNAi do knock-downu genów w komórkach wykorzystują syntetyczne dupleksy RNA, w tym dwa niemodyfikowane 21-merowe oligonukleotydy, które można złożyć w celu wytworzenia siRNA. RNAi siRNA, którego użyliśmy w tym badaniu, jest prostą i bardzo wydajną metodą transfekcji komórek, a ten odczynnik działa z różnymi unieśmiertelnionymi liniami komórkowymi. W niniejszym badaniu pokazujemy metody zastosowane do tej analizy, w tym kierunkowy test rany wywołany zadrapaniem, western blotting, test transfekcji siRNA, test immunofluorescencji i cytometrię przepływową.

<table><tbody><tr><td>Szafa bezpieczeństwa biologicznego</td><td>CHC LAB Co., Ltd,&nbsp; Daejeon, Korea Południowa&nbsp;</td><td>CHC-777A2-06</td><td>Klasa II, Typ A2&nbsp;</td></tr><tr><td>Stealth RNAi&trade; siRNA</td><td>Thermo Fisher Scientific, Inc., Waltham, MA</td><td></td><td>RNAi siRNA; zaszyfrowane siRNA kontrolne i swoiste dla HSP27 siRNA</td></tr><tr><td>BEGMTMLonza</td><td>, Inc., Walkersville, MD</td><td>CC-3171, CC4175</td><td>Pożywka do wzrostu nabłonka oskrzeli&nbsp;</td></tr><tr><td>Inhibitor proteazy&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich, Inc., St. Louis, MO</td><td>P8340 ,P7626</td><td>1 &#956; M Pepstatyna A, 1 &#956; M Leupeptin, 0,1 i #956; Test białka M Aprotynina</td></tr><tr><td>Bradforda&nbsp;</td><td>Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA</td><td>#500-0001</td><td>Test białka Bradford&nbsp;</td></tr><tr><td>Filtry nitrocelulozowe&nbsp;</td><td>Amersham, Little Chalfont, Wielka Brytania</td><td>RPN3032D</td><td>Membrana Western blotting</td></tr><tr><td>Niefosforylowany HSP27&nbsp;</td><td>Abcam Inc., Cambridge, MA</td><td>ab12351</td><td>Rozcieńczenie 1:1,000 (Total HSP27)</td></tr><tr><td>Fosforylowane HSP27 (Ser85)</td><td>Abcam Inc., Cambridge, MA</td><td>ab5594</td><td>Rozcieńczenie 1:1,000 HSP27 fosforylowano w Ser85</td></tr><tr><td>Odczynnik lipofekctaminy&reg; RNAiMAX&nbsp;</td><td>Invitrogen, Carlsbad, CA</td><td>13-778-075</td><td>Odczynnik do transfekcji</td></tr><tr><td>Fosforylowany Akt (Ser473)</td><td>Technologia sygnalizacji komórkowej, Danvers, MA</td><td>nr 4060</td><td>Rozcieńczenie 1:1,000 Akt został ufosforylowany w Ser473 (marker przeżycia komórki)</td></tr><tr><td>Niefosforylowany Akt&nbsp;</td><td>Technologia sygnalizacji komórkowej, Danvers, MA</td><td>nr 4061</td><td>Rozcieńczenie 1:1,000 (Total Akt)</td></tr><tr><td>Białko X związane z Bcl-2&nbsp;</td><td>Technologia sygnalizacji komórkowej, Danvers, MA</td><td>nr 4062</td><td>1:1,000 (antyapoptotyczny marker białkowy)</td></tr><tr><td>GAPDH</td><td>Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA</td><td>nr 4063</td><td>1:1,000 marker kontroli ładowania (gen utrzymania domu)</td></tr><tr><td>Przeciwciała anty-królicze sprzężone z peroksydazą chrzanową Thermo</td><td>Fisher Scientific, Inc., Waltham, MA</td><td>NCI1460KR</td><td>rozcieńczenie 1:10 000</td></tr><tr><td>OPTI-MEM</td><td>Invitrogen, Carlsbad, CA</td><td>31985</td><td>zredukowana pożywka surowicy do transfekcji</td></tr><tr><td>Oprogramowanie do analizy obrazu</td><td>Olympus, Inc., Tokio, Japonia</td><td>Image-Pro Plus 5.0</td><td></td></tr><tr><td>Odtłuszczone mleko w proszku&nbsp;</td><td>Carl Roth GmbH + Co. KG, Karlstruhe, Niemcy</td><td>T145.2</td><td></td></tr><tr><td>Tris&nbsp;</td><td>Amresco LCC, Inc. Solon, OH</td><td>No-0497</td><td></td></tr><tr><td>Chlorek sodu&nbsp;</td><td>Amresco LCC, Inc. Solon, OH</td><td>No-0241</td><td></td></tr><tr><td>Sześciodołkowa płytka</td><td>hodowlana Thermo Fisher Scientific, Inc., Waltham, MA</td><td>140675</td><td>średnica 35,00 mm / studnia</td></tr><tr><td>24-dołkowa miska do hodowli</td><td>Thermo Fisher Scientific, Inc., Waltham, MA</td><td>142475</td><td></td></tr><tr><td>Wytrząsarka orbitalna</td><td>N-Bioteck, Inc., Seul, Korea Południowa</td><td>NB1015</td><td></td></tr><tr><td>Albumina surowicy bydlęcej</td><td>Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA</td><td>sc-2323&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>BDFACSCantoTM II</td><td>BD Biosciences, Franklin Lakes, NJ</td><td></td> Klisz rentgenowski do <td>cytometrii przepływowej</td></tr><tr><td></td><td>Kodak, Rochester, NY</td><td></td><td>Medyczna kaseta rentgenowska z zielonym ekranem 400&nbsp;</td></tr><tr><td>odczynnik do western blot luminol</td><td>Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA</td><td>sc-2048&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Zestaw do wykrywania apoptozy FITC Annexin V I</td><td>BD Biosciences, Franklin Lakes, NJ</td><td>556547</td><td></td></tr></tbody></table>

oparte na interferencji rna badanie funkcji białka szoku cieplnego 27 podczas gojenia się ran nabłonka rogówki

RNA Interference-based Investigation of the Function of Heat Shock Protein 27 during Corneal Epithelial Wound Healing

Małe interferujące RNA (siRNA) jest jedną z najczęściej używanych metod interferencji RNA do krótkoterminowego wyciszania genów kodujących białka. siRNA to syntetyczny dupleks RNA stworzony specjalnie do celowania w transkrypt mRNA w celu wywołania jego degradacji i został wykorzystany do identyfikacji nowych szlaków w różnych procesach komórkowych. Istnieje niewiele doniesień dotyczących roli fosforylowanego białka szoku cieplnego 27 (HSP27) w gojeniu się ran nabłonka rogówki. W tym przypadku hodowane ludzkie komórki nabłonka rogówki podzielono na grupę transfekowaną z zakodowaną kontrolną transfekcją siRNA i grupę transfekowaną siRNA specyficzną dla HSP27. Następnie przeprowadzono testy kierunkowego zranienia wywołanego zadrapaniem, western blot i cytometrię przepływową. Wnioskujemy, że HSP27 odgrywa rolę w gojeniu się ran nabłonka rogówki, które mogą obejmować apoptozę i migrację komórek nabłonka. W tym miejscu znajdują się opisy krok po kroku przygotowania próbki oraz protokół badania.

Ekspresja fosforylowanego HSP27 znacznie wzrosła w 5, 10 i 30 min po zadrapaniu w porównaniu z nieuszkodzonymi HCEC13. Analiza Western blot wykazała, że ekspresja fosforylowanego HSP27 oraz fosforylowanego Akt była znacznie obniżona, natomiast ekspresja Bax była znacznie zwiększona w HCEC transfekowanych specyficznym dla HSP27 siRNA (Rycina 1A-E). Ekspresja fosforylowanego HSP27 była obniżona odpowiednio o 30% i 40% w komórkach transfekowanych 10 nM i 50 nM spe...

Niniejszym przedstawiamy protokół wykorzystania małego interferującego RNA specyficznego dla białka szoku cieplnego 27 (HSP27) do oceny funkcji HSP27 podczas gojenia się ran nabłonka rogówki. Interferencja RNA jest najlepszą metodą skutecznego obniżania ekspresji genów w celu zbadania funkcji białek w różnych typach komórek.

Oparte na interferencji RNA badanie funkcji białka szoku cieplnego 27 podczas gojenia się ran nabłonka rogówki

Small interfering RNA (siRNA) is among the most widely used RNA interference methods for the short-term silencing of protein-coding genes. siRNA is a ...

Ogólnym celem tego testu transfekcji RNA jest wykorzystanie specyficznego dla HSP27 małego interferującego RNA w celu oceny potencjalnej roli HSP27 w gojeniu ran nabłonka rogówki. Metoda ta może pomóc w udzieleniu odpowiedzi na kluczowe pytania dotyczące funkcji białka szoku cieplnego 27 podczas procesu gojenia ran nabłonka. Główną zaletą tej techniki jest to, że małe interferujące RNA to czuły konstrukt RNA stworzony w celu specyficznego targetowania transkryptu mRNA w celu wywołania jego degradacji.Metoda ta była wykorzystywana do identyfikacji nowych celów w ramach różnych procesów komórkowych. Chociaż technika ta pozwala uzyskać wgląd w proces gojenia ran nabłonka rogówki, może ona mieć zastosowanie również w innych układach, takich jak skóra i błony śluzowe. Procedurę zaprezentuje Soon-Suk Kang, technik z mojego laboratorium.Aby rozpocząć tę procedurę, należy hodować ludzkie komórki nabłonka rogówki w płytce sześciodołkowej w pożywce wzrostowej dla nabłonka oskrzeli w temperaturze 37 °C i przy pięciu procentowym stężeniu dwutlenku węgla, aż do osiągnięcia 95% konfluencji. Następnie należy rozcieńczyć 2,5 µl lub 7,5 µl odczynnika do transfekcji w 100 µl pożywki z obniżoną zawartością surowicy do transfekcji. Potem należy rozpuścić specyficzne siRNA dla HSP27 oraz kontrolne siRNA typu scrambled w 100 µl pożywki z obniżoną zawartością surowicy, aby przygotować odpowiednio 10 nM specyficznego siRNA dla HSP27 oraz 15 nM kontrolnego siRNA typu scrambled.Następnie zmieszaj 100 µL roztworu siRNA z 100 µL rozcieńczonego odczynnika do transfekcji i inkubuj mieszaninę przez 15 minut w temperaturze pokojowej. Następnie dodaj kompleksy lipidowo-siRNA do komórek. Po czterogodzinnej inkubacji wymień medium na kompletną pożywkę do wzrostu nabłonka oskrzeli i inkubuj komórki przez dwa dni w temperaturze 37 °C przed przeprowadzeniem analizy western blot.W tym kroku należy poddać ekstrakcji HCEC przetransfekowane specyficznym siRNA przeciwko HSP27 oraz siRNA kontrolnym (scrambled) w komorze z laminarnym przepływem powietrza, używając 100 µL lodowatego buforu do lizy. Następnie inkubować komórki przez 30 minut na lodzie w celu wywołania lizy komórek. Kolejnym krokiem jest wirowanie lizatów przy 10 000 ×g przez 15 minut.Następnie przenieś nadsącz do nowych probówek o pojemności 1,5 ml i przechowuj w temperaturze -80°C. Po tym czasie określ stężenie białek w lizatach komórkowych, wykorzystując analizę białek metodą Bradforda. Następnie nałóż na żel z 10% lub 12% akrylamidem próbki zawierające równe ilości całkowitego białka komórkowego.Poddaj żel elektroforezie SDS-PAGE, a następnie przenieś elektroforetycznie rozdzielone prążki białkowe na filtry nitrocelulozowe przy natężeniu prądu 200 mA przez jedną godzinę w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Następnie zablokuj membrany filtrów nitrocelulozowych 5% roztworem mleka odtłuszczonego w buforze TBST przez jedną godzinę. Po tym czasie dodaj przeciwciała pierwotne i inkubuj membrany przez noc w temperaturze czterech stopni Celsjusza na wytrząsarce.Następnego dnia należy przemyć membrany trzykrotnie roztworem TBST, poświęcając dziesięć minut na każde płukanie. Następnie wykrywa się prążki immunoreaktywne, używając przeciwciał kozich anty-króliczych sprzężonych z peroksydazą chrzanową w pięcioprocentowym BSA. Następnie membrany inkubuje się w odczynnikach luminolowych do western blottingu przez jedną minutę w temperaturze pokojowej.Wyjmij membranę z roztworu odczynnika. Następnie usuń nadmiar cieczy za pomocą chłonnego ręcznika i umieść ją w plastikowej koszulce ochronnej. Po tym czasie umieść osłoniętą membranę w kasecie do filmu, stroną z białkiem skierowaną do góry.Umieść kliszę rentgenowską na membranach i naświetlaj ją przez jedną minutę. W komorze z laminarnym przepływem powietrza wykonaj ranę, przeciągając sterylną końcówkę pipety przez konfluencyjne kultury HCECs przetransfekowanych specyficznym dla HSP27 lub kontrolnym (scrambled) siRNA. Natychmiast po zranieniu przemyj komórki dwukrotnie 1XPBS i utrzymuj je w pożywce do wzrostu nabłonka oskrzeli w temperaturze 37°C i pięciu procent CO2 przez 24 godziny.24 godziny po zranieniu należy wykonać obrazowanie HCEC za pomocą mikroskopu biologicznego przy powiększeniu 100x, a następnie przeprowadzić wyrównywanie tła, korzystając z polecenia filtra w oprogramowaniu do analizy obrazu. Używając polecenia wyboru pomiarów, należy zdefiniować obszar zainteresowania w formie wielokąta o takim rozmiarze, aby pokrywał on pierwotną ranę prostopadle od jednego końca do drugiego. Następnie w obszarze zranienia każdej z próbek należy wyznaczyć trzy różne obszary zainteresowania.Automatycznie policz liczbę komórek w każdym polu, korzystając z opcji menu pomiaru liczby i wielkości (count size measure). Przedstawiona tutaj analiza Western blot wykazała, że ekspresja fosforylowanego HSP27 oraz fosforylowanego Akt była znacznie zredukowana. Natomiast ekspresja białek kontrolnych była znacznie zwiększona w HCEC transfekowanych specyficznym siRNA przeciwko HSP27.Ekspresja fosforylowanego HSP27 została zredukowana odpowiednio o 30% i 40% w komórkach transfektowanych 10 nM i 15 nM specyficznego siRNA przeciwko HSP27, w porównaniu z komórkami transfektowanymi kontrolnym siRNA. Ponadto ekspresja niefosforylowanego HSP27 została zredukowana odpowiednio o 20% i 30% w komórkach transfektowanych 10 nM i 15 nM specyficznego siRNA przeciwko HSP27. Testy migracji w kierunku rany indukowanej metodą scratch wykazały, że 24 godziny po zadaniu rany komórki transfektowane 10 nM i 15 nM specyficznego siRNA przeciwko HSP27 wykazywały ograniczoną migrację.Dodatkowo, w komórkach HCEC przetransfekowanych siRNA specyficznym dla HSP27 odnotowano wyższą częstotliwość apoptycznej i nekrotycznej śmierci komórkowej w porównaniu z komórkami przetransfekowanymi kontrolnym siRNA (scrambled), co wykazano za pomocą cytometrii przepływowej. Po opanowaniu techniki transfekcji RNA proces ten może zostać przeprowadzony w ciągu 24 godzin, jeśli zostanie wykonany prawidłowo. Przestrzeganie powyższych procedur pozwala na stworzenie modelu stanu przypominającego zablokowanie ust, w celu odpowiedzi na dodatkowe pytania, takie jak pierwotna funkcja białka szoku cieplnego 27 w gojeniu ran nabłonka rogówki.Po obejrzeniu tego filmu powinni Państwo dobrze rozumieć, jak wykorzystać specyficzne dla białka szoku cieplnego 27 małe interferujące RNA do oceny potencjalnej roli białka szoku cieplnego 27 w gojeniu ran nabłonka rogówki. Należy pamiętać, że praca z małymi interferującymi RNA i odczynnikami może być niebezpieczna, dlatego podczas wykonywania tych procedur zawsze należy stosować środki ostrożności, takie jak komora z laminarnym przepływem powietrza i maska ochronna.

rna-interference-based-investigation-function-heat-shock-protein-27

Research

JoVE Journal

Genetics

Genetyka

Przykład terapii genowej adenowirusa w ludzkich rogówkach z hodowlą narządów cukrzycowych jest przedstawiony w kierunku normalizacji opóźnionego gojenia się ran i znacznie zmniejszonej ekspresji markerów nabłonkowych komórek macierzystych w tych rogówkach. Opisano również optymalizację tego procesu w kulturach nabłonka rąbka włokanego wzbogaconych komórkami macierzystymi.

Adenowirusowa terapia genowa w keratopatii cukrzycowej: wpływ na gojenie się ran i ekspresję markerów komórek macierzystych w rogówkach i komórkach nabłonka rąbka ludzkiego hodowanych w narządach

Wysokoprzepustowe badanie przesiewowe RNA hamującego małą próbę jest ważnym narzędziem, które może pomóc w szybszym wyjaśnieniu molekularnych mechanizmów chemicznego uszkodzenia nabłonka rogówki. W niniejszym artykule przedstawiono rozwój i walidację modeli i metod ekspozycji do wysokoprzepustowych badań przesiewowych uszkodzeń nabłonka rogówki wywołanych fluorowodorem i chloropikryną.

Wysokoprzepustowe badania przesiewowe SiRNA w kierunku uszkodzenia komórek nabłonka rogówki wywołanego chloropikryną i fluorowodorem

Ten protokół opisuje metodę polegającą na otarciu powierzchni oka myszy i śledzeniu procesu gojenia się ran. Protokół wykorzystuje zadzior oczny do częściowego usunięcia nabłonka powierzchniowego oka u znieczulonych myszy.

Otarcie nabłonka rogówki z zadziorem ocznym jako model gojenia się ran rogówki

Opisano protokół dla modelu hodowli narządów rogówki ex vivo, przydatnego do badań nad gojeniem się ran. Ten system modelowy może być używany do oceny działania środków wspomagających regeneracyjne gojenie lub toksyczność leków w zorganizowanym środowisku wielokomórkowym 3D.

Model hodowli narządów rogówki ex vivo do badań nad gojeniem się ran

Tutaj opisany jest protokół tworzenia centralnej rany po otarciu nabłonka rogówki u myszy za pomocą trepanacji i kija golfowego. Ten model gojenia się ran rogówki jest wysoce powtarzalny i jest obecnie wykorzystywany do oceny upośledzonego gojenia się ran rogówki w kontekście chorób.

Model ścierania nabłonka do badania gojenia się ran rogówki

Tutaj tworzone są modele zwierzęce oparte na myszach i królikach do mechanicznego i chemicznego uszkodzenia nabłonka rogówki, aby przebadać nowe terapie i leżący u ich podstaw mechanizm.

Modele zwierzęce ex vivo i in vivo do mechanicznych i chemicznych urazów nabłonka rogówki

Obecny protokół pokazuje różne etapy związane z uszkodzeniem rogówki embrionalnego pisklęcia in ovo. Regenerujące się lub w pełni odbudowane rogówki mogą być analizowane pod kątem potencjału regeneracyjnego przy użyciu różnych technik komórkowych i molekularnych po zabiegu zranienia.

Badanie bezbliznowatej regeneracji tkanek w zarodkach zranionych rogówek piskląt

Ten protokół skupia się na uszkadzaniu powierzchni oka danio pręgowanego poprzez ścieranie, aby ocenić późniejsze zamknięcie rany na poziomie komórkowym. Podejście to wykorzystuje zadzior oczny do częściowego usunięcia nabłonka rogówki i wykorzystuje skaningową mikroskopię elektronową do śledzenia zmian w morfologii komórek podczas zamykania rany.

Gojenie się ran rogówki danio pręgowanego: od ścierania do analizy obrazowej zamknięcia rany

Niniejsza praca opisuje nowatorski protokół eksperymentalny, który wykorzystuje uchwyt wydrukowany w 3D, aby umożliwić obrazowanie żywych komórek w wysokiej rozdzielczości wyłuszczonych kul. Dzięki temu protokołowi można obserwować w czasie rzeczywistym komórkową aktywność sygnalizacyjną wapnia w uszkodzonym nabłonku rogówki z kul ex vivo.

Obrazowanie żywych komórek nienaruszonych kul ex vivo za pomocą nowatorskiego uchwytu wydrukowanego w 3D

Opracowaliśmy szczurzy model ciężkiego zapalenia rogówki poprzez łyżeczkowanie nabłonka rogówki w połączeniu ze szwami rogówkowymi. W badaniu oceniano wzorce zapalenia rogówki, proliferację nabłonka i zmiany w rąbkowych komórkach macierzystych w stanach zapalnych.

Ustalenie modelu ciężkiego zapalenia rogówki u szczurów na podstawie łyżeczkowania nabłonka rogówki w połączeniu ze szwami rogówkowymi

Hodowla narządów ex vivo rogówki świń i gojenie ran nabłonkowych dostarczają ekonomicznego, etycznego, powtarzalnego i ilościowego sposobu testowania toksyczności ocznej chemikaliów. Pomagają również w wyjaśnieniu mechanizmów leżących u podstaw regulacji nabłonka i naprawy tkanek oraz w ocenie terapii stosowanych w leczeniu keratopatii cukrzycowej i opóźnionego gojenia się ran.

Ocena toksyczności terapeutycznej i chemicznej przy użyciu rogówek świń z hodowli narządowych i gojenie się ran nabłonkowych

Poznaj metodę interferencji RNA w badaniu funkcji białka HSP27 podczas gojenia ran nabłonka rogówki. Technika ta pozwala ocenić rolę białka szoku cieplnego w procesie regeneracji tkanek.

Oparte na interferencji RNA badanie funkcji białka szoku cieplnego 27 podczas gojenia się ran nabłonka rogówki

Przeglądaj więcej filmów