Oparte na interferencji RNA badanie funkcji białka szoku cieplnego 27 podczas gojenia się ran nabłonka rogówki

Ogólnym celem tego testu transfekcji RNA jest wykorzystanie małego interferującego RNA specyficznego dla HSP27 do oceny potencjalnej roli HSP27 w gojeniu się ran nabłonka rogówki. Metoda ta może pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytania dotyczące funkcji białka szoku cieplnego 27 podczas procesu gojenia się ran nabłonkowych. Główną zaletą tej techniki jest to, że małe interferujące RNA jest wrażliwym RNA sacharozą stworzoną w celu specyficznego celowania w informacyjny transkrypt RNA w celu wywołania jego degradacji.

Wykorzystano go do identyfikacji nowych szkodników, różnych procesów komórkowych. Chociaż technika ta może zapewnić wgląd w gojenie się ran nabłonka rogówki, może mieć również zastosowanie do innego systemu, takiego jak skóra i błona śluzowa. Procedurę zademonstruje Soon-Suk Kang, technik z mojego laboratorium.

Aby rozpocząć tę procedurę, hoduj ludzkie komórki nabłonka rogówki na sześciodołkowej płytce z pożywką wzrostową nabłonka oskrzeli w temperaturze 37 stopni Celsjusza i pięcioprocentowym dwutlenkiem węgla, aż do 95-procentowej konfluencji. Następnie rozcieńczyć 2,5 mikrolitra lub 7,5 mikrolitra odczynnika do transfekcji 100 mikrolitrami zredukowanej pożywki surowicy do transfekcji. Następnie rozpuść siRNA specyficzne dla HSP27 i zaszyfrowane kontrolowane siRNA w 100 mikrolitrach lub zredukowanej pożywce surowicy, aby utworzyć odpowiednio 10 nanomolów siRNA specyficznego dla HSP27 i 15 nanomolowych zaszyfrowanego kontrolnego siRNA.

Następnie wymieszaj 100 mikrolitrów roztworu siRNA ze 100 mikrolitrami rozcieńczonego odczynnika do transfekcji i inkubuj mieszaninę przez 15 minut w temperaturze pokojowej. Następnie dodaj kompleksy lipidowe siRNA do komórek. Po czterogodzinnej inkubacji zmień pożywkę na kompletną pożywkę do wzrostu nabłonka oskrzeli i inkubuj komórki przez dwa dni w temperaturze 37 stopni Celsjusza przed analizą western blot.

Na tym etapie wyekstrahuj specyficzne dla HSP27 i zaszyfrowane kontrolne siRNA transfekowane HCEC w komorze bezpieczeństwa biologicznego przy użyciu 100 mikrolitrów lodowatego buforu do lizy. Następnie inkubuj komórki przez 30 minut na lodzie, aby wywołać lizę komórek. Następnie odwirować lizaty w temperaturze 10 000 razy G przez 15 minut.

Następnie przenieś supernatanty do świeżych probówek o pojemności 1,5 mililitra i przechowuj je w temperaturze minus 80 stopni Celsjusza. Następnie określ stężenia białek w litynianach komórkowych za pomocą testu białkowego Bradforda. Następnie załaduj próbki równymi ilościami wszystkich białek komórkowych na 10-procentowy lub 12-procentowy żel akrylamidowy.

Poddaj żel stronie SDS i elektroforetycznie przenieś oddzielone pasma białkowe do filtrów nitrocelulozowych o natężeniu 200 miliamperów prądu przez jedną godzinę i cztery stopnie Celsjusza. Następnie zablokuj membrany filtracyjne nitrocelulozy pięcioprocentowym odtłuszczonym mlekiem w TBST na jedną godzinę. Następnie dodaj przeciwciała pierwszorzędowe i inkubuj błony przez noc w temperaturze czterech stopni Celsjusza na shakerze.

Następnego dnia umyj membrany trzykrotnie za pomocą TBST, pozostawiając dziesięć minut na każde mycie. Następnie wykryj prążki immunolreaktywne za pomocą sprzężonych z peroksydazą chrzanową kozich przeciwciał anty-króliczych w pięciu procentach BSA. Następnie inkubować błony w odczynnikach western blotting luminol przez jedną minutę w temperaturze pokojowej.

Usuń membranę z roztworu odczynnika. Następnie usuń nadmiar płynu chłonnym ręcznikiem i umieść je w plastikowym ochraniaczu na prześcieradło. Następnie umieść zakrytą membranę w kasecie z folią stroną z białkiem skierowaną do góry.

Umieść film rentgenowski na membranach i naświetlaj go na jedną minutę. W komorze bezpieczeństwa biologicznego należy zrobić ranę, przeciągając sterylną końcówkę pipety przez zbiegające się kultury HCEC transfekowanych siRNA specyficznych dla HSP27 lub zaszyfrowanych kontrolnych transfekowanych siRNA. Natychmiast po zranieniu przemyj komórki dwukrotnie 1XPBS i utrzymuj je w pożywce wzrostowej nabłonka oskrzeli w temperaturze 37 stopni Celsjusza i pięciu procentach dwutlenku węgla przez 24 godziny.

24 godziny po zranieniu wykonaj zdjęcie HCECs za pomocą mikroskopu pionowego pod kątem 100x i wykonaj spłaszczenie tła za pomocą polecenia filtra w oprogramowaniu do analizy obrazu. Za pomocą polecenia wybierz pomiary zdefiniuj obszar zainteresowania o kształcie wielokąta o tym samym rozmiarze, który może pokryć początkowy uraz prostopadle od końca do końca. Następnie określ trzy różne obszary zainteresowania w zranionym obszarze każdej próbki.

Automatycznie zliczaj numer komórki w każdym polu za pomocą opcji menu miary rozmiaru liczby. Przedstawiona tutaj analiza Western blot wykazała, że ekspresja fosforylowanego HSP27 i fosforylowanego Akt była znacznie zmniejszona. Tam, gdzie ekspresja pleców była znacznie zwiększona w HSP27 specyficzne siRNA transfekowane HCEC.

Ufosforylowana ekspresja HSP27 została zmniejszona o 30 procent i 40 procent odpowiednio w 10 nanomolowych i 15 nanomolowych komórkach transfekowanych siRNA specyficznych dla HSP27, w porównaniu z kontrolnymi komórkami transfekowanymi siRNA. Co więcej, nieufosforylowana ekspresja HSP27 została zmniejszona o 20 procent i 30 procent odpowiednio w dziesięciu nanomolowych i 15 nanomolowych komórkach transfekowanych siRNA specyficznych dla HSP27. Test kierunkowy rany wywołany zadrapaniem wykazał, że 24 godziny po zranieniu komórki transfekowane siRNA specyficzne dla HSP27 przy 10 i 15 nanomolowych eksplodowanych zmniejszyły migrację.

Ponadto transfekowane HCEC siRNA specyficzne dla HSP27 uległy większej apoptozie i martwiczej śmierci komórek w porównaniu z zaszyfrowanymi komórkami transfekowanymi siRNA wykazanymi przez cytometrię przepływową. Po opanowaniu technika transfekcji RNA może być wykonana w ciągu 24 godzin, jeśli zostanie wykonana prawidłowo. Po tych procedurach można wygenerować epizod, taki jak zamek, aby odpowiedzieć na dodatkowe pytanie, takie jak początkowa funkcja białka szoku cieplnego 27 w gojeniu się ran nabłonka rogówki.

Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak używać małego interferującego RNA specyficznego dla białka szoku cieplnego 27 do oceny potencjalnej roli białka szoku cieplnego 27 w gojeniu się ran nabłonka rogówki. Nie zapominaj, że praca z małymi interferującymi RNA i odczynnikami może być niebezpieczna, a podczas wykonywania tych procedur należy zawsze używać prekursorów, takich jak szafa bezpieczeństwa biologicznego i maska ochronna.