Komunikacja międzykomórkowa ze skrzyżowaniem szczelinowym: funkcjonalny biomarker do oceny niekorzystnych skutków toksyn i toksyn oraz korzyści zdrowotnych produktów naturalnych
25 grudnia 2016
Ten protokół opisuje technikę przenoszenia barwnika metodą skalpela i fluorescencyjnego, która mierzy komunikację międzykomórkową poprzez kanały połączeń szczelinowych. Komunikacja międzykomórkowa ze skrzyżowaniem szczelinowym jest głównym procesem komórkowym, w którym utrzymywana jest homeostaza tkanek, a zakłócenie tej sygnalizacji komórkowej ma niekorzystne skutki zdrowotne.
Ogólnym celem jest dostarczenie prostego testu do pomiaru komunikacji międzykomórkowej w szczelinie za pośrednictwem populacji komórek ssaków, który może zaspokoić szeroki zakres potrzeb farmakologicznych i toksykologicznych in vitro. Metoda ta może pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytania w dziedzinie toksykologii, takie jak to, czy związek wpływa na rozwój lub utrzymanie tkanki, poprzez rozregulowanie komunikacji międzykomórkowej w szczelinie. Główną zaletą tej techniki jest to, że oferuje prostą i szybką ocenę funkcji złącza szczelinowego w dużej populacji komórek w odpowiedzi na toksyny i toksyny.
Procedurę zademonstruje Ajna Uzuni, asystentka naukowa z mojego laboratorium. Aby rozpocząć eksperyment, wysiewaj trzy razy 10 do piątej WB-F344 komórek nabłonka wątroby szczura na płytkach hodowlanych o średnicy 35 milimetrów zawierających zmodyfikowaną pożywkę Eagle'a oraz 5% płodowej surowicy bydlęcej. Hoduj komórki w inkubatorze, aż osiągną 100% zbieżności i kontynuuj eksperymentalne traktowanie komórek.
Aby kontynuować eksperymenty dawka-odpowiedź, dodaj 10 mikrolitrów i 20 mikrolitrów wcześniej przygotowanego, dwumilimolowego roztworu podstawowego fenantrenu w 100% acetonitrylu oraz cztery mikrolitry, sześć mikrolitrów i osiem mikrolitrów 20-milimolowego roztworu podstawowego fenantrenu w 100% acetonitrylu do trzech płytek komórek zawierających dwa mililitry pożywki wzrostowej na każdą dodaną objętość roztworu podstawowego. Następnie dodaj cztery mikrolitry, sześć mikrolitrów, osiem mikrolitrów, 10 mikrolitrów i 20 mikrolitrów 100% roztworu acetonitrylu do trzech płytek komórek zawierających dwa mililitry pożywki wzrostowej na każdą dodaną objętość roztworu acetonitrylu, który ma służyć jako kontrola nośnika. Po dodaniu acetonitrylu inkubować płytki.
Aby przeprowadzić eksperymenty z reakcją czasową, dodaj siedem mikrolitrów 20-milimolowego roztworu podstawowego fenantrenu w 100% acetonitrylu do trzech płytek komórek, zawierających dwa mililitry pożywki wzrostowej na każdy punkt czasowy. Następnie dodaj siedem mikrolitrów 100% acetonitrylu do trzech płytek komórek, zawierających dwa mililitry pożywki wzrostowej na każdy punkt czasowy, aby służyły jako kontrola nośnika. Inkubuj płytki dla każdego wyznaczonego punktu czasowego.
Wyrzuć pożywkę hodowlaną, delikatnie odlewając pożywkę. Przepłucz komórki trzema mililitrami PBS i albo zdekantuj, albo odessaj między płukaniami. Odpipetować jeden mililitr jednego miligrama na mililitr żółtego barwnika lucyfera rozpuszczonego w PBS do każdej płytki komórkowej.
Wstępnie załaduj barwnik do komórek, ściskając skalpel między palcem wskazującym a kciukiem. Umieść skalpel prostopadle do krawędzi płytki hodowlanej i pięć milimetrów od niej, a następnie użyj grawitacji, aby skalpel delikatnie przetoczył się z tego prostopadłego kąta pod kątem 15 stopni. Przetocz ostrze przez populację komórek w trzech różnych obszarach całej płytki.
Następnie inkubuj komórki z roztworem LY przez trzy minuty w temperaturze pokojowej. Zdekantować lub odessać LY i przepłukać komórki, aby usunąć cały barwnik zewnątrzkomórkowy i wyeliminować zewnątrzkomórkową fluorescencję tła. Następnie dodaj 0,5 mililitra 4% roztworu formaliny buforowanej fosforanem, aby utrwalić komórki.
Zobacz utrwalone komórki za pomocą mikroskopu epifluorescencyjnego przy 200-krotnym powiększeniu. Wyrównaj wszystkie płytki tak, aby linia wcięcia była równoległa do poziomego pola widzenia. Wygenerowano serię obrazów SL-DT komórek nabłonka wątroby szczura WB-F344 leczonych rosnącymi dawkami fenantrenu.
Spadek migracji żółtego barwnika fluorescencyjnego lucyfera jest spowodowany rosnącymi dawkami fenantrenu, co świadczy o rosnącym indukowanym przez toksyny hamowaniu komunikacji międzykomórkowej w szczelinie lub GJIC. Ułamek kontrolny lub wartości FOC uzyskane z obrazów SL-DT uśredniono, przeanalizowano statystycznie, a następnie sporządzono wykres. Po tej procedurze można wykonać inne metody, takie jak western blot pojedynczych białek transdukcji, aby odpowiedzieć na dodatkowe pytania.
Na przykład, czy te związki aktywują mitogenne zdarzenia perforacji komórek?
Wyświetl pełny transkrypt i uzyskaj dostęp do tysięcy filmów naukowych
Przegląd
Ten protokół opisuje technikę ładowania skalpela z barwnikiem fluorescencyjnym, która mierzy komunikację międzykomórkową przez kanały szczelinowe. Ta metoda zapewnia prosty test do oceny międzykomórkowej komunikacji przez szczeliny szczelinowe w komórkach ssaków, co jest kluczowe dla zrozumienia homeostazy tkankowej.
Kluczowe elementy badania
Obszar nauki
- Neuronauki
- Biologia komórki
- Toksykologia
Tło
- Międzykomórkowa komunikacja przez szczeliny szczelinowe jest niezbędna do utrzymania homeostazy tkankowej.
- Zerwanie tej komunikacji może prowadzić do niekorzystnych skutków zdrowotnych.
- Ta technika pozwala na szybkie ocenę funkcji szczelin szczelinowych.
- Może być zastosowana w różnych badaniach farmakologicznych i toksykologicznych.
Cel badania
- Zmierzyć wpływ związków chemicznych na międzykomórkową komunikację przez szczeliny szczelinowe.
- Zapewnienie niezawodnej metody oceny rozwoju i utrzymania tkanek.
- Fascilitację badań toksykologicznych dotyczących wpływu toksyn na komunikację komórkową.
Zastosowane metody
- Zasiać komórki nabłonkowe wątroby szczurów WB-F344 na płytkach hodowlanych.
- Hodowla komórek do osiągnięcia 100% konfluencji.
- Zastosowanie eksperymentalnych obróbek do komórek.
- Wykorzystanie transferu fluorescencyjnego barwnika do oceny komunikacji międzykomórkowej.
Główne wyniki
- Technika pozwala na ocenę funkcji szczelin szczelinowych w dużych populacjach komórek.
- Zapewnia wgląd w sposób, w jaki toksyczne substancje wpływają na komunikację międzykomórkową.
- Wykazała skuteczność w różnych badaniach in vitro.
- Szybki i prosty protokół poprawia efektywność badań.
Wnioski
- Ta metoda jest cennym narzędziem do badań toksykologicznych.
- Pomaga w zrozumieniu roli szczelin szczelinowych w zdrowiu tkanek.
- Przyszłe badania mogą rozszerzyć jej zastosowania w farmakologii.
Często zadawane pytania
Executive Industry Relevance
Gap junctional intercellular communication (GJIC) serves as a functional biomarker for assessing tissue homeostasis disruption by toxicants and evaluating protective effects of natural products. The scalpel loading-fluorescent dye transfer (SL-DT) technique enables rapid, population-level assessment of GJIC inhibition, supporting mechanistic de-risking in early discovery. This assay provides predictive confidence for prioritizing compounds based on their impact on cellular communication pathways critical to organ function.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Interrogates therapeutic hypotheses by linking compound exposure to GJIC disruption as a mechanism of toxicity.
- Operational Value: Enables functional target validation through direct measurement of intercellular channel activity in live cell populations.
- Predictive Value: Supports portfolio triage by identifying early biomarkers of adverse effects on tissue maintenance and homeostasis.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Prepares validated biological systems for downstream workflows by establishing baseline GJIC competence.
- Operational Value: Delivers standardized, quantitative dye transfer readouts amenable to automation and high-throughput imaging.
- Scalability: Adapted for in vivo tissue slices and amenable to automated fluorescence microscopy for increased sample throughput.
Translational & Preclinical Research
- Translational Continuity: Connects discovery findings to preclinical validation through conserved GJIC mechanisms across species.
- Mechanistic De-risking: Clarifies whether observed phenotypes stem from disrupted intercellular communication rather than off-target effects.
- Risk-Adjusted Decisions: Informs advancement criteria by quantifying structure-activity relationships in GJIC modulation.
Pipeline & Workflow Integration
The SL-DT assay functions as a discovery-stage tool for mechanistic insight, positioned before lead optimization to filter compounds with high tissue disruption risk.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing by quantifying how toxicants or natural products alter intercellular signaling networks.
- Screening: Delivers assay readiness through reproducible, population-based functional readouts that reflect tissue-level communication.
- Analytics: Generates fraction of control (FOC) values enabling statistical comparison across doses and time points.
- Translational Research: Aligns with biomarker strategies by linking GJIC function to tissue integrity outcomes in preclinical models.
- Enterprise Reuse: Serves as a reusable platform across toxicology, pharmacology, and nutraceutical development programs.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Reduces mechanistic ambiguity by providing direct functional readout of gap junction channel activity.
- Operational Value: Ensures standardization and reproducibility via simple scalpel loading and fixed-endpoint imaging.
- Strategic Value: Improves go/no-go decisions by linking early GJIC disruption to downstream adverse tissue effects.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization by identifying compounds that preserve intercellular communication homeostasis.
Implementation Considerations
- Requires expertise in cell culture, fluorescent dye handling, and epifluorescence microscopy.
- Depends on standardized scalpel technique and consistent incubation times for reliable dye transfer.
- Necessitates cross-team agreement on image analysis thresholds and morphometric parameters.
- Adaptable across mammalian cell types and tissue slices with optimization of loading and fixation parameters.
- Limited to assessing functional channel activity; does not distinguish between connexin expression, phosphorylation, or gating states.
