Name: Komunikacja międzykomórkowa ze skrzyżowaniem szczelinowym: funkcjonalny biomarker do oceny niekorzystnych skutków toksyn i toksyn oraz korzyści zdrowotnych produktów naturalnych (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-12-25T13:00:00.000+00:00
Duration: 5 min 27 s
Description: Poznaj technikę transferu barwnika fluorescencyjnego do oceny komunikacji międzykomórkowej przez szczeliny łączące w komórkach ssaków. Ta metoda pozwala szybko badać wpływ toksyn na funkcję połączeń szczelinowych.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Wspierane przez granty NIEHS #R01 ES013268-01A2, a treść jest wyłączną odpowiedzialnością autora i niekoniecznie reprezentuje oficjalne poglądy NIEHS, i wspierane przez CETOCOEN UPgrade project No. CZ.1.05/2.1.00/19.0382.

Protokół tego badania został zatwierdzony przez Komitet do spraw Opieki nad Zwierzętami i ich Wykorzystania Narodowych Instytutów Nauk Medycznych Japonii, gdzie przeprowadzono eksperymenty in vivo, aby zapewnić, że szczury były traktowane w sposób humanitarny oraz z uwzględnieniem minimalizacji cierpienia.
1. Test bioanalityczny SL-DT
<ol>
	<li>Zasadź 3 x 105 komórek nabłonkowych wątroby szczura WB-F344 na płytkach hodowlanych o średnicy 35 mm zawierających zmodyfikowane medium Eaglesa z dodatkiem 5% cielęcego surowicy fetalnej i hoduj komórki w inkubatorze w temperaturze 37 ºC, wilgotności względnej 100% (RH) i 5% CO2.</li>
	<li>Hoduj komórki aż do osiągnięcia 100% konfluentności (zwykle po 2 dniach) i przeprowadź wymagane eksperymentalne zabiegi na komórkach, zgodnie z poniższym opisem.
	<ol>
		<li>Przeprowadź eksperymenty dotyczące odpowiedzi dawkowej
		<ol>
			<li>Dodaj 10 µl i 20 µl 2 mM roztworu zapasowego fenantrenu w 100% acetonitrylu oraz 4 µl, 6 µl i 8 µl 20 mM roztworu zapasowego fenantrenu w 100% acetonitrylu do trzech płytek komórkowych zawierających po 2 ml ośrodka wzrostu dla każdej dodanej objętości roztworu zapasowego.</li>
			<li>Dodaj 4 µl, 6 µl, 8 µl, 10 µl i 20 µl 100% roztworu acetonitrylu do trzech płytek komórkowych zawierających po 2 ml ośrodka wzrostu dla każdej dodanej objętości roztworu acetonitrylu, aby uzyskać kontrolę pojazdu.</li>
			<li>Umieść płytki w inkubatorze na 15 min w temperaturze 37 °C, wilgotności względnej 100% i 5% CO2.</li>
			<li>Przejdź do kroku 1.3.</li>
		</ol>
		</li>
		<li>Przeprowadź eksperymenty dotyczące odpowiedzi czasowej
		<ol>
			<li>Dodaj 7 µl 20 mM roztworu zapasowego fenantrenu w 100% acetonitrylu do trzech płytek komórkowych zawierających po 2 ml ośrodka wzrostu dla każdego punktu czasowego (tj. 0, 1, 2, 3, 4, 5, 10 min).</li>
			<li>Dodaj 7 µl 100% acetonitrylu do trzech płytek komórkowych zawierających po 2 ml ośrodka wzrostu dla każdego punktu czasowego, aby uzyskać kontrolę pojazdu.</li>
			<li>Umieść płytki w inkubatorze na każdy wyznaczony punkt czasowy w temperaturze 37 °C, wilgotności względnej 100% i 5% CO2.</li>
			<li>Przejdź do kroku 1.3.</li>
		</ol>
		</li>
		<li>Przeprowadź eksperymenty dotyczące czasu regeneracji
		<ol>
			<li>Dodaj 7 µl 20 mM roztworu zapasowego fenantrenu w 100% acetonitrylu do trzech płytek komórkowych zawierających po 2 ml ośrodka wzrostu na 15 min.</li>
			<li>Dodaj 7 µl 100% acetonitrylu do trzech płytek komórkowych zawierających po 2 ml ośrodka wzrostu na 15 min, aby uzyskać kontrolę pojazdu.</li>
			<li>Odlaj medium zawierające fenantren lub acetonitryl i przepłucz trzykrotnie po 3 ml buforu fosforanowego (PBS).</li>
			<li>Dodaj po 2 ml świeżego ośrodka wzrostu do każdej płytki i inkubuj przez wymagane czasy regeneracji (tj. 25, 35, 45, 60, 90, 120, 150, 180, 240, 360 min) w inkubatorze w temperaturze 37 °C, wilgotności względnej 100% i 5% CO2.</li>
			<li>Przejdź do kroku 1.3.</li>
		</ol>
		</li>
		<li>Przeprowadź eksperymenty mechanistyczne
		<ol>
			<li>Dodaj inhibitor transdukcji sygnału, tj. 5 µl 20 mM roztworu zapasowego D609 w 100% acetonitrylu do trzech płytek komórkowych zawierających po 2 ml ośrodka wzrostu na 15 min.</li>
			<li>Dodaj 5 µl 100% acetonitrylu do trzech płytek komórkowych zawierających po 2 ml ośrodka wzrostu na 15 min, aby uzyskać kontrolę pojazdu.</li>
			<li>Dodaj 7 µl 20 mM roztworu zapasowego fenantrenu w 100% acetonitrylu do trzech płytek komórkowych zawierających po 2 ml ośrodka wzrostu z dodatkiem D609 na dodatkowe 15 min.</li>
			<li>Dodaj 7 µl 100% acetonitrylu do trzech płytek komórkowych zawierających po 2 ml ośrodka wzrostu z dodatkiem 100% acetonitrylu na dodatkowe 15 min, aby uzyskać kontrolę pojazdu.</li>
			<li>Przejdź do kroku 1.3.</li>
		</ol>
		</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Usuń medium hodowlane poprzez ostrożne wylanie go lub odsączenie pod próżnią. 
	Uwaga: Zużyte medium zawierające substancje niebezpieczne należy odpowiednio zutylizować.</li>
	<li>Przepłucz komórki trzykrotnie po 3 ml PBS, odlając lub odsączając między poszczególnymi przepłukaniami.</li>
	<li>Pipetą dodaj po 1 ml barwnika Lucifer Yellow (LY) o stężeniu 1 mg/ml rozpuszczonego w PBS do każdej płytki komórkowej.</li>
	<li>Wstępnie nasyć komórki barwnikiem, delikatnie przetaczając ostrze chirurgiczne ze stali nierdzewnej nr 20 z zaokrąglonym brzegiem przez populację komórek w trzech różnych miejscach płytki.
	<ol>
		<li>Zacznij od ustawienia skalpela prostopadle (pod kątem 90°) i w odległości 5 mm od krawędzi płytki hodowlanej, a następnie przetocz skalpel z tej pozycji prostopadłej do pozycji pod kątem około 15° (patrz Rycina 1). 
		Uwaga: Ruch ten wykonuje się, trzymając skalpel między kciukiem a palcem wskazującym. Wykorzystaj siłę grawitacji, aby delikatnie przetoczyć skalpel z pozycji 90° do 15° (zaokrąglone ostrze po prostu przetacza się po komórkach). Ruch ten pozostawia widoczną linię wgłębienia.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Umieść komórki w roztworze LY na 3 min w temperaturze pokojowej.</li>
	<li>Odlaj lub odsącz roztwór LY i przepłucz trzykrotnie po 3 ml PBS, aby usunąć cały barwnik pozakomórkowy i zminimalizować tło fluorescencyjne pozakomórkowe.</li>
	<li>Dodaj po 0,5 ml 10% roztworu formaliny buforowanej fosforanem w celu utrwalenia komórek. 
	Uwaga: Po utrwaleniu w formalinie komórki należy wysuszyć na powietrzu i przechowywać w ciemności do dwóch lat, minimalizując wybielanie fotometryczne barwnika LY. W razie potrzeby ponownie nawilżyć komórki roztworem 10% formaliny, aby móc obserwować front fluorescencyjny barwnika.</li>
	<li>Obserwuj utrwalone komórki za pomocą mikroskopu epi-fluorescencyjnego wyposażonego w kostkę dichroiczną do długości fali wzbudzenia/emisji 428/536 nm przy powiększeniu 200X. Ustaw wszystkie płytki tak, aby linia wgłębienia była równoległa do poziomego pola widzenia. 
	Uwaga: Kostka dichroiczna FITC nadaje się bardzo dobrze.
	<ol>
		<li>Uzyskaj obraz za pomocą kamery CCD i odpowiedniego oprogramowania.
		<ol>
			<li>Otwórz oprogramowanie obsługujące kamerę CCD i ustaw automatyczne nasycenie ekspozycji. Użyj przycisku „capture” (przechwyć), aby cyfrowo uzyskać obraz. Zapisz obraz w formacie .tif, korzystając z przycisku „Save” (zapisz).</li>
		</ol>
		</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. Adaptacja testu SL-DT do tkanki wątroby
<ol>
	<li>Usunięcie za pomocą nożyczek do mikrochirurgii kawałka wątroby o wymiarach około 2 x 2 cm z lewej płata wątroby samca szczura linii Fischer 344 w wieku 5 tygodni i umieszczenie go na plastikowej talii wagowej przykrytej wilgotną gazą12.</li>
	<li>Pipetowanie 0,5 ml roztworu PBS zawierającego po 1 mg/ml lucyfernej żółci i dekstranu rodaminowego (RD) na powierzchnię kawałka wątroby umieszczonego na plastikowej talii wagowej. 
	Uwaga: RD to barwnik, który nie może przenikać przez kanały stykowe i oznaczy komórki, które zostały załadowane.</li>
	<li>Wykonanie trzech do pięciu nacięć o długości około 1 cm na powierzchni kawałka wątroby, na którym znajduje się roztwór barwnika, za pomocą ostrego noża, a następnie dodanie dodatkowej ilości barwnika w ilości wystarczającej do wypełnienia nacięć.</li>
	<li>Incynacja tkanki przez 3 minuty w temperaturze pokojowej na plastikowej talii wagowej.</li>
	<li>Przemywanie trzykrotnie 5 ml roztworu PBS.</li>
	<li>Utwardzanie tkanki przez całą noc w 30 ml 10% formaliny buforowanej fosforanem w 50 ml stożkowej probówce do wirowania w ciemnym miejscu w temperaturze pokojowej.</li>
	<li>Następnego dnia przemyć kawałki wodą, przyciąć tkankę wokół nacięć nożyczkami do mikrochirurgii na paski o wymiarach 1 x 1 x 0,5 cm3, a następnie wykorzystać standardowe techniki do wtopienia kawałków w parafinie13.</li>
	<li>Przecinać kawałki prostopadle do linii nacięcia na cienkie warstwy o grubości 5 µm i przechowywać próbki w ciemnym miejscu do momentu wykonania obrazowania, stosując standardowe techniki przecinania mikrotomem13.</li>
	<li>Wykorzystać mikroskop epi-fluorescencyjny wyposażony w cyfrową kamerę CCD do wizualizacji i rejestracji obrazów frontów fluorescencyjnych barwników zgodnie z punktem 1.107.</li>
</ol>
3. Ilościowe określanie komunikacji przez połączenia szczelinowe
<ol>
	<li>Zmierz rozprzestrzenienie barwnika fluorescencyjnego za pomocą oprogramowania morfometrycznego (np. ImageJ).
	<ol>
		<li>Kliknij kartę „Plik”, a następnie kliknij „Otwórz”, aby otworzyć zapisany obraz.</li>
		<li>Kliknij narzędzie „Kształt swobodny” na pasku narzędzi, aby prześledzić kontur czoła barwnika.</li>
		<li>Kliknij kartę „Analiza”, a następnie kliknij „Pomiary”. 
		Uwaga: Spowoduje to wygenerowanie wartości powierzchni w arkuszu, którą można skopiować do innego programu arkusza kalkulacyjnego, jeśli jest taka potrzeba.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Używając programu arkusza kalkulacyjnego, oblicz ułamek kontroli (FOC), dzieląc powierzchnię rozprzestrzenienia barwnika na talii doświadczalnej przez powierzchnię, na jaką rozprzestrzenił się barwnik na talii kontrolnej, zgodnie z poniższym równaniem: 
	<img alt="Równanie równowagi statycznej Ae/Ac=FOC, symbol analizy stosunku sił, diagram edukacyjny." src="/files/ftp_upload/54281/54281equation1.jpg" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Equation1"> 
	Ae = powierzchnia rozprzestrzenienia barwnika w komórkach narażonych na zmienną doświadczalną, taką jak komórki traktowane substancją chemiczną w określonym stężeniu lub czasie 
	Ac = powierzchnia rozprzestrzenienia barwnika w kontrolce, czyli w komórkach traktowanych rozpuszczalnikiem używanym do rozpuszczenia badanej substancji chemicznej 
	Uwaga: Aby określić wpływ rozpuszczalnika, Ae oznacza powierzchnię rozprzestrzenienia barwnika w komórkach traktowanych rozpuszczalnikiem, a Ac – powierzchnię rozprzestrzenienia barwnika w komórkach nie traktowanych rozpuszczalnikiem. Wpływ rozpuszczalnika powinien być zazwyczaj mniejszy niż 10%.</li>
</ol>

<ol><li>Rotroff, D. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Predictive+endocrine+testing+in+the+21st+century+using+in+vitro+assays+of+estrogen+receptor+signaling+responses%5BTitle%5D)+AND+%22Environ.Sci.Technol%22%5BJournal%5D)">Predictive endocrine testing in the 21st century using in vitro assays of estrogen receptor signaling responses.</a> Environ.Sci.Technol. 48 (15), 8706-8716 (2014).</li>
<li>Axelsen, L. N., Calloe, K., Holstein-Rathlou, N. H., Nielsen, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Managing+the+complexity+of+communication%3A+regulation+of+gap+junctions+by+post-translational+modification%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Pharmacol%22%5BJournal%5D)">Managing the complexity of communication: regulation of gap junctions by post-translational modification.</a> Front Pharmacol. 4, 130(2013).</li>
<li>Nielsen, M. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gap+junctions%5BTitle%5D)+AND+%22Compr.Physiol%22%5BJournal%5D)">Gap junctions.</a> Compr.Physiol. 2 (3), 1981-2035 (2012).</li>
<li>Sovadinova, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phosphatidylcholine+specific+PLC-induced+dysregulation+of+gap+junctions%2C+a+robust+cellular+response+to+environmental+toxicants%2C+and+prevention+by+resveratrol+in+a+rat+liver+cell+model%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS.One%22%5BJournal%5D)">Phosphatidylcholine specific PLC-induced dysregulation of gap junctions, a robust cellular response to environmental toxicants, and prevention by resveratrol in a rat liver cell model.</a> PLoS.One. 10 (5), e0124454(2015).</li>
<li>Trosko, J. E., Chang, C. C. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aTrosko%2C+JE+%22Biologically+Based+Methods+for+Cancer+Risk+Assessment%22">Biologically Based Methods for Cancer Risk Assessment</a>. Travis, C. C. , Plenum Press. New York. 165-179 (1989).</li>
<li>Trosko, J. E. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aTrosko%2C+JE+%22Biomarkers+and+occupational+health%3A+progess+and+perspectives%22">Biomarkers and occupational health: progess and perspectives</a>. Mendelsohn, M. D., Peeters, J. P., Normandy, M. J. , John Henry Press. Washington D.C. 264-274 (1995).</li>
<li>Upham, B. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Role+of+integrative+signaling+through+gap+junctions+in+toxicology%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.Protoc.Toxicol%22%5BJournal%5D)">Role of integrative signaling through gap junctions in toxicology.</a> Curr.Protoc.Toxicol. 47, 2.18:2.18.1-2.18:2.18.18 (2011).</li>
<li>Vinken, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Connexins+and+their+channels+in+cell+growth+and+cell+death%5BTitle%5D)+AND+%22Cell.Signal%22%5BJournal%5D)">Connexins and their channels in cell growth and cell death.</a> Cell.Signal. 18 (5), 592-600 (2006).</li>
<li>Browne, C. L., Wiley, H. S., Dumont, J. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Oocyte-follicle+cell+gap+junctions+in+Xenopus+laevis+and+the+effects+of+gonadotropin+on+their+permeability%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Oocyte-follicle cell gap junctions in Xenopus laevis and the effects of gonadotropin on their permeability.</a> Science. 203 (4376), 182-183 (1979).</li>
<li>El-Fouly, M. H., Trosko, J. E., Chang, C. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Scrape-loading+and+dye+transfer.+A+rapid+and+simple+technique+to+study+gap+junctional+intercellular+communication%5BTitle%5D)+AND+%22Exp.Cell+Res%22%5BJournal%5D)">Scrape-loading and dye transfer. A rapid and simple technique to study gap junctional intercellular communication.</a> Exp.Cell Res. 168 (2), 422-430 (1987).</li>
<li>Wade, M. H., Trosko, J. E., Schindler, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+fluorescence+photobleaching+assay+of+gap+junction-mediated+communication+between+human+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">A fluorescence photobleaching assay of gap junction-mediated communication between human cells.</a> Science. 232 (4749), 525-528 (1986).</li>
<li>Upham, B. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structure-activity-dependent+regulation+of+cell+communication+by+perfluorinated+fatty+acids+using+in+vivo+and+in+vitro+model+systems%5BTitle%5D)+AND+%22Environ.+Health+Perspect%22%5BJournal%5D)">Structure-activity-dependent regulation of cell communication by perfluorinated fatty acids using in vivo and in vitro model systems.</a> Environ. Health Perspect. 117 (4), 545-551 (2009).</li>
<li>Paraffin Processing of Tissue. Protoplasma. , <a target="_blank" href="http://protocolsonline.com/histology/sample-preparation/paraffin-processing-of-tissue">http://protocolsonline.com/histology/sample-preparation/paraffin-processing-of-tissue</a> (2012).</li>
<li>Trosko, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gap+junctional+intercellular+communication+as+a+biological+%26%2334%3BRosetta+stone%26%2334%3B+in+understanding%2C+in+a+systems+biological+manner%2C+stem+cell+behavior%2C+mechanisms+of+epigenetic+toxicology%2C+chemoprevention+and+chemotherapy%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Membr.+Biol%22%5BJournal%5D)">Gap junctional intercellular communication as a biological &#34;Rosetta stone&#34; in understanding, in a systems biological manner, stem cell behavior, mechanisms of epigenetic toxicology, chemoprevention and chemotherapy.</a> J. Membr. Biol. 218 (1-3), 93-100 (2007).</li>
<li>Upham, B. L., Weis, L. M., Trosko, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modulated+gap+junctional+intercellular+communication+as+a+biomarker+of+PAH+epigenetic+toxicity%3A+structure-function+relationship%5BTitle%5D)+AND+%22Environ.Health+Perspect%22%5BJournal%5D)">Modulated gap junctional intercellular communication as a biomarker of PAH epigenetic toxicity: structure-function relationship.</a> Environ.Health Perspect. 106, 975-981 (1998).</li>
<li>Upham, B. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tumor+promoting+properties+of+a+cigarette+smoke+prevalent+polycyclic+aromatic+hydrocarbon+as+indicated+by+the+inhibition+of+gap+junctional+intercellular+communication+via+phosphatidylcholine-specific+phospholipase%5BTitle%5D)+AND+%22C.+Cancer+Sci%22%5BJournal%5D)">Tumor promoting properties of a cigarette smoke prevalent polycyclic aromatic hydrocarbon as indicated by the inhibition of gap junctional intercellular communication via phosphatidylcholine-specific phospholipase.</a> C. Cancer Sci. 99 (4), 696-705 (2008).</li>
<li>Sai, K., Kanno, J., Hasegawa, R., Trosko, J. E., Inoue, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Prevention+of+the+down-regulation+of+gap+junctional+intercellular+communication+by+green+tea+in+the+liver+of+mice+fed+pentachlorophenol%5BTitle%5D)+AND+%22Carcinogenesis%22%5BJournal%5D)">Prevention of the down-regulation of gap junctional intercellular communication by green tea in the liver of mice fed pentachlorophenol.</a> Carcinogenesis. 21 (9), 1671-1676 (2000).</li>
<li>Upham, B. L., Deocampo, N. D., Wurl, B., Trosko, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inhibition+of+gap+junctional+intercellular+communication+by+perfluorinated+fatty+acids+is+dependent+on+the+chain+length+of+the+fluorinated+tail%5BTitle%5D)+AND+%22Int.+J.+Cancer%22%5BJournal%5D)">Inhibition of gap junctional intercellular communication by perfluorinated fatty acids is dependent on the chain length of the fluorinated tail.</a> Int. J. Cancer. 78 (4), 491-495 (1998).</li>
<li>Trosko, J. E., Tai, M. H. Infections and inflammation: Impacts on oncogenesis. Impacts on Oncogenesis. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aTrosko%2C+JE+%22Contrib+Microbiol%22">Contrib Microbiol</a>. Dittmar, T., Zaenkar, K. S., Schmidt, A. , Karger. Basel. 45-65 (2006).</li>
<li>Trosko, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+stem+cells+as+targets+for+the+aging+and+diseases+of+aging+processes%5BTitle%5D)+AND+%22Med.+Hypotheses%22%5BJournal%5D)">Human stem cells as targets for the aging and diseases of aging processes.</a> Med. Hypotheses. 60 (3), 439-447 (2003).</li>
<li>JE, T. rosko <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aJE%2C+Trosko+%22Stem+Cells+and+Cancer%22">Stem Cells and Cancer</a>. Dittmar, T., Zaenkar, K. , Nova Publishers. New York. 147-188 (2008).</li>
<li>Osgood, R. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Polycyclic+aromatic+hydrocarbon-induced+signaling+events+relevant+to+inflammation+and+tumorigenesis+in+lung+cells+are+dependent+on+molecular+structure%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS.+One%22%5BJournal%5D)">Polycyclic aromatic hydrocarbon-induced signaling events relevant to inflammation and tumorigenesis in lung cells are dependent on molecular structure.</a> PLoS. One. 8 (6), e65150(2014).</li>
<li>Weis, L. M., Rummel, A. M., Masten, S. J., Trosko, J. E., Upham, B. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bay+or+baylike+regions+of+polycyclic+aromatic+hydrocarbons+were+potent+inhibitors+of+gap+junctional+intercellular+communication%5BTitle%5D)+AND+%22Environ.Health+Perspect%22%5BJournal%5D)">Bay or baylike regions of polycyclic aromatic hydrocarbons were potent inhibitors of gap junctional intercellular communication.</a> Environ.Health Perspect. 106 (1), 17-22 (1998).</li>
<li>Yotti, L. P., Chang, C. C., Trosko, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Elimination+of+metabolic+cooperation+in+Chinese+hamster+cells+by+a+tumor+promoter%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Elimination of metabolic cooperation in Chinese hamster cells by a tumor promoter.</a> Science. 206 (4422), 1089-1091 (1979).</li>
<li>Zhao, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((New+caged+coumarin+fluorophores+with+extraordinary+uncaging+cross+sections+suitable+for+biological+imaging+applications%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Am.+Chem.+Soc%22%5BJournal%5D)">New caged coumarin fluorophores with extraordinary uncaging cross sections suitable for biological imaging applications.</a> J. Am. Chem. Soc. 126 (14), 4653-4663 (2004).</li>
<li>Goldberg, G. S., Bechberger, J. F., Naus, C. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+pre-loading+method+of+evaluating+gap+junctional+communication+by+fluorescent+dye+transfer%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechniques%22%5BJournal%5D)">A pre-loading method of evaluating gap junctional communication by fluorescent dye transfer.</a> Biotechniques. 18 (3), 490-497 (1995).</li>
<li>Ziambaras, K., Lecanda, F., Steinberg, T. H., Civitelli, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cyclic+stretch+enhances+gap+junctional+communication+between+osteoblastic+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J.Bone+Miner.Res%22%5BJournal%5D)">Cyclic stretch enhances gap junctional communication between osteoblastic cells.</a> J.Bone Miner.Res. 13 (2), 218-228 (1998).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Test SL-DT jest prostą i wszechstronną techniką pomiaru GJIC, ale istnieje kilka krytycznych problemów, które należy wziąć pod uwagę przy projektowaniu odpowiednich protokołów eksperymentalnych. Aby uzyskać solidne pomiary GJIC przy użyciu testu SL-DT, musi istnieć dobre rozprzestrzenianie się barwnika LY przez połączenia szczelinowe komórek. Jako minimum należy wybrać odpowiedni czas, aby zapewnić, że barwnik rozprzestrzeni się przez osiem lub więcej rzędów komórek z komórek obciążonych skalpelem w obu kierunkach. Ponad...

Ogólnym celem tej metody jest dostarczenie prostej, wszechstronnej i stosunkowo taniej techniki oceny potencjalnej toksyczności związków. Jest to podejście in vitro, które można zastosować w wielu liniach komórkowych. Standardowe laboratoria biologii komórki wyposażone w mikroskopy epifluorescencyjne mogą prowadzić badania przy użyciu tego testu.
Nasza podstawowa wiedza na temat funkcji komórek była w dużym stopniu zależna od testów biologicznych in vitro i stała się niezbędnym składnikiem w ocenach toksykologicznych farmaceutyków, zanieczyszczeń środowiska i zanieczyszczeń żywności. Niestety, nie ma jednego systemu testów biologicznych in vitro, który byłby w stanie kompleksowo spełnić wymagania dotyczące wszystkich ocen toksykologicznych. Wiele testów in vitro jest zaprojektowanych i zoptymalizowanych pod kątem oceny, a także oceny określonego biochemicznego lub molekularnego punktu końcowego. Są one dość często łączone w konfigurację o wysokiej przepustowości, aby odzwierciedlić zaburzenie pewnego szlaku transdukcji sygnału, takiego jak sygnalizacja receptora estrogenowego1. Strategia ta okazała się całkiem skuteczna, ale ogromna liczba szlaków transdukcji sygnału zaangażowanych w ekspresję genów sprawia, że zadanie wyboru konkretnego szlaku sygnałowego do oceny jest dość złożone. Obecnie opracowywane są protokoły o wysokiej przepustowości, które są wykorzystywane do jednoczesnego pomiaru wielu ścieżek sygnałowych, co jest jednym z podejść do przezwyciężenia niektórych ograniczeń pojedynczych testów. Jednak nie wszystkie szlaki sygnałowe zostały z powodzeniem włączone do bardziej kompleksowych podejść, a ponadto stale odkrywane są nowe szlaki sygnałowe, co jeszcze bardziej komplikuje ten proces oceny. Stosowanie dużej liczby podejść in vitro, w szczególności systemów o wysokiej przepustowości, do kompleksowych ocen toksykologicznych jest również bardzo kosztowne i nie sprzyja większości projektów badawczych prowadzonych przez jednego badacza.
GJIC to proces ściśle kontrolowany przez zmiany napięcia, stężenia wapnia, pH, równowagi redoks, regulowany przez główne wewnątrzkomórkowe szlaki transdukcji sygnału i interakcje z białkami błony i cytoszkieletu2,3. Tak więc hamowanie GJIC może odzwierciedlać różne rodzaje stresu komórkowego, zakłócenia różnych funkcji komórkowych lub zaburzenia różnych szlaków transdukcji sygnału. Innym podejściem do przezwyciężenia stosowania ograniczonych testów biologicznych transdukcji sygnału jest wykorzystanie zjawisk biologicznych polegających na tym, że wiele, jeśli nie większość, szlaków transdukcji sygnału jest dalej modulowanych przez współpracujące systemy sygnalizacji międzykomórkowej przez kanały połączeń szczelinowych4-8. Chociaż międzykomórkowe systemy sygnalizacyjne są również liczne i podlegają kontroli wielu ścieżek, sygnalizacja międzykomórkowa przez kanały połączeń szczelinowych jest ostatecznie funkcją kanałów, które są otwierane, częściowo zamknięte lub całkowicie zamknięte. Zapewnia to punkt końcowy, który można łatwo zmierzyć za pomocą różnych systemów testów biologicznych in vitro 7. Biorąc pod uwagę, że homeostatyczna wartość zadana tkanki wymaga otwartych kanałów, określenie wpływu związków na komunikację międzykomórkową w szczelinie (GJIC) jest bardziej kompleksowym podejściem do określania potencjalnych skutków toksycznych związków4,8. W istocie, to krytyczne zjawisko biologiczne, które odgrywa kluczową rolę w koordynowaniu wielu zdarzeń transdukcji sygnału kontrolujących ekspresję genów, pozwala na szeroką ocenę skutków toksycznych. W związku z tym testy biologiczne, które oceniają GJIC, są doskonałym punktem wyjścia do oceny potencjału toksycznego związków.
Najbardziej rozbudowane techniki używane do oceny GJIC opierają się na wstępnym załadowaniu komórek sondą fluorescencyjną, a następnie monitorowaniu migracji barwnika z załadowanej komórki lub komórek do sąsiednich komórek. Techniki wstępnego ładowania barwnika obejmowały mikroiniekcję9, ładowanie skrobanie10 i estry metylowe sond11. Metoda obciążenia skalpelem i fluorescencyjnego transferu barwnika (SL-DT) jest modyfikacją testu obciążenia skrobaniem - transferu barwnika opracowanego przez El Fouly10. Zamiast bardziej inwazyjnego skrobania, metoda ładowania skalpelem opisana w tym raporcie polega na delikatnym przetaczaniu skalpela z okrągłym ostrzem przez monowarstwę komórek, które minimalizują uszkodzenia inwazyjne (ryc. 1). Zaletą tej techniki jest ocena toksykologiczna populacji komórek, a nie pojedynczych komórek w teście mikroiniekcji. Co więcej, prostota tego testu pozwala na szybkie wykrycie wielu płytek w krótkim czasie, podczas gdy metody wykorzystujące techniki mikroiniekcji oraz techniki wykorzystujące estry metylowe sond fluorescencyjnych są znacznie bardziej czasochłonne i wymagają znacznie wyższego poziomu umiejętności.
Chociaż nie ma jednej metody na zaspokojenie wszystkich potrzeb badania GJIC; test SL-DT jest prostym, dość tanim i wszechstronnym testem, który może zaspokoić wiele potrzeb związanych z początkową oceną toksyczności różnych związków. Do głównych zalet należą: prostota, brak specjalnego zapotrzebowania na sprzęt lub umiejętności, które są wymagane przy innych metodach, takich jak mikroiniekcja, odzyskiwanie fluorescencyjne po fotowybielaniu (FRAP) i lokalna aktywacja molekularnych testów fluorescencyjnych, szybka i jednoczesna ocena GJIC w dużej liczbie komórek, sprzyjająca konfiguracji o wysokiej przepustowości z automatycznym obrazowaniem i analizą mikroskopii fluorescencyjnej, a także jego zdolność adaptacji do badań in vivo.

<table><tbody><tr><td>WB-F344 komórki nabłonkowe wątroby szczura</td><td>Od dr J. W. Grishama i MS Tsao z Uniwersytetu Karoliny Północnej (Chapel Hill, NC)</td><td>brak</td><td>Dostarczone przez dr J. W. Grishama i MS Tsao University of North Carolina-Chapel Hill-NC</td></tr><tr><td>Płytki hodowlane 35 mm</td><td>Corning</td><td>430165</td><td></td></tr><tr><td>25 cm2 kolby hodowlane</td><td>Corning</td><td>430639</td><td></td></tr><tr><td>Kolby hodowlane 75 cm2</td><td>Corning</td><td>430641</td><td></td></tr><tr><td>D-medium, pożywka modyfikowana przez Eagles&nbsp;</td><td>ThermoFisher/GIBCO&nbsp;</td><td>Wzór nr 78-5470EF</td><td></td></tr><tr><td>płodowa surowica bydlęca</td><td>ThermoFisher/GIBCO&nbsp;</td><td>10437</td><td></td></tr><tr><td>0,25% trypsyna-EDTA&nbsp;</td><td>ThermoFisher/GIBCO&nbsp;</td><td>15050</td><td></td></tr><tr><td>sól fizjologiczna buforowana fosforanami</td><td>domowej roboty</td><td>patrz poniżej dla składnika cat#</td><td>137 mM NaCl, 2,7 mM KCl, 10 mM Na2PO4, 2 mM KH2PO4</td></tr><tr><td>KCl</td><td>JT Baker - Mallinckrodt&nbsp;</td><td>3040-01</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>JT Baker - Mallinckrodt&nbsp;</td><td>3624-05</td><td></td></tr><tr><td>Na2HPO4</td><td>JT Baker - Mallinckrodt&nbsp;</td><td>3819--01</td><td></td></tr><tr><td>KH2PO4</td><td>JT Baker - Mallinckrodt&nbsp;</td><td>3246-01</td><td></td></tr><tr><td>Lucyfer Żółty CH, sól litowa</td><td>Sigma-Aldrich Chemical</td><td>L0259</td><td></td></tr><tr><td>rodamina-dekstran</td><td>Sigma-Aldrich Chemical</td><td>R9379</td><td></td></tr><tr><td>1-metyloantracen</td><td>Sigma-Aldrich Chemical</td><td></td><td></td></tr><tr><td>fenantren</td><td>Sigma-Aldrich Chemical</td><td>P11409</td><td></td></tr><tr><td>resweratrol</td><td>Sigma-Aldrich Chemical</td><td>R5010</td><td></td></tr><tr><td>D609</td><td>Tocris Bioscience&nbsp;</td><td>1437</td><td></td></tr><tr><td>acetonitryl</td><td>EMD</td><td>AX0145-1</td><td></td></tr><tr><td>37% roztwór formaldehydu</td><td>JT Baker - Mallinckrodt&nbsp;</td><td>2106-01</td><td></td></tr><tr><td>#20 ostrze chirurgiczne</td><td>Fine Science Tools Inc.&nbsp;</td><td>10317-14</td><td></td></tr><tr><td>50 ml stożkowe sterylne probówki</td><td>Thermo scientific&nbsp;</td><td></td><td></td>339652</tr><tr><td>Mikroskop epifluorescencyjny firmy Nikon&nbsp;</td><td>Nikon -Mager Scientific</td><td>Eclipse TE300</td><td></td></tr><tr><td>Nikon FITC dichroiczna kostka</td><td>Nikon -Mager Scientific</td><td>96107</td><td></td></tr><tr><td>Kamera CCD</td><td>Nikon -Mager Scientific</td><td>Nikon Cool Snap EZ</td> System obrazowania CCD <td></td></tr><tr><td></td><td>Nikon -Mager Scientific</td><td>Nikon NIS-Elements F2.2.</td><td></td></tr><tr><td>ImageJ</td><td>Narodowy Instytut Zdrowia</td><td>http://imagej.nih.gov/ij/</td><td></td></tr></tbody></table>

komunikacja międzykomórkowa ze skrzyżowaniem szczelinowym: funkcjonalny biomarker do oceny niekorzystnych skutków toksyn i toksyn oraz korzyści zdrowotnych produktów naturalnych

Gap Junctional Intercellular Communication: A Functional Biomarker to Assess Adverse Effects of Toxicants and Toxins, and Health Benefits of Natural Products

Ten protokół opisuje technikę transferu barwnika fluorescencyjnego (SL-DT) za pomocą skalpela, która mierzy komunikację międzykomórkową poprzez kanały połączeń szczelinowych, co jest głównym procesem międzykomórkowym, dzięki któremu utrzymywana jest homeostaza tkanek. Przerwanie komunikacji międzykomórkowej (GJIC) przez toksyny, toksyny, leki itp. wiąże się z licznymi niekorzystnymi skutkami zdrowotnymi. Wiele chorób genetycznych u ludzi jest powiązanych z mutacjami w genach połączeń szczelinowych. Technika SL-DT jest prostym testem funkcjonalnym do jednoczesnej oceny GJIC w dużej populacji komórek. Test polega na wstępnym załadowaniu komórek barwnikiem fluorescencyjnym poprzez krótkie zakłócenie błony komórkowej ostrzem skalpela przez populację komórek. Barwnik fluorescencyjny może następnie przechodzić przez kanały połączeń szczelinowych do sąsiednich komórek przez określony czas. Test jest następnie przerywany przez dodanie formaliny do komórek. Rozprzestrzenianie się barwnika fluorescencyjnego w populacji komórek ocenia się za pomocą mikroskopu epifluorescencyjnego, a obrazy są analizowane za pomocą dowolnej liczby dostępnych pakietów oprogramowania morfometrycznego, w tym pakietów bezpłatnego oprogramowania znalezionych w domenie publicznej. Test ten został również przystosowany do badań in vivo z wykorzystaniem wycinków tkanek z różnych narządów leczonych zwierząt. Ogólnie rzecz biorąc, test SL-DT może zaspokoić szeroki zakres potrzeb farmakologicznych i toksykologicznych in vitro i może być potencjalnie dostosowany do wysokowydajnych systemów konfiguracyjnych z automatycznym obrazowaniem i analizą mikroskopii fluorescencyjnej w celu wyjaśnienia większej liczby próbek w krótszym czasie.

Zaburzenie komunikacji poprzez połączenia szczelinowe (GJIC) jest szeroko wykorzystywane jako biomarker do identyfikacji związków toksycznych na niegenotoksycznym, epigenetycznym poziomie kontroli genów, które wywołują niekorzystne skutki zdrowotne14. Na przykład wielopierścieniowe węglowodory aromatyczne (WWA) są powszechnymi zanieczyszczeniami środowiska, jednak ich toksyczność epigenetyczna różni się w zależności od ich struktury molekularnej15. W wielu zróżnicowa...

Ten protokół opisuje technikę przenoszenia barwnika metodą skalpela i fluorescencyjnego, która mierzy komunikację międzykomórkową poprzez kanały połączeń szczelinowych. Komunikacja międzykomórkowa ze skrzyżowaniem szczelinowym jest głównym procesem komórkowym, w którym utrzymywana jest homeostaza tkanek, a zakłócenie tej sygnalizacji komórkowej ma niekorzystne skutki zdrowotne.

Komunikacja międzykomórkowa ze skrzyżowaniem szczelinowym: funkcjonalny biomarker do oceny niekorzystnych skutków toksyn i toksyn oraz korzyści zdrowotnych produktów naturalnych

This protocol describes a scalpel loading-fluorescent dye transfer (SL-DT) technique that measures intercellular communication through gap junction ...

Ogólnym celem jest dostarczenie prostego testu do pomiaru komunikacji międzykomórkowej w szczelinie za pośrednictwem populacji komórek ssaków, który może zaspokoić szeroki zakres potrzeb farmakologicznych i toksykologicznych in vitro. Metoda ta może pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytania w dziedzinie toksykologii, takie jak to, czy związek wpływa na rozwój lub utrzymanie tkanki, poprzez rozregulowanie komunikacji międzykomórkowej w szczelinie. Główną zaletą tej techniki jest to, że oferuje prostą i szybką ocenę funkcji złącza szczelinowego w dużej populacji komórek w odpowiedzi na toksyny i toksyny.Procedurę zademonstruje Ajna Uzuni, asystentka naukowa z mojego laboratorium. Aby rozpocząć eksperyment, wysiewaj trzy razy 10 do piątej WB-F344 komórek nabłonka wątroby szczura na płytkach hodowlanych o średnicy 35 milimetrów zawierających zmodyfikowaną pożywkę Eagle'a oraz 5% płodowej surowicy bydlęcej. Hoduj komórki w inkubatorze, aż osiągną 100% zbieżności i kontynuuj eksperymentalne traktowanie komórek.Aby kontynuować eksperymenty dawka-odpowiedź, dodaj 10 mikrolitrów i 20 mikrolitrów wcześniej przygotowanego, dwumilimolowego roztworu podstawowego fenantrenu w 100% acetonitrylu oraz cztery mikrolitry, sześć mikrolitrów i osiem mikrolitrów 20-milimolowego roztworu podstawowego fenantrenu w 100% acetonitrylu do trzech płytek komórek zawierających dwa mililitry pożywki wzrostowej na każdą dodaną objętość roztworu podstawowego. Następnie dodaj cztery mikrolitry, sześć mikrolitrów, osiem mikrolitrów, 10 mikrolitrów i 20 mikrolitrów 100% roztworu acetonitrylu do trzech płytek komórek zawierających dwa mililitry pożywki wzrostowej na każdą dodaną objętość roztworu acetonitrylu, który ma służyć jako kontrola nośnika. Po dodaniu acetonitrylu inkubować płytki.Aby przeprowadzić eksperymenty z reakcją czasową, dodaj siedem mikrolitrów 20-milimolowego roztworu podstawowego fenantrenu w 100% acetonitrylu do trzech płytek komórek, zawierających dwa mililitry pożywki wzrostowej na każdy punkt czasowy. Następnie dodaj siedem mikrolitrów 100% acetonitrylu do trzech płytek komórek, zawierających dwa mililitry pożywki wzrostowej na każdy punkt czasowy, aby służyły jako kontrola nośnika. Inkubuj płytki dla każdego wyznaczonego punktu czasowego.Wyrzuć pożywkę hodowlaną, delikatnie odlewając pożywkę. Przepłucz komórki trzema mililitrami PBS i albo zdekantuj, albo odessaj między płukaniami. Odpipetować jeden mililitr jednego miligrama na mililitr żółtego barwnika lucyfera rozpuszczonego w PBS do każdej płytki komórkowej.Wstępnie załaduj barwnik do komórek, ściskając skalpel między palcem wskazującym a kciukiem. Umieść skalpel prostopadle do krawędzi płytki hodowlanej i pięć milimetrów od niej, a następnie użyj grawitacji, aby skalpel delikatnie przetoczył się z tego prostopadłego kąta pod kątem 15 stopni. Przetocz ostrze przez populację komórek w trzech różnych obszarach całej płytki.Następnie inkubuj komórki z roztworem LY przez trzy minuty w temperaturze pokojowej. Zdekantować lub odessać LY i przepłukać komórki, aby usunąć cały barwnik zewnątrzkomórkowy i wyeliminować zewnątrzkomórkową fluorescencję tła. Następnie dodaj 0,5 mililitra 4% roztworu formaliny buforowanej fosforanem, aby utrwalić komórki.Zobacz utrwalone komórki za pomocą mikroskopu epifluorescencyjnego przy 200-krotnym powiększeniu. Wyrównaj wszystkie płytki tak, aby linia wcięcia była równoległa do poziomego pola widzenia. Wygenerowano serię obrazów SL-DT komórek nabłonka wątroby szczura WB-F344 leczonych rosnącymi dawkami fenantrenu.Spadek migracji żółtego barwnika fluorescencyjnego lucyfera jest spowodowany rosnącymi dawkami fenantrenu, co świadczy o rosnącym indukowanym przez toksyny hamowaniu komunikacji międzykomórkowej w szczelinie lub GJIC. Ułamek kontrolny lub wartości FOC uzyskane z obrazów SL-DT uśredniono, przeanalizowano statystycznie, a następnie sporządzono wykres. Po tej procedurze można wykonać inne metody, takie jak western blot pojedynczych białek transdukcji, aby odpowiedzieć na dodatkowe pytania.Na przykład, czy te związki aktywują mitogenne zdarzenia perforacji komórek?

gap-junctional-intercellular-communication-functional-biomarker-to

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Opisano test częstotliwości adhezji służący do pomiaru kinetyki oddziaływań receptor-ligand w sytuacjach, gdy obie cząsteczki są zakotwiczone na powierzchniach oddziałujących komórek. Ten oparty na mechanice test został zilustrowany z wykorzystaniem ludzkiego erytrocyta poddanego ciśnieniu za pomocą mikropipety jako sensora adhezji oraz integryny αLβ2 i cząsteczki adhezyjnej międzykomórkowej 1 jako oddziałujących receptorów i ligandów.

Analiza częstotliwości adhezji w celu badania kinetyki in situ międzykomórkowych oddziaływań molekularnych w obrębie złączy komórkowych

Opisujemy tutaj, jak wykonać mikroiniekcję pojedynczej komórki Lucyfera Żółtego, aby zobrazować komunikację komórkową poprzez połączenia szczelinowe w żywych komórkach, i podajemy kilka przydatnych wskazówek. Oczekujemy, że ten artykuł pomoże każdemu ocenić stopień sprzężenia komórkowego z powodu funkcjonalnych połączeń szczelinowych. Wszystko, co tu opisano, można by w zasadzie zaadaptować do innych barwników fluorescencyjnych o masie cząsteczkowej poniżej 1000 daltonów.

Mikroiniekcja jednokomórkowa do analizy komunikacji komórkowej

Ta prezentacja demonstruje metodę, za pomocą której elektroporacja przylegających, hodowanych komórek jest używana do badania komunikacji międzykomórkowej, połączeniowej, podczas gdy komórki rosną na szkiełku pokrytym przewodzącym i przezroczystym tlenkiem indu i cyny.

Test funkcjonalny do badania łączenia luk; Elektroporacja ogniw adherentnych na tlenku indu i cyny

Ulepszone testy neurotoksyczności in vitro pomogłyby w identyfikacji nowych związków neuroprotekcyjnych. Przedstawiono przydatność analizatora komórkowego opartego na impedancji w czasie rzeczywistym do określania cytotoksyczności i cytoprotekcji w liniach komórek neuronalnych oraz do wyznaczania udziału szlaków drugiego przekaźnika, uzyskując w ten sposób wgląd w mechanizm neuroprotekcji.

Analizator komórek oparty na impedancji w czasie rzeczywistym jako narzędzie do wyznaczania szlaków molekularnych zaangażowanych w neurotoksyczność i neuroprotekcję w linii komórek neuronalnych

Protokoły opisują dwa systemy testów toksyczności rozwojowej in vitro (UKK i UKN1) oparte na ludzkich embrionalnych komórkach macierzystych i badaniach transkryptomu. Systemy testowe przewidują zagrożenie toksycznym wpływem na rozwój człowieka i mogą przyczynić się do zmniejszenia liczby badań na zwierzętach, kosztów i czasu potrzebnego na przeprowadzenie badań bezpieczeństwa chemicznego.

Testy toksyczności rozwojowej na podstawie ludzkich pluripotencjalnych komórek macierzystych do badań przesiewowych bezpieczeństwa chemicznego i generowania danych z biologii systemowej

Badanie wczesnej migracji komórek śródbłonka (EEC) jest ważne dla zrozumienia patofizjologii niektórych chorób i potencjalnego zidentyfikowania nowych strategii interwencji terapeutycznej. Poniższy protokół opisuje techniki oceny migracji komórek, które zostały dostosowane do badania EWG.

Ocena migracji komórek śródbłonka po ekspozycji na toksyczne chemikalia

Tutaj prezentujemy protokół dla nowatorskiego testu komunikacji międzykomórkowej z połączeniem szczelinowym, przeznaczonego do wysokoprzepustowych badań przesiewowych substancji chemicznych modulujących złącze szczelinowe w celu odkrycia leków i oceny toksykologicznej.

Test komunikacji międzykomórkowej z jodkowo-żółtą fluorescencyjną przerwą białkową-złącze szczelinowe

Tutaj prezentujemy protokół oparty na mechanice, który ma na celu zakłócenie połączenia szczelinowego 43 i zmierzenie późniejszego wpływu, jaki ma to na biomechanikę śródbłonka poprzez obserwację trakcji i naprężeń międzykomórkowych.

Zaburzanie biomechaniki śródbłonka poprzez zakłócenie strukturalne Connexin 43

Ten protokół przedstawia zautomatyzowaną, opartą na obrazie technikę wysokoprzepustową do identyfikacji związków modulujących zabijanie komórek raka piersi za pośrednictwem komórek NK w obecności terapeutycznego przeciwciała anty-HER-2.

Test przesiewowy o wysokiej zawartości do identyfikacji zależnych od przeciwciał związków modyfikujących cytotoksyczność komórkową

W tym nagranym protokole zaprezentowano technikę sekcji służącą do usunięcia zakrętu zębatego u dorosłej myszy przy użyciu stereomikroskopu.

Disekcja zakrętu zębatego hipokampa dorosłej myszy

Poznaj technikę transferu barwnika fluorescencyjnego do oceny komunikacji międzykomórkowej przez szczeliny łączące w komórkach ssaków. Ta metoda pozwala szybko badać wpływ toksyn na funkcję połączeń szczelinowych.

Komunikacja międzykomórkowa ze skrzyżowaniem szczelinowym: funkcjonalny biomarker do oceny niekorzystnych skutków toksyn i toksyn oraz korzyści zdrowotnych produktów naturalnych (Wideo) | JoVE Journal

Komunikacja międzykomórkowa ze skrzyżowaniem szczelinowym: funkcjonalny biomarker do oceny niekorzystnych skutków toksyn i toksyn oraz korzyści zdrowotnych produktów naturalnych

Przeglądaj więcej filmów