Name: Filtracja izolacji kwasów nukleinowych: prosta i szybka metoda ekstrakcji DNA (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-08-06T13:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 56 s
Description: Poznaj metodę FINA do szybkiej ekstrakcji DNA z krwi całej dla diagnostyki HIV za pomocą PCR ilościowego. Ta technika papierowa nie wymaga sprzętu laboratoryjnego i trwa mniej niż dwie minuty.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Ten rozwój protokołu był wspierany przez grant Fundacji Billa i Melindy Gatesów Grand Challenges in Global Health 37774. Odczynniki do PCR w czasie rzeczywistym i porady zostały dostarczone przez firmę Abbott Molecular Inc. Des Plaines, IL. Komórki 8E5-LAV zostały dostarczone przez Laboratorium Zapewnienia Jakości Wirusologii, Rush Presbyterian; Centrum Medyczne św. Łukasza. Krew z ujemnym wynikiem testu na obecność wirusa HIV-1 została dostarczona przez Core Lab, NorthShore University HealthSystems, Evanston, IL. Podziękowania dla Marka Fishera za pomoc fotograficzną.

Oświadczenie etyczne: Próbki krwi pełnej użyte w tym badaniu nie są uważane za badania z udziałem ludzi. Próbki zostały pozyskane do klinicznych celów diagnostycznych, które zostały spełnione, a pozostała część tych próbek została przekazana do testu badawczego FINA. Próbki zostały zakodowane w taki sposób, że badacze nie byli w stanie łatwo ustalić tożsamości osób.
1. Przygotowanie modułu przygotowania próbek FINA
<ol>
	<li>Przygotuj bibułkę, wycinając 35 x 35mm2 ze 100% wacika o grubości 2,6 mm. Wytnij jedną podkładkę na próbkę.</li>
	<li>Przygotuj plastikową folię parafinową za pomocą papierowej taśmy podkładowej, wycinając kawałek folii parafinowej (25 mm (wys.) na 50 mm (szer.)), a następnie wybijając otwór o średnicy 7,14 mm w środku taśmy za pomocą dziurkacza wbijanego młotkiem. Przygotuj jedną taśmę na próbkę.</li>
	<li>Przygotuj związany dysk szklanej membrany separatora krwi (membrany wychwytującej), przebijając okrąg o średnicy 8,35 mm za pomocą dziurkacza wbijanego młotkiem. Przebij jeden krążek na próbkę. Dysk ma zdolność zatrzymywania cząstek na poziomie 2,3 μm.</li>
	<li>Zmontuj moduł przygotowania próbki FINA, umieszczając dysk przechwytujący na środku bibuły za pomocą kleszczy. Umieść taśmę z folii parafinowej na dysku przechwytującym tak, aby otwór taśmy parafinowej pozostawiał odsłonięty środek dysku przechwytującego.</li>
	<li>Zapewnij maksymalny kontakt między krążkiem a podkładką bibułkową, lekko rozciągając taśmę parafinową, aby zakryć podkładkę bibułkową i mocno dociskając taśmę parafinową, aby przykleić ją do bibułki wokół wszystkich krawędzi dysku.</li>
	<li>Zbuduj tyle modułów, ile potrzeba do eksperymentu lub zgromadź do wykorzystania w przyszłości.</li>
</ol>
2. Przygotowanie probówki qPCR
<ol>
	<li>Przygotuj krążek taśmy o średnicy 5,1 mm, który zakotwiczy błonę wychwytującą komórki z boku probówki qPCR, aby zapobiec blokowaniu detekcji fluorescencji przez membranę poprzez przebicie koła podwójnie powlekanej poliestrowej taśmy diagnostycznej za pomocą stempla wbijanego młotkiem z arkusza taśmy. Przygotuj jeden krążek taśmowy na próbkę.</li>
	<li>Usuń jedną stronę paska ochronnego taśmy klejącej. Umieść taśmę w probówce do PCR o pojemności 200 μl, przyklejając ją z jednej strony i w kierunku dolnej części probówki. Usuń drugi wkładek do naklejek. Tuba jest teraz gotowa do przyjęcia przygotowanego dysku.</li>
	<li>Wyprodukuj tyle probówek, ile potrzeba do eksperymentu lub zgromadź zapasy do wykorzystania w przyszłości.</li>
</ol>
3. Spreparuj próbkę krwi
Uwaga: Jeśli przygotowywana jest oryginalna próbka testowa, przejdź do kroku 4.
<ol>
	<li>Rozmrozić komórki 8e5-LAV 15 zawierające pojedynczą kopię prowirusa HIV-1 uzyskanego z Laboratorium Zapewnienia Jakości Wirusologii (VQA; Rush Presbyterian/St. Luke's Medical Center, Chicago, IL). 
	Uwaga: Są one przechowywane w postaci zamrożonych granulek komórkowych w stężeniu 4 000 komórek/μl. Liczba komórek została zweryfikowana zgodnie z wcześniejszym opisem 9.</li>
	<li>Przygotować seryjne rozcieńczenia w pożywce zamrażającej (90% płodowa surowica bydlęca, 10% dimetylosulfotlenek) do stężeń w zakresie od 1 do 400 komórek/μl.</li>
	<li>Odpipetować 10 μl komórek z każdego z seryjnych rozcieńczeń do probówki mikrowirówkowej. Dodaj 100 μl świeżej próbki krwi pełnej poddanej działaniu HIV-1 z ujemnym wynikiem EDTA do każdej probówki, aby utworzyć standardową krzywą liczby kopii 8e5-LAV 10-4,000. Wymieszaj, delikatnie przesuwając spód tubki 5 razy.</li>
</ol>
4. Wykonaj ekstrakcję FINA
<ol>
	<li>Lizować krwinki, dodając Triton-X100) do końcowego stężenia 1% (11 μl 10% Triton-X100 do 110 μl pełnej krwi i komórek z kroku 3.3).</li>
	<li>Wymieszaj, delikatnie przesuwając spód tubki 5 razy. Krew powinna zmienić kolor na półprzezroczysty czerwony.</li>
	<li>Zlosuj całą próbkę krwi na dysk przechwytujący. 
	Uwaga: Wodoszczelne uszczelnienie między taśmą parafinową a membraną wychwytującą zapewnia przepływ krwi przez membranę, a dobry kontakt między membraną wychwytującą a zespołem podkładki bibułkowej zapewnia szybkie odprowadzanie próbki.</li>
	<li>Pozwól próbce przesiąknąć przez filtr. 
	Uwaga: Lizat krwi przenika do podkładki bibułkowej w wyniku działania kapilarnego, wychwytując genomowe DNA na powierzchni dysku wychwytującego. Lisat wsiąkł w dysk, gdy wydaje się matowy.</li>
	<li>Dodaj kroplami 600-1,000 μl 10 mM NaOH na dysk przechwytujący. 
	Uwaga: Bufor do płukania można również dodać jako dodatek luzem 600 μl. Bufor utworzy kropelkę na hydrofobowej taśmie parafinowej i przeniknie przez otwór do dysku w ciągu około 20 sekund. Filtr zmieni kolor z czerwonego na biały, wskazując na klirens hemoglobiny.</li>
	<li>Oddziel krążek od bibułki za pomocą kleszczyków i przyłóż krążek do taśmy w przygotowanej probówce PCR. Jeśli na filtrze pozostał czerwony kolor, dodaj 50-100 μl buforu do płukania, aby wyczyścić filtr przed umieszczeniem w probówce. 
	Uwaga: W rzadkich przypadkach nadciśnienie stosowane podczas przygotowywania modułów FINA powoduje podział warstw membrany podczas oddzielania od bibuły. Wyrzuć te krążki i przygotuj nową próbkę.</li>
	<li>Po umieszczeniu filtra w probówce do PCR należy od razu przeanalizować próbki. Alternatywnie, wysuszyć przez noc w pudełku zawierającym środek osuszający z siarczanem wapnia, a następnie zakryć i umieścić w foliowej torebce ze środkiem osuszającym krzemionkę i przechowywać do momentu, aż będzie gotowy do analizy.</li>
</ol>
5. Reakcja qPCR
<ol>
	<li>Przygotować 100 μl głównej mieszaniny qPCR na reakcję, używając starterów i sond specyficznych dla wirusa HIV, jak opisano poprzednio 9,11. Uwzględnij wewnętrzną kontrolę amplifikacji w celu monitorowania obecności inhibitorów amplifikacji i sprawdzenia, czy próbka ujemna jest prawdziwie ujemna. Upewnij się, że filtr jest całkowicie pokryty mieszanką główną i że filtr pozostaje przymocowany do boku rurki przez cały czas trwania reakcji.</li>
	<li>Wykonaj amplifikację za pomocą urządzenia do PCR w czasie rzeczywistym, jak opisano wcześniej 9.</li>
</ol>

<ol><li>Byrnes, S. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((One-step+purification+and+concentration+of+DNA+in+porous+membranes+for+point-of-care+applications%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+Chip%22%5BJournal%5D)">One-step purification and concentration of DNA in porous membranes for point-of-care applications.</a> Lab Chip. 15 (12), 2647-2659 (2015).</li>
<li>Connelly, J. T., Rolland, J. P., Whitesides, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((%22Paper+Machine%22+for+Molecular+Diagnostics%5BTitle%5D)+AND+%22Anal+Chem%22%5BJournal%5D)">"Paper Machine" for Molecular Diagnostics.</a> Anal Chem. 87 (15), 7595-7601 (2015).</li>
<li>Govindarajan, A. V., Ramachandran, S., Vigil, G. D., Yager, P., Bohringer, K. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+low+cost+point-of-care+viscous+sample+preparation+device+for+molecular+diagnosis+in+the+developing+world%3B+an+example+of+microfluidic+origami%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+Chip%22%5BJournal%5D)">A low cost point-of-care viscous sample preparation device for molecular diagnosis in the developing world; an example of microfluidic origami.</a> Lab Chip. 12 (1), 174-181 (2012).</li>
<li>Linnes, J. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Paper-based+molecular+diagnostic+for%5BTitle%5D)+AND+%22RSC+Adv%22%5BJournal%5D)">Paper-based molecular diagnostic for.</a> RSC Adv. 4 (80), 42245-42251 (2014).</li>
<li>Rodriguez, N. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Paper-Based+RNA+Extraction%2C+in+Situ+Isothermal+Amplification%2C+and+Lateral+Flow+Detection+for+Low-Cost%2C+Rapid+Diagnosis+of+Influenza+A+%28H1N1%29+from+Clinical+Specimens%5BTitle%5D)+AND+%22Anal+Chem%22%5BJournal%5D)">Paper-Based RNA Extraction, in Situ Isothermal Amplification, and Lateral Flow Detection for Low-Cost, Rapid Diagnosis of Influenza A (H1N1) from Clinical Specimens.</a> Anal Chem. 87 (15), 7872-7879 (2015).</li>
<li>Peeling, R. W., Holmes, K. K., Mabey, D., Ronald, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+tests+for+sexually+transmitted+infections+%28STIs%29%3A+the+way+forward%5BTitle%5D)+AND+%22Sex+Transm+Infect%22%5BJournal%5D)">Rapid tests for sexually transmitted infections (STIs): the way forward.</a> Sex Transm Infect. 82, Suppl 5 1-6 (2006).</li>
<li>Mabey, D., Peeling, R. W., Ustianowski, A., Perkins, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Diagnostics+for+the+developing+world%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Diagnostics for the developing world.</a> Nat Rev Microbiol. 2 (3), 231-240 (2004).</li>
<li>Jangam, S. R., Agarwal, A. K., Sur, K., Kelso, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+point-of-care+PCR+test+for+HIV-1+detection+in+resource-limited+settings%5BTitle%5D)+AND+%22Biosens+Bioelectron%22%5BJournal%5D)">A point-of-care PCR test for HIV-1 detection in resource-limited settings.</a> Biosens Bioelectron. 42, 69-75 (2013).</li>
<li>Jangam, S. R., Yamada, D. H., McFall, S. M., Kelso, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+point-of-care+extraction+of+human+immunodeficiency+virus+type+1+proviral+DNA+from+whole+blood+for+detection+by+real-time+PCR%5BTitle%5D)+AND+%22J+Clin+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Rapid point-of-care extraction of human immunodeficiency virus type 1 proviral DNA from whole blood for detection by real-time PCR.</a> J Clin Microbiol. 47 (8), 2363-2368 (2009).</li>
<li>Kelso, D. M., Jangam, S., Yamada, D., McFall, S. Google Patents. , (2012).</li>
<li>McFall, S. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Simple+and+Rapid+DNA+Extraction+Method+from+Whole+Blood+for+Highly+Sensitive+Detection+and+Quantitation+of+HIV-1+Proviral+DNA+by+Real-Time+PCR%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Virological+Methods%22%5BJournal%5D)">A Simple and Rapid DNA Extraction Method from Whole Blood for Highly Sensitive Detection and Quantitation of HIV-1 Proviral DNA by Real-Time PCR.</a> Journal of Virological Methods. 214, 37-42 (2015).</li>
<li>Boom, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+and+simple+method+for+purification+of+nucleic+acids%5BTitle%5D)+AND+%22J+Clin+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Rapid and simple method for purification of nucleic acids.</a> J Clin Microbiol. 28 (3), 495-503 (1990).</li>
<li>Radstrom, P., Knutsson, R., Wolffs, P., Lovenklev, M., Lofstrom, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pre-PCR+processing%3A+strategies+to+generate+PCR-compatible+samples%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Pre-PCR processing: strategies to generate PCR-compatible samples.</a> Mol Biotechnol. 26 (2), 133-146 (2004).</li>
<li>Schrader, C., Schielke, A., Ellerbroek, L., Johne, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((PCR+inhibitors+-+occurrence%2C+properties+and+removal%5BTitle%5D)+AND+%22J+Appl+Microbiol%22%5BJournal%5D)">PCR inhibitors - occurrence, properties and removal.</a> J Appl Microbiol. 113 (5), 1014-1026 (2012).</li>
<li>Folks, T. M., Powell, D. M., Martin, M. A. Google Patents. , (1991).</li>
<li>Violari, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Early+Antiretroviral+Therapy+and+Mortality+among+HIV-Infected+Infants%5BTitle%5D)+AND+%22N+Engl+J+Med%22%5BJournal%5D)">Early Antiretroviral Therapy and Mortality among HIV-Infected Infants.</a> N Engl J Med. 359 (21), 2233-2244 (2008).</li>
<li><a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%22World+Health+Organization%22">World Health Organization</a>. , World Health Organization. Geneva, Switzerland. (2010).</li>
<li>Gruner, N., Stambouli, O., Ross, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dried+blood+spots--preparing+and+processing+for+use+in+immunoassays+and+in+molecular+techniques%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Dried blood spots--preparing and processing for use in immunoassays and in molecular techniques.</a> J Vis Exp. (97), (2015).</li>
<li>Maiers, T. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+investigation+of+fingerstick+blood+collection+for+point-of-care+HIV-1+viral+load+monitoring+in+South+Africa%5BTitle%5D)+AND+%22S+Afr+Med+J%22%5BJournal%5D)">An investigation of fingerstick blood collection for point-of-care HIV-1 viral load monitoring in South Africa.</a> S Afr Med J. 105 (3), 228-231 (2015).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Wykazano, że EID związane z szybkim dostępem do leczenia zmniejsza śmiertelność niemowląt z powodu zakażenia wirusem HIV 16. Ze względu na utrzymywanie się przeciwciał matczynych we krwi niemowlęcia, szybkie testy na obecność przeciwciał HIV mają ograniczoną użyteczność w określaniu statusu niemowląt narażonych na HIV. Światowa Organizacja Zdrowia (WHO) zaleca, aby wszystkie niemowlęta urodzone przez matki zakażone wirusem HIV-1 były badane w wieku 4-6 tygodni za pomocą testu wirusologicznego. Infor...

Kilka raportów omawiało rozwój metod ekstrakcji opartych na papierze lub membranie do stosowania w urządzeniach przyłóżkowych (POC) 1-5 w celu udostępnienia wszystkim wyjątkowej czułości i specyficzności diagnostyki molekularnej. Inicjatywa Diagnostyki Chorób Przenoszonych drogą Płciową Światowej Organizacji Zdrowia (WHO) ukuła termin ASSURED (Affordable, Sensitive, Specific, User-friendly, Rapid and Robust, Equipment-free and Delivered to those who need) w celu opisania idealnych cech testu POC 6. Spośród tych wytycznych, charakterystyka braku sprzętu jest szczególnie trudna do osiągnięcia w diagnostyce molekularnej. Jednak każda innowacja w tej dziedzinie przyczyni się do osiągnięcia celu, jakim jest dotarcie do osób najbardziej potrzebujących, i istnieje nadzieja na krótkoterminową poprawę wydajności testów poprzez dostosowanie istniejącej technologii 7.
Tutaj opisujemy prosty protokół ekstrakcji DNA z krwi pełnej, który nie wymaga skomplikowanej chemii ani laboratoryjnego oprzyrządowania. Metoda przygotowania próbki FINA (filtracja izolacji kwasów nukleinowych) została pierwotnie opracowana w celu ekstrakcji DNA leukocytów z krwi pełnej w celu wykrycia prowirusa HIV-1 w ramach platformy ilościowej diagnostyki PCR (qPCR) (EID) w miejscu opieki nad pacjentem (POC) do użytku w warunkach ograniczonych zasobów 8-11. Ekstrakcja FINA różni się od konwencjonalnych metod oczyszczania, które wykorzystują membrany krzemionkowe lub cząstki paramagnetyczne pokryte krzemionką do odwracalnego wiązania DNA w obecności czynników chaotropowych 12. Zamiast tego FINA wykorzystuje filtrację pionową przez membranę separacyjną do bezpośredniego wyodrębnienia DNA komórkowego z krwi pełnej. Błonę zawierającą uwięzione DNA można umieścić bezpośrednio w probówce do PCR i albo natychmiast użyć w reakcji PCR, albo wysuszyć na powietrzu w celu późniejszej amplifikacji 9. W ekstrakcji próbki nie stosuje się żadnych środków chaotropowych, fenolu ani alkoholi, co eliminuje rozległe etapy płukania potrzebne do usunięcia silnych inhibitorów qPCR pochodzących z procesu ekstrakcji 13,14.
Membrana FINA może wychwycić zarówno komórki 9, jak i genomowe DNA uwolnione przez lizę komórkową 11 przed dodaniem próbki do membrany. W celu wychwycenia komórek krew pełną dodaje się bezpośrednio do błony. Komórki są następnie poddawane lizie w błonie przez dodanie 10 mM NaOH. Zaletą tej metody jest to, że obejmuje tylko 3 etapy: 1) dodanie próbki; 2) liza / płukanie komórek i 3) umieszczenie dysku filtra w probówce qPCR. Wadą tej metody jest to, że membrana może pomieścić tylko określoną liczbę komórek wprost proporcjonalną do średnicy dysku membrany. Aby osiągnąć granicę wykrywalności wymaganą dla EID, do wprowadzenia próbki potrzeba 100 μl krwi pełnej, co wiąże się z filtrem, który jest zbyt duży, aby można go było umieścić w probówce qPCR. Liza komórek krwi detergentem przed dodaniem próbki do membrany zbiorczej dodaje etap przetwarzania, ale pozwala na użycie mniejszego filtra dla tej samej wielkości próbki. Byliśmy w stanie wykazać wysoką odtwarzalność, wykrywanie pojedynczej kopii i kwantyfikację zaledwie 10 kopii prowirusowego DNA wirusa HIV-1 ze 100 μl krwi przy użyciu tej konfiguracji testowej 11.
W tym raporcie opisujemy protokół FINA jako pierwotnie opracowany do użytku laboratoryjnego. Przekładka membranowo-filtracyjna, znana jako moduł przygotowania próbek FINA, może być przygotowywana w dużych partiach i składowana do późniejszego wykorzystania. Gdy próbki mają zostać pobrane, proces ten trwa 2 minuty i może być wykonywany w partiach o różnej wielkości. qPCR można uruchomić natychmiast lub filtry zawierające osadzone DNA mogą być przechowywane do czasu, gdy będzie to wygodne do wykonania qPCR. Ta metoda jest bardzo wygodna w rutynowej analizie próbek zarówno w warunkach niskich, jak i wysokich zasobów.

<table><tbody><tr><td>Fusion 5</td><td>GE Healthcare Life Sciences</td><td>8151-9915</td><td></td></tr><tr><td>707 bibuła</td><td>VWR International</td><td>28298-014</td><td></td></tr><tr><td>PARAFILM M</td><td>VWR International</td><td>52858-000</td><td></td></tr><tr><td>Podwójnie powlekana poliestrowa taśma diagnostyczna 3M&nbsp;</td><td>3M Specjalizacje Medyczne</td><td>9965</td><td></td></tr><tr><td>200 &mikro; l Probówki paskowe qPCR</td><td>Nasadki optyczne Agilent</td><td>401428</td><td></td></tr><tr><td></td><td>Agilent</td><td>401425</td><td></td></tr><tr><td>Mx3005p System qPCR</td><td>Agilent</td><td>401456</td><td></td></tr><tr><td>wodorotlenek sodu</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>221465</td><td>A.C.S.</td></tr><tr><td>Odczynnik Triton X-100</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T9284</td><td>BioXtra</td></tr><tr><td>dimetylosulfotlenek</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D8418</td><td>w dziedzinie biologii molekularnej</td></tr><tr><td>płodowa surowica bydlęca, certyfikowana, pochodzenia amerykańskiego</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>16000-044</td><td></td></tr><tr><td>Dziurkacz do małych otworów z młotkiem o średnicy otworu 3/16" (5,1 mm)</td><td>McMaster Carr</td><td>3424A16</td><td></td></tr><tr><td>Dziurkacz o średnicy 1/4" (7,14 mm) Dziurkacz o średnicy 1/4" (7,14 mm)</td><td>McMaster Carr</td><td>3424A19</td><td></td></tr><tr><td>Dziurkacz o małych otworach z młotkiem o średnicy 5/16" (8,35 mm)</td> <td>McMaster Carr</td><td>3424A23</td><td></td></tr></tbody></table>

filtracja izolacji kwasów nukleinowych: prosta i szybka metoda ekstrakcji dna

Filtration Isolation of Nucleic Acids:  A Simple and Rapid DNA Extraction Method

FINA, filtracja kwasów nukleinowych, to nowatorska metoda ekstrakcji, która wykorzystuje pionową filtrację za pomocą membrany separacyjnej i podkładki absorpcyjnej do ekstrakcji komórkowego DNA z krwi pełnej w czasie krótszym niż 2 minuty. Próbka krwi jest traktowana detergentem, krótko mieszana i nakładana pipetą na membranę separacyjną. Lis przenika do wkładki bibułkowej w wyniku działania kapilarnego, wychwytując genomowe DNA na powierzchni błony separacyjnej. Wyekstrahowane DNA jest zatrzymywane na membranie podczas prostego etapu mycia, w którym inhibitory PCR są wprowadzane do chłonnej wkładki bibułkowej. Błona zawierająca uwięzione DNA jest następnie dodawana do reakcji PCR bez dalszego oczyszczania. Ta prosta metoda nie wymaga sprzętu laboratoryjnego i można ją łatwo wdrożyć za pomocą niedrogich materiałów laboratoryjnych. W tym miejscu opisujemy protokół bardzo czułego wykrywania i ilościowego oznaczania DNA prowirusa HIV-1 ze 100 μl krwi pełnej jako model wczesnej diagnostyki HIV u niemowląt, który można łatwo dostosować do innych celów genetycznych.

Schemat postępowania przy ekstrakcji prowiralnego DNA z krwi pełnej wzbogaconej komórkami 8e5-LAV przedstawiono na Rysunku 1. Rysunek 2 przedstawia moduł próbkowy FINA oraz przygotowaną probówkę do qPCR. Metoda ta umożliwia wydajną amplifikację prowirusa HIV-1 z komórek 8e5-LAV przy różnych liczbach kopii, co obrazuje krzywa standardowa dla preparatów syntetycznych (Rysunek 3). Wydajność PCR wyniosła 103%, obliczona według wzoru Efficienc...

Opisujemy tutaj prostą i szybką metodę ekstrakcji DNA prowirusa HIV z pełnej krwi, wykrywaną metodą ilościowego PCR. Protokół ten może zostać rozszerzony do wykorzystania w wykrywaniu innych markerów genetycznych lub przy użyciu alternatywnych metod amplifikacji.

Filtracja izolacji kwasów nukleinowych: prosta i szybka metoda ekstrakcji DNA

FINA, filtration isolation of nucleic acids, is a novel extraction method which utilizes vertical filtration via a separation membrane and absorbent pad ...

Ogólnym celem metody FINA (ang. filtration isolation of nucleic acids – filtracyjna izolacja kwasów nukleinowych) jest szybka i prosta izolacja genomowego DNA do amplifikacji PCR z kompleksowych próbek, bez użycia aparatury laboratoryjnej, takiej jak wirówka. Ta szybka metoda ekstrakcji DNA oparta na papierze, przeznaczona do wyodrębniania prowiralnego DNA HIV, została opracowana z myślą o wdrożeniu do diagnostycznego urządzenia do ilościowego PCR. Główną zaletą tej techniki jest możliwość wcześniejszego przygotowania modułów do obróbki próbek oraz probówek do PCR, dzięki czemu ekstrakcja DNA trwa mniej niż dwie minuty.Opracowaliśmy tę metodę początkowo w celu włączenia jej do analizy próbek w ramach wczesnej diagnostyki HIV-1 u niemowląt z krwi pobranej z pięty. Osoby rozpoczynające pracę z tą metodą mogą napotkać trudności, ponieważ usunięcie warstwy zabezpieczającej z dwustronnej taśmy, która mocuje membranę do wychwytywania komórek do ścianki probówki PCR, wymaga wprawy. Procedurę zaprezentuje Jen Reed, starszy technik z mojego laboratorium.Rozpocznij procedurę od przygotowania materiałów niezbędnych do montażu modułu przygotowania próbek FINA. Przygotuj podkładkę do blotingu, wycinając kwadrat o wymiarach 35 na 35 mm z bawełnianej podkładki 100% o grubości 2,6 mm. Przygotuj plastikową folię parafinową z papierową taśmą podkładową.Wytnij fragment folii parafinowej o wymiarach 25 x 50 mm, a następnie za pomocą młotka wykonaj w centrum taśmy otwór o średnicy 7,14 mm. Przygotuj związaną szklaną membranę do separacji krwi lub dysk wychwytujący, wycinając za pomocą młotka okrąg o średnicy 8,35 mm. Aby złożyć moduł do przygotowania próbek FINA, użyj pęsety, aby umieścić dysk wychwytujący w centrum podkładki do blotowania.Zdejmij warstwę ochronną z parafinowej taśmy filmowej i umieść ją na dysku przechwytującym w taki sposób, aby cała taśma parafinowa pozostawiła odsłonięte centrum dysku. Aby zapewnić maksymalny kontakt między dyskiem a podkładką do blotowania, lekko rozciągnij taśmę parafinową, tak aby zakryła podkładkę, a następnie mocno dociśnij taśmę, aby przykleić ją do podkładki wzdłuż wszystkich krawędzi dysku. Wymagany jest dysk z taśmy o średnicy 5,1 mm, aby przymocować membranę przechwytującą do ścianki probówki do qPCR, co zapobiegnie blokowaniu detekcji fluorescencji przez membranę w urządzeniu do PCR w czasie rzeczywistym.Przygotuj dysk z taśmy, wybijając młotkiem okrąg z diagnostycznej taśmy poliestrowej z podwójną powłoką z arkusza taśmy. Za pomocą pęsety usuń jedną stronę podkładki lepkawej taśmy. Umieść taśmę w probówce PCR o pojemności 200 µL, przyklejając ją do jednej ścianki w kierunku dna probówki.Usuń drugą folię zabezpieczającą naklejkę. Probówka jest teraz gotowa do przyjęcia przygotowanego dysku. W tym filmie zostanie zademonstrowane wykrywanie prowiralnego DNA z krwi pełnej wzbogaconej o 8e5 komórek LAV.Odmrozić wcześniej zamrożone pellety 8e5 komórek LAV na lodzie. Przygotować rozcieńczenia seryjne komórek w medium do mrożenia o stężeniach od 1 do 400 komórek na mikrolitr. Pipetować 10 mikrolitrów komórek z każdego rozcieńczenia do probówki do mikrocentryfugi.Do każdej probówki należy dodać 100 µL świeżej próbki krwi pełnej traktowanej eDTA, ujemnej pod kątem HIV-1, w celu utworzenia krzywej wzorcowej. Wymieszać, delikatnie stukując dnem probówki pięć razy. Aby rozpocząć procedurę ekstrakcji DNA, należy zlizować komórki krwi, dodając triton X-100 do stężenia końcowego 1%.Wymieszać, delikatnie stukając pięć razy w dno probówki. Krew powinna przybrać półprzezroczysty czerwony kolor. Przenieść całą próbkę krwi pipetą na dysk wychwytujący.Wodoodporna uszczelka między taśmą parafinową a membraną przechwytującą zapewnia przepływ krwi przez membranę. Z kolei dobry kontakt między membraną kontaktową a zestawem podkładek do blottingu zapewnia szybkie wsysanie próbki. Pozostaw próbkę do całkowitego przesiąknięcia przez filtr.Lizat krwi wsiąknął w dysk wychwytujący, a dysk stał się matowy. Do dysku wychwytującego dodaje się kroplami od 600 do 1 000 µL 10 mmol wodorotlenku sodu. Filtr zmieni kolor z czerwonego na biały, co wskazuje na usunięcie hemoglobiny.Następnie oddziel krążek od podkładki do blotowania i przyłóż go do taśmy w przygotowanej probówce do PCR. Po umieszczeniu filtra w probówce do PCR należy bezzwłocznie przeanalizować próbkę. Przygotuj master mix do qPCR zgodnie z opisem w tekście protokołu i upewnij się, że filtr jest całkowicie pokryty master mixem i pozostaje przymocowany do ścianki probówki przez cały czas trwania reakcji.Przeprowadzić amplifikację przy użyciu urządzenia do PCR w czasie rzeczywistym zgodnie z opisem w tekście protokołu. Alternatywnie, jeśli qPCR nie może zostać przeprowadzony natychmiast, wysuszyć filtr przez noc w pudełku zawierającym osuszacz z siarczanu wapnia. Następnego dnia zamknąć probówkę PCR zakrętką, umieścić ją w foliowej torebce z osuszaczem krzemionkowym i przechowywać w temperaturze pokojowej do momentu analizy.Metoda ta umożliwia wydajną amplifikację prowirusa HIV-1 z 8e5 komórek LAV przy różnych liczbach kopii. Linie ciągłe przedstawiają wykresy amplifikacji uzyskane z czterech powtórzeń krwi pełnej ujemnej pod kątem HIV-1, wzbogaconej o 4 000, 400, 40 i 10 8e5 komórek LAV, z 500 kopiami kontroli wewnętrznej na reakcję. Linia przerywana oznacza próg detekcji.Kolejny wykres przedstawia krzywe wzorcowe wartości cyklu kwantyfikacji obliczone z wykresu amplifikacji w funkcji logarytmu liczby kopii 8e5 komórek LAV na 100 µL krwi pełnej. Obliczona wydajność PCR wyniosła 103%. Powtórzenia krzywej wzorcowej dla prowiralnego DNA HIV wykazują również bardzo powtarzalną amplifikację.Dodatkowo obecność kontroli wewnętrznej w postaci 500 kopii reduktazy hydroksypirogronianowej wykazuje, że nie występuje inhibicja PCR wynikająca z ekstrakcji krwi tą metodą, niezależnie od liczby kopii prowirusa HIV-1. Linie ciągłe reprezentują wykresy amplifikacji, a linia przerywana reprezentuje próg detekcji. Po zastosowaniu tej procedury cele PCR mogą być amplifikowane z różnych typów próbek w celu wykrycia interesującego badacza genu.Na przykład wymazy z policzków do badań farmakogenetycznych lub krew do szybkiego genotypowania modeli zwierzęcych. Należy pamiętać, że praca z patogenami przenoszonymi przez krew może być niezwykle niebezpieczna i podczas wykonywania tej procedury zawsze należy przestrzegać zasad uniwersalnych środków ostrożności.

filtration-isolation-nucleic-acids-simple-rapid-dna-extraction

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Opisano narzędzie oraz odczynniki do sekwencyjnej izolacji kwasów nukleinowych, a następnie białek z próbki, bez konieczności użycia energii elektrycznej. Narzędzie składa się z sorbentu umieszczonego w pipecie transferowej, natomiast odczynniki do izolacji opierają się na zasadach ekstrakcji do fazy stałej. Izolowane makrocząsteczki mogą być analizowane za pomocą testów immunologicznych oraz PCR.

Sekwencyjna izolacja kwasów nukleinowych i białek bez użycia energii elektrycznej

Przedstawiamy metodologię przetwarzania krwi pełnej w celu uzyskania różnych składników do dalszej analizy. Zoptymalizowaliśmy uproszczony protokół, który umożliwia szybkie, wysokoprzepustowe jednoczesne przetwarzanie próbek krwi pełnej w warunkach nieklinicznych.

Szybkie frakcjonowanie i izolacja składników krwi pełnej w próbkach uzyskanych w warunkach środowiskowych

Tutaj prezentujemy protokół szybkiej ekstrakcji kwasu nukleinowego wirusa z inaktywowanej wirusem krwi pełnej. Ekstrakcja odbywa się bezpośrednio w probówkach do pobierania krwi i nie wymaga żadnego sprzętu ani energii elektrycznej. Metoda nie jest zależna od zaplecza laboratoryjnego i może być stosowana wszędzie (np. w szpitalach polowych).

Szybka, bezpieczna i prosta ręczna ekstrakcja kwasów nukleinowych przy łóżku pacjenta w celu wykrycia wirusa w próbkach krwi pełnej

Izolacja pojedynczych jąder opiera się na dysocjacji i przenikaniu błony komórkowej za pomocą detergentów, etapach, które wymagają optymalizacji i są podatne na wprowadzanie artefaktów technicznych. Demonstrujemy bezdetergentowy i bezenzymatyczny protokół szybkiej izolacji nienaruszonych jąder bezpośrednio z całej tkanki, uzyskując jądra odpowiednie do sekwencjonowania RNA pojedynczego jądra (snRNA-Seq) lub ATAC-seq.

Izolacja jąder z całej tkanki metodą bezdetergentową i enzymatyczną

Badanie opisuje prosty, szybki i częściowo zautomatyzowany protokół izolowania wysokiej jakości jąder z zamrożonych tkanek ssaków do sekwencjonowania RNA pojedynczych jąder.

Prosty, szybki i częściowo zautomatyzowany protokół izolacji pojedynczych jąder z zamrożonych tkanek ssaków w celu sekwencjonowania pojedynczego jądra

Tutaj prezentujemy prostą technikę oceny środowiskowej oporności na środki przeciwdrobnoustrojowe (AMR) poprzez zwiększenie proporcji niskocząsteczkowego DNA zewnątrzkomórkowego. Wcześniejsze leczenie 20%-30% PEG i 1,2 M NaCl pozwala na wykrycie zarówno genomowych, jak i przenoszonych horyzontalnie genów AMR. Protokół nadaje się do procesu bez zestawów z dodatkową optymalizacją.

Ulepszona ekstrakcja DNA o niskiej masie cząsteczkowej ze ścieków w celu kompleksowej oceny oporności na środki przeciwdrobnoustrojowe

Ten protokół opisuje opłacalną metodę przyspieszenia ekstrakcji DNA plazmidowego. Wykorzystując niestandardowe, drukowane 3D stojaki kompatybilne ze standardowymi wirującymi stojakami do płytek, naukowcy mogą przetwarzać jednocześnie do 48 kolumn wirujących z kołkami lub do 116 kolumn wirujących bez kołków, co znacznie skraca czas obsługi w porównaniu z ręcznymi metodami mikrowirówkowych.

Ekstrakcja DNA metodą kolumnową o średniej przepustowości z wykorzystaniem racków 24-dołkowych

Zastosowanie systemów mikroobjętościowych NanoDrop jako praktycznych i wydajnych alternatyw dla tradycyjnej metodologii oznaczania ilości kwasów nukleinowych opisano poprzez prezentację dwóch protokołów mikroobjętościowego oznaczania ilości kwasów nukleinowych.

Mikroobjętościowe oznaczanie ilościowe kwasów nukleinowych za pomocą NanoDrop

Niniejszy komunikat przedstawia dane dotyczące dokładności i powtarzalności spektrofotometru UV-VIS BioSpec-nano w oznaczaniu ilościowym dsDNA oraz białek. Nawet przy ultra małych objętościach (1 do 2 µL) powtarzalność jest doskonała, natomiast zautomatyzowana funkcja przecierania zwiększa wydajność i minimalizuje zjawisko przeniesienia próbki, co pozwala na uzyskanie bardziej precyzyjnych wyników.

Oznaczanie stężenia kwasów nukleinowych i białek przy użyciu mikroobjętościowego spektrofotometru Bio-spec Nano

W niniejszym filmie zaprezentowano protokół ekstrakcji DNA z materiału utrwalonego w formalinie i zatopionego w parafinie. Jest to procedura wielodniowa, w ramach której skrawki tkanek są deparafinowane ksylenem, rehydratowane etanolem i traktowane proteinazą K w celu oczyszczenia i wyizolowania DNA do późniejszej analizy genowo-specyficznej lub całego genomu.

Ekstrakcja DNA z materiału zatopionego w parafinie do analiz genetycznych i epigenetycznych

Poznaj metodę FINA do szybkiej ekstrakcji DNA z krwi całej dla diagnostyki HIV za pomocą PCR ilościowego. Ta technika papierowa nie wymaga sprzętu laboratoryjnego i trwa mniej niż dwie minuty.

Filtracja izolacji kwasów nukleinowych: prosta i szybka metoda ekstrakcji DNA

Przeglądaj więcej filmów