Filtracja izolacji kwasów nukleinowych: prosta i szybka metoda ekstrakcji DNA

Ogólnym celem tej metody FINA, która oznacza filtracyjną izolację kwasów nukleinowych, jest szybkie i proste wyizolowanie genomowego DNA do amplifikacji PCR ze złożonych próbek bez użycia oprzyrządowania laboratoryjnego, takiego jak wirówka. Ta szybka metoda ekstrakcji DNA wirusa HIV oparta na papierze została opracowana w celu włączenia do ilościowego urządzenia diagnostycznego PCR. Główną zaletą tej techniki jest to, że moduły do przygotowywania próbek i probówki do PCR można przygotować z wyprzedzeniem, dzięki czemu ekstrakcja DNA trwa mniej niż dwie minuty.

Po raz pierwszy opracowaliśmy tę metodę, aby włączyć ją do próbki, aby odpowiedzieć na wczesny test diagnostyczny dla niemowląt na obecność HIV-1 z krwi z pięty. Ogólnie rzecz biorąc, osoby, które są nowe w tej metodzie, mogą mieć trudności, ponieważ usunięcie podkładu z taśmy dwustronnej, która utrzymuje błonę wychwytywania komórek z boku probówki PCR, wymaga praktyki. Procedurę zademonstruje Jen Reed, starszy technik z mojego laboratorium.

Procedurę tę należy rozpocząć od przygotowania materiałów potrzebnych do złożenia modułu przygotowania próbki FINA. Przygotuj podkładkę do bibuły, wycinając kwadrat o wymiarach 35 na 35 milimetrów ze 100% wacika o grubości 2,6 milimetra. Przygotuj plastikową folię parafinową za pomocą papierowej taśmy nośnej.

Wytnij kawałek folii parafinowej o wymiarach 25 na 50 mm, a następnie za pomocą młotka wybij otwór o średnicy 7,14 mm na środku taśmy. Przygotuj związaną szklaną membranę separatora krwi lub dysk wychwytujący, używając młotka, aby przebić okrąg o średnicy 8,35 mm. Aby zmontować moduł przygotowania próbki FINA, użyj kleszczyków, aby umieścić krążek przechwytujący na środku podkładki do bibuły.

Usuń podkład taśmy z folii parafinowej i umieść ją na dysku przechwytującym tak, aby cała taśma parafinowa pozostawiła odsłonięty środek krążka przechwytującego. Zapewnij maksymalny kontakt między krążkiem a podkładką do bibuły, lekko rozciągając taśmę parafinową, aby zakryć podkładkę do bibuły i mocno dociskając taśmę parafinową, aby przykleić ją do podkładki bibułkowej wokół wszystkich krawędzi dysku. Dysk z taśmą o średnicy 5,1 mm jest wymagany do zakotwiczenia membrany wychwytującej z boku probówki qPCR, aby zapobiec blokowaniu przez membranę wykrywania fluorescencji przez przyrząd do PCR w czasie rzeczywistym.

Przygotuj ten krążek z taśmą, używając młotka, aby przebić okrąg podwójnie powlekanej poliestrowej taśmy diagnostycznej z arkusza taśmy. Za pomocą kleszczy usuń jedną stronę wkładki do naklejek taśmy. Umieść taśmę w probówce PCR o pojemności 200 mikrolitrów, przyklejając ją z jednej strony i w kierunku dna probówki.

Usuń drugi wkładek do naklejek. Tuba jest teraz gotowa do przyjęcia przygotowanego dysku. Wykrywanie prowirusowego DNA z krwi pełnej wzbogaconej komórkami LAV 8e5 zostanie zademonstrowane w tym filmie.

Rozmrozić wcześniej zamrożone granulki ogniw 8e5 LAV na lodzie. Przygotować seryjne rozcieńczenie komórek w pożywce zamrażającej o stężeniach w zakresie od 1 do 400 komórek na mikrolitr. Odpipetować 10 mikrolitrów komórek z każdego z rozcieńczeń do mikroprobówki wirówkowej.

Dodaj 100 mikrolitrów świeżej próbki krwi pełnej poddanej działaniu eDTA z ujemnym wynikiem HIV-1 do każdej probówki, aby utworzyć standardową krzywą. Wymieszaj, delikatnie przesuwając spód tubki pięć razy. Aby rozpocząć procedurę ekstrakcji DNA, należy poddać lizie komórki krwi, dodając tryton X-100 do końcowego stężenia jednego procenta.

Wymieszaj, delikatnie przesuwając spód tubki pięć razy. Krew powinna zmienić kolor na półprzezroczysty czerwony. Pobrać pipetą całą próbkę krwi na krążek przechwytujący.

Wodoszczelne uszczelnienie między taśmą parafinową a membraną wychwytującą zapewnia przepływ krwi przez membranę. Dobry kontakt między membraną kontaktową a zespołem podkładki bibułkowej zapewnia szybkie odprowadzanie próbki. Pozostawić próbkę do przesiąknięcia przez filtr.

Lizat krwi wsiąkł w krążek przechwytujący, a dysk wydaje się matowy. Dodaj kroplami 600 do 1 000 mikrolitrów wodorotlenku sodu o stężeniu 10 mmol na krążek przechwytujący. Filtr zmieni kolor z czerwonego na biały, wskazując klirens hemoglobiny.

Następnie należy oddzielić krążek od podkładki bibułkowej i przyłożyć krążek do taśmy w przygotowanej probówce do PCR. Po umieszczeniu filtra w probówce do PCR należy od razu przeanalizować próbkę. Przygotować główną mieszaninę qPCR zgodnie z opisem w tekście protokołu i upewnić się, że filtr jest całkowicie pokryty mieszanką wzorcową i pozostaje przymocowany do boku probówki przez cały czas trwania reakcji.

Wykonaj amplifikację za pomocą urządzenia do PCR w czasie rzeczywistym, zgodnie z opisem w tekście protokołu. Alternatywnie, jeśli qPCR nie można wykonać, natychmiast wysuszyć filtr przez noc w pudełku zawierającym środek osuszający z siarczanem wapnia. Następnego dnia zakryj i umieść probówkę PCR w foliowanej torebce ze środkiem osuszającym krzemionkę i przechowuj w temperaturze pokojowej do momentu, gdy będzie gotowa do analizy.

Metoda ta pozwala na efektywną amplifikację prowirusa HIV-1 z komórek 8e5 LAV przy różnej liczbie kopii. Linie stałe to wykresy amplifikacyjne uzyskane z czterech powtórzeń krwi pełnej z ujemnym wynikiem testu na obecność wirusa HIV-1 wzbogaconej 4 000, 400, 40 i 10 komórkami LAV 8e5 z 500 kopiami na reakcję kontroli wewnętrznej. Linia przerywana wskazuje próg.

Następny wykres przedstawia standardowe krzywe wartości cyklu ilościowego obliczone na podstawie wykresu amplifikacji vs. log liczby kopii komórek 8e5 LAV na 100 mikrolitrów krwi pełnej. Obliczona skuteczność PCR wyniosła 103%Powtórzenia krzywej standardowej DNA prowirusa HIV mają również wysoce powtarzalną amplifikację.

Dodatkowo, obecność wewnętrznej kontroli 500 kopii reduktazy hydroksylopigronianowej pokazuje, że nie ma zahamowania PCR wynikającego z ekstrakcji krwi tą metodą, niezależnie od liczby obecnych kopii prowirusa HIV-1. Linie ciągłe reprezentują wykresy wzmocnienia, a linia przerywana reprezentuje próg. Zgodnie z tą procedurą cele PCR mogą być amplifikowane z różnych typów próbek w celu wykrycia interesującego Cię genu.

Na przykład wymazy z policzków do badań farmakogenetycznych lub krwi do szybkiego genotypowania modeli zwierzęcych. Nie zapominaj, że praca z patogenami przenoszonymi przez krew może być niezwykle niebezpieczna i zawsze należy zachować uniwersalne środki ostrożności podczas wykonywania tej procedury.