Filtracja izolacji kwasów nukleinowych: prosta i szybka metoda ekstrakcji DNA

Ogólnym celem metody FINA (ang. filtration isolation of nucleic acids – filtracyjna izolacja kwasów nukleinowych) jest szybka i prosta izolacja genomowego DNA do amplifikacji PCR z kompleksowych próbek, bez użycia aparatury laboratoryjnej, takiej jak wirówka. Ta szybka metoda ekstrakcji DNA oparta na papierze, przeznaczona do wyodrębniania prowiralnego DNA HIV, została opracowana z myślą o wdrożeniu do diagnostycznego urządzenia do ilościowego PCR. Główną zaletą tej techniki jest możliwość wcześniejszego przygotowania modułów do obróbki próbek oraz probówek do PCR, dzięki czemu ekstrakcja DNA trwa mniej niż dwie minuty.

Opracowaliśmy tę metodę początkowo w celu włączenia jej do analizy próbek w ramach wczesnej diagnostyki HIV-1 u niemowląt z krwi pobranej z pięty. Osoby rozpoczynające pracę z tą metodą mogą napotkać trudności, ponieważ usunięcie warstwy zabezpieczającej z dwustronnej taśmy, która mocuje membranę do wychwytywania komórek do ścianki probówki PCR, wymaga wprawy. Procedurę zaprezentuje Jen Reed, starszy technik z mojego laboratorium.

Rozpocznij procedurę od przygotowania materiałów niezbędnych do montażu modułu przygotowania próbek FINA. Przygotuj podkładkę do blotingu, wycinając kwadrat o wymiarach 35 na 35 mm z bawełnianej podkładki 100% o grubości 2,6 mm. Przygotuj plastikową folię parafinową z papierową taśmą podkładową.

Wytnij fragment folii parafinowej o wymiarach 25 x 50 mm, a następnie za pomocą młotka wykonaj w centrum taśmy otwór o średnicy 7,14 mm. Przygotuj związaną szklaną membranę do separacji krwi lub dysk wychwytujący, wycinając za pomocą młotka okrąg o średnicy 8,35 mm. Aby złożyć moduł do przygotowania próbek FINA, użyj pęsety, aby umieścić dysk wychwytujący w centrum podkładki do blotowania.

Zdejmij warstwę ochronną z parafinowej taśmy filmowej i umieść ją na dysku przechwytującym w taki sposób, aby cała taśma parafinowa pozostawiła odsłonięte centrum dysku. Aby zapewnić maksymalny kontakt między dyskiem a podkładką do blotowania, lekko rozciągnij taśmę parafinową, tak aby zakryła podkładkę, a następnie mocno dociśnij taśmę, aby przykleić ją do podkładki wzdłuż wszystkich krawędzi dysku. Wymagany jest dysk z taśmy o średnicy 5,1 mm, aby przymocować membranę przechwytującą do ścianki probówki do qPCR, co zapobiegnie blokowaniu detekcji fluorescencji przez membranę w urządzeniu do PCR w czasie rzeczywistym.

Przygotuj dysk z taśmy, wybijając młotkiem okrąg z diagnostycznej taśmy poliestrowej z podwójną powłoką z arkusza taśmy. Za pomocą pęsety usuń jedną stronę podkładki lepkawej taśmy. Umieść taśmę w probówce PCR o pojemności 200 µL, przyklejając ją do jednej ścianki w kierunku dna probówki.

Usuń drugą folię zabezpieczającą naklejkę. Probówka jest teraz gotowa do przyjęcia przygotowanego dysku. W tym filmie zostanie zademonstrowane wykrywanie prowiralnego DNA z krwi pełnej wzbogaconej o 8e5 komórek LAV.

Odmrozić wcześniej zamrożone pellety 8e5 komórek LAV na lodzie. Przygotować rozcieńczenia seryjne komórek w medium do mrożenia o stężeniach od 1 do 400 komórek na mikrolitr. Pipetować 10 mikrolitrów komórek z każdego rozcieńczenia do probówki do mikrocentryfugi.

Do każdej probówki należy dodać 100 µL świeżej próbki krwi pełnej traktowanej eDTA, ujemnej pod kątem HIV-1, w celu utworzenia krzywej wzorcowej. Wymieszać, delikatnie stukując dnem probówki pięć razy. Aby rozpocząć procedurę ekstrakcji DNA, należy zlizować komórki krwi, dodając triton X-100 do stężenia końcowego 1%.

Wymieszać, delikatnie stukając pięć razy w dno probówki. Krew powinna przybrać półprzezroczysty czerwony kolor. Przenieść całą próbkę krwi pipetą na dysk wychwytujący.

Wodoodporna uszczelka między taśmą parafinową a membraną przechwytującą zapewnia przepływ krwi przez membranę. Z kolei dobry kontakt między membraną kontaktową a zestawem podkładek do blottingu zapewnia szybkie wsysanie próbki. Pozostaw próbkę do całkowitego przesiąknięcia przez filtr.

Lizat krwi wsiąknął w dysk wychwytujący, a dysk stał się matowy. Do dysku wychwytującego dodaje się kroplami od 600 do 1 000 µL 10 mmol wodorotlenku sodu. Filtr zmieni kolor z czerwonego na biały, co wskazuje na usunięcie hemoglobiny.

Następnie oddziel krążek od podkładki do blotowania i przyłóż go do taśmy w przygotowanej probówce do PCR. Po umieszczeniu filtra w probówce do PCR należy bezzwłocznie przeanalizować próbkę. Przygotuj master mix do qPCR zgodnie z opisem w tekście protokołu i upewnij się, że filtr jest całkowicie pokryty master mixem i pozostaje przymocowany do ścianki probówki przez cały czas trwania reakcji.

Przeprowadzić amplifikację przy użyciu urządzenia do PCR w czasie rzeczywistym zgodnie z opisem w tekście protokołu. Alternatywnie, jeśli qPCR nie może zostać przeprowadzony natychmiast, wysuszyć filtr przez noc w pudełku zawierającym osuszacz z siarczanu wapnia. Następnego dnia zamknąć probówkę PCR zakrętką, umieścić ją w foliowej torebce z osuszaczem krzemionkowym i przechowywać w temperaturze pokojowej do momentu analizy.

Metoda ta umożliwia wydajną amplifikację prowirusa HIV-1 z 8e5 komórek LAV przy różnych liczbach kopii. Linie ciągłe przedstawiają wykresy amplifikacji uzyskane z czterech powtórzeń krwi pełnej ujemnej pod kątem HIV-1, wzbogaconej o 4 000, 400, 40 i 10 8e5 komórek LAV, z 500 kopiami kontroli wewnętrznej na reakcję. Linia przerywana oznacza próg detekcji.

Kolejny wykres przedstawia krzywe wzorcowe wartości cyklu kwantyfikacji obliczone z wykresu amplifikacji w funkcji logarytmu liczby kopii 8e5 komórek LAV na 100 µL krwi pełnej. Obliczona wydajność PCR wyniosła 103%. Powtórzenia krzywej wzorcowej dla prowiralnego DNA HIV wykazują również bardzo powtarzalną amplifikację.

Dodatkowo obecność kontroli wewnętrznej w postaci 500 kopii reduktazy hydroksypirogronianowej wykazuje, że nie występuje inhibicja PCR wynikająca z ekstrakcji krwi tą metodą, niezależnie od liczby kopii prowirusa HIV-1. Linie ciągłe reprezentują wykresy amplifikacji, a linia przerywana reprezentuje próg detekcji. Po zastosowaniu tej procedury cele PCR mogą być amplifikowane z różnych typów próbek w celu wykrycia interesującego badacza genu.

Na przykład wymazy z policzków do badań farmakogenetycznych lub krew do szybkiego genotypowania modeli zwierzęcych. Należy pamiętać, że praca z patogenami przenoszonymi przez krew może być niezwykle niebezpieczna i podczas wykonywania tej procedury zawsze należy przestrzegać zasad uniwersalnych środków ostrożności.