Połączone obrazowanie fluorescencyjne w bliskiej podczerwieni i tomografia mikrokomputerowa do bezpośredniej wizualizacji choroby zakrzepowo-zatorowej mózgu

Ogólnym celem tej techniki bezpośredniego obrazowania zakrzepów jest ilościowa wizualizacja znakowanych fluorescencyjnie zakrzepowo-zatorów mózgowych in vivo i ex vivo, z wykorzystaniem nanocząsteczek złota, tomografii komputerowej oraz obrazowania fluorescencyjnego w bliskiej podczerwieni. Metoda ta może pomóc w udzieleniu odpowiedzi na kluczowe pytania z zakresu hemostazy i zakrzepicy, takie jak zależna od czasu lub dawki, poważna odpowiedź ortopedyczna zakrzepowo-zatorów mózgowych na aktywator plazminogenu tkankowego lub nowe badane środki trombolityczne. Główną zaletą tej techniki jest to, że po dożylnym wstrzyknięciu nanocząsteczek złota mikro-CT o wysokiej rozdzielczości umożliwia uchwycenie dynamicznej ewolucji zakrzepowo-zatorów mózgowych poprzez ilościową wizualizację ich lokalizacji i obciążenia in vivo, co następnie jest potwierdzane ex vivo za pomocą obrazowania fluorescencyjnego zakrzepów w bliskiej podczerwieni.

Procedurę zademonstruje Jeong-Yeon Kim, pracownik postdoktorski z mojego laboratorium. Po pobraniu od 300 do 1 000 µL krwi tętniczej za pomocą punkcji serca, należy dodać 70 µL próbki do 30 µL odpowiedniego aktywowanego czynnika krzepnięcia oraz fluorescencyjnej sondy czułej na aktywność sieciowania fibryny pośredniczoną przez czynnik 13, a następnie pobrać powstałą mieszaninę do strzykawki o pojemności 3 mL wyposażonej w igłę o rozmiarze 23 G. Następnie należy wstrzyknąć oznakowaną krew do rurki polietylenowej o długości 20 cm i pozostawić krew do skrzepnięcia w temperaturze pokojowej.

Po dwóch godzinach przenieś probówkę do temperatury 4 °C na 22 godziny, a następnie potnij ją na odcinki o długości 1,5 cm. Używając strzykawki 3 ml wypełnionej PBS, wypłucz zakrzep z każdego odcinka rurki do poszczególnych dołków płytki 6-dołkowej zawierającej PBS. Przemyj zakrzepy trzykrotnie PBS, a następnie włóż strzykawkę 1 ml wypełnioną solą fizjologiczną i wyposażoną w igłę 30 G do jednego końca 15 cm rurki PE10 i ostrożnie wciągnij pojedynczy przemyty zakrzep do przeciwległego końca rurki.

Następnie połącz rurkę PE10 z wprowadzonym zakrzepem z rurką PE50 o długości trzech centymetrów i stożkowym zakończeniu o średnicy 200 mikronów. Po potwierdzeniu znieczulenia poprzez brak reakcji na uciśnięcie palca u stopy, zdezynfekuj pole operacyjne Betadyną i 70% alkoholem, a następnie za pomocą skalpela wykonaj jedno centymetrowe pionowe nacięcie między lewym uchem a okiem. Przyklej dystalny koniec światłowodu laserowego flowmetru Dopplera do odsłoniętej powierzchni lewej kości skroniowej, jeden milimetr na lewo i cztery milimetry poniżej bregma, i rozpocznij monitorowanie dopplerowskie.

Następnie wykonaj trzycentymetrowe pionowe nacięcie w linii środkowej przez tkanki miękkie okołonaczyniowe, aby odsłonić obszar lewej zatoce szyjnej. Używając sterylnej czarnej nici jedwabnej 6-0, podwiąż lewą tętnicę szyjną wspólną w odcinku proksymalnym, a następnie podwiąż lewą tętnicę szyjną wewnętrzną oraz lewą tętnicę skrzydłowopodniebienną za pomocą sterylnych czarnych nici jedwabnych 7-0. Używając monopolarnej kauteryzacji elektrycznej, wypal lewą tętnicę tarczową górną, a następnie za pomocą sterylnych czarnych nici jedwabnych 7-0 wykonaj luźne podwiązanie lewej tętnicy szyjnej zewnętrznej w odcinku proksymalnym oraz ciasne podwiązanie dystalnego końca naczynia.

Za pomocą mikronożyczek wykonaj otwór o wielkości od 0,2 do 0,25 mikrona pomiędzy miejscami podwiązania tętnicy szyjnej zewnętrznej, a następnie wprowadź do otworu cewnik zawierający skrzep, poluzowując przy tym proksymalne podwiązanie tętnicy szyjnej zewnętrznej. Przesuń cewnik do tętnicy szyjnej wspólnej, aby go unieruchomić, i ponownie zaciśnij proksymalne podwiązanie tętnicy szyjnej zewnętrznej. Przetnij dystalny koniec tętnicy szyjnej zewnętrznej za pomocą kauteryzacji i obróć wolny koniec proksymalny tętnicy szyjnej zewnętrznej zgodnie z ruchem wskazówek zegara, aby wyrównać naczynie z tętnicą szyjną wewnętrzną, wycofując jednocześnie cewnik.

Następnie poluzować podwiązkę tętnicy szyjnej wewnętrznej i niezwłocznie przesunąć cewnik o około dziewięć milimetrów w kierunku rozgałęzienia tętnicy mózgowej środkowej i przedniej. Teraz ponownie zaciągnąć szew tętnicy szyjnej wewnętrznej wokół cewnika i delikatnie nacisnąć strzykawkę, aby wstrzyknąć zakrzep w obszar rozgałęzienia. Jeśli w badaniu Doppler zaobserwowano przepływ krwi większy lub równy 30% poniżej poziomu bazowego, usunąć cewnik i niezwłocznie podwiązać proksymalny koniec tętnicy szyjnej zewnętrznej.

Aby zobrazować zakrzep za pomocą mikrokomputerowej tomografii w odpowiednim punkcie czasowym eksperymentu, rozcieńczyć złote nanocząsteczki ukierunkowane na fibrynę do stężenia 10 mg/mL w 10 mM PBS i poddać środek obrazujący zakrzepy działaniu ultradźwięków przez 30 minut, aby zapewnić homogeniczną zawiesinę nanocząsteczek. Następnie wstrzyknąć 300 µL nanocząsteczek ukierunkowanych na fibrynę do żyły prącia zwierzęcia doświadczalnego. Przenieść zwierzę na stół mikro-CT i za pomocą sznurka przymocowanego do szpilki delikatnie pociągnąć za górne przednie zęby, aby wyprostować szyję.

Obrazowanie należy rozpocząć pięć minut po wstrzyknięciu nanocząsteczek złota. Aby zwizualizować zakrzep za pomocą obrazowania bliskiej podczerwieni ex vivo, należy umieścić wyciętą tkankę mózgu w urządzeniu do obrazowania podstawą do góry. Należy uzyskać obrazy fluorescencyjnie znakowanych zatorów zakrzepowych w tętnicach koła Willisa.

Następnie ustaw tkankę wierzchołkiem do góry i wykonaj obrazowanie zakrzepowo-zatorowych zmian w korze. Nawilż tkankę kilkoma kroplami soli fizjologicznej, a następnie, korzystając z urządzenia do cięcia mózgu zgodnie z instrukcją producenta, szybko wykonaj sześć coronalnych przekrojów mózgu o grubości 2 mm. Utrzymując nawilżenie przekrojów solą fizjologiczną, wykonaj dodatkowe obrazy w bliskiej podczerwieni zarówno przedniej, jak i tylnej powierzchni sekcji.

Aby określić powierzchnię zakrzepu po obrazowaniu mikro-CT, otwórz pliki z sekwencją obrazów, a następnie wybierz Image, potem Type, a następnie 8-bit, aby przekonwertować obrazy na 8-bitową skalę szarości. Gdy jeden piksel plików obrazu CT odpowiada 0,053 milimetrom, użyj Analyze Set Scale, aby wprowadzić kolejno wartości jeden, 0,053 i milimetry dla Distance in pixels, Known distance oraz Unit of length. Następnie w menu Edit wybierz Selection, a potem Specify, aby wyznaczyć obszar zainteresowania (ROI) na fragmencie miąższu mózgu pozbawionym zakrzepu lub hiperdensyjnego obszaru związanego z kością.

Ponieważ określony obszar zainteresowania odnosi się do każdego przekroju stosu, należy potwierdzić, że obszar ten nie pokrywa się z regionem hiperdensyjnym na żadnym z przekrojów. Następnie w menu Plugin należy wybrać Region of Interest, a z niego Background Subtraction i wprowadzić wartość dwa dla parametru Number of standard deviations from the mean. Należy zlokalizować hiperdensyjne zmiany związane z zakrzepowo-zatorowością i powiększyć obszar zmiany.

Następnie wybierz Image, potem Adjust, a następnie Threshold i wprowadź dolny poziom progu (Lower Threshold Level) wynoszący 22 oraz górny poziom progu (Upper Threshold Level) wynoszący 255. Wybierz opcję Over/Under, aby wyświetlić piksele poniżej dolnej wartości progu w kolorze niebieskim, piksele spełniające kryteria progu w skali szarości, a piksele powyżej górnej wartości progu w kolorze zielonym. Następnie użyj narzędzia Freehand, aby obrysować obszary zainteresowania otaczające hiperdensyjne zmiany związane z zakrzepowo-zatorowością, unikając obszarów kostnych.

Wybierz Analyze, Set Measurements, aby zaznaczyć Area, Mean gray value oraz Integrated density area times mean. Zaznacz następujące opcje: Limit to threshold oraz Display label. Użyj Analyze Measure, aby uzyskać dane ilościowe, a następnie zapisz wyniki.

Te bazowe obrazy mikro-tomografii komputerowej (micro-CT) uzyskano in vivo pięć minut po wstrzyknięciu celowanych w fibrynę nanocząsteczek złota, godzinę po wywołaniu udaru niedokrwiennego u myszy. Zakrzep mózgowy jest wyraźnie widoczny w obszarze rozwidlenia tętnicy środkowej i przedniej mózgu w dystalnej części tętnicy szyjnej wewnętrznej. Obrazy micro-CT z obserwacji kontrolnej nie wykazują zmian w zakrzepie w obrębie koła Willisa u zwierząt traktowanych solą fizjologiczną, natomiast u zwierząt traktowanych aktywatorem plazminogenu tkankowego widoczne jest stopniowe rozpuszczanie się zakrzepu w kole Willisa w czasie, co wskazują niebieskie groty strzałek.

Istnieje silna korelacja między gęstością w badaniu CT in vivo a obrazowaniem w bliskiej podczerwieni ex vivo w przypadku resztkowych zatorów zakrzepowych po 24 godzinach. Na przykład, na tych obrazach hiperdensyjne obszary w mikro-CT, uwidocznione za pomocą cząsteczek złota celujących w fibrynę, bezpośrednio odpowiadają obszarom sygnału w bliskiej podczerwieni zidentyfikowanym przez fluorescencyjną sondę wrażliwą na aktywność sieciowania fibryny pośredniczoną przez czynnik krzepnięcia 13A, która wiąże się z zakrzepem podczas procesu dojrzewania wcześniej uformowanego skrzepu. Ponadto, jak pokazano na tych obrazach, barwienie TTC może być wykorzystane do oceny efektów trombolizy w niedokrwiennym uszkodzeniu mózgu u zwierząt kontrolnych otrzymujących sól fizjologiczną w porównaniu do zwierząt leczonych aktywatorem plazminogenu tkankowego.

Po opanowaniu, ta technika obrazowania mikro-CT in vivo oraz obrazowania zakrzepów fluorescencją w bliskiej podczerwieni ex vivo może zostać przeprowadzona w około godzinę, jeśli jest wykonywana prawidłowo i gdy dostępne są sondy obrazujące. Podczas przeprowadzania tej procedury należy pamiętać o zastosowaniu nieagregujących się i ukierunkowanych na fibrynę nanocząsteczek złota do bezpośredniego obrazowania zakrzepów mózgowych w oparciu o mikro-CT. Po wykonaniu tej procedury można zastosować inne metody, takie jak mikroskopia elektronowa lub ICPMS (spektrometria mas z plazmą indukcyjnie sprzężoną), aby odpowiedzieć na dodatkowe pytania, takie jak rozkład tkankowy i kinetyka we krwi nanocząsteczek złota.

Po opracowaniu technika ta utorowała drogę badaczom w dziedzinie udarów lub chorób układu sercowo-naczyniowego do badania zakrzepowo-zatorowości w modelach zwierzęcych podatnych na zakrzepicę wieńcową lub zatorowy udar mózgu. Po obejrzeniu tego filmu powinni Państwo posiadać gruntowną wiedzę na temat tego, jak przygotować zakrzepy znakowane fluorescencyjnie do indukowania udaru zakrzepowo-zatorowego u myszy oraz jak przeprowadzić seryjne obrazowanie i kwantyfikację zakrzepów w mózgu in vivo, a następnie ex vivo, monitorując w ten sposób ewolucję zakrzepu.