Zrobotyzowana platforma do wysokowydajnej izolacji i transformacji protoplastów
27 września 2016
Opisana jest wysokoprzepustowa, zautomatyzowana metodologia produkcji i przetwarzania protoplastów tytoniu. Zrobotyzowany system umożliwia masowo równoległą ekspresję i odkrywanie genów w modelowym systemie BY-2, które powinno być możliwe do przełożenia na uprawy niemodelowe.
Ogólnym celem tego protokołu jest opracowanie metody szybkich, zautomatyzowanych, wysokoprzepustowych badań przesiewowych protoplastów roślinnych, w szczególności w celu rozwiązania obecnego wąskiego gardła we wczesnych badaniach przesiewowych dużej liczby celów edycji genomu i wyciszania genów. Metoda ta może pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytania w dziedzinie biotechnologii roślin. Główną zaletą tej techniki jest to, że umożliwia ona wysokowydajną, zautomatyzowaną produkcję i transformację protoplastów w celu szybkiego, równoległego badania przesiewowego funkcji promotora w ekspresji genów.
Procedura ta zostanie zademonstrowana przy użyciu powszechnie stosowanej jasnożółtej kultury zawiesinowej tytoniu (BY-2). Zacznij od wyhodowania kultury BY-2 w kolbie Erlenmeyera, zgodnie z opisem w tekście protokołu. W dniu izolacji protoplastów dokładnie wymieszaj kulturę, ponieważ komórki szybko się uspokoją, i przenieś sześć mililitrów kultury do 15-mililitrowej probówki wirówkowej ze stożkowym dnem.
Pozwól komórkom osiąść przez co najmniej 10 minut. Dostosuj objętość upakowanych komórek do 50% całkowitej objętości, usuwając odpowiednią objętość supernatantu. Wstrząśnij probówką, odwracając ją, a następnie użyj pipet o szerokim otworze, aby odpipetować 500 mikrolitrów zawiesiny komórkowej do każdej studzienki sześciodołkowej płytki w celu roztrawienia.
Pierwszym krokiem w tej procedurze jest włączenie wszystkich elementów systemu robotyki, którymi są napęd mikropłytek, regulator cieczy, wielomodowy czytnik płytek, dozownik wielomodowy, podgrzewacz płytowy lub agregat chłodniczy oraz komputery. Następnie otwórz oprogramowanie do planowania zadań przenoszenia płyt, które integruje urządzenie do przenoszenia mikropłytek z innymi urządzeniami, aby umożliwić przenoszenie płytek między każdym elementem wyposażenia. W oprogramowaniu do przenoszenia płyt zdefiniuj specyfikacje techniczne dla sprzętu laboratoryjnego używanego w protokole.
Kliknij przycisk Ustawienia na głównym pasku narzędzi i wybierz polecenie Zarządzaj typami kontenerów. Wybierz odpowiedni typ kontenera z listy istniejących typów kontenerów. Zdefiniuj specyfikacje techniczne dla wszystkich urządzeń laboratoryjnych, z którymi spotka się osoba zajmująca się przenoszeniem płyt.
Następnym krokiem jest zdefiniowanie pozycji początkowej i końcowej dla każdego kontenera. Kliknij kartę Rozpocznij/Zakończ w określonym protokole. Wybierz pozycję początkową każdego kontenera i zaznacz pole wyboru Z pokrywą, Bez pokrywy zarówno w pozycji początkowej, jak i końcowej.
Po zdefiniowaniu pozycji początkowej i końcowej dla każdego elementu wyposażenia laboratoryjnego ręcznie załaduj wszystkie płytki do pozycji początkowej dla całego przepływu pracy. Załaduj 96-dołkowe fluorescencyjne płytki przesiewowe do hotelu drugiego, sześciodołkowe płytki z komórkami BY-2 do hotelu trzeciego, płytkę dołkową o głębokości 96 głębokości, która zostanie użyta do transformacji na drugie gniazdo grzejnika płytowego lub agregatu chłodniczego oraz 50-mililitrową stożkową rurkę zawierającą roztwór enzymu na dozownik wielomodowy. Aby przeprowadzić transformację w protokole, należy wstępnie załadować każdą studzienkę płytki studzienkowej o głębokości 96 10 mikrolitrami plazmowego DNA zawierającego pomarańczowy fluorescencyjny konstrukt reporterowy białka i inkubować na grzałce płytki lub chłodziarce w temperaturze czterech stopni Celsjusza.
Załaduj wszystkie materiały eksploatacyjne i talerze na zautomatyzowaną platformę do obsługi cieczy w wyznaczonych miejscach. Załadować 96-dołkową płytkę wstępnie załadowaną 200 mikrolitrami 40% roztworu glikolu polietylenowego na studzienkę w kolumnie pierwszej. Załaduj pudełko z końcówkami do pipet do gniazda ósmego.
Aby zdefiniować lokalizację każdego elementu w oprogramowaniu zautomatyzowanych platform do obsługi cieczy, wybierz z menu Narzędzia i kliknij Edytor oprogramowania laboratoryjnego. Wybierz typ sprzętu laboratoryjnego z menu rozwijanego. Wybierz kartę Main Protocol (Protokół główny) i kliknij przycisk Configure Labware (Konfiguruj oprogramowanie laboratoryjne), aby zdefiniować położenie każdego elementu oprogramowania laboratoryjnego.
Kliknij przycisk Uruchom, aby zainicjować wszystkie urządzenia, które będą używane w protokole. Na koniec w oknie Eksploratora pracy kliknij Dodaj jednostkę roboczą, aby zweryfikować całe oprogramowanie laboratoryjne w systemie i rozpocząć automatyczny protokół. Najbardziej wrażliwą częścią procedury jest transformacja protoplastów.
Ponieważ transformacja jest wykonywana przez system robotyki, bardzo ważne jest, aby zautomatyzowane protokoły były poprawnie skonfigurowane. Na potrzeby tego filmu zostaną pokazane tylko wybrane kroki w protokołach automatycznych. Podczas protokołu transformacji zautomatyzowana platforma do obsługi cieczy zasysa 70 mikrolitrów roztworu protoplastu z płytki sześciodołkowej i dozuje go do płytki dołkowej o głębokości 96 w gnieździe szóstym.
Następnie nowe końcówki pipet są używane do powolnego zasysania 70 mikrolitrów roztworu glikolu polietylenowego o wysokiej lepkości z wstępnie załadowanej płytki głębokiej studzienki i całkowitego dozowania roztworu do odpowiednich studzienek płytki głębokiej studzienki. Następnie zautomatyzowana platforma do obsługi cieczy przesuwa płytkę głębokiej studzienki z następnej szóstki do dziewiątego gniazda, gdzie osoba poruszająca płytkami podnosi płytkę i przenosi ją do stacji wytrząsania płytek i potrząsa nią z prędkością 1500 obr./min przez 30 sekund. Po 20-minutowej inkubacji bez wstrząsania w celu umożliwienia zrównoważenia protoplastów, osoba poruszająca płytkami przenosi płytkę dołka o głębokości 96 do dozownika wielomodowego i uruchamia protokół mycia.
Po zakończeniu automatycznego protokołu izolacji i transformacji protoplastów usuń płytkę z przekształconymi protoplastami z hotelu pierwszego systemu robotyki. Włącz odwrócony mikroskop, kamerę i lampę fluorescencyjną. Wybierz obiektyw 10X, aby początkowo ustawić ostrość na protoplastach.
Włącz halogen lamp i zamknij przesłonę świetlówki. Załaduj płytkę do systemu mikroskopowego i skup się na protoplastach za pomocą jasnego pola. Następnie wyłącz żarówkę halogenową i otwórz przesłonę świetlówki.
Wybierz zestaw filtrów Cy3/TRITC do wizualizacji pomarańczowego białka fluorescencyjnego ulegającego ekspresji przez transgeniczne protoplasty. Zeskanuj każdą studzienkę, aby określić liczbę protoplastów wyrażających marker fluorescencyjny. Trawienie enzymatyczne protoplastów w warunkach określonych w tym protokole dało 2 820 000 protoplastów na płytkę sześciodołkową.
Oceniono utratę stężenia protoplastów po każdym kroku transferu w protokole. Po protokole trawienia 11 500 protoplastów przeniesiono do każdej studzienki z płytek studzienkowych o głębokości 96. Po zakończeniu protokołu transformacji 1 230 protoplastów przeniesiono na 96-dołkową fluorescencyjną płytkę przesiewową.
Aby upewnić się, że wiele etapów pipetowania nie uszkodzi protoplastów, ich żywotność oznaczono za pomocą barwienia jodkiem propidyny. Wyniki nie wykazały znaczącej różnicy w żywotności po trawieniu, po przeniesieniu do 96-dołkowej fluorescencyjnej płytki przesiewowej i po protokole transformacji. Protokół transformacji odniósł sukces w generowaniu komórek transgenicznych, które wyrażają pomarańczowe białko fluorescencyjne, chociaż wydajność transformacji była niska, tylko około 2%Wynika to z zastosowanego dużego binarnego plazmy i protokołu, który nie został zoptymalizowany specjalnie dla protoplastów BY-2.
Metryki uzyskane dla przebiegu czasowego protokołu wykazały, że główna inwestycja czasu jest poświęcana na etapie trawienia. Całkowity czas izolacji i transformacji protoplastów wynosił trzy godziny, 50 minut i 53 sekundy bez konieczności zewnętrznego wkładu ze strony operatora. Po prawidłowym skonfigurowaniu technika ta może być wykonana przez robota w mniej niż cztery godziny.
Po jej opracowaniu, technika ta toruje drogę naukowcom zajmującym się biotechnologią roślin do wykonywania wysokoprzepustowych procedur genomicznych upraw, takich jak edycja genomu i badania przesiewowe promotorów.
Wyświetl pełny transkrypt i uzyskaj dostęp do tysięcy filmów naukowych
Przegląd
Ten artykuł opisuje wysokowydajną, zautomatyzowaną metodę produkcji i transformacji protoplastów tytoniu. System robotyczny umożliwia masowo równoległe ekspresję genów i odkrywanie w modelowym systemie BY-2, z potencjalnymi zastosowaniami w roślinach niebędących modelami.
Kluczowe elementy badania
Obszar nauki
- Biotechnologia roślin
- Genomika
- Ekspresja genów
Tło
- Obecne wąskie gardła w edycji genomu i przesiewowym badaniu celów wyciszania genów.
- Znaczenie protoplastów w badaniach roślin.
- Potrzeba szybkich metod przesiewowych w biotechnologii.
- Kultura zawiesinowa BY-2 jako szeroko stosowany system modelowy.
Cel badania
- Opracowanie szybkiej, zautomatyzowanej metody do przesiewowego badania protoplastów roślin.
- Podniesienie efektywności badań nad ekspresją genów.
- Rozwiązanie wyzwań w wczesnym przesiewaniu genetycznych celów.
Zastosowane metody
- Hodowla kultury BY-2 w kolbie Erlenmeyera.
- Dokładne mieszanie kultury przed izolacją protoplastów.
- Przeniesienie kultury do probówki do wirówki w celu izolację protoplastów.
- Zautomatyzowane procesy transformacji do analizy wysokowydajnej.
Główne wyniki
- Udana opracowanie metody produkcji protoplastów o wysokiej wydajności.
- Demonstracja zdolności do szybkiego równoległego przesiewania.
- Potencjał dla zastosowania w roślinach niebędących modelami.
- Postęp w rozumieniu funkcji promotora w ekspresji genów.
Wnioski
- Zautomatyzowana metoda znacznie poprawia efektywność produkcji protoplastów.
- To podejście może ułatwić duże skale badania ekspresji genów.
- Ma potencjał dla szerszych zastosowań w biotechnologii roślin.
Często zadawane pytania
Executive Industry Relevance
High-throughput protoplast isolation and transformation addresses a critical bottleneck in early-stage plant biotechnology screening, enabling rapid parallel evaluation of genome editing and gene silencing targets. The robotic platform reduces operator dependence and accelerates discovery timelines for promoter function analysis and trait validation. This capability supports predictive confidence in target selection and portfolio prioritization for crop improvement programs.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of transcriptional regulatory networks and promoter function in a high-throughput format.
- Operational Value: Automates protoplast isolation and transformation, reducing manual variability and increasing reproducibility.
- Predictive Value: Supports rapid screening of genetic constructs to de-risk target hypotheses before downstream investment.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Generates quantitative fluorescence readouts via OFP reporter expression for promoter activity assessment.
- Operational Value: Standardizes protoplast production and transformation across 96-well formats for scalable screening.
- Assay Readiness: Enables preparation of validated protoplast systems for compound or genetic library evaluation.
Translational & Preclinical Research
- Translational Continuity: Bridges discovery-phase promoter screening with preclinical trait validation in crop systems.
- Disease-Relevant System: Applicable to any plant suspension culture, supporting broad crop genomics relevance.
- Risk-Adjusted Advancement: Facilitates go/no-go decisions based on reproducible transformation efficiency and reporter expression.
Pipeline & Workflow Integration
The method integrates into the discovery workflow from target hypothesis testing through lead identification, enabling rapid protoplast-based screening prior to stable line generation.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing of promoter function and gene expression dynamics in a controlled, high-throughput system.
- Screening: Delivers assay-ready protoplasts with standardized isolation and transformation for library-scale evaluation.
- Analytics: Provides quantitative fluorescence measurements and viability metrics via propidium iodide staining for data-driven comparisons.
- Translational Research: Enables continuity from BY-2 model screening to non-model crop applications through translatable protocols.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable robotic platform for repeated protoplast-based assays across projects and target classes.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence in target validation through reproducible, high-resolution promoter activity readouts.
- Operational Value: Achieves full automation from isolation to transformation in under 4 hours, minimizing hands-on time and batch effects.
- Strategic Value: Improves capital efficiency by enabling rapid screening of numerous targets with minimal reagent waste via low-cost food-grade enzymes.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization of genetic targets based on scalable, quantitative expression data.
Implementation Considerations
- Requires expertise in robotic platform programming, liquid handling, and fluorescence microscopy.
- Dependent on integrated instrumentation including microplate movers, dispensers, plate readers, and environmental controllers.
- Necessitates cross-team standardization of labware definitions, start/end positions, and protocol scheduling.
- Adaptation across model systems may require optimization of enzyme concentrations and transformation conditions.
- Transformation efficiency is influenced by plasmid size and protoplast susceptibility, necessitating empirical tuning for new systems.
Biopharma FAQs
Chapters in this video
0:05
Title
0:40
Establishment of Suspension Cell Cultures
1:40
Set up of Automated Protocols for Protoplast Isolation and Transformation
5:16
Automated Protocols
6:37
Microscopic Analysis of Transformation
7:42
Results: Rapid, Automated, High-throughput Screening of Plant Protoplasts
9:40
Conclusion
