Zrobotyzowana platforma do wysokowydajnej izolacji i transformacji protoplastów

Ogólnym celem niniejszego protokołu jest opracowanie metody szybkiego, zautomatyzowanego wysokoprzepustowego przesiewu protoplastów roślinnych, w szczególności w celu rozwiązania obecnego problemu wąskiego gardła przy wczesnym przesiewie dużej liczby celów edycji genomu i wyciszania genów. Metoda ta może pomóc w odpowiedzi na kluczowe pytania z zakresu biotechnologii roślin. Główną zaletą tej techniki jest to, że umożliwia ona wysokoprzepustową, zautomatyzowaną produkcję i transformację protoplastów do szybkiego równoległego przesiewu funkcji promotora w ekspresji genów.

Procedurę tę zaprezentowano na przykładzie powszechnie stosowanej hodowli zawiesinowej tytoniu odmiany bright yellow two, czyli BY-2. Rozpocznij od wyhodowania kultury BY-2 w kolbie Erlenmeyera, zgodnie z opisem w tekście protokołu. W dniu izolacji protoplastów dokładnie wymieszaj kulturę, ponieważ komórki szybko osiadają, a następnie przenieś 6 ml kultury do 15 ml probówki do wirowania z stożkowym dnem.

Pozostawić komórki do opadnięcia na co najmniej 10 minut. Dostosować objętość osadu komórkowego do 50% objętości całkowitej poprzez usunięcie odpowiedniej ilości supernatantu. Wymieszać zawartość probówki, odwracając ją, a następnie za pomocą pipet o szerokim wlocie przenieść 500 µL zawiesiny komórkowej do każdej studni płytki sześciostudniowej w celu przeprowadzenia trawienia.

Pierwszym krokiem w tej procedurze jest włączenie wszystkich komponentów systemu robotycznego, czyli przenośnika mikropłytek, systemu do dozowania cieczy, wielofunkcyjnego czytnika płytek, wielofunkcyjnego dyspensera, podgrzewacza lub chłodniczki do płytek oraz komputerów. Następnie należy uruchomić oprogramowanie do planowania zadań przenośnika płytek, które integruje przenośnik mikropłytek z pozostałym sprzętem, umożliwiając przenoszenie płytek między poszczególnymi urządzeniami. W oprogramowaniu przenośnika płytek należy zdefiniować specyfikacje techniczne dla naczyń laboratoryjnych użytych w protokole.

Kliknij Setup na głównym pasku narzędzi i wybierz polecenie Manage Container Types. Wybierz odpowiedni Typ Pojemnika (Container Type) z listy istniejących Typów Pojemników. Zdefiniuj specyfikacje techniczne dla wszystkich elementów wyposażenia laboratoryjnego, z którymi będzie stykać się przenośnik płytek.

Kolejnym krokiem jest zdefiniowanie pozycji początkowej i końcowej dla każdego pojemnika. Kliknij kartę Start/End w konkretnym protokole. Wybierz pozycję początkową każdego pojemnika i zaznacz pole Lidded (z pokrywką) lub Unlidded (bez pokrywki) zarówno dla pozycji początkowej, jak i końcowej.

Po zdefiniowaniu pozycji początkowej i końcowej dla każdego elementu wyposażenia laboratoryjnego, ręcznie umieść wszystkie płytki w pozycji startowej dla całego procesu. Włóż 96-dołkowe płytki do przesiewania fluorescencyjnego do hotelu dwa, płytki 6-dołkowe z komórkami BY-2 do hotelu trzy, 96-dołkową płytkę głęboką, która będzie wykorzystywana do transformacji, na gniazdo dwa podgrzewacza lub chłodziarki do płytek, a 50 mililitrową probówkę stożkową zawierającą roztwór enzymu na dyspenser wielofunkcyjny. Aby przeprowadzić transformację w protokole, należy uprzednio napełnić każdy dołek płytki 96-dołkowej głębokiej 10 mikrolitrami plazmidowego DNA zawierającego konstrukt reporterowy białka fluorescencyjnego o barwie pomarańczowej i inkubować na podgrzewaczu lub chłodziarce do płytek w temperaturze czterech stopni Celsjusza.

Umieść wszystkie materiały i płytki na zautomatyzowanej platformie do dozowania cieczy w wyznaczonych miejscach. W pierwszej kolumnie umieść płytkę 96-dołkową, w której każdy dołek zawiera 200 µL 40% roztworu glikolu polietylenowego. W gnieździe ósmym umieść pudełko z końcówkami do pipet.

Aby zdefiniować położenie każdego elementu w oprogramowaniu platformy do zautomatyzowanego dozowania cieczy, wybierz Tools z menu i kliknij Labware Editor. Wybierz rodzaj sprzętu laboratoryjnego z menu rozwijanego. Wybierz kartę Main Protocol i kliknij Configure Labware, aby zdefiniować pozycję każdego elementu sprzętu laboratoryjnego.

Kliknij Run, aby zainicjować wszystkie urządzenia, które będą wykorzystywane w protokole. Na koniec, w oknie Work Explorer, kliknij Add Work Unit, aby zweryfikować wszystkie naczynia laboratoryjne w systemie i rozpocząć zautomatyzowany protokół. Najbardziej krytycznym etapem procedury jest transformacja protoplastów.

Ponieważ transformacja jest przeprowadzana przez system robotyczny, kluczowe jest prawidłowe skonfigurowanie protokołów automatycznych. Na potrzeby tego filmu zaprezentowano jedynie wybrane kroki w protokołach automatycznych. Podczas protokołu transformacji zautomatyzowana platforma do obsługi cieczy pobiera 70 µL roztworu protoplastów z płytki 6-dołkowej i dozuje go do płytki 96-dołkowej w gnieździe sześć.

Następnie, przy użyciu nowych końcówek do pipety, powoli aspiruje się 70 µL wysokolepki roztworu glikolu polietylenowego z wcześniej napełnionej płytki głębokich dołków i całkowicie dozuje roztwór do odpowiednich dołków płytki głębokich dołków. Następnie zautomatyzowana platforma do obsługi cieczy przenosi płytkę głębokich dołków z gniazda sześć do gniazda dziewięć, gdzie przenośnik płytek pobiera ją i przenosi do stacji wstrząsania, w której jest ona wstrząsana z prędkością 1500 RPM przez 30 sekund. Po 20-minutowej inkubacji bez wstrząsania w celu wyrównania stanu protoplastów, przenośnik przenosi 96-dołkową płytkę głębokich dołków do dozownika wielofunkcyjnego i uruchamia protokół płukania.

Po zakończeniu zautomatyzowanego protokołu izolacji i transformacji protoplastów, wyjmij płytkę z transformowanymi protoplastami z pierwszego hotela systemu robotycznego. Włącz mikroskop odwrócony, kamerę oraz lampę fluorescencyjną. Wybierz obiektyw 10X do wstępnego ustawienia ostrości na protoplastach.

Włącz lampę halogenową i zamknij migawkę lampy fluorescencyjnej. Umieść płytkę w systemie mikroskopowym i ustaw ostrość na protoplasty, korzystając z pola jasnego. Następnie wyłącz żarówkę halogenową i otwórz migawkę lampy fluorescencyjnej.

Wybierz zestaw filtrów Cy3/TRITC do wizualizacji pomarańczowego białka fluorescencyjnego ekspresowanego przez transgeniczne protoplasty. Zeskanuj każdą studzienkę, aby określić liczbę protoplastów ekspresujących marker fluorescencyjny. Trawienie enzymatyczne protoplastów w warunkach określonych w niniejszym protokole doprowadziło do uzyskania 2 820 000 protoplastów na płytkę sześciodołkową.

Oceniono ubytek stężenia protoplastów po każdym etapie przenoszenia w protokole. Po zakończeniu protokołu trawienia do każdej studzienki 96-dołkowych płytek głębokich przeniesiono 11 500 protoplastów. Po zakończeniu protokołu transformacji do 96-dołkowej płytki do przesiewania fluorescencyjnego przeniesiono 1 230 protoplastów.

Aby upewnić się, że wielokrotne etapy pipetowania nie uszkodziły protoplastów, ich żywotność oceniono za pomocą barwienia jodkiem propidyny. Wyniki nie wykazały istotnych różnic w żywotności po trawieniu, po przeniesieniu na 96-dołkową płytkę do przesiewu fluorescencyjnego oraz po protokole transformacji. Protokół transformacji pozwolił na uzyskanie komórek transgenicznych wykazujących ekspresję pomarańczowego białka fluorescencyjnego, choć wydajność transformacji była niska i wynosiła zaledwie około 2%. Wynika to z zastosowania dużego plazmidu binarnego oraz faktu, że protokół nie został zoptymalizowany specjalnie dla protoplastów BY-2.

Parametry uzyskane dla przebiegu czasowego protokołu wykazały, że największa część czasu jest poświęcana na etap trawienia. Całkowity czas izolacji i transformacji protoplastów wyniósł trzy godziny, 50 minut i 53 sekundy, bez konieczności interwencji operatora. Po odpowiednim przygotowaniu technika ta może być wykonywana przez robota w czasie krótszym niż cztery godziny.

Po opracowaniu, technika ta toruje drogę badaczom w dziedzinie biotechnologii roślin do przeprowadzania wysokoprzepustowych procedur genomicznych w uprawach, takich jak edycja genomu i screening promotorów.