Name: Zrobotyzowana platforma do wysokowydajnej izolacji i transformacji protoplastów (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-09-27T13:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 12 s
Description: Poznaj zrobotyzowaną metodę izolacji i transformacji protoplastów BY-2 w celu szybkiego przesiewania genów. To podejście usprawnia badania ekspresji genów w biotechnologii roślinnej.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

To badanie było wspierane przez Advanced Research Projects Agency - Energy (ARPA-E) Award No. DE-AR0000313.

1. Zakładanie zawiesinowych kultur komórkowych
<ol>
	<li>Przygotować płynną pożywkę BY-2, dodając 4,43 g pożywki podstawowej Linsmaier & Skoog, 30 g sacharozy, 200 mg KH2PO4 i 200 μg kwasu 2,4-dichlorofenoksyoctowego (2,4-D) do 900 ml wody destylowanej i pH do 5,8 z 0,1 M KOH. Po dostosowaniu pH dostosuj końcową objętość do 1,000 ml za pomocą wody destylowanej i autoklawu. Media można przechowywać do 2 tygodni w temperaturze 4 °C.</li>
	<li>Zaszczepić 250 ml kolby Erlenmeyera 100 ml płynnej pożywki BY-2 i pojedynczym kawałkiem kalusa BY-2 (o średnicy >1 cm) wyhodowanym na stałym podłożu BY-2 (płynna pożywka BY-2 z dodatkiem 1% agaru) i zamknąć folią aluminiową. Inkubować kulturę w temperaturze 28-30 °C z wytrząsaniem przez 5 dni. 
	UWAGA: Kalus BY-2 jest utrzymywany na pożywkach stałych do długotrwałego przechowywania, ponieważ płynne kultury szybko się przerastają. Objętość kultury można dostosować w razie potrzeby, zazwyczaj kultura o pojemności 100 ml będzie w stanie załadować trzydzieści trzy płytki 6-dołkowe.</li>
	<li>Przenieść 2 ml kultury BY-2 w fazie logarytmicznej do 98 ml świeżej pożywki BY-2 i inkubować przez 5-7 dni w temperaturze 28-30 °C z wytrząsaniem. 
	UWAGA: Podhodowlę ustalonych płynnych kultur można przeprowadzać regularnie, stosując rozcieńczenia 1:100 5-7-dniowych kultur, zamiast zaszczepiania kalusem.</li>
	<li>Dokładnie wymieszaj kulturę, ponieważ komórki szybko się uspokoją, a następnie przenieś 6 ml kultury komórkowej do stożkowej dolnej probówki wirówkowej o pojemności 15 ml i pozwól komórkom osiąść przez co najmniej 10 minut. Dostosuj objętość upakowanych komórek do 50% całkowitej objętości, usuwając supernatant.</li>
	<li>Wstrząsnąć probówką, odwracając i odpipetować 500 μl do każdego dołka na 6-dołkowej płytce w celu roztrawienia. Na tym etapie do przenoszenia komórek należy używać pipet o szerokim otworze, ponieważ są one gęste i zatykają standardowe końcówki pipet.</li>
</ol>
2. Izolacja protoplastów
<ol>
	<li>Włącz wszystkie elementy systemu zrobotyzowanego (Rysunek 1A) i otwórz oprogramowanie do planowania zadań przenoszenia płyt. Program do planowania zadań integruje urządzenie do przenoszenia mikropłytek z innymi urządzeniami, aby umożliwić przenoszenie płytek między każdym elementem wyposażenia.</li>
	<li>Przed przystąpieniem do eksperymentów należy określić specyfikacje techniczne dla sprzętu laboratoryjnego (np. płytek, pokrywek) używanego w protokole, a także pozycje początkowe i końcowe dla każdego elementu przyboru laboratoryjnego w oprogramowaniu do przenoszenia płytek w następujący sposób:
	<ol>
		<li>Kliknij przycisk Ustawienia na głównym pasku narzędzi w oprogramowaniu do przenoszenia blach i wybierz polecenie Zarządzaj typami kontenerów.</li>
		<li>Jeśli typ kontenera znajduje się w istniejącej bibliotece typów kontenerów, wybierz odpowiedni kontener.</li>
		<li>Jeśli typ kontenera nie jest wymieniony w istniejącej bibliotece typów kontenerów, kliknij przycisk Dodaj, aby określić nowy typ kontenera.</li>
		<li>Po dodaniu nowego typu kontenera wstaw wymiary nowego kontenera (wysokość, szerokość, wymiary stosu i przesunięcie chwytaka) w odpowiednie zakładki i kliknij przycisk Zapisz.
		<ol>
			<li>Jeśli prawidłowe wymiary nie są dostępne u producenta, dokładnie określ wszystkie wymiary z dokładnością do milimetra za pomocą suwmiarki. Błędy w pomiarze wymiarów pojemnika będą skutkowały awarią przenośnika płyt.</li>
		</ol>
		</li>
		<li>Powtórz kroki od 2.2.2 do 2.2.4.1 dla wszystkich typów pojemników, z którymi napotka się osoba poruszająca płytami. Po wykonaniu tego kroku dla wszystkich urządzeń laboratoryjnych konieczne jest zdefiniowanie lokalizacji początkowej i końcowej dla każdego pojemnika (krok 2.2.6). 
		UWAGA: W przypadku tego protokołu sprzęt laboratoryjny obejmuje płytkę 6-dołkową, płytkę głębinową i 96-dołkową fluorescencyjną płytkę przesiewową.</li>
		<li>Aby zdefiniować pozycję początkową i końcową każdego kontenera, kliknij kartę Początek/Koniec w określonym protokole. Najpierw wybierz pozycję początkową każdego kontenera. Następnie zaznacz pole Lidded/Unlidded zarówno w pozycji początkowej, jak i końcowej. Powtórz te czynności dla wszystkich kontenerów. 
		UWAGA: Jeśli pojemnik zostanie pozostawiony na innym elemencie wyposażenia (zamiast nośnika płyt), lokalizacja końcowa może pozostać pusta.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Na tym etapie należy ręcznie załadować wszystkie płyty do pozycji początkowej dla całego przepływu pracy. Załaduj 96-dołkowe fluorescencyjne płytki przesiewowe do Hotelu 2, 6-dołkowe płytki z komórkami BY-2 do Hotelu 3, 96-dołkową płytkę głębokodołkową, która zostanie użyta do przemiany na grzałkę płytkową/gniazdo agregatu chłodniczego 2, a stożkową probówkę o pojemności 50 ml zawierającą roztwór enzymu (patrz Plik uzupełniający, sekcja 1.2.2) na dozownik wielomodowy.
	<ol>
		<li>Jeżeli w protokole ma zostać przeprowadzona transformacja, należy wstępnie załadować 96 płytek głębokodołkowych 10 μl plazmidowego DNA na studzienkę (1 μg/μl, A260/280 > 1,8) zawierającą konstrukt reporterowy OFP i inkubować na podgrzewaczu płytkowym/chłodziarce w temperaturze 4 °C. Każda studzienka zostanie wykorzystana do pojedynczej transformacji, dlatego liczba napełnionych studzienek będzie zależała od konfiguracji eksperymentalnej.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Załaduj wszystkie materiały eksploatacyjne i talerze na zautomatyzowaną platformę do obsługi cieczy w wyznaczonych lokalizacjach i określ pozycję każdego elementu w oprogramowaniu sterowania automatyką (rysunek 1B).
	<ol>
		<li>Załadować 96-dołkową płytkę wstępnie załadowaną 200 μl 40% PEG w MMg (0,4 M mannitolu, 100 mM MgCl2, 4 mM MES, pH 5,7) w kolumnie 1, 200 μl jodku propidyny (PI, 1 μg/ml) w kolumnie 2 i 200 μl etanolu w kolumnie 3 (gniazdo 2) oraz pudełko końcówek do pipet w gnieździe 8.</li>
		<li>Aby zdefiniować lokalizację sprzętu laboratoryjnego w oprogramowaniu platformy do automatycznego transportu cieczy, wybierz z menu Narzędzia i kliknij Edytor oprogramowania laboratoryjnego.</li>
		<li>Wybierz typ sprzętu laboratoryjnego z menu rozwijanego lub zdefiniuj nowy typ sprzętu laboratoryjnego za pomocą przycisku Nowe oprogramowanie laboratoryjne.</li>
		<li>Zdefiniuj położenie każdego wybranego elementu oprogramowania laboratoryjnego, wybierając kartę Protokół główny i klikając przycisk Konfiguruj oprogramowanie laboratoryjne. Upewnij się, że każdy element wyposażenia laboratoryjnego umieszczony na platformie do automatycznego obchodzenia się z cieczami jest zdefiniowany przed uruchomieniem protokołu.</li>
		<li>Aby wyzwolić automatyczne protokoły, kliknij okno Eksplorator profili i wybierz nazwę protokołu, który ma zostać uruchomiony (Izolacja Protoplastu, Liczba komórek i Transformacja za pośrednictwem PEG).</li>
		<li>Kliknij przycisk Uruchom, aby zainicjować wszystkie urządzenia, które będą używane w protokole.</li>
		<li>Na koniec w oknie Eksploratora pracy kliknij Dodaj jednostkę roboczą, aby zweryfikować wszystkie kontenery/oprogramowanie laboratoryjne w systemie i uruchomić automatyczny protokół. 
		UWAGA: Pełne opisy protokołów automatycznych znajdują się w pliku uzupełniającym.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
3. Ustal krzywą standardową dla zliczania komórek
<ol>
	<li>Ręcznie zagęścić protoplasty w stężeniu 1 x 106 protoplastów/ml w objętości 1 ml. Odwirować protoplasty w stężeniu 1 000 x g przez 10 minut i usunąć supernatant.</li>
	<li>Ręcznie dodać 900 μl 70% etanolu (utrzymywanego w temperaturze 4 °C) do osadu protoplastu i ponownie zawiesić osad. Inkubować przez 10 minut na lodzie, aby utrwalić komórki.</li>
	<li>Dodać 100 μl PI (1 μg/ml) do protoplastów, aby oznaczyć jądra i umożliwić wykrycie przez czytnik płytek.</li>
	<li>Załadować 80 μl ciekłej pożywki BY-2 do każdej kolumny i rzędu 96-dołkowej fluorescencyjnej płytki przesiewowej, zaczynając od kolumny 2.</li>
	<li>W kolumnie 1 96-dołkowej fluorescencyjnej płytki przesiewowej dodać 70 μl protoplastów i 50 μl pożywki BY-2 do każdej pożywki w kolumnie.</li>
	<li>Umieść płytkę w gnieździe 6 zautomatyzowanej platformy do obsługi cieczy i uruchom 2-krotne seryjne rozcieńczanie.
	<ol>
		<li>Aby przeprowadzić rozcieńczanie seryjne na zautomatyzowanej platformie do obsługi cieczy, kliknij przycisk Uruchom Kreatora rozcieńczania szeregowego i dostosuj objętość transferu (60 μl), liczbę mieszanin i objętość (2, 70 μl), dołki początkowe (kolumna 1, rzędy A-F), studzienki rozcieńczające (kolumny 2-11, rzędy A-F) oraz właściwości zasysania i dozowania (0,5 mm od dna studzienki).</li>
		<li>Po ustawieniu parametrów zapisz i uruchom protokół. 
		UWAGA: Ponieważ wszystkie protoplasty są znakowane PI (ze względu na utrwalenie komórek), fluorescencja jest proporcjonalna do stężenia protoplastów.</li>
		<li>Po zakończeniu seryjnego rozcieńczania wyjmij płytkę z gniazda 9 i włóż ją do czytnika płytek, a następnie uruchom standardowy protokół krzywej w oprogramowaniu czytnika płytek. 
		UWAGA: Następnie zostanie wygenerowana krzywa wzorcowa, porównując fluorescencję z PI (wzbudzenie 536 nm/emisja 620 nm) w każdym studzience ze znanym stężeniem protoplastów.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Po wypełnieniu protokołu czytnika płytek należy wyjąć płytkę i zebrać wszelkie komórki transgeniczne do autoklawowania lub innych procedur dewitalizacji, jak określono w protokołach bezpieczeństwa biologicznego".</li>
</ol>
4. Mikroskopowa analiza transformacji
<ol>
	<li>Usunąć płytkę z przekształconymi protoplastami (iloczyn Protokołu Automatycznego 3, Pliku Uzupełniającego) z Hotelu 1 systemu robotycznego.</li>
	<li>Włącz odwrócony mikroskop, kamerę i lampę fluorescencyjną.</li>
	<li>Wybierz obiektyw 10X, aby wstępnie ustawić ostrość na protoplastach, włącz lampę halogenową i zamknij migawkę lampy fluorescencyjnej.</li>
	<li>Załaduj płytkę do systemu mikroskopowego i skup się na protoplastach za pomocą jasnego pola.</li>
	<li>Po skupieniu się na protoplastach wyłącz żarówkę halogenową i otwórz przesłonę świetlówki.</li>
	<li>Należy wybrać zestaw filtrów CY3/TRITC do wizualizacji białka pporRFP wyrażonego przez transgeniczne protoplasty.</li>
	<li>Zeskanuj każdą studzienkę, aby określić liczbę protoplastów wyrażających marker fluorescencyjny pporRFP.</li>
	<li>Obliczyć wydajność przemiany jako całkowitą liczbę protoplastów wyrażających marker fluorescencyjny, całkowitą liczbę protoplastów.</li>
	<li>Zebrać wszelkie płytki zawierające komórki transgeniczne w zatwierdzonych workach bezpieczeństwa biologicznego do autoklawowania lub innych procedur dewitalizacji, jak określono w protokołach bezpieczeństwa biologicznego".</li>
</ol>

<ol><li>Atkinson, H. J., Lilley, C. J., Urwin, P. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Strategies+for+transgenic+nematode+control+in+developed+and+developing+world+crops%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Opin.+Biotech%22%5BJournal%5D)">Strategies for transgenic nematode control in developed and developing world crops.</a> Curr. Opin. Biotech. 23 (2), 251-256 (2012).</li>
<li>Duke, S. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Perspectives+on+transgenic%2C+herbicide-resistant+crops+in+the+United+States+almost+20+years+after+introduction%5BTitle%5D)+AND+%22Pest+Manag.+Sci%22%5BJournal%5D)">Perspectives on transgenic, herbicide-resistant crops in the United States almost 20 years after introduction.</a> Pest Manag. Sci. 71 (5), 652-657 (2015).</li>
<li>Mir, R., Zaman-Allah, M., Sreenivasulu, N., Trethowan, R., Varshney, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Integrated+genomics%2C+physiology+and+breeding+approaches+for+improving+drought+tolerance+in+crops%5BTitle%5D)+AND+%22Theor.+Appl.+Genet%22%5BJournal%5D)">Integrated genomics, physiology and breeding approaches for improving drought tolerance in crops.</a> Theor. Appl. Genet. 125 (4), 625-645 (2012).</li>
<li>Hu, H., Xiong, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetic+engineering+and+breeding+of+drought-resistant+crops%5BTitle%5D)+AND+%22Annu.+Rev.+Plant+Bio%22%5BJournal%5D)">Genetic engineering and breeding of drought-resistant crops.</a> Annu. Rev. Plant Bio. 65, 715-741 (2014).</li>
<li>Marco, F., et al. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aMarco%2C+F+%22Plant+Biology+and+Biotechnology%22">Plant Biology and Biotechnology</a>. , Springer. 579-609 (2015).</li>
<li>Edgerton, M. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transgenic+insect+resistance+traits+increase+corn+yield+and+yield+stability%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Transgenic insect resistance traits increase corn yield and yield stability.</a> Nat. Biotechnol. 30 (6), 493-496 (2012).</li>
<li>Vanhercke, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Metabolic+engineering+of+biomass+for+high+energy+density%3A+oilseed-like+triacylglycerol+yields+from+plant+leaves%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Biotech.+J%22%5BJournal%5D)">Metabolic engineering of biomass for high energy density: oilseed-like triacylglycerol yields from plant leaves.</a> Plant Biotech. J. 12 (2), 231-239 (2014).</li>
<li>Baxter, H. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Two-year+field+analysis+of+reduced+recalcitrance+transgenic+switchgrass%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Biotech.+J%22%5BJournal%5D)">Two-year field analysis of reduced recalcitrance transgenic switchgrass.</a> Plant Biotech. J. 12 (7), 914-924 (2014).</li>
<li>Xing, H. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+CRISPR%2FCas9+toolkit+for+multiplex+genome+editing+in+plants%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Plant+Biol%22%5BJournal%5D)">A CRISPR/Cas9 toolkit for multiplex genome editing in plants.</a> BMC Plant Biol. 14 (1), 327(2014).</li>
<li>Cao, J., Yao, D., Lin, F., Jiang, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((PEG-mediated+transient+gene+expression+and+silencing+system+in+maize+mesophyll+protoplasts%3A+a+valuable+tool+for+signal+transduction+study+in+maize%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Physio.+Plant%22%5BJournal%5D)">PEG-mediated transient gene expression and silencing system in maize mesophyll protoplasts: a valuable tool for signal transduction study in maize.</a> Acta Physio. Plant. 36 (5), 1271-1281 (2014).</li>
<li>Martinho, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dissection+of+miRNA+pathways+using+Arabidopsis+mesophyll+protoplasts%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Plant%22%5BJournal%5D)">Dissection of miRNA pathways using Arabidopsis mesophyll protoplasts.</a> Mol. Plant. 8 (2), 261-275 (2015).</li>
<li>Bart, R., Chern, M., Park, C. J., Bartley, L., Ronald, P. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+system+for+gene+silencing+using+siRNAs+in+rice+leaf+and+stem-derived+protoplasts%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Methods%22%5BJournal%5D)">A novel system for gene silencing using siRNAs in rice leaf and stem-derived protoplasts.</a> Plant Methods. 2 (1), 13(2006).</li>
<li>Jiang, F., Zhu, J., Liu, H. -L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protoplasts%3A+a+useful+research+system+for+plant+cell+biology%2C+especially+dedifferentiation%5BTitle%5D)+AND+%22Protoplasma%22%5BJournal%5D)">Protoplasts: a useful research system for plant cell biology, especially dedifferentiation.</a> Protoplasma. 250 (6), 1231-1238 (2013).</li>
<li>Martin-Ortigosa, S., Valenstein, J. S., Lin, V. S. Y., Trewyn, B. G., Wang, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nanotechnology+meets+plant+sciences%3A+Gold+functionalized+mesoporous+silica+nanoparticle+mediated+protein+and+DNA+codelivery+to+plant+cells+via+the+biolistic+method%5BTitle%5D)+AND+%22Adv.+Funct.+Mater%22%5BJournal%5D)">Nanotechnology meets plant sciences: Gold functionalized mesoporous silica nanoparticle mediated protein and DNA codelivery to plant cells via the biolistic method.</a> Adv. Funct. Mater. 22 (17), 3529-3529 (2012).</li>
<li>Křenek, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transient+plant+transformation+mediated+by+Agrobacterium+tumefaciens%3A+Principles%2C+methods+and+applications%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechnol.+Adv%22%5BJournal%5D)">Transient plant transformation mediated by Agrobacterium tumefaciens: Principles, methods and applications.</a> Biotechnol. Adv. , (2015).</li>
<li>Yoo, S. D., Cho, Y. H., Sheen, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Arabidopsis+mesophyll+protoplasts%3A+a+versatile+cell+system+for+transient+gene+expression+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Protoc%22%5BJournal%5D)">Arabidopsis mesophyll protoplasts: a versatile cell system for transient gene expression analysis.</a> Nat. Protoc. 2 (7), 1565-1572 (2007).</li>
<li>Mustafa, N. R., de Winter, W., van Iren, F., Verpoorte, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Initiation%2C+growth+and+cryopreservation+of+plant+cell+suspension+cultures%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Protoc%22%5BJournal%5D)">Initiation, growth and cryopreservation of plant cell suspension cultures.</a> Nat. Protoc. 6 (6), 715-742 (2011).</li>
<li>Nagata, T., Nemoto, Y., Hasezawa, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tobacco+BY-2+cell+line+as+the+%26%2334%3BHeLa%26%2334%3B+cell+in+the+cell+biology+of+higher+plants%5BTitle%5D)+AND+%22Int.+Rev.+Cytol%22%5BJournal%5D)">Tobacco BY-2 cell line as the &#34;HeLa&#34; cell in the cell biology of higher plants.</a> Int. Rev. Cytol. 132 (1), 1-30 (1992).</li>
<li>Centomani, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Involvement+of+DNA+methylation+in+the+control+of+cell+growth+during+heat+stress+in+tobacco+BY-2+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Protoplasma%22%5BJournal%5D)">Involvement of DNA methylation in the control of cell growth during heat stress in tobacco BY-2 cells.</a> Protoplasma. , 1-9 (2015).</li>
<li>Sgobba, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cyclic+AMP+deficiency+stimulates+a+stress+condition+in+tobacco+BY-2+cells%5BTitle%5D)+AND+%22BioTechnologia%22%5BJournal%5D)">Cyclic AMP deficiency stimulates a stress condition in tobacco BY-2 cells.</a> BioTechnologia. 94 (2), (2013).</li>
<li>Väisänen, E. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Coniferyl+alcohol+hinders+the+growth+of+tobacco+BY-2+cells+and+Nicotiana+benthamiana+seedlings%5BTitle%5D)+AND+%22Planta%22%5BJournal%5D)">Coniferyl alcohol hinders the growth of tobacco BY-2 cells and Nicotiana benthamiana seedlings.</a> Planta. 242 (3), 747-760 (2015).</li>
<li>Ortiz-Espìn, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Over-expression+of+Trxo1+increases+the+viability+of+tobacco+BY-2+cells+under+H2O2+treatment%5BTitle%5D)+AND+%22Ann.+Botany%22%5BJournal%5D)">Over-expression of Trxo1 increases the viability of tobacco BY-2 cells under H2O2 treatment.</a> Ann. Botany. 116 (4), 571-582 (2015).</li>
<li>Ito, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((cis-Golgi+proteins+accumulate+near+the+ER+exit+sites+and+act+as+the+scaffold+for+Golgi+regeneration+after+brefeldin+A+treatment+in+tobacco+BY-2+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Bio.+Cell%22%5BJournal%5D)">cis-Golgi proteins accumulate near the ER exit sites and act as the scaffold for Golgi regeneration after brefeldin A treatment in tobacco BY-2 cells.</a> Mol. Bio. Cell. 23 (16), 3203-3214 (2012).</li>
<li>Madison, S. L., Nebenführ, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Live-cell+imaging+of+dual-labeled+Golgi+stacks+in+tobacco+BY-2+cells+reveals+similar+behaviors+for+different+cisternae+during+movement+and+brefeldin+A+treatment%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Plant%22%5BJournal%5D)">Live-cell imaging of dual-labeled Golgi stacks in tobacco BY-2 cells reveals similar behaviors for different cisternae during movement and brefeldin A treatment.</a> Mol. Plant. 4 (5), 896-908 (2011).</li>
<li>de Pinto, M. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((S-nitrosylation+of+ascorbate+peroxidase+is+part+of+programmed+cell+death+signaling+in+tobacco+Bright+Yellow-2+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Physiol%22%5BJournal%5D)">S-nitrosylation of ascorbate peroxidase is part of programmed cell death signaling in tobacco Bright Yellow-2 cells.</a> Plant Physiol. 163 (4), 1766-1775 (2013).</li>
<li>Hanamata, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+imaging+and+quantitative+monitoring+of+autophagic+flux+in+tobacco+BY-2+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Signa.+Behav%22%5BJournal%5D)">In vivo imaging and quantitative monitoring of autophagic flux in tobacco BY-2 cells.</a> Plant Signa. Behav. 8 (1), 22510(2013).</li>
<li>Sakai, A., Takusagawa, M., Nio, A., Sawai, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cytological+Studies+on+proliferation%2C+differentiation%2C+and+death+of+BY-2+cultured+tobacco+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cytologia%22%5BJournal%5D)">Cytological Studies on proliferation, differentiation, and death of BY-2 cultured tobacco cells.</a> Cytologia. 80 (2), 133-141 (2015).</li>
<li>Yasuhara, H., Kitamoto, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Aphidicolin-induced+nuclear+elongation+in+tobacco+BY-2+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Cell+Physiol%22%5BJournal%5D)">Aphidicolin-induced nuclear elongation in tobacco BY-2 cells.</a> Plant Cell Physiol. 55 (5), 913-927 (2014).</li>
<li>Buntru, M., Vogel, S., Stoff, K., Spiegel, H., Schillberg, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+versatile+coupled+cell-free+transcription-translation+system+based+on+tobacco+BY-2+cell+lysates%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechnol.+Bioeng%22%5BJournal%5D)">A versatile coupled cell-free transcription-translation system based on tobacco BY-2 cell lysates.</a> Biotechnol. Bioeng. 112 (5), 867-878 (2015).</li>
<li>Buntru, M., Vogel, S., Spiegel, H., Schillberg, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tobacco+BY-2+cell-free+lysate%3A+an+alternative+and+highly-productive+plant-based+in+vitro+translation+system%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Tobacco BY-2 cell-free lysate: an alternative and highly-productive plant-based in vitro translation system.</a> BMC Biotechnol. 14 (1), 37(2014).</li>
<li>Alieva, N. O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Diversity+and+evolution+of+coral+fluorescent+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+ONE%22%5BJournal%5D)">Diversity and evolution of coral fluorescent proteins.</a> PLoS ONE. 3 (7), 2680(2008).</li>
<li>Maćkowska, K., Jarosz, A., Grzebelus, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Plant+regeneration+from+leaf-derived+protoplasts+within+the+Daucus+genus%3A+effect+of+different+conditions+in+alginate+embedding+and+phytosulfokine+application%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Cell+Tiss.+Org%22%5BJournal%5D)">Plant regeneration from leaf-derived protoplasts within the Daucus genus: effect of different conditions in alginate embedding and phytosulfokine application.</a> Plant Cell Tiss. Org. 117 (2), 241-252 (2014).</li>
<li>Guo, Y., Song, X., Zhao, S., Lv, J., Lu, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+transient+gene+expression+system+in+Populus+euphratica+Oliv.+protoplasts+prepared+from+suspension+cultured+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Physio.+Plant%22%5BJournal%5D)">A transient gene expression system in Populus euphratica Oliv. protoplasts prepared from suspension cultured cells.</a> Acta Physio. Plant. 37 (8), 1-8 (2015).</li>
<li>Wang, H., Wang, W., Zhan, J., Huang, W., Xu, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+efficient+PEG-mediated+transient+gene+expression+system+in+grape+protoplasts+and+its+application+in+subcellular+localization+studies+of+flavonoids+biosynthesis+enzymes%5BTitle%5D)+AND+%22Sci.+Hort%22%5BJournal%5D)">An efficient PEG-mediated transient gene expression system in grape protoplasts and its application in subcellular localization studies of flavonoids biosynthesis enzymes.</a> Sci. Hort. 191, 82-89 (2015).</li>
<li>Masani, M. Y. A., Noll, G. A., Parveez, G. K. A., Sambanthamurthi, R., Pruefer, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+transformation+of+oil+palm+protoplasts+by+PEG-mediated+transfection+and+DNA+microinjection%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Efficient transformation of oil palm protoplasts by PEG-mediated transfection and DNA microinjection.</a> PLoS One. 9 (5), 96831(2014).</li>
<li>Sasamoto, H., Ashihara, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effect+of+nicotinic+acid%2C+nicotinamide+and+trigonelline+on+the+proliferation+of+lettuce+cells+derived+from+protoplasts%5BTitle%5D)+AND+%22Phytochem.+Lett%22%5BJournal%5D)">Effect of nicotinic acid, nicotinamide and trigonelline on the proliferation of lettuce cells derived from protoplasts.</a> Phytochem. Lett. 7, 38-41 (2014).</li>
<li>Uddin, M. J., Robin, A. H. K., Raffiand, S., Afrin, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Somatic+embryo+formation+from+co-cultivated+protoplasts+of+Brassica+rapa+%26+B.+juncea%5BTitle%5D)+AND+%22Am.+J.+Exp.+Ag%22%5BJournal%5D)">Somatic embryo formation from co-cultivated protoplasts of Brassica rapa & B. juncea.</a> Am. J. Exp. Ag. 8 (6), 342-349 (2015).</li>
<li>Hayashimoto, A., Li, Z., Murai, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+polyethylene+glycol-mediated+protoplast+transformation+system+for+production+of+fertile+transgenic+rice+plants%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Physiol%22%5BJournal%5D)">A polyethylene glycol-mediated protoplast transformation system for production of fertile transgenic rice plants.</a> Plant Physiol. 93 (3), 857-863 (1990).</li>
<li>Mazarei, M., Al-Ahmad, H., Rudis, M. R., Stewart, C. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protoplast+isolation+and+transient+gene+expression+in+switchgrass%2C+Panicum+virgatum+L%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechnol.+J%22%5BJournal%5D)">Protoplast isolation and transient gene expression in switchgrass, Panicum virgatum L.</a> Biotechnol. J. 3 (3), 354-359 (2008).</li>
<li>Mazarei, M., Al-Ahmad, H., Rudis, M. R., Joyce, B. L., Stewart, C. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Switchgrass+%28Panicum+virgatum+L.%29+cell+suspension+cultures%3A+Establishment%2C+characterization%2C+and+application%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Sci%22%5BJournal%5D)">Switchgrass (Panicum virgatum L.) cell suspension cultures: Establishment, characterization, and application.</a> Plant Sci. 181 (6), 712-715 (2011).</li>
<li>Locatelli, F., Vannini, C., Magnani, E., Coraggio, I., Bracale, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficiency+of+transient+transformation+in+tobacco+protoplasts+is+independent+of+plasmid+amount%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Cell+Rep%22%5BJournal%5D)">Efficiency of transient transformation in tobacco protoplasts is independent of plasmid amount.</a> Plant Cell Rep. 21 (9), 865-871 (2003).</li>
<li>Di Sansebastiano, G. P., Paris, N., Marc-Martin, S., Neuhaus, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Specific+accumulation+of+GFP+in+a+non-acididc+vacuolar+compartment+via+a+C-terminal+propeptide-mediated+sorting+pathway%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+J%22%5BJournal%5D)">Specific accumulation of GFP in a non-acididc vacuolar compartment via a C-terminal propeptide-mediated sorting pathway.</a> Plant J. 15 (4), 449-457 (1998).</li>
<li>De Sutter, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Exploration+of+jasmonate+signalling+via+automated+and+standardized+transient+expression+assays+in+tobacco+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+J%22%5BJournal%5D)">Exploration of jasmonate signalling via automated and standardized transient expression assays in tobacco cells.</a> Plant J. 44 (6), 1065-1076 (2005).</li>
</ol>

Autorzy oświadczają, że nie mają konkurencyjnego interesu finansowego.

Opisany powyżej protokół został pomyślnie zwalidowany pod kątem izolacji, liczenia i transformacji protoplastów przy użyciu hodowli komórek zawiesiny tytoniu BY-2; Protokół można jednak łatwo rozszerzyć na dowolną hodowlę zawiesiny roślinnej. Obecnie izolację i przemianę protoplastów osiągnięto w wielu roślinach, w tym w kukurydzy (Zea mays)10, marchwi (Daucus carota)32, topoli (Populus euphratica)33, winogronach (Vitis vinifera)34, palmie <e...

W ostatnich latach położono znaczący nacisk na projektowanie upraw transgenicznych, aby przezwyciężyć różne choroby1, zapewnić odporność na herbicydy2, zapewnić suszę3,4 i tolerancję na sól5, zapobiec roślinożerności6, zwiększyć plony biomasy7 i zmniejszyć oporność ścian komórkowych8. Trend ten został wsparty przez rozwój nowych narzędzi molekularnych do generowania roślin transgenicznych, w tym edycji genomu za pomocą CRISPR i TALENs9 oraz wyciszania genów za pomocą dsRNA10, miRNA11 i siRNA12. Chociaż technologie te uprościły wytwarzanie roślin transgenicznych, stworzyły również wąskie gardło, w wyniku którego sama liczba generowanych roślin transgenicznych nie może być przesiewana przy użyciu tradycyjnych systemów, które opierają się na regeneracji roślin. W związku z tym wąskim gardłem, podczas gdy konstrukty wyciszające i edytujące genom mogą być szybko wprowadzane do roślin, wiele docelowych cech nie daje pożądanego efektu, który często nie jest wykrywany, dopóki rośliny nie zostaną przeanalizowane w szklarni. W ramach tej pracy opracowaliśmy metodę szybkich, zautomatyzowanych, wysokoprzepustowych badań przesiewowych protoplastów roślinnych, w szczególności w celu rozwiązania obecnego wąskiego gardła we wczesnych badaniach przesiewowych dużej liczby celów edycji genomu i wyciszania genów.
Użycie protoplastów, w przeciwieństwie do nienaruszonych komórek roślinnych, ma kilka zalet dla rozwoju zautomatyzowanej platformy. Po pierwsze, protoplasty są izolowane po strawieniu ściany komórkowej rośliny, a gdy ta bariera już nie występuje, zwiększa się wydajność przemiany13. W nienaruszonych komórkach roślinnych istnieją tylko dwie dobrze znane metody transformacji: biolistyczna14 i transformacja za pośrednictwem Agrobacterium15. Żadnej z tych metod nie można łatwo przełożyć na platformy do obsługi cieczy, ponieważ biolistyka wymaga specjalistycznego sprzętu do transformacji, podczas gdy transformacja za pośrednictwem Agrobacterium wymaga kohodowli, a następnie usunięcia bakterii. Żaden z nich nie jest podatny na metody o wysokiej przepływności. W przypadku protoplastów transformacja jest rutynowo przeprowadzana przy użyciu transfekcji16 za pośrednictwem glikolu polietylenowego (PEG), która wymaga jedynie kilku wymian roztworu i idealnie nadaje się do stosowania na platformach do obsługi cieczy. Po drugie, protoplasty z definicji są hodowlami jednokomórkowymi, a zatem problemy związane z zbrylaniem się i tworzeniem łańcuchów w kulturach komórek roślinnych nie są obserwowane w protoplastach. Jeśli chodzi o szybkie badania przesiewowe przy użyciu spektrofotometru płytkowego, zlepianie się komórek lub komórek w wielu płaszczyznach doprowadzi do trudności w uzyskaniu spójnych pomiarów. Ponieważ protoplasty są również gęstsze niż ich pożywki hodowlane, osadzają się na dnie studzienek, tworząc monowarstwę, co sprzyja spektrofotometrii płytkowej. Wreszcie, podczas gdy hodowle zawiesiny komórek roślinnych pochodzą głównie z kalusa17, protoplasty można zbierać z wielu tkanek roślinnych, co prowadzi do możliwości identyfikacji ekspresji specyficznej dla tkanki. Na przykład możliwość analizy ekspresji genu specyficznej dla korzeni lub liści może być bardzo ważna dla przewidywania fenotypu. Z tych powodów protokoły opracowane w tej pracy zostały zweryfikowane przy użyciu protoplastów wyizolowanych z powszechnie stosowanej kultury zawiesiny tytoniu (Nicotiana tabacum L.) "Bright Yellow" 2 (BY-2).
Kultura zawiesiny BY-2 została opisana jako komórka "HeLa" wyższych roślin, ze względu na jej wszechobecne zastosowanie w analizie molekularnej komórek roślinnych18. Ostatnio komórki BY-2 zostały wykorzystane do badania wpływu stresorów roślinnych19-22, wewnątrzkomórkowej lokalizacji białek23,24 i podstawowej biologii komórki25-27, wykazując szerokie zastosowanie tych kultur w biologii roślin. Dodatkową zaletą kultur BY-2 jest możliwość synchronizacji kultur z afidikoliną, co może prowadzić do zwiększonej odtwarzalności w badaniach ekspresji genów28. Ponadto opracowano metody ekstrakcji protoplastów BY-2 przy użyciu tanich enzymów29,30, ponieważ enzymy tradycyjnie stosowane do wytwarzania protoplastów są zbyt kosztowne w przypadku systemów o wysokiej przepustowości. W związku z tym opisany poniżej protokół został zwalidowany przy użyciu hodowli zawiesinowej BY-2, ale powinien on być możliwy do zmiany w każdej hodowli zawiesiny komórek roślinnych. Eksperymenty potwierdzające słuszność koncepcji są przeprowadzane przy użyciu genu reporterowego (pporRFP) pomarańczowego białka fluorescencji (OFP) z twardego koralowca Porites porites31 pod kontrolą promotora CAMV 35S.

<table><tbody><tr><td>Orbitor RS Microplate mover</td><td>Thermo Scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Bravo Liquid Handler</td><td>Agilent</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Synergy H1 Multi-mode Reader</td><td>BioTek</td><td></td><td></td></tr><tr><td>MultiFlo FX Multi-mode Dispenser</td><td>BioTek Teleshake</td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td>Inheco</td><td>3800048</td><td></td></tr><tr><td>CPAC Ultraflat Heater/cooler</td><td>Inheco</td><td></td><td></td>7000190</tr><tr><td>Vworks Automation Software</td><td>Agilent</td><td></td><td>Software służące do sterowania i pisania protokołów dla Agilent Bravo</td></tr><tr><td>Momentum Software</td><td>Thermo Scientific</td><td></td><td>Oprogramowanie do planowania zadań do sterowania Orbiter RS</td></tr><tr><td>Liquid Handling Control 2.17 Oprogramowanie</td><td>Biotek</td><td></td><td>używane do sterowania i zapisu protokołów dla</td></tr><tr><td>mikroskopu odwróconego MultiFlo FX IX81</td><td>Kamera mikroskopowa Olympus</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Zyla 3-Tap</td> Zestaw filtrów <td>Andor</td><td></td><td></td></tr><tr><td>ET-CY3/TRITC</td><td>Chroma Technology Corp</td><td>49004</td><td></td></tr><tr><td>Rohament CL</td> AB <td>Butelka na próbkę</td><td>enzymów</td><td>tania celulaza</td></tr><tr><td>Rohapect UF</td> AB <td>Butelka na próbkę</td><td>enzymów</td><td>Tanie pestynazy</td></tr><tr><td>Rohapect 10L</td><td>AB Butelka</td><td>na próbkę enzymów</td><td>tania pektynaza/arabinaza</td></tr><tr><td>Linsmaier & Skoog Basal Medium</td><td>Phytotechnology Laboratories</td><td>L689</td><td></td></tr><tr><td>Kwas 2,4-dichlorofenoksyoctowy</td><td>Laboratoria Fitotechnologiczne</td><td>D295</td><td></td></tr><tr><td>jodek propidyny</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P4170</td><td></td></tr><tr><td>Poli(glikol etylenowy) 4000</td><td>Sigma Aldrich</td><td>95904-250G-F</td><td>Dawniej Fluka PEG</td></tr><tr><td>Jodek propidium</td><td>Fisher Scientific</td><td>25535-16-4</td><td>Acros Organics</td></tr><tr><td>CaCl2</td><td>Sigma Aldrich</td><td>C7902-1KG</td><td></td></tr><tr><td>Octan sodu</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP333-500</td><td></td></tr><tr><td>Mannitol</td><td>Sigma Aldrich</td><td>M1902-1KG</td><td></td></tr><tr><td>Sacharoza</td><td>Fisher Scientific</td><td>S5-3</td><td></td></tr><tr><td>KH2PO4</td><td>Fisher Scientific</td><td>AC424205000</td><td></td></tr><tr><td>KOH</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P1767</td><td></td></tr><tr><td>Gelzan CM</td><td>Sigma Aldrich</td><td>G1910-250G</td><td></td></tr><tr><td>Płytka 6-dołkowa</td><td>Thermo Scientific 103184</td><td></td><td></td></tr><tr><td>96-dołkowa 1,2 ml płytka głębinowa</td><td>Thermo Scientific</td><td>AB-0564</td><td></td></tr><tr><td>96-dołkowa optyczna płyta dolna</td><td>Thermo Scientific</td><td>165305</td><td></td></tr><tr><td>Finntip 1000 Końcówki do pipet o szerokim otworze</td><td>Thermo Scientific</td><td>9405 163</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP358-10</td><td></td></tr><tr><td>KCl</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P4504-1KG</td><td></td></tr><tr><td>MES</td><td>Fisher Scientific</td><td>AC17259-5000</td><td></td></tr><tr><td>MgCl2</td><td>Fisher Scientific</td><td>M33-500</td><td></td></tr></tbody></table>

zrobotyzowana platforma do wysokowydajnej izolacji i transformacji protoplastów

A Robotic Platform for High-throughput Protoplast Isolation and Transformation

W ciągu ostatniej dekady nastąpiło odrodzenie użycia protoplastów roślinnych, które obejmują różne gatunki modelowe, do analizy szlaków transdukcji sygnału, transkrypcyjnych sieci regulacyjnych, ekspresji genów, edycji genomu i wyciszania genów. Ponadto poczyniono znaczne postępy w regeneracji roślin z protoplastów, co spowodowało jeszcze większe zainteresowanie wykorzystaniem tych systemów w genomice roślin. W ramach niniejszej pracy opracowano protokół automatyzacji izolacji i transformacji protoplastów z kultury zawiesiny tytoniu "Bright Yellow" 2 (BY-2) przy użyciu platformy robotycznej. Procedury transformacji poddano walidacji przy użyciu genu reporterowego pomarańczowego białka fluorescencyjnego (OFP) (pporRFP) pod kontrolą promotora 35S wirusa mozaiki kalafiora (35S). Ekspresję OFP w protoplastach potwierdzono za pomocą mikroskopii epifluorescencyjnej. Analizy objęły również metody efektywności produkcji protoplastów z wykorzystaniem jodku propidyny. Wreszcie, do procedury izolacji protoplastów wykorzystano tanie enzymy spożywcze, omijając potrzebę stosowania enzymów klasy laboratoryjnej, które są zbyt kosztowne w przypadku wysokowydajnej automatycznej izolacji i analizy protoplastów. W oparciu o protokół opracowany w tej pracy, całą procedurę od izolacji protoplastów do transformacji można przeprowadzić w czasie krótszym niż 4 godziny, bez żadnego wkładu ze strony operatora. Chociaż protokół opracowany w ramach tej pracy został zwalidowany za pomocą hodowli komórkowej BY-2, procedury i metody powinny być możliwe do przełożenia na dowolny system hodowli zawiesiny roślinnej/protoplastów, co powinno umożliwić przyspieszenie badań nad genomiką roślin.

W niniejszym badaniu czas podwojenia BY-2 wynosił od 14 do 18 h w zależności od temperatury inkubacji kultur, co jest zgodne z wcześniejszymi doniesieniami o średniej długości cyklu komórkowego wynoszącej 15 h. Przy takim czasie podwojenia do zainicjowania kultur zastosowano inokulum w stosunku 1:100, co doprowadziło do uzyskania kultur o objętości skompresowanych komórek (PCV) 50% w ciągu 5–7 dni. W obecnym protokole, w którym kultury hodowano w 200 ml pożywki, w ciągu 7 dni uzyskano PCV...

Opisana jest wysokoprzepustowa, zautomatyzowana metodologia produkcji i przetwarzania protoplastów tytoniu. Zrobotyzowany system umożliwia masowo równoległą ekspresję i odkrywanie genów w modelowym systemie BY-2, które powinno być możliwe do przełożenia na uprawy niemodelowe.

Zrobotyzowana platforma do wysokowydajnej izolacji i transformacji protoplastów

Over the last decade there has been a resurgence in the use of plant protoplasts that range from model species to crop species, for analysis of signal ...

Ogólnym celem niniejszego protokołu jest opracowanie metody szybkiego, zautomatyzowanego wysokoprzepustowego przesiewu protoplastów roślinnych, w szczególności w celu rozwiązania obecnego problemu wąskiego gardła przy wczesnym przesiewie dużej liczby celów edycji genomu i wyciszania genów. Metoda ta może pomóc w odpowiedzi na kluczowe pytania z zakresu biotechnologii roślin. Główną zaletą tej techniki jest to, że umożliwia ona wysokoprzepustową, zautomatyzowaną produkcję i transformację protoplastów do szybkiego równoległego przesiewu funkcji promotora w ekspresji genów.Procedurę tę zaprezentowano na przykładzie powszechnie stosowanej hodowli zawiesinowej tytoniu odmiany bright yellow two, czyli BY-2. Rozpocznij od wyhodowania kultury BY-2 w kolbie Erlenmeyera, zgodnie z opisem w tekście protokołu. W dniu izolacji protoplastów dokładnie wymieszaj kulturę, ponieważ komórki szybko osiadają, a następnie przenieś 6 ml kultury do 15 ml probówki do wirowania z stożkowym dnem.Pozostawić komórki do opadnięcia na co najmniej 10 minut. Dostosować objętość osadu komórkowego do 50% objętości całkowitej poprzez usunięcie odpowiedniej ilości supernatantu. Wymieszać zawartość probówki, odwracając ją, a następnie za pomocą pipet o szerokim wlocie przenieść 500 µL zawiesiny komórkowej do każdej studni płytki sześciostudniowej w celu przeprowadzenia trawienia.Pierwszym krokiem w tej procedurze jest włączenie wszystkich komponentów systemu robotycznego, czyli przenośnika mikropłytek, systemu do dozowania cieczy, wielofunkcyjnego czytnika płytek, wielofunkcyjnego dyspensera, podgrzewacza lub chłodniczki do płytek oraz komputerów. Następnie należy uruchomić oprogramowanie do planowania zadań przenośnika płytek, które integruje przenośnik mikropłytek z pozostałym sprzętem, umożliwiając przenoszenie płytek między poszczególnymi urządzeniami. W oprogramowaniu przenośnika płytek należy zdefiniować specyfikacje techniczne dla naczyń laboratoryjnych użytych w protokole.Kliknij Setup na głównym pasku narzędzi i wybierz polecenie Manage Container Types. Wybierz odpowiedni Typ Pojemnika (Container Type) z listy istniejących Typów Pojemników. Zdefiniuj specyfikacje techniczne dla wszystkich elementów wyposażenia laboratoryjnego, z którymi będzie stykać się przenośnik płytek.Kolejnym krokiem jest zdefiniowanie pozycji początkowej i końcowej dla każdego pojemnika. Kliknij kartę Start/End w konkretnym protokole. Wybierz pozycję początkową każdego pojemnika i zaznacz pole Lidded (z pokrywką) lub Unlidded (bez pokrywki) zarówno dla pozycji początkowej, jak i końcowej.Po zdefiniowaniu pozycji początkowej i końcowej dla każdego elementu wyposażenia laboratoryjnego, ręcznie umieść wszystkie płytki w pozycji startowej dla całego procesu. Włóż 96-dołkowe płytki do przesiewania fluorescencyjnego do hotelu dwa, płytki 6-dołkowe z komórkami BY-2 do hotelu trzy, 96-dołkową płytkę głęboką, która będzie wykorzystywana do transformacji, na gniazdo dwa podgrzewacza lub chłodziarki do płytek, a 50 mililitrową probówkę stożkową zawierającą roztwór enzymu na dyspenser wielofunkcyjny. Aby przeprowadzić transformację w protokole, należy uprzednio napełnić każdy dołek płytki 96-dołkowej głębokiej 10 mikrolitrami plazmidowego DNA zawierającego konstrukt reporterowy białka fluorescencyjnego o barwie pomarańczowej i inkubować na podgrzewaczu lub chłodziarce do płytek w temperaturze czterech stopni Celsjusza.Umieść wszystkie materiały i płytki na zautomatyzowanej platformie do dozowania cieczy w wyznaczonych miejscach. W pierwszej kolumnie umieść płytkę 96-dołkową, w której każdy dołek zawiera 200 µL 40% roztworu glikolu polietylenowego. W gnieździe ósmym umieść pudełko z końcówkami do pipet.Aby zdefiniować położenie każdego elementu w oprogramowaniu platformy do zautomatyzowanego dozowania cieczy, wybierz Tools z menu i kliknij Labware Editor. Wybierz rodzaj sprzętu laboratoryjnego z menu rozwijanego. Wybierz kartę Main Protocol i kliknij Configure Labware, aby zdefiniować pozycję każdego elementu sprzętu laboratoryjnego.Kliknij Run, aby zainicjować wszystkie urządzenia, które będą wykorzystywane w protokole. Na koniec, w oknie Work Explorer, kliknij Add Work Unit, aby zweryfikować wszystkie naczynia laboratoryjne w systemie i rozpocząć zautomatyzowany protokół. Najbardziej krytycznym etapem procedury jest transformacja protoplastów.Ponieważ transformacja jest przeprowadzana przez system robotyczny, kluczowe jest prawidłowe skonfigurowanie protokołów automatycznych. Na potrzeby tego filmu zaprezentowano jedynie wybrane kroki w protokołach automatycznych. Podczas protokołu transformacji zautomatyzowana platforma do obsługi cieczy pobiera 70 µL roztworu protoplastów z płytki 6-dołkowej i dozuje go do płytki 96-dołkowej w gnieździe sześć.Następnie, przy użyciu nowych końcówek do pipety, powoli aspiruje się 70 µL wysokolepki roztworu glikolu polietylenowego z wcześniej napełnionej płytki głębokich dołków i całkowicie dozuje roztwór do odpowiednich dołków płytki głębokich dołków. Następnie zautomatyzowana platforma do obsługi cieczy przenosi płytkę głębokich dołków z gniazda sześć do gniazda dziewięć, gdzie przenośnik płytek pobiera ją i przenosi do stacji wstrząsania, w której jest ona wstrząsana z prędkością 1500 RPM przez 30 sekund. Po 20-minutowej inkubacji bez wstrząsania w celu wyrównania stanu protoplastów, przenośnik przenosi 96-dołkową płytkę głębokich dołków do dozownika wielofunkcyjnego i uruchamia protokół płukania.Po zakończeniu zautomatyzowanego protokołu izolacji i transformacji protoplastów, wyjmij płytkę z transformowanymi protoplastami z pierwszego hotela systemu robotycznego. Włącz mikroskop odwrócony, kamerę oraz lampę fluorescencyjną. Wybierz obiektyw 10X do wstępnego ustawienia ostrości na protoplastach.Włącz lampę halogenową i zamknij migawkę lampy fluorescencyjnej. Umieść płytkę w systemie mikroskopowym i ustaw ostrość na protoplasty, korzystając z pola jasnego. Następnie wyłącz żarówkę halogenową i otwórz migawkę lampy fluorescencyjnej.Wybierz zestaw filtrów Cy3/TRITC do wizualizacji pomarańczowego białka fluorescencyjnego ekspresowanego przez transgeniczne protoplasty. Zeskanuj każdą studzienkę, aby określić liczbę protoplastów ekspresujących marker fluorescencyjny. Trawienie enzymatyczne protoplastów w warunkach określonych w niniejszym protokole doprowadziło do uzyskania 2 820 000 protoplastów na płytkę sześciodołkową.Oceniono ubytek stężenia protoplastów po każdym etapie przenoszenia w protokole. Po zakończeniu protokołu trawienia do każdej studzienki 96-dołkowych płytek głębokich przeniesiono 11 500 protoplastów. Po zakończeniu protokołu transformacji do 96-dołkowej płytki do przesiewania fluorescencyjnego przeniesiono 1 230 protoplastów.Aby upewnić się, że wielokrotne etapy pipetowania nie uszkodziły protoplastów, ich żywotność oceniono za pomocą barwienia jodkiem propidyny. Wyniki nie wykazały istotnych różnic w żywotności po trawieniu, po przeniesieniu na 96-dołkową płytkę do przesiewu fluorescencyjnego oraz po protokole transformacji. Protokół transformacji pozwolił na uzyskanie komórek transgenicznych wykazujących ekspresję pomarańczowego białka fluorescencyjnego, choć wydajność transformacji była niska i wynosiła zaledwie około 2%. Wynika to z zastosowania dużego plazmidu binarnego oraz faktu, że protokół nie został zoptymalizowany specjalnie dla protoplastów BY-2.Parametry uzyskane dla przebiegu czasowego protokołu wykazały, że największa część czasu jest poświęcana na etap trawienia. Całkowity czas izolacji i transformacji protoplastów wyniósł trzy godziny, 50 minut i 53 sekundy, bez konieczności interwencji operatora. Po odpowiednim przygotowaniu technika ta może być wykonywana przez robota w czasie krótszym niż cztery godziny.Po opracowaniu, technika ta toruje drogę badaczom w dziedzinie biotechnologii roślin do przeprowadzania wysokoprzepustowych procedur genomicznych w uprawach, takich jak edycja genomu i screening promotorów.

a-robotic-platform-for-high-throughput-protoplast-isolation

Research

JoVE Journal

Genetics

Genetyka

Opisano prostą i wydajną metodę transformacji protoplastów Physcomitrella pantens. Metoda ta została zaadaptowana z protokołów transformacji protoplastów protonemialnych Physocmitrella oraz protoplastów mezofilu Arabidopsis1.

Efektywna transformacja mchu Physcomitrella patens za pomocą glikolu polietylenowego (PEG)

W niniejszym opracowaniu opisujemy badanie przesiewowe nadekspresji plazmidowej w Saccharomyces cerevisiae, z wykorzystaniem ułożonej w matrycy biblioteki plazmidów oraz wysokoprzepustowego protokołu transformacji drożdży z użyciem robota do obsługi cieczy.

Wysokoprzepustowy screening nadekspresji plazmidowej w drożdżach

Opisano wysokoprzepustową, zautomatyzowaną platformę rozwoju linii komórkowych do produkcji białkowych leków terapeutycznych. Wdrożenie sortera komórek BD FACS Aria, obrazownika CloneSelect Imager oraz systemu do obsługi cieczy TECAN Freedom EVO wykazało znaczące zwiększenie wydajności przetwarzania w procesie rozwoju linii komórkowych, przy jednoczesnej poprawie jakości linii komórkowych i wysokiej powtarzalności.

Wysokoprzepustowa zautomatyzowana platforma do opracowywania linii komórkowych produkcyjnych dla białkowych produktów terapeutycznych

Niniejszy artykuł opisuje transformację genetyczną jednokomórkowej morskiej algi Ostreococcus tauri za pomocą elektroporacji. Ten organizm eukariotyczny stanowi efektywną platformę modelową dla roślin wyższych, posiadając znacznie zredukowaną złożoność genomową i komórkową oraz będąc łatwo podatnym na hodowlę komórkową i biologię chemiczną.

Transformacja genomiczna piko-eukarionta Ostreococcus tauri

Opisujemy metodę oczyszczania białek rekombinowanych z użyciem znaczników powinowactwa przy wykorzystaniu robotyki do obsługi cieczy. Metoda ta znajduje ogólne zastosowanie w małoscale’owym oczyszczaniu rozpuszczalnych białek z znacznikiem His w formacie wysokoprzepustowym.

Wysokoprzepustowe oczyszczanie rekombinowanych białek z markerami powinowactwa

Tutaj prezentowany jest zautomatyzowany przepływ pracy do wykonywania modułowego montażu "urządzenia" DNA przy użyciu modułowej metody klonowania DNA na robotach obsługujących ciecze. Protokół wykorzystuje intuicyjne narzędzie programowe do generowania list wyboru osób zajmujących się cieczami do kombinatorycznego generowania biblioteki urządzeń DNA, które demonstrujemy za pomocą dwóch platform do obsługi cieczy.

Zautomatyzowany zrobotyzowany montaż modułowych urządzeń DNA do obsługi cieczy

Opracowaliśmy prosty i efektywny protokół do przygotowania dużych ilości protoplastów soi do badania złożonych mechanizmów regulacyjnych i sygnalizacyjnych w żywych komórkach.

Prosta metoda izolacji protoplastów soi i zastosowanie do analiz przejściowej ekspresji genów

Tutaj opisujemy protokół ekspresji białek do protoplastów za pomocą metody transformacji za pośrednictwem PEG. Metoda ta zapewnia łatwą ekspresję białek będących przedmiotem zainteresowania oraz efektywne badanie lokalizacji białek i procesu importu dla różnych warunków eksperymentalnych in vivo.

Badanie importu białek do chloroplastów przy użyciu protoplastów

Tutaj prezentujemy protokół o wysokiej przepustowości do przejściowego transfekcji milionów protoplastów kukurydzy do testowania dużych bibliotek plazmidów w komórkach mezofilu kukurydzy.

Skalowalna transfekcja protoplastów mezofilu kukurydzy

Opisujemy użycie multipleksowanej platformy ekspresji genów o wysokiej przepustowości, która określa ilościowo ekspresję genów poprzez kodowanie kreskowe i liczenie cząsteczek w substratach biologicznych bez potrzeby amplifikacji. Wykorzystaliśmy platformę do ilościowego określenia ekspresji mikroRNA (miRNA) we krwi pełnej u osób z zespołem jelita drażliwego i bez niego.

Zaburzenia krążących miRNA w zespole jelita drażliwego wykryte za pomocą multipleksowanej platformy ekspresji genów o wysokiej przepustowości

Poznaj zrobotyzowaną metodę izolacji i transformacji protoplastów BY-2 w celu szybkiego przesiewania genów. To podejście usprawnia badania ekspresji genów w biotechnologii roślinnej.

Zrobotyzowana platforma do wysokowydajnej izolacji i transformacji protoplastów

Przeglądaj więcej filmów