Podejście chirurgiczne do niedrożności tętnicy środkowej mózgu i udaru wywołanego reperfuzją u myszy

Ogólnym celem metody Longa jest odtworzenie niedokrwienia u nasady tętnicy środkowej mózgu lub MCA, ponieważ udary niedokrwienne u ludzi najczęściej występują z powodu niedrożności MCA. Metoda ta może pomóc nam odpowiedzieć na kluczowe pytania w dziedzinie udaru mózgu, takie jak znalezienie odpowiedniego celu terapeutycznego w leczeniu tej choroby. Główną zaletą metody Longa, w przeciwieństwie do technik alternatywnych, jest przeżywalność.

Dzięki tej technice następuje również wzrost interakcji leukocytów ze śródbłonkiem i objętości zawału. Tę procedurę zademonstruje Shantel Vital, kierownik mojego laboratorium. Po wywołaniu znieczulenia u samca myszy C57 Black Six zgodnie z protokołem tekstowym, monitoruj głębokość znieczulenia za pomocą uszczypnięcia stopy i nałóż sterylną maść do oczu, aby zapobiec wysuszeniu.

Następnie ogol szyję zwierzęcia. Umieść mysz w pozycji leżącej na macie o regulowanej temperaturze i włóż sondę doodbytniczą, aby monitorować i utrzymywać temperaturę ciała 36.5 plus minus 0.1 stopnia Celsjusza. Następnie użyj 70% alkoholu etylowego do dezynfekcji skóry.

Następnie za pomocą prostych nożyczek Iris wykonaj nacięcie w linii środkowej i cofnij tkanki miękkie, aby odsłonić naczynia. Za pomocą kleszczy Dumonta wypreparuj tętnicę szyjną wspólną (CCA) i tętnicę szyjną zewnętrzną (ECA) z otaczającej tkanki bez uszkadzania nerwu błędnego. Z jedwabiem 7-0 wykonaj tymczasowy szew, zawiązując luźny węzeł wokół CCA.

Następnie wykonaj stały szew wokół ECA i mniejszych naczyń wystających z niego, ściśle podwiązując naczynia. Teraz wykonaj szew wokół ECA proksymalnie do rozwidlenia CCA. Następnie umieść klips do mikronaczyń wokół tętnicy szyjnej wewnętrznej lub ICA i tętnicy skrzydłowo-podniebiennej lub PPA.

Za pomocą nożyczek sprężynowych do mikropreparowania wykonaj małe nacięcie w ECA jak najbliżej stałego szwu i włóż żyłkę monofilamentową o długości 180 mikrometrów z silikonową końcówką. Po włożeniu filamentu zaciśnij tymczasowy szew wokół ECA i zdejmij klips do mikronaczyń. Użyj nożyczek sprężynowych do mikropreparacji, aby przeciąć ECA między stałym szwem dystalnym a punktem wejścia włókna.

Przeprowadź filament przez ICA, aż wyczujesz opór w MCA. Zapoznaj się z dodatkowymi szczegółami w protokole tekstowym. Po 30-minutowym okresie okluzji usuń włókno za pomocą kleszczy Dumonta, aby delikatnie go odciągnąć i zabezpieczyć szew wokół otwartego końca ECA.

Usuń tymczasowy szew wokół CCA, ostrożnie poluzowując ligaturę, aby umożliwić wznowienie przepływu krwi przez CCA. Usuń retraktory, a następnie użyj ciągłego szwu chirurgicznego, aby zamknąć nacięcie. Wstrzyknij myszowi jeden mililitr soli fizjologicznej podskórnie w celu uzupełnienia objętości oraz z przeciwbólowym karprofenem w celu złagodzenia bólu i dyskomfortu związanego z zabiegiem chirurgicznym.

Obserwuj mysz przez cały okres rekonwalescencji po znieczuleniu w dedykowanej klatce podgrzanej do 30 stopni Celsjusza i umieść rozgniecioną karmę na szalce Petriego na podłodze klatki, aby zachęcić ją do jedzenia. Korzystając z 18-punktowego systemu punktacji, neurologicznie oceń myszy po odpowiednim okresie reperfuzji, oceniając wyniki ogólne, motoryczne, czuciowe i propriocepcyjne. Wyższy wynik neurologiczny odpowiada obniżeniu funkcji neurologicznych.

Aby zmierzyć objętość zawału otrębów, po wywołaniu znieczulenia i monitorowaniu głębokości zgodnie z protokołem tekstowym, umieść mysz w pozycji leżącej i użyj prostych nożyczek Iris, aby przeciąć skórę od brzucha do szyi przed przecięciem otrzewnej. Za pomocą kleszczy Dumonta podnieś mostek i przetnij żebra. Następnie użyj dwóch par hemostatów, aby otworzyć lewą i prawą stronę klatki piersiowej, odsłaniając serce.

Włóż igłę o rozmiarze 26 dołączoną do pięciomilimetrowej strzykawki do lewej komory i przetnij prawy przedsionek. Następnie za pomocą normalnej soli fizjologicznej w temperaturze pokojowej lub PBS należy perfundować serce, aż płyn stanie się przezroczysty. Za pomocą prostych nożyczek i kleszczy Iris usuń głowę zwierzęcia i ostrożnie usuń mózg z czaszki.

Następnie za pomocą żyletki odetnij opuszkę węchową i móżdżek, aby mózg zmieścił się w matrycy. Po schłodzeniu matrycy umieść mózg w środku i ustaw go na lodzie. Następnie za pomocą żyletki wykonaj pierwsze cięcie w mózgu dwa milimetry od góry i pozostaw ostrze na miejscu.

Za pomocą drugiej żyletki wykonaj kolejne dwumilimetrowe cięcie za pierwszą. Następnie wyjmij pierwszą żyletkę z dołączoną chusteczką. Powtarzaj ten proces, aż cała tkanka zostanie pokrojona.

Umieść każdy segment w kolejności, w jakiej zostały pocięte, w jednym dołku 24-dołkowej płytki zawierającej 2% chlorku dwu-, trzech, pięciu trifenylotetrazoliowych lub TTC, i umieść płytkę w płytkiej łaźni wodnej o temperaturze 37 stopni Celsjusza na 20 minut. Po inkubacji przez 10 minut odwróć plastry. Następnie umieść niewielką ilość 10% formaliny w dołkach nowej 24-dołkowej płytki i przenieś segmenty do dołków formaliny w kolejności, w jakiej zostały pocięte.

Po zeskanowaniu segmentów do komputera użyj oprogramowania do analizy ImageJ, aby przeanalizować rozmiar zawału jako procent całego wycinka mózgu, obrysowując obszar zawału w celu wygenerowania pomiaru powierzchni. Następnie zmierz całą półkulę przeciwległą, aby określić obszar. Na koniec podziel obszar zawału przez obszar półkuli przeciwległej i pomnóż go przez 100, aby określić objętość zawału.

Jak pokazano tutaj, laserowa przepływomierz dopplerowska została użyta do potwierdzenia perfuzji przepływu krwi na terytorium MCA przed i po reperfuzji MCA. Kiedy tymczasowy krawat CCA zostaje zwolniony po 30 minutach niedokrwienia w celu usunięcia włókna i reperfuzji, następuje gwałtowny wzrost perfuzji, który osiągnął nieco poniżej 100% perfuzji wyjściowej po pięciu minutach reperfuzji. W tej tabeli przedstawiono wyniki neurologiczne dotyczące oceny deficytów ogólnych, czuciowych, motorycznych i proprioceptywnych.

Ten wykres ilustruje, że wynik dla 27 myszy po 24 godzinach wynosił 12,56 plus minus 0,7 i pozostał wysoki tydzień później na poziomie 11,50 plus minus 1,5. Wyższy wynik neurologiczny oznacza obniżoną funkcję neurologiczną. Objętość zawału wykazywała podobne wzorce do wyniku neurologicznego po 24 godzinach.

Jak pokazano tutaj, 24 godziny po MCAo, myszy miały duże objętości zawału, które zwiększyły się tydzień po udarze. Po opanowaniu tej techniki można ją wykonać w ciągu 15 minut, jeśli zostanie wykonana prawidłowo. Podczas wykonywania tej procedury ważne jest, aby utrzymać temperaturę na poziomie 36,5 stopnia Celsjusza.

Po tej procedurze można również wykonać inne metody, takie jak podwiązanie i nakłucie jelita ślepego. Dzięki temu możemy odpowiedzieć na dodatkowe pytania, takie jak skutki sepsy przed i po udarze. Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak wywołać niedokrwienie, wkładając monofilament do środkowej tętnicy mózgowej i usuwając go, aby umożliwić reperfuzję.

Nie zapominaj, że praca z przyrządami, takimi jak nożyczki do tęczówki i kleszcze, może być niebezpieczna i zawsze należy zachować środki ostrożności.