Name: Obrazowanie oczyszczonych serc embrionalnych i pourodzeniowych w rozdzielczości pojedynczej komórki (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-10-07T13:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 30 s
Description: Poznaj metodę obrazowania komórek z fluorescencyjnymi białkami w nienaruszonych sercach embrionalnych i pourodzeniowych w rozdzielczości pojedynczej komórki. Protokół łączy techniki przezroczystości tkanek z barwieniem całych preparatów, umożliwiając szczegółową analizę funkcji genów podczas rozwoju serca.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dziękujemy członkom laboratorium M.W. za naukową dyskusję. Praca ta jest wspierana przez AHA [13SDG16920099] dla M.W. oraz przez granty National Heart, Lung, and Blood Institute [R01HL121700] dla M.W. Obrazy zostały wykonane w Imaging Core Facility w Albany Medical College.

Wszystkie eksperymenty na zwierzętach zostały zatwierdzone przez Instytucjonalny Komitet ds. Opieki i Użytkowania Zwierząt (IACUC) w Albany Medical College i przeprowadzone zgodnie z Przewodnikiem NIH dotyczącym opieki i użytkowania zwierząt laboratoryjnych.
1. Przygotowanie roztworu
UWAGA: Linie myszy Rosa26CreERT2 15, R26R-Confetti16, αMHC-Cre17 i Rosa26-mTmG (mTmG)20 zostały zakupione komercyjnie. cTnT-Cre18 był prezentem od dr Jiao z University of Alabama. Nfatc1-Cre był prezentem od dr Bin Zhou z Albert Einstein College of Medicine19. Myszy zostały poddane eutanazji poprzez wdychanie dwutlenku węgla w zamkniętej komorze przez co najmniej 60 sekund, a następnie fizyczną weryfikację zgonu poprzez obustronną torakotomię, dekapitację lub zwichnięcie szyjki macicy.
<ol>
	<li>Przygotować tamoksyfen. Rozpuścić 10 mg tamoksyfenu w 10 ml oleju z nasion słonecznika. Po całkowitym rozpuszczeniu podwielokrotność należy rozdzielić i przechowywać w temperaturze -20 °C.</li>
	<li>Przygotować sól fizjologiczną buforowaną fosforanami (PBS). Rozpuścić Na2HPO4 (1,41960 g), KH2PO4 (0,24496 g), NaCl (8,0669 g) i KCl (0,20129 g) w 1 l wody destylowanej i dostosować pH do 7,4.</li>
	<li>Przygotować PBST: 0,1% roztwór Tween-20 w PBS, rozpuszczając 100 μl Tween-20 w 100 ml PBS.</li>
	<li>Przygotuj bufor blokujący. Przygotować 3% roztwór blokujący albuminę surowicy bydlęcej (BSA), rozpuszczając 3 g BSA w 100 ml PBST zawierającego 0,2% Tween-20.</li>
	<li>Przygotować CUBIC-1 (odczynnik 1). Zmieszać 25% wag. mocznika, 25% wag. N, N, N', N'-tetrakis (2-hydroksypropylo)etylenodiaminy i 15% wag. Triton X-100 w dH2O.</li>
	<li>Przygotować CUBIC-2 (odczynnik 2). Zmieszać 50% wag. sacharozy, 25% wag. mocznika, 10% wag. 2, 2′, 2′'-nitrylotriotrietanolu i 0,1% (v/v) Triton X-100 w dH2O.</li>
	<li>Przygotować Scale A2: 4 M mocznik, 10% w/v glicerolu i 0,1% w/v Triton X-100 w dH2O. Dostosować pH do 7,7.</li>
	<li>Przygotować Scale B4: 8 M mocznika i 0,1% w/v Triton X-100 w dH2O. Dostosować pH do 8,7.</li>
	<li>Przygotuj Scale 70: 4 M mocznik, 70% w/v glicerolu i 0,1% w/v Triton X-100 w dH2O.</li>
</ol>
2. Indukcja tamoksyfenu, izolacja i utrwalanie zarodka
<ol>
	<li>Indukcja tamoksyfenu i izolacja zarodków
	<ol>
		<li>Korzystając z protokołu zatwierdzonego przez zakrzywioną rurkę do karmienia (ACUP 13-12007), należy podać samicom myszy R26CreERT2 Confetti (podłączonym przez samce myszy R26CreERT2) 10 μg/g tamoksyfenu w dniu rozwoju embrionalnego E7.7533. W 9,5 (E9,5) lub 10,5 dniu embrionalnym poddać eutanazji samice myszy z CO2 i zwichnięciem szyjki macicy.</li>
		<li>Po stwierdzeniu zgonu myszy (patrz punkt 1 Uwaga), otwórz jamę brzuszną myszy nożyczkami i wypreparuj róg macicy, usuń warstwy jajowodu za pomocą nożyczek i pęsety i uwolnij zarodki z jajowodu23,24.
		<ol>
			<li>Przenieść zarodki na szalkę Petriego zawierającą PBS (pH 7,4). Pod mikroskopem preparacyjnym usuń warstwy nieembrionalne (kosmówkę, woreczek żółtkowy i owodnię) za pomocą pęsety.</li>
		</ol>
		</li>
		<li>Za pomocą pęsety i nożyczek zbierz próbki samicy myszy i ogona zarodka do genotypowania, jak wcześniej zgłoszono22. Za pomocą plastikowej pipety przenieść każdy zarodek do dołka z 48-dołkową płytką zawierającą 1 ml 1x PBS.</li>
		<li>Pod mikroskopem fluorescencyjnym zidentyfikuj zarodki dodatnie GFP/RFP/CFP za pomocą mikroskopu odwróconego z kamerą. Oderwij osierdzie za pomocą pęsety i obróć serce/zarodek za pomocą zakrzywionej pęsety, aby określić liczbę fluorescencyjnych klonów po obu stronach serca za pomocą filtrów GFP/RFP/CFP. Nie są potrzebne żadne cięcia.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Po zidentyfikowaniu zarodków GFP/RFP/CFP dodatnich, szybko umyj zarodki dwukrotnie (po 2 minuty) 1x PBS w 48-dołkowej płytce na wytrząsarce w temperaturze pokojowej (RT). To usunie nadmiar krwi.</li>
	<li>Unieruchomić zarodek/serce zarodka za pomocą 4% paraformaldehydu (PFA) w temperaturze pokojowej. Czas utrwalenia zależy od wieku zarodka i wielkości tkanki. W przypadku E9.5 utrwalić zarodek na 2 godziny w RT. Zarodki w późnym stadium embrionalnym wymagają dłuższego czasu utrwalenia, który może być nawet wydłużony do 24 godzin w przypadku serca po urodzeniu. 
	UWAGA: Paraformaldehyd jest toksyczny, należy unikać kontaktu ze skórą, oczami i błonami śluzowymi.</li>
	<li>Po utrwaleniu umyj zarodek/serce na płytce 48-dołkowej dwukrotnie (po 10 minut każda) 1x PBS na wytrząsarce do płytek w temperaturze pokojowej. To usuwa nadmiar PFA z zarodka/serca. Zarodki są następnie dalej przetwarzane w celu barwienia całego wierzchowca i oczyszczenia tkanek.</li>
</ol>
3. Barwienie całego wierzchowca
UWAGA: Po utrwaleniu PFA zarodek/serce jest poddawane barwieniu całego wierzchowca w następujący sposób.
<ol>
	<li>Przepuszczalność zarodka/serca w 48-dołkowej płytce przy użyciu 1 ml 0,1% PBST przez 2 godziny na wytrząsarce płytkowej w temperaturze pokojowej.</li>
	<li>Po przeniknięciu zanurzyć zarodek/serce w 1 ml buforu blokującego na 2 godziny lub na noc na wytrząsarce płytkowej w temperaturze 4 °C.</li>
	<li>Zanurzyć zarodek/serce w przeciwciałie PECAM (CD31) specyficznym dla komórek śródbłonka, rozcieńczonym (1:100) w 0,3 ml buforze blokującym przez 48 godzin na wytrząsarce płytki w temperaturze 4 °C.</li>
	<li>Umyć zarodek/serce za pomocą PBST 5 razy, po 30 minut w temperaturze pokojowej na shakerze płytkowym. Powoduje to usunięcie nadmiaru nieswoistego związanego przeciwciała pierwszorzędowego z tkanki.</li>
	<li>Zanurz zarodek/serce w kozim przeciwciałie drugorzędowym przeciwko szczurom Alexa Fluor 647, rozcieńczonym (1:1,000) w 1 ml buforu blokującego przez 48 godzin na wytrząsarce płytkowej w temperaturze 4 ºC.</li>
	<li>Powtórz krok 3.4, aby umyć przeciwciało drugorzędowe.</li>
	<li>Po utrwaleniu zarodka/serca 4% PFA przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej na wytrząsarce płytkowej i przemyć dwukrotnie PBS po 5 minut.</li>
	<li>Zarodek/serce zabarwić jądrowym barwnikiem 4′,6-diamidino-2-fenyloindolowym (DAPI) (rozcieńczonym w PBST w stężeniu 0,01 mg/ml) przez 10 minut na wytrząsarce płytkowej w temperaturze pokojowej. Następnie wykonać dwa płukania PBS po 5 minut każde.</li>
</ol>
4. Oczyszczanie zarodka/serca metodą Scale lub metodą CUBIC
UWAGA: Po barwieniu całego wierzchowca, zarodek/serce jest poddawane metodzie oczyszczania tkanek metodą Scale lub CUBIC. Wybór metody zależy od wielkości tkanki i wieku zarodka. W przypadku zarodków w wieku E11,5 lub młodszym należy zastosować metodę oczyszczania tkanek Scale, natomiast w przypadku starszych zarodków lub serc po urodzeniu preferowana jest metoda oczyszczania tkanek CUBIC.
<ol>
	<li>Metoda oczyszczania tkanek w skali
	<ol>
		<li>Inkubować zarodek/serce z 1 ml roztworu Scale A2 w fiolce scyntylacyjnej (owiniętej folią aluminiową), od czasu do czasu delikatnie wstrząsając (ręcznie) przez 48 godzin w temperaturze 4 °C.</li>
		<li>Po inkubacji Scale A2 inkubować zarodek/serce z 1 ml roztworu Scale B4 w temperaturze 4 °C w tej samej fiolce, od czasu do czasu delikatnie wstrząsając przez kolejne 48 godzin.</li>
		<li>Inkubować zarodek/serce przez kolejne 48 godzin z 1 ml Scale 70 w temperaturze 4 °C, od czasu do czasu delikatnie wstrząsając. Zamontuj zarodek przy użyciu 90% glicerolu (patrz punkt 5.1).</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Metoda oczyszczania tkanek CUBIC
	<ol>
		<li>W celu oczyszczenia CUBIC całego zarodka/serca, zanurzyć każdy zarodek/serce w 1 ml CUBIC-1, od czasu do czasu delikatnie potrząsając przez 48 godzin w temperaturze 37 ºC7. Po 48 godzinach zastąpić roztwór tą samą objętością świeżego odczynnika CUBIC 1 i inkubować próbkę przez dodatkowe 48 godzin w temperaturze 37 °C, od czasu do czasu potrząsając ręką.</li>
		<li>Umyj serce/zarodek poddane działaniu CUBIC-1 kilkakrotnie 1x PBS w temperaturze pokojowej, delikatnie potrząsając ręką. Spowoduje to usunięcie nadmiaru roztworu CUBIC-1.</li>
		<li>Po wypłukaniu CUBIC-1 za pomocą PBS, zanurzyć zarodki/serca w roztworze CUBIC-2 (1 g na zarodek/serce) na 48 godzin w temperaturze 37 °C, od czasu do czasu delikatnie potrząsając ręką. Następuje to po zamontowaniu zarodka/serca za pomocą glicerolu (patrz punkt 5.2).</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
5. Montaż i obrazowanie próbki
UWAGA: Oczyszczone zarodki lub organy w roztworze Scale 70 lub CUBIC-2 mogą być obrazowane bezpośrednio za pomocą roztworu Scale 70 i CUBIC-2 jako medium do obrazowania. Biorąc jednak pod uwagę podatność próbek embrionalnych na odczynniki usuwające, jeśli próbki nie są natychmiast obrazowane, ale przechowywane przez długi czas, należy przechowywać próbki w 90% glicerolu zgodnie z poniższym protokołem.
<ol>
	<li>Bezpośrednio zanurzyć oczyszczoną próbkę w 1 ml 90% glicerolu i przechowywać w temperaturze 4 °C do czasu obrazowania.</li>
	<li>Przemyć próbkę poddaną działaniu CUBIC dwukrotnie 1x PBS po 5 minut i sekwencyjnie inkubować próbkę z 1 ml 30%, 50%, 70% i 90% roztworu glicerolu przez 30 minut.</li>
	<li>W celu obrazowania przenieś próbkę na szklaną płytkę Petriego z minimalną ilością 90% glicerolu i klony obrazowe za pomocą mikroskopu konfokalnego wyposażonego w dwie zdolności fotonowe.</li>
	<li>Wyobraź sobie serce lub zarodek w glicerolu za pomocą soczewki korekcyjnej 10X/0,3 NA, zanurzenia 25X/0,8 NA lub 40X/1,2 NA. Obraz DAPI wykorzystujący wzbudzenie 2-fotonowe ze spójnego lasera kameleona tytanowo-szafirowego. Wybór mikroskopu i soczewki obiektywowej będzie zależał od celu eksperymentów, np. w celu uzyskania super rozdzielczości można użyć mikroskopu fluorescencyjnego z arkuszem światła.</li>
</ol>

<ol><li>Vincent, S. D., Buckingham, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((How+to+make+a+heart%3A+the+origin+and+regulation+of+cardiac+progenitor+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Top+Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">How to make a heart: the origin and regulation of cardiac progenitor cells.</a> Curr Top Dev Biol. 90, 1-41 (2010).</li>
<li>Olson, E. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+decade+of+discoveries+in+cardiac+biology%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Med%22%5BJournal%5D)">A decade of discoveries in cardiac biology.</a> Nat Med. 10, 467-474 (2004).</li>
<li>Olson, E. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gene+regulatory+networks+in+the+evolution+and+development+of+the+heart%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Gene regulatory networks in the evolution and development of the heart.</a> Science. 313, 1922-1927 (2006).</li>
<li>Bruneau, B. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+developmental+genetics+of+congenital+heart+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">The developmental genetics of congenital heart disease.</a> Nature. 451, 943-948 (2008).</li>
<li>Mohun, T. J., Weninger, W. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Embedding+embryos+for+high-resolution+episcopic+microscopy+%28HREM%29%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harb+Protoc%22%5BJournal%5D)">Embedding embryos for high-resolution episcopic microscopy (HREM).</a> Cold Spring Harb Protoc. , 678-680 (2012).</li>
<li>Soufan, A. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Three-dimensional+reconstruction+of+gene+expression+patterns+during+cardiac+development%5BTitle%5D)+AND+%22Physiol+Genomics%22%5BJournal%5D)">Three-dimensional reconstruction of gene expression patterns during cardiac development.</a> Physiol Genomics. 13, 187-195 (2003).</li>
<li>Richardson, D. S., Lichtman, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Clarifying+Tissue+Clearing%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Clarifying Tissue Clearing.</a> Cell. 162, 246-257 (2015).</li>
<li>Susaki, E. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Whole-brain+imaging+with+single-cell+resolution+using+chemical+cocktails+and+computational+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Whole-brain imaging with single-cell resolution using chemical cocktails and computational analysis.</a> Cell. 157, 726-739 (2014).</li>
<li>Becker, K., Jahrling, N., Saghafi, S., Weiler, R., Dodt, H. U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chemical+clearing+and+dehydration+of+GFP+expressing+mouse+brains%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Chemical clearing and dehydration of GFP expressing mouse brains.</a> PLoS One. 7, e33916(2012).</li>
<li>Erturk, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Three-dimensional+imaging+of+solvent-cleared+organs+using+3DISCO%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">Three-dimensional imaging of solvent-cleared organs using 3DISCO.</a> Nat Protoc. 7, 1983-1995 (2012).</li>
<li>Ke, M. T., Fujimoto, S., Imai, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((SeeDB%3A+a+simple+and+morphology-preserving+optical+clearing+agent+for+neuronal+circuit+reconstruction%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Neurosci%22%5BJournal%5D)">SeeDB: a simple and morphology-preserving optical clearing agent for neuronal circuit reconstruction.</a> Nat Neurosci. 16, 1154-1161 (2013).</li>
<li>Chung, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structural+and+molecular+interrogation+of+intact+biological+systems%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Structural and molecular interrogation of intact biological systems.</a> Nature. 497, 332-337 (2013).</li>
<li>Yang, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-cell+phenotyping+within+transparent+intact+tissue+through+whole-body+clearing%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Single-cell phenotyping within transparent intact tissue through whole-body clearing.</a> Cell. 158, 945-958 (2014).</li>
<li>Hama, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Scale%3A+a+chemical+approach+for+fluorescence+imaging+and+reconstruction+of+transparent+mouse+brain%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Scale: a chemical approach for fluorescence imaging and reconstruction of transparent mouse brain.</a> Nat Neurosci. 14, 1481-1488 (2011).</li>
<li>Badea, T. C., Wang, Y., Nathans, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+noninvasive+genetic%2Fpharmacologic+strategy+for+visualizing+cell+morphology+and+clonal+relationships+in+the+mouse%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">A noninvasive genetic/pharmacologic strategy for visualizing cell morphology and clonal relationships in the mouse.</a> J Neurosci. 23, 2314-2322 (2003).</li>
<li>Livet, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transgenic+strategies+for+combinatorial+expression+of+fluorescent+proteins+in+the+nervous+system%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Transgenic strategies for combinatorial expression of fluorescent proteins in the nervous system.</a> Nature. 450, 56-62 (2007).</li>
<li>Agah, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gene+recombination+in+postmitotic+cells.+Targeted+expression+of+Cre+recombinase+provokes+cardiac-restricted%2C+site-specific+rearrangement+in+adult+ventricular+muscle+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22J+Clin+Invest%22%5BJournal%5D)">Gene recombination in postmitotic cells. Targeted expression of Cre recombinase provokes cardiac-restricted, site-specific rearrangement in adult ventricular muscle in vivo.</a> J Clin Invest. 100, 169-179 (1997).</li>
<li>Jiao, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+essential+role+of+Bmp4+in+the+atrioventricular+septation+of+the+mouse+heart%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+Dev%22%5BJournal%5D)">An essential role of Bmp4 in the atrioventricular septation of the mouse heart.</a> Genes Dev. 17, 2362-2367 (2003).</li>
<li>Wu, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Endocardial+cells+form+the+coronary+arteries+by+angiogenesis+through+myocardial-endocardial+VEGF+signaling%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Endocardial cells form the coronary arteries by angiogenesis through myocardial-endocardial VEGF signaling.</a> Cell. 151, 1083-1096 (2012).</li>
<li>Muzumdar, M. D., Tasic, B., Miyamichi, K., Li, L., Luo, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+global+double-fluorescent+Cre+reporter+mouse%5BTitle%5D)+AND+%22Genesis%22%5BJournal%5D)">A global double-fluorescent Cre reporter mouse.</a> Genesis. 45, 593-605 (2007).</li>
<li>Wu, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Epicardial+spindle+orientation+controls+cell+entry+into+the+myocardium%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Cell%22%5BJournal%5D)">Epicardial spindle orientation controls cell entry into the myocardium.</a> Dev Cell. 19, 114-125 (2010).</li>
<li>Zhao, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Numb+family+proteins+are+essential+for+cardiac+morphogenesis+and+progenitor+differentiation%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Numb family proteins are essential for cardiac morphogenesis and progenitor differentiation.</a> Development. 141, 281-295 (2014).</li>
<li>Kaufman, M. H., Kaufman, M. H. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aKaufman%2C+MH+%22The+atlas+of+mouse+development%22">The atlas of mouse development</a>. , Academic Press. London. (1992).</li>
<li>Nagy, A. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aNagy%2C+A+%22Manipulating+the+mouse+embryo+%3A+a+laboratory+manual%22">Manipulating the mouse embryo : a laboratory manual</a>. , 3rd, Cold Spring Harbor Laboratory Press. Cold Spring Harbor, N.Y. (2003).</li>
<li>Buckingham, M., Meilhac, S., Zaffran, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Building+the+mammalian+heart+from+two+sources+of+myocardial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Genet%22%5BJournal%5D)">Building the mammalian heart from two sources of myocardial cells.</a> Nat Rev Genet. 6, 826-835 (2005).</li>
<li>Kelly, R. G., Buckingham, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+anterior+heart-forming+field%3A+voyage+to+the+arterial+pole+of+the+heart%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Genet%22%5BJournal%5D)">The anterior heart-forming field: voyage to the arterial pole of the heart.</a> Trends Genet. 18, 210-216 (2002).</li>
<li>Verzi, M. P., McCulley, D. J., De Val, S., Dodou, E., Black, B. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+right+ventricle%2C+outflow+tract%2C+and+ventricular+septum+comprise+a+restricted+expression+domain+within+the+secondary%2Fanterior+heart+field%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">The right ventricle, outflow tract, and ventricular septum comprise a restricted expression domain within the secondary/anterior heart field.</a> Dev Biol. 287, 134-145 (2005).</li>
<li>Ward, C., Stadt, H., Hutson, M., Kirby, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ablation+of+the+secondary+heart+field+leads+to+tetralogy+of+Fallot+and+pulmonary+atresia%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">Ablation of the secondary heart field leads to tetralogy of Fallot and pulmonary atresia.</a> Dev Biol. 284, 72-83 (2005).</li>
<li>Echelard, Y., Vassileva, G., McMahon, A. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cis-acting+regulatory+sequences+governing+Wnt-1+expression+in+the+developing+mouse+CNS%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Cis-acting regulatory sequences governing Wnt-1 expression in the developing mouse CNS.</a> Development. 120, 2213-2224 (1994).</li>
<li>Jiang, X., Rowitch, D. H., Soriano, P., McMahon, A. P., Sucov, H. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fate+of+the+mammalian+cardiac+neural%5BTitle%5D)+AND+%22Developement%22%5BJournal%5D)">Fate of the mammalian cardiac neural.</a> Developement. 127, 1607-1616 (2000).</li>
<li>Viragh, S., Challice, C. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+origin+of+the+epicardium+and+the+embryonic+myocardial+circulation+in+the+mouse%5BTitle%5D)+AND+%22Anat+Rec%22%5BJournal%5D)">The origin of the epicardium and the embryonic myocardial circulation in the mouse.</a> Anat Rec. 201, 157-168 (1981).</li>
<li>Wu, M., Li, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Numb+family+proteins%3A+novel+players+in+cardiac+morphogenesis+and+cardiac+progenitor+cell+differentiation%5BTitle%5D)+AND+%22Biomolecular+concepts%22%5BJournal%5D)">Numb family proteins: novel players in cardiac morphogenesis and cardiac progenitor cell differentiation.</a> Biomolecular concepts. 6, 137-148 (2015).</li>
<li>Li, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-Cell+Lineage+Tracing+Reveals+that+Oriented+Cell+Division+Contributes+to+Trabecular+Morphogenesis+and+Regional+Specification%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+reports%22%5BJournal%5D)">Single-Cell Lineage Tracing Reveals that Oriented Cell Division Contributes to Trabecular Morphogenesis and Regional Specification.</a> Cell reports. 15, 158-170 (2016).</li>
<li>Alkaabi, K. M., Yafea, A., Ashraf, S. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effect+of+pH+on+thermal-+and+chemical-induced+denaturation+of+GFP%5BTitle%5D)+AND+%22Appl+Biochem+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Effect of pH on thermal- and chemical-induced denaturation of GFP.</a> Appl Biochem Biotechnol. 126, 149-156 (2005).</li>
<li>Captur, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Morphogenesis+of+myocardial+trabeculae+in+the+mouse+embryo%5BTitle%5D)+AND+%22J+Anat%22%5BJournal%5D)">Morphogenesis of myocardial trabeculae in the mouse embryo.</a> J Anat. , (2016).</li>
</ol>

Autorzy deklarują brak sprzecznych interesów finansowych.

Izolacja zarodka jest bardzo krytycznym krokiem. Zarodki E9.5 są bardzo delikatne i mają małe rozmiary, dlatego należy zachować szczególną ostrożność, aby nie uszkodzić struktur zarodka/serca podczas izolacji. Dodatkowe warstwy otaczające zarodek/serce powinny być ostrożnie usuwane, zwłaszcza podczas obrazowania całego zarodka. Umożliwia to przenikanie przeciwciał i mieszaniny oczyszczającej głęboko do tkanek embrionalnych, a także pomaga w usuwaniu sygnału tła podczas obrazowania. Zbadano wiele przeciwciał, w tym przeci...

Morfogeneza serca to sekwencyjne zdarzenie, które wymaga czasoprzestrzennej organizacji czterech różnych typów komórek progenitorowych serca w odrębne sektory serca, a także wymaga wielu genetycznych sieci regulacyjnych, aby zaaranżować ten proces w celu utworzenia funkcjonalnego serca1,2. Specyfikacja, różnicowanie, wzorzec i dojrzewanie komory serca są regulowane przez kardiogenne czynniki transkrypcyjne3. Mutacja genetyczna lub aberracja potranskrypcyjna tych czynników w komórkach progenitorowych serca może prowadzić do śmiertelności zarodka lub wrodzonych wad serca (CHD)4. Badanie morfogenezy serca wymaga zrozumienia nieodłącznych szczegółów strukturalnych w trzech wymiarach (3D), a śledzenie linii komórek progenitorowych serca za pomocą pojedynczego znakowania podczas rozwoju serca ułatwi zrozumienie morfogenezy serca. W ciągu ostatnich kilku dekad opracowano szereg metod tomografii skrawków o wysokiej rozdzielczości w celu obrazowania struktury narządów5,6; Metody te wymagają jednak drogich, specjalistycznych instrumentów, dużego nakładu pracy i braku szczegółowej organizacji strukturalnej w rozdzielczości pojedynczej komórki w końcowym zrekonstruowanym obrazie wolumetrycznym7,8.
Obrazowanie wolumetryczne 3D na poziomie pojedynczej komórki umożliwia badanie różnicowania komórek progenitorowych i zachowania komórek in vivo7. Jednak rozpraszanie światła w tkankach pozostaje główną przeszkodą w obrazowaniu komórek i struktur w 3D głęboko wewnątrz nienaruszonego serca. Lipidy są głównym źródłem rozpraszania światła, a usunięcie lipidów i/lub dostosowanie różnicy współczynnika załamania światła między lipidami a ich otoczeniem jest potencjalnym podejściem do zwiększenia przezroczystości tkanek8. W ciągu ostatnich kilku lat opracowano szereg metod oczyszczania tkanek, które zmniejszają zmętnienie tkanek i rozpraszanie światła, takie jak BABB (mieszanina alkoholu benzylowego i benzoesanu benzylu) i DBE (tetrahydrofuran i eter dibenzylowy); Ale w tych metodach wygaszanie fluorescencji pozostaje problemem8-10. Metody hydrofilowe oparte na rozpuszczalnikach, takie jak SeeDB (fruktoza/tioglicerol) i 3DISCO (dichlorometan/eter dibenzylowy), zachowują sygnały fluorescencyjne, ale nie sprawiają, że cały narząd jest przezroczysty7,8,11. Dla porównania, metoda oczyszczania tkanek CLARITY sprawia, że narząd staje się przezroczysty, ale wymaga specjalistycznego urządzenia do elektroforezy w celu usunięcia lipidów8,12, podobnie jak PACT (technika pasywnej przejrzystości), która również wymaga zatopienia hydrożelu7,13. Szczegółowe informacje dotyczące wszystkich dostępnych metod oczyszczania tkanek znajdują się w Tabeli 1 w Richardson i Lichtman, et al.Rozdział 7.
W 2011 roku, Hama i in. przypadkowo odkryli hydrofilową mieszaninę 'Scale' (mieszanina mocznika, glicerolu i Triton X-100), która sprawia, że mózg i zarodek myszy stają się przezroczyste, jednocześnie całkowicie zachowując sygnały fluorescencyjne z oznakowanych klonów14. Pozwala to na obrazowanie nienaruszonego mózgu na głębokości kilku milimetrów i rekonstrukcję populacji neuronów i projekcji na dużą skalę w rozdzielczości subkomórkowej. Susaki i wsp. udoskonalili Scale poprzez dodanie aminoalkoholi i opracowali metodę oczyszczania tkanek "CUBIC" (clear, unstructed brain imaging cocktails and computational analysis), która zwiększyła rozpuszczalność fosfolipidów, skróciła czas oczyszczania i umożliwiła wielokolorowe obrazowanie fluorescencyjne8. W niniejszym badaniu, wykorzystując techniki oczyszczania tkanek Scale i CUBIC oraz sekcję optyczną 3D o wysokiej rozdzielczości, poszczególne klony wewnątrz serca podczas kardiogenezy śledzono za pomocą Rosa26CreERT2 15, R26R-Confetti16, αMHC-Cre17, cTnT-Cre18, Nfatc1-Cre19 i Rosa26-mTmG (mTmG)20 linii myszy. Połączenie opracowanej wcześniej metody barwienia całego mocowania (WMS)21,22 z metodami oczyszczania tkanek pozwoliło na barwienie innych białek w znakowanych klonach i badanie ich zachowania w kontekście wolumetrycznym 3D. Połączenie oczyszczania tkanek i WMS pozwala na lepsze zrozumienie roli różnych genów i białek podczas rozwoju serca oraz etiologii wrodzonych wad serca. Protokół ten można zastosować do badania różnicowania innych komórek progenitorowych, zachowania komórkowego i zdarzeń morfogenezy narządów podczas rozwoju.

<table><tbody><tr><td>2,2&liczba pierwsza;,2&prymiczna; '-Nitrolotrieetanol&nbsp;</td><td>Sigma Aldrich</td><td>90279</td><td></td></tr><tr><td>4% paraformaldehyd w PBS</td><td>Affymetrix</td><td>19943</td><td></td></tr><tr><td>BSA</td><td>Fischer Scientific&nbsp;</td><td></td><td></td>BP16000</tr><tr><td>N,N,N',N'-tetrakis(2-hydroksypropylo)etylenodiamina&nbsp;</td><td>Sigma Aldrich</td><td>122262</td><td></td></tr><tr><td>Bufor fosforanowy sól fizjologiczna</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P5368-10PAK</td><td></td></tr><tr><td>Triton&nbsp; X-100</td><td>Sigma Aldrich</td><td>T8787</td><td></td></tr><tr><td>Mocznik</td><td>Sigma Aldrich</td><td>U-1250</td><td></td></tr><tr><td>Sacharoza</td><td>Sigma Aldrich</td><td>84097</td><td></td></tr><tr><td>Glicerol</td><td>Sigma Aldrich</td><td>G8773</td><td></td></tr><tr><td>Tamoksyfen</td><td>Sigma Aldrich</td><td>T5648</td><td></td></tr><tr><td>Olej słonecznikowy</td><td>Sigma Aldrich</td><td>S5007</td><td></td></tr><tr><td>Tween 20</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P1379</td><td></td></tr><tr><td>PECAM (CD31)</td><td>BD Pharmingen&nbsp;</td><td></td><td></td>550274</tr><tr><td>Alexa Fluor 647&nbsp;</td><td>Invitrogen</td><td>A-21247</td><td></td></tr><tr><td>Barwienie jądrowe DAPI</td><td>Sigma Aldrich</td><td>D9542</td><td></td></tr><tr><td>37oC Inkubator</td><td>Thermoscientific Fischer</td><td>Heratherm, Kompaktowe</td><td></td>inkubatory mikrobiologiczne</tr><tr><td>Płytki 48-dołkowe</td><td>Cell Treat</td><td>229148</td><td></td></tr><tr><td>Waga analityczna</td><td>Metler Toledo</td><td>PB153-S/FACT</td><td></td></tr><tr><td>Konfokalny mikroskop</td><td>Zeiss</td><td>Mikroskop konfokalny</td><td></td>Zeiss 510</tr><tr><td>Mikroskop preparacyjny</td><td>Unitron</td><td>Z850</td><td></td></tr><tr><td>Mikroskop fluorescencyjny</td><td>Zeiss</td><td>Observer. Z1</td><td></td></tr><tr><td>Germinator 500 Sterylizator z kulkami szklanymi</td><td>CellPoint Scientific</td><td>GER-5287-120V</td><td></td></tr><tr><td>Źródło światła</td><td>SCHOTT</td><td>ACE I</td><td></td></tr><tr><td>Para nożyczek</td><td>Narzędzia do nauki</td><td>14084-08</td><td></td></tr><tr><td>Szalka Petriego 60 mm x15 mm&nbsp;</td><td>TPP Techno Plastic Products AG</td><td>93060</td><td></td></tr><tr><td>Rocker II&nbsp; Platforma Rocker</td><td>Boekel Scientific</td><td>260350</td><td></td></tr><tr><td>Rurki scyntylacyjne</td><td>Fischer Scientific&nbsp;</td><td>03-337-26</td><td></td></tr><tr><td>Pipeta transferowa</td><td>Samco Scientific</td><td>202</td><td></td></tr><tr><td>Pęseta</td><td>Fine Science Tools</td><td>11251-20</td><td></td></tr></tbody></table>

obrazowanie oczyszczonych serc embrionalnych i pourodzeniowych w rozdzielczości pojedynczej komórki

Imaging Cleared Embryonic and Postnatal Hearts at Single-cell Resolution

Śledzenie i analiza pojedynczego klonu na poziomie całego serca może określić zachowanie i różnicowanie komórek progenitorowych serca podczas rozwoju serca i pozwolić na badanie komórkowych i molekularnych podstaw normalnej i nieprawidłowej morfogenezy serca. Najnowsze technologie retrospektywnych analiz pojedynczych klonów umożliwiają badanie morfogenezy serca w rozdzielczości pojedynczej komórki. Jednak zmętnienie tkanek i rozpraszanie światła serca wraz ze wzrostem głębokości obrazowania utrudniają obrazowanie całego serca w rozdzielczości pojedynczej komórki. Aby przezwyciężyć te przeszkody, należy opracować system oczyszczania całego zarodka, który może sprawić, że serce będzie wysoce przezroczyste zarówno pod względem oświetlenia, jak i wykrywania. Na szczęście w ciągu ostatnich kilku lat opisano wiele metodologii dla systemów oczyszczania całego organizmu, takich jak CLARITY, Scale, SeeDB, ClearT, 3DISCO, CUBIC, DBE, BABB i PACT. Laboratorium to interesuje się komórkowymi i molekularnymi mechanizmami morfogenezy serca. Niedawno ustaliliśmy śledzenie linii pojedynczych komórek za pomocą ROSA26-CreERT2; System ROSA26-Confetti do rzadkiego znakowania komórek podczas rozwoju serca. Dostosowaliśmy kilka metodologii oczyszczania całego zarodka, w tym Scale i CUBIC (clear, untracted brain imaging cocktails and computational analysis), aby oczyścić zarodek w połączeniu z barwieniem całego wierzchowca, aby zobrazować pojedyncze klony wewnątrz serca. Serce udało się zobrazować w rozdzielczości pojedynczej komórki. Odkryliśmy, że Scale może oczyścić serce embrionalne, ale nie może skutecznie oczyścić serca pourodzeniowego, podczas gdy CUBIC może oczyścić serce po urodzeniu, ale uszkadza serce embrionalne poprzez rozpuszczenie tkanki. Opisane tutaj metody pozwolą na badanie funkcji genów w rozdzielczości pojedynczego klonu podczas morfogenezy serca, co z kolei może ujawnić komórkowe i molekularne podstawy wrodzonych wad serca.

Obrazowanie przejrzystego serca embrionalnego
Tworzenie serca kręgowców jest procesem morfogenetycznym regulowanym czasowo i przestrzennie, który zależy od organizacji i różnicowania komórek progenitorowych pochodzących z czterech różnych źródeł1. Komórki z pierwszego pola serca półksiężyca sercowego zwiną się w stronę linii środkowej brzusznej, tworząc liniową rurkę serca. Komórki z drugiego pola serca, początkowo zl...

Opisujemy protokół do wolumetrycznego obrazowania komórek znakowanych białkiem fluorescencyjnym głęboko w nienaruszonych sercach embrionalnych i pourodzeniowych. Wykorzystując metody oczyszczania tkanek w połączeniu z barwieniem całego wierzchowca, pojedyncze komórki znakowane białkiem fluorescencyjnym wewnątrz serca embrionalnego lub pourodzeniowego mogą być wyraźnie i dokładnie zobrazowane.

Obrazowanie oczyszczonych serc embrionalnych i pourodzeniowych w rozdzielczości pojedynczej komórki

Single clonal tracing and analysis at the whole-heart level can determine cardiac progenitor cell behavior and differentiation during cardiac development, ...

Ogólnym celem tej procedury jest obrazowanie wolumetryczne komórek znakowanych białkiem fluorescencyjnym głęboko wewnątrz nienaruszonych serc, aby badać funkcję genów z rozdzielczością pojedynczej komórki podczas rozwoju serca oraz w sercach ponatalnych. Metoda ta może pomóc w udzieleniu odpowiedzi na kluczowe pytania dotyczące rozwoju serca, takie jak badanie funkcji genów oraz obrazowanie z rozdzielczością pojedynczej komórki podczas rozwoju serca i eliminacja artefaktów zwierzęcych. Główną zaletą tej metody jest to, że jest ona stosunkowo prosta, niedroga i wydajna, co umożliwia specjalistyczną analizę czasową funkcji genów i białek z rozdzielczością pojedynczej komórki w nienaruszonym zarodku lub sercu.Choć system ten wykorzystujemy do badania rozwoju serca u myszy, można go również zastosować do badania innych układów organów, takich jak mięśnie, mózg i płuca, a także w przypadku innych organizmów modelowych. W niniejszym protokole wykorzystano embriony wykazujące ekspresję białek fluorescencyjnych pochodzące od samic R-26 Cre-RET2 confetti traktowanych tamoksyfenem. Barwienie należy rozpocząć od zanurzenia każdego utrwalonego w paraformaldehydzie embrionu w jednym mililitrze

imaging-cleared-embryonic-postnatal-hearts-at-single-cell

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Biologia rozwojowa

Mutacje, które prowadzą do wrodzonych wad serca, korzystają z badań in vivo struktury serca podczas rozwoju, ale badania strukturalne w wysokiej rozdzielczości na embrionalnym sercu myszy są technicznie trudne. W tym miejscu przedstawiamy solidną metodę immunofluorescencji i analizy obrazu w celu oceny struktur specyficznych dla kardiomiocytów w rozwijającym się sercu myszy.

Analiza rozwoju kardiomiocytów za pomocą immunofluorescencji w embrionalnym sercu myszy

Przedstawiamy protokół analizy naczyń wieńcowych w całych embrionalnych sercach myszy do E15.5, przy użyciu standardowych metod barwienia immunologicznego, a następnie klirensu optycznego i mikroskopii konfokalnej. Technika ta umożliwia wizualizację naczyń krwionośnych w całym sercu bez konieczności czasochłonnej analizy odcinków seryjnych.

Analiza naczyń wieńcowych w oczyszczonych sercach embrionalnych

Aby odróżnić podział komórek od zmian cyklu komórkowego w kardiomiocytach, prezentujemy protokoły wykorzystujące dwie transgeniczne linie myszy: myszy transgeniczne Myh6-H2B-mCh, do jednoznacznej identyfikacji jąder kardiomiocytów, oraz myszy CAG-eGFP-anilin, do odróżniania podziału komórek od zmian cyklu komórkowego.

Wizualizacja zmian cyklu komórkowego i oznaczanie zarodkowania w kardiomiocytach postnatalnych

Tutaj opisujemy protokół immunofluorescencji całego wierzchowca i ilościowej analizy objętościowej zarodków myszy we wczesnym stadium rozwoju. Przedstawiamy tę technikę jako potężne podejście do jakościowej i ilościowej oceny struktur serca podczas rozwoju i sugerujemy, że może być ona szeroko adaptowalna do innych układów narządów.

Ilościowa analiza immunofluorescencyjna całego mocowania populacji progenitorów serca w zarodkach myszy

To badanie wykorzystuje technikę mikroskopii fluorescencyjnej z dwustronnym oświetleniem (LSFM) w połączeniu z oczyszczaniem optycznym do badania mysiego serca.

Mikroskopia fluorescencyjna z arkuszem świetlnym do badania mysiego serca

Proliferacja kardiomiocytów po urazie jest dynamicznym procesem, który wymaga symfonii sygnałów zewnątrzkomórkowych z populacji komórek niebędących miocytami. Wykorzystując śledzenie linii, pasywną CLARITY i techniki trójwymiarowej mikroskopii konfokalnej z pełnym mocowaniem, możemy analizować wpływ różnych typów komórek na naprawę i regenerację serca.

Uchwycenie reakcji docelowych populacji komórek na uraz serca za pomocą trójwymiarowego obrazowania serca

Przedstawiamy metodę mezoskopowej rekonstrukcji całego serca myszy poprzez połączenie nowych osiągnięć w transformacji tkanek i barwieniu z rozwojem osiowo skanowanego mikroskopu świetlnego.

Mezoskopowe obrazowanie optyczne całego serca myszy

Przedstawiamy szczegółowy protokół hodowli i obrazowania embrionów myszy, który umożliwia obrazowanie 3D + czasowe komórek progenitorowych serca. Ten zestaw narzędzi wideo omawia kluczowe umiejętności wymagane do skutecznego obrazowania na żywo, które w przeciwnym razie byłyby trudne do zdobycia z publikacji tekstowych.

Obrazowanie na żywo wczesnych progenitorów serca w zarodku myszy

Protokół wykorzystuje zaawansowaną mikroskopię świetlną wraz z dostosowanymi metodami oczyszczania tkanek do badania skomplikowanych struktur serca w sercach gryzoni, co ma ogromny potencjał dla zrozumienia morfogenezy i przebudowy serca.

Obrazowanie w arkuszach świetlnych w celu ujawnienia struktury serca w sercach gryzoni

Ten protokół wprowadza szybką metodę ilościowego trójwymiarowego obrazowania naczyń krwionośnych za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej z użyciem arkusza świetlnego. Skuteczność metody wykazano przy użyciu systemu tętnic łukowatych gardła w modelu zarodka pisklęcia, z siłami hemodynamicznymi określonymi ilościowo za pomocą obliczeniowej dynamiki płynów.

Szybkie obrazowanie naczyń krwionośnych małych zwierząt w całej rozdzielczości do badań ilościowych

Poznaj metodę obrazowania komórek z fluorescencyjnymi białkami w nienaruszonych sercach embrionalnych i pourodzeniowych w rozdzielczości pojedynczej komórki. Protokół łączy techniki przezroczystości tkanek z barwieniem całych preparatów, umożliwiając szczegółową analizę funkcji genów podczas rozwoju serca.

Obrazowanie oczyszczonych serc embrionalnych i pourodzeniowych w rozdzielczości pojedynczej komórki

Przeglądaj więcej filmów