Obrazowanie oczyszczonych serc embrionalnych i pourodzeniowych w rozdzielczości pojedynczej komórki

Ogólnym celem tej procedury jest wolumetryczne obrazowanie komórek znakowanych białkiem fluorescencyjnym głęboko w nienaruszonym sercu, badanie funkcji genów w rozdzielczości pojedynczej komórki podczas rozwoju serca i w sercach po urodzeniu. Metoda ta może pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytania podczas rozwoju serca, takie jak badanie funkcji genów i pomoc w obrazowaniu w rozdzielczości pojedynczej komórki podczas rozwoju serca i artefaktów animidalnych. Główną zaletą tej metody jest to, że jest stosunkowo prosta, niedroga i korzystna pod względem specjalnej analizy czasowej funkcji genu i białka w rozdzielczości pojedynczej komórki w nienaruszonym zarodku lub sercu.

Chociaż używamy tego systemu do badania rozwoju serca u myszy, można go również używać do badania innych układów narządów, takich jak mięśnie, mózg i płuca, a także w innych organizmach modelowych. Wykorzystuje się tu zarodki z dodatnim wynikiem białka fluorescencyjnego z matek konfetti Cre-26 Cre-RET2 poddanych działaniu tamoksyferu. Barwienie należy rozpocząć od zanurzenia każdego zarodka utrwalonego paraformaldehydem w jednym mililitrze 0,1% PBST w dołkach płytki 48-dołkowej.

Inkubować przez dwie godziny na wytrząsarce płytkowej w temperaturze pokojowej, aby przepuszczalność tkanki. Następnie zastąp roztwór permeabilizacyjny jednym ml buforu blokującego i inkubuj, wstrząsając, przez dwie godziny w temperaturze pokojowej lub przez noc w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Następnie przygotuj rozcieńczenie od 1 do 100 przeciwciała specyficznego dla komórek śródbłonka, PECAM, w 0,3 mililitra buforu blokującego dla każdej studzienki i dodaj go do studzienek zawierających zarodki.

Inkubować przez 48 godzin, wstrząsając w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Po inkubacji przemyć zarodki pięciokrotnie PBST przez 30 minut za każdym razem, aby usunąć nadmiar przeciwciał pierwszorzędowych z tkanki. Następnie zanurz zarodki w roztworze przeciwciał drugorzędowych antykadu Alexa Fluor 647 i inkubuj z wstrząsaniem przez 48 godzin w temperaturze czterech stopni Celsjusza, chroniąc je przed światłem.

48 godzin później, po wcześniejszym wypłukaniu, utrwalaj zarodki za pomocą 4% PFA przez godzinę w temperaturze pokojowej z potrząsaniem. Następnie, po dwukrotnym przemyciu PBS przez pięć minut za każdym razem, inkubuj zarodki z barwnikiem jądrowym DAPI przez dziesięć minut. Następnie wykonaj dwa płukania PBS po pięć minut każde, a następnie przystąp do oczyszczania tkanek.

Oczyszczanie tkanek jest najważniejszym krokiem w tym protokole w celu zobrazowania serca w rozdzielczości pojedynczej komórki. Również wybór metody oczyszczania, zarówno w skali jak i CUBIC, jest również bardzo ważny w celu zachowania sygnałów fluorescencyjnych w nienaruszonym sercu embrionalnym. Przenieś umyte, barwione zarodki do fiolki scyntylacyjnej owiniętej folią aluminiową, która zawiera jeden mililitr roztworu A2

Inkubować w temperaturze czterech stopni Celsjusza, od czasu do czasu delikatnie potrząsając ręką przez 48 godzin. Po inkubacji w skali A2 zastąp roztwór w fiolce jednym mililitrem roztworu skali B4 i inkubuj w temperaturze czterech stopni Celsjusza, od czasu do czasu delikatnie wstrząsając przez kolejne 48 godzin. Inkubuj zarodki przez kolejne 48 godzin za pomocą jednego mililitra skali 70 w temperaturze czterech stopni Celsjusza, od czasu do czasu delikatnie potrząsając, jak poprzednio.

Na koniec zanurz oczyszczoną próbkę w jednym mililitrze 90% glicerolu i przechowuj w temperaturze czterech stopni Celsjusza do momentu obrazowania. Aby wykonać obraz, przenieś próbkę na szalkę Petriego ze szklanym dnem z minimalną ilością 90% glicerolu i zobrazuj za pomocą mikroskopu konfokalnego wyposażonego w dwie zdolności fotonowe. W celu oczyszczenia CUBIC zanurz każdy zarodek w jednym mililitrze CUBIC one, od czasu do czasu delikatnie potrząsając przez 48 godzin w temperaturze 37 stopni Celsjusza.

Po 48 godzinach zastąp roztwór tą samą objętością świeżego odczynnika CUBIC i inkubuj próbkę przez dodatkowe 48 godzin, jak poprzednio. Po inkubacji należy kilkakrotnie umyć zarodki poddane działaniu CUBIC one PBS, delikatnie potrząsając ręką, aby usunąć nadmiar roztworu CUBIC one. Następnie zanurz zarodki w roztworze CUBIC two na 48 godzin w temperaturze 37 stopni Celsjusza, od czasu do czasu delikatnie potrząsając ręką.

Jeśli wystąpi opóźnienie przed obrazowaniem, należy sekwencyjnie inkubować próbki z jednym mililitrem 30%50% i 70% glicerolu i PBS przez 30 minut każda. Po przejściu przez serię przenieś do 90% roztworu glicerolu do przechowywania w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Gdy będziesz gotowy, zobrazuj na szalce Petriego ze szklanym dnem z 90% glicerolu, tak jak poprzednio.

Ten film pokazuje przekroje optyczne serca poddanego działaniu skali E 8,75, od powierzchni serca do światła. Żółty oznacza ekspresję PECAM, a wszystkie kardiomiocyty są zielone. Głębokość wynosi 110,4 mikrona, a w sumie są 93 plasterki.

To jest pokazany przed chwilą obraz powierzchni 3D zrekonstruowanego serca. Ponownie, żółty oznacza ekspresję PECAM, a zielony oznacza wszystkie kardiomiocyty. Ten film pokazuje skrawki pojedynczego klonu przodka z serca poddanego obróbce łuski E 9,5 w obszarze drogi odpływu.

Na żółto zaznaczono wyrażenie PECAM, a klon pojawił się na zielono. Głębokość wynosi 36 mikronów, a w sumie jest 10 plasterków. Ten film pokazuje sekcje serca P 2 poddanego działaniu CUBIC od powierzchni do światła.

Głębokość wynosi 130 mikronów przy trzech mikronach na sekcję. Ten film pokazuje przekroje serca E 17,5 poddanego działaniu CUBIC od powierzchni do światła. Głębokość wynosi 630 mikronów przy sześciu mikronach na sekcję.

Jest to pokazany przed chwilą obraz powierzchni 3D serca, zrekonstruowany za pomocą oprogramowania do rekonstrukcji 3D. Podejmując się tej procedury, należy pamiętać, że zarodek jest delikatny i patologia serca może być łatwo zaburzona. Po tej procedurze można uzyskać inne białko, wykorzystując barwienie do badania funkcji genu po zakończeniu i spienieniu.