Name: Obrazowanie wapnia u Drosophila podczas aktywacji jaj (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-08-06T14:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 45 s
Description: Poznaj metodę obrazowania wapnia podczas aktywacji jaj u Drosophila melanogaster. Technika ta pozwala badać dynamikę jonów wapnia z wysoką rozdzielczością przestrzenną w biologii rozwoju.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Jesteśmy wdzięczni Laurze Bampton, Alexowi Davidsonowi, Richardowi Partonowi, Aricie Acharyi za pomoc podczas przygotowania tego rękopisu; Mariana Wolfner za dyskusje na temat aktywacji jaj; Matt Wayland za wsparcie w zakresie obrazowania; oraz Nan Hu za ogólne wsparcie w laboratorium.
Ta praca była wspierana przez Uniwersytet Cambridge, ISSF dla T.T.W. [numer grantu 097814].

Uwaga: Wykonuj wszystkie kroki w temperaturze pokojowej, chyba że zaznaczono inaczej.
1. Przygotowanie do sekcji
Uwaga: Opisane tutaj kroki są zgodne z E. Gavis, Princeton University & Weil et. al. 18. Wykonaj następujące czynności na dwa dni przed obrazowaniem.
<ol>
	<li>Weź fiolkę na muchy zawierającą około 10 ml stałego pokarmu i dodaj niewielką ilość suszonych drożdży do jednego rogu, wystarczy mniej niż 1 g. 
	Uwaga: Aby uzyskać informacje na temat fiolek na muchy lub pokarmu, patrz "Konserwacja Drosophila" 19.</li>
	<li>Dodaj 1-3 krople wody, aby uwodnić drożdże.</li>
	<li>Odstawić fiolkę pod kątem 45° i odczekać 3 - 5 minut, aż drożdże wchłoną wodę.</li>
	<li>Podczas gdy drożdże wchłaniają wodę, wybierz butelkę much wyrażających UASt-myr GCaMP5 20 napędzanych przez wannę-VP16GAL4 (określane jako GCaMP5), które niedawno się pojawiły (wybrano mirystoylowaną formę GCaMP5, aby zapewnić wysoki stosunek sygnału do szumu poprzez przywiązanie GECI do błony w jaju).</li>
	<li>Znieczulić muchy w butelce gazem CO2 . Pamiętaj, aby trzymać butelkę odwróconą, aby nie zgubić much w mokrej karmie.</li>
	<li>Przerzuć znieczulone muchy na podkładkę CO2 i posortuj 10 - 15 samic i 5 samców za pomocą pędzla pod mikroskopem preparacyjnym. Uwaga: Standardem jest włączenie samców, aby zapewnić zdrowe samice do sekcji.</li>
	<li>Gdy fiolka z kroku 1.3 będzie gotowa, dodaj do niej wybrane muchy. Należy uważać, aby fiolka była ustawiona poziomo, aż muchy staną się aktywne.</li>
	<li>Umieścić fiolkę w temperaturze 25 °C na około 36 godzin.</li>
	<li>Pozostałe muchy z wkładki CO2 należy umieścić z powrotem w butelce lub wyrzucić.</li>
</ol>
2. Wycinanie jajników Drosophila
Uwaga: Opisane tutaj kroki są zgodne z Weil et al. Rozdział 18.
<ol>
	<li>Po 36 godzinach znieczulić muchy z fiolki drożdżowej CO2 .</li>
	<li>Gdy muchy wewnątrz fiolki zostaną znieczulone, przerzuć je na podkładkę CO2 w celu posortowania pędzlem pod mikroskopem preparacyjnym.</li>
	<li>Wybierz kobietę.</li>
	<li>Odizoluj dwa jajniki od samicy. Pełny szczegółowy protokół znajduje się w Weil et. al. 18. Podsumowując:
	<ol>
		<li>Umieść małą kroplę utlenionego oleju halowęglowego (seria 95) na szkiełku nakrywkowym nr 1.5 o wymiarach 22 x 40 mm.</li>
		<li>Chwyć samicę kleszczami w przedniej części brzucha.</li>
		<li>Trzymając samicę pod mikroskopem preparacyjnym, użyj drugiego zestawu kleszczy, aby delikatnie usunąć tylną część samicy.</li>
		<li>Zetrzyj tkankę tylną z drugich kleszczy.</li>
		<li>Ściśnij jamę brzuszną drugimi kleszczami od przodu do tylnej części brzucha. Dwa nieprzezroczyste jajniki powinny przylegać do kleszczy, gdy znajdują się na zewnątrz samicy.</li>
		<li>Dotknij jajników olejem.</li>
		<li>Usuń wszelkie tkanki z kleszczy, wycierając kleszcze.</li>
		<li>Powtórzyć te kroki (2.4.1-2.4.7), aby uzyskać trzy szkiełka nakrywkowe, z których każde zawiera jajniki jednej muchy.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
3. Izolowanie poszczególnych dojrzałych jaj
<ol>
	<li>Pod standardowym mikroskopem preparacyjnym z powiększeniem ustawionym na 4X, na pierwszym szkiełku nakrywkowym z kroku 2.4, oddziel dwa jajniki, rozrywając jajowód.</li>
	<li>Wprowadź parę zamkniętych kleszczy do środka pojedynczego jajnika, uważając, aby nie przebić żadnych komór jajowych.</li>
	<li>Włóż standardową sondę preparacyjną do środka jajnika obok zamkniętych kleszczy.</li>
	<li>Delikatnie przeciągnij sondę preparacyjną przez jajnik w kierunku tylnego bieguna, gdzie znajdują się dojrzałe jaja (komory jajowe stadium 14).</li>
	<li>Powtórz kroki 3.1 - 3.4 2 - 5 razy w zależności od wielkości jajnika i liczby jaj. 
	Uwaga: Dodanie CO2 zazwyczaj powoduje złożenie pojedynczego jaja, które będzie wydawać się większe z podniesionymi wyrostkami grzbietowymi niż jaja wstępnie złożone. To jajo należy wyrzucić do obrazowania, ponieważ zostało już aktywowane wewnątrz samicy. 
	Uwaga: Dojrzałe komórki jajowe prawdopodobnie łatwo oddzielają się od tkanki łącznej jajnika.</li>
	<li>Jeśli na zewnątrz jajnika nie są widoczne żadne dojrzałe jaja, kontynuuj delikatne drażnienie sondą preparacyjną.</li>
	<li>Gdy dojrzałe jaja będą widoczne na szkiełku nakrywkowym na zewnątrz jajnika, manewruj 3 - 5 w linii pośrodku szkiełka nakrywkowego. 
	Uwaga: Aby uzyskać najlepsze wyniki, delikatnie przesuń sondę wzdłuż boku jaj. 
	Uwaga: Unikaj ciągnięcia za przydatki grzbietowe, ponieważ może to uszkodzić jajo. 
	Uwaga: W zależności od przyszłej konfiguracji obrazowania, ustaw jaja w odległości około 200 μm od siebie prostopadle do szkiełka nakrywkowego, aby uzyskać maksymalną powierzchnię obrazowania.</li>
	<li>Po wyrównaniu usuń resztę tkanki jajnika, odciągając ją od wyrównanych komórek jajowych za pomocą kleszczy.</li>
	<li>Usuń nadmiar oleju, wklepując go rogiem chusteczki medycznej. Uważaj, aby nie dotykać dojrzałych jaj chusteczką medyczną, ponieważ dojrzałe jaja, z którymi się zetkniesz, zostaną utracone.</li>
	<li>Narysuj krzyżyk na szkiełku nakrywkowym za pomocą markera, aby uprościć zlokalizowanie próbki pod mikroskopem.</li>
	<li>Ustaw szkiełko nakrytkowe w bezpiecznym miejscu i pozostaw przygotowane komory na jajka na szkiełku nakrywkowym na odpoczynek na 5 - 10 minut. Dzięki temu jajko może osiąść w oleju. Próbki można wykorzystać do 1 godziny po sekcji.</li>
	<li>Powtórz kroki 3.1 - 3.11 dla pozostałych szkiełek nakrywkowych z jajnikami.</li>
</ol>
4. Przygotowanie do obrazowania
<ol>
	<li>Doprowadzić przygotowany bufor aktywacyjny 15 do temperatury pokojowej. 
	Uwaga: Bufor aktywacyjny jest buforem hipotonicznym: 3,3 mM NaH2PO4, 16,6 mM KH2PO4, 10 mM NaCl, 50 mM KCl, 5% glikolu polietylenowego 8 000, 2 mM CaCl2, doprowadzony do pH 6,4 ze stosunkiem 1:5 NaOH:KOH. Więcej informacji można znaleźć w: Mahowald, 1983 15. Podwielokrotności buforu aktywacyjnego mogą być przechowywane w temperaturze -20 °C przez miesiące i w temperaturze 4 °C przez okres do 2 tygodni.</li>
	<li>Starannie przetransportować przygotowane szkiełka nakrywkowe, bufor aktywacyjny i szklane pipety do zakładu obrazowania. 
	Uwaga: Można użyć mikroskopu szerokokątnego, konfokalnego, z wirującym dyskiem lub mikroskopem z blachą świetlną. Zalecamy użycie mikroskopu odwróconego. Nasze reprezentatywne wyniki uzyskano przy użyciu mikroskopu konfokalnego.</li>
	<li>Należy wybrać obiektyw odpowiedni do obrazowania całej dojrzałej komórki jajowej (tutaj: 20X 0,7 NA).</li>
	<li>Zamontuj pierwsze przygotowane szkiełko nakrywkowe na stoliku mikroskopowym. Uważaj, aby nie złamać szkiełek nakrywkowych na scenie.</li>
	<li>Jakościowo wybierz pole widzenia z dojrzałą komorą jajową do aktywacji. Nie wyobrażaj sobie przebitych komór jajowych ani tych z pęcherzykami w błonie. 
	Uwaga: W przypadku kroków 4.6 - 4.7 polecenia oprogramowania będą się różnić w zależności od mikroskopu i producenta.</li>
	<li>Ustawić parametry obrazowania dla standardowego wzbudzenia GFP (488 nm) i emisji (500 - 580 nm). Ustaw również widok jasnego pola, aby zwizualizować i zorientować dojrzałe jajo i przemieszczony olej.</li>
	<li>Wybierz najniższą płaszczyznę Z, na której widoczne są dojrzałe jaja i ustaw pełny stos Z, który ma być pobrany dla 40 μm przy około 2 μm na krok. Ustaw parametry tak, aby nie było opóźnień między akwizycją stosu Z. Ustaw szereg czasowy do przechwytywania przez około 30 minut.</li>
</ol>
5. Obrazowanie Ex Vivo Aktywacja komórek jajowych
<ol>
	<li>Rozpocznij przechwytywanie obrazu.</li>
	<li>Poczekaj na zdobycie 1-2 pełnych stosów Z. Pokazuje dojrzałe jajo przed aktywacją.</li>
	<li>Pobrać około 300 μl buforu aktywacyjnego do szklanej pipety.</li>
	<li>Umieszczając końcówkę szklanej pipety zawierającej bufor aktywacyjny pod kątem 45° nad szkiełkiem nakrywkowym, powoli przesuwać pipetę na ścieżkę wiązki, aż znajdzie się bezpośrednio nad obrazowaną dojrzałą komórką jajową. Szklana pipeta powinna znajdować się 1-2 cm nad olejem.</li>
	<li>Dodać 1-2 krople buforu aktywacyjnego w czasie krótszym niż 5 sekund ze szklanej pipety. To powinno wyprzeć olej. Należy unikać dodawania nadmiaru buforu aktywacyjnego lub dotykania jaja szklaną pipetą, ponieważ może to spowodować przemieszczenie dojrzałej komórki jajowej. Należy uważać, aby nie dotknąć szkiełka nakrywkowego pipetą, ponieważ może to spowodować zmianę płaszczyzny ogniskowej lub tworzenie się pęcherzyków powietrza w olejku immersyjnym między obiektywem a szkiełkiem nakrywkowym.</li>
	<li>Podczas dodawania bufora aktywacyjnego podczas akwizycji obrazu, sprawdź kanał jasnego pola, aby upewnić się, że olej został przemieszczony przez bufor aktywacji. 
	Uwaga: Najpierw pojawi się jako cień, ponieważ pipeta przerywa ścieżkę wiązki, ale spowoduje to również pojawienie się małych kropelek oleju. Niektóre kropelki oleju mogą pozostać związane z dojrzałą komórką jajową, co wpłynie na wyniki eksperymentów i jakość obrazu.</li>
	<li>Jeżeli olej nie zostanie wyparty z początkowego dodania buforu aktywacyjnego, należy powtórzyć kroki 5.4-5.6.</li>
	<li>Po pomyślnym przemieszczeniu oleju pozwól szeregom czasowym działać aż do zakończenia. 
	Uwaga: Ze względu na pęcznienie oocytów podczas aktywacji, niektóre komory jajowe drastycznie przesuną się poza płaszczyznę ogniskową lub pole widzenia po dodaniu bufora aktywacyjnego. W takiej sytuacji należy przerwać akwizycję i zamontować następny szkiełko nakrywkowe.</li>
	<li>Po zakończeniu akwizycji sekwencji obrazów zapisz dane.</li>
</ol>
6. Przetwarzanie obrazu po akwizycji
<ol>
	<li>Otwórz zestaw danych za pomocą oprogramowania Fiji (http://fiji.sc/Downloads#Fiji) lub równoważnego oprogramowania do przetwarzania obrazu i wybierz odpowiednie pliki do analizy.</li>
	<li>Aby zbudować projekcję pozyskanych danych wybierz: Image > Stacks > Z-project.</li>
	<li>Wybierz początkowy plasterek Z i końcowy plasterek Z, zazwyczaj całą sekcję. Wybierz typ projekcji, zwykle ustawiony na "Maksymalna intensywność". Zaznacz pole wyboru "Wszystkie ramy czasowe", aby zastosować wybrane ustawienia do całej serii.</li>
	<li>Jeśli zobrazowano więcej niż jeden kanał fluorescencyjny, użyj narzędzia Kanały, aby umożliwić przesuwanie między kolorami, tworzenie kompozycji lub zmianę skali szarości obrazu. Wybierz narzędzie Obraz > Kolory > Kanały.</li>
	<li>Aby dostosować jasność i kontrast obrazu, wybierz Obraz > Dostosuj > Jasność/Kontrast.</li>
	<li>Aby wyeksportować pojedynczy obraz, przesuń suwak skali czasu do odpowiedniej klatki i wybierz Plik > Zapisz jako > JPEG lub dowolny preferowany format.</li>
	<li>Wybierz lokalizację i tytuł eksportowanego pliku, a następnie zapisz. 
	Uwaga Liczba klatek na sekundę z oprogramowania do przetwarzania obrazu będzie wymagana do nadania znacznika czasu na obrazie.</li>
	<li>Aby wyeksportować szereg czasowy jako film, wybierz: Plik > Zapisz jako > AVI, a następnie wybierz liczbę klatek na sekundę (~ 7 klatek na sekundę).</li>
	<li>Wybierz lokalizację i tytuł eksportowanego pliku, a następnie zapisz.</li>
	<li>Aby zapisać skorygowany plik w formacie Fidżi, wybierz opcję Plik > Zapisz.</li>
</ol>

<ol><li>Stricker, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparative+biology+of+calcium+signaling+during+fertilization+and+egg+activation+in+animals%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">Comparative biology of calcium signaling during fertilization and egg activation in animals.</a> Dev Biol. 211 (2), 157-176 (1999).</li>
<li>Horner, V. L., Wolfner, M. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transitioning+from+egg+to+embryo%3A+triggers+and+mechanisms+of+egg+activation%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Dyn%22%5BJournal%5D)">Transitioning from egg to embryo: triggers and mechanisms of egg activation.</a> Dev Dyn. 237 (3), 527-544 (2008).</li>
<li>Gilkey, J. C., Jaffe, L. F., Ridgway, E. B., Reynolds, G. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+free+calcium+wave+traverses+the+activating+egg+of+the+medaka%2C+Oryzias+latipes%5BTitle%5D)+AND+%22J+Chem+Biol%22%5BJournal%5D)">A free calcium wave traverses the activating egg of the medaka, Oryzias latipes.</a> J Chem Biol. 76 (2), 448-466 (1978).</li>
<li>Fujiwara, T., Nakada, K., Shirakawa, H., Miyazaki, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+inositol+trisphosphate-induced+calcium+release+mechanism+during+maturation+of+hamster+oocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">Development of inositol trisphosphate-induced calcium release mechanism during maturation of hamster oocytes.</a> Dev Biol. 156 (1), 69-79 (1993).</li>
<li>Hafner, M., Petzelt, C., Nobiling, R., Pawley, J. B., Kramp, D., Schatten, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Wave+of+free+calcium+at+fertilization+in+the+sea+urchin+egg+visualized+with+fura-2%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Motil+Cytoskeleton%22%5BJournal%5D)">Wave of free calcium at fertilization in the sea urchin egg visualized with fura-2.</a> Cell Motil Cytoskeleton. 9 (3), 271-277 (1988).</li>
<li>Fontanilla, R. A., Nuccitelli, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+the+sperm-induced+calcium+wave+in+Xenopus+eggs+using+confocal+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys+J%22%5BJournal%5D)">Characterization of the sperm-induced calcium wave in Xenopus eggs using confocal microscopy.</a> Biophys J. 75 (4), 2079-2087 (1998).</li>
<li>Kotlikoff, M. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetically+encoded+Ca2%2B+indicators%3A+using+genetics+and+molecular+design+to+understand+complex+physiology%5BTitle%5D)+AND+%22J+Physiol%22%5BJournal%5D)">Genetically encoded Ca2+ indicators: using genetics and molecular design to understand complex physiology.</a> J Physiol. 578, (Pt 1) 55-67 (2007).</li>
<li>Douglass, A. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aDouglass%2C+A+%22New+Techniques+in+Systems+Neuroscience%22">New Techniques in Systems Neuroscience</a>. , Springer. (2015).</li>
<li>Nakai, J., Ohkura, M., Imoto, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+high+signal-to-noise+Ca%282%2B%29+probe+composed+of+a+single+green+fluorescent+protein%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">A high signal-to-noise Ca(2+) probe composed of a single green fluorescent protein.</a> Nat Biotechnol. 19 (2), 137-141 (2001).</li>
<li>Akerboom, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optimization+of+a+GCaMP+calcium+indicator+for+neural+activity+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Optimization of a GCaMP calcium indicator for neural activity imaging.</a> J Neurosci. 32 (40), 13819-13840 (2012).</li>
<li>Chen, T. -W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ultrasensitive+fluorescent+proteins+for+imaging+neuronal+activity%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Ultrasensitive fluorescent proteins for imaging neuronal activity.</a> Nature. 499 (7458), 295-300 (2013).</li>
<li>Wang, J., Wong, A., Flores, J., Vosshall, L., Axel, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Two-photon+calcium+imaging+reveals+an+odor-evoked+map+of+activity+in+the+fly+brain%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Two-photon calcium imaging reveals an odor-evoked map of activity in the fly brain.</a> Cell. 112 (2), 271-282 (2003).</li>
<li>Kaneuchi, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Calcium+waves+occur+as+Drosophila+oocytes+activate%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Calcium waves occur as Drosophila oocytes activate.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 112 (3), 791-796 (2015).</li>
<li>York-Andersen, A. H., Parton, R. M., Bi, C. J., Bromley, C. L., Davis, I., Weil, T. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+single+and+rapid+calcium+wave+at+egg+activation+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Biol+Open%22%5BJournal%5D)">A single and rapid calcium wave at egg activation in Drosophila.</a> Biol Open. 4 (4), 553-560 (2015).</li>
<li>Mahowald, A. P., Goralski, T. J., Caulton, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro+activation+of+Drosophila+eggs%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">In vitro activation of Drosophila eggs.</a> Dev Biol. 98 (2), 437-445 (1983).</li>
<li>Page, A. W., Orr-Weaver, T. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Activation+of+the+meiotic+divisions+in+Drosophila+oocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">Activation of the meiotic divisions in Drosophila oocytes.</a> Dev Biol. 183 (2), 195-207 (1997).</li>
<li>Horner, V. L., Wolfner, M. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanical+stimulation+by+osmotic+and+hydrostatic+pressure+activates+Drosophila+oocytes+in+vitro+in+a+calcium-dependent+manner%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">Mechanical stimulation by osmotic and hydrostatic pressure activates Drosophila oocytes in vitro in a calcium-dependent manner.</a> Dev Biol. 316 (1), 100-109 (2008).</li>
<li>Weil, T. T., Parton, R. M., Davis, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Preparing+individual+Drosophila+egg+chambers+for+live+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Preparing individual Drosophila egg chambers for live imaging.</a> J Vis Exp. (60), (2012).</li>
<li>Essentials of Biology 1: yeast, Drosophila and C. elegans. Drosophila Maintenance. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%22JoVE+Science+Education+Database%22">JoVE Science Education Database</a>. , JoVE. Cambridge, MA. (2016).</li>
<li>Melom, J. E., Littleton, J. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mutation+of+a+NCKX+Eliminates+Glial+Microdomain+Calcium+Oscillations+and+Enhances+Seizure+Susceptibility%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Mutation of a NCKX Eliminates Glial Microdomain Calcium Oscillations and Enhances Seizure Susceptibility.</a> J Neurosci. 33 (3), 1169-1178 (2013).</li>
<li>Munro, E., Nance, J., Priess, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cortical+flows+powered+by+asymmetrical+contraction+transport+PAR+proteins+to+establish+and+maintain+anterior-posterior+polarity+in+the+early+C.+elegans+embryo%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Cell%22%5BJournal%5D)">Cortical flows powered by asymmetrical contraction transport PAR proteins to establish and maintain anterior-posterior polarity in the early C. elegans embryo.</a> Dev Cell. 7 (3), 413-424 (2004).</li>
<li>Maruyama, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((EGG-3+regulates+cell-surface+and+cortex+rearrangements+during+egg+activation+in+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Biol%22%5BJournal%5D)">EGG-3 regulates cell-surface and cortex rearrangements during egg activation in Caenorhabditis elegans.</a> Curr Biol. 17 (18), 1555-1560 (2007).</li>
<li>Wong, G. K., Woods, M. A., Szymczak, R. K., Gavlik, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Disruption+of+normal+actin+cytoskeletal+reorganization+affects+cell+cycle+time+in+fertilized+sea+urchin+eggs%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Biol+Cell%22%5BJournal%5D)">Disruption of normal actin cytoskeletal reorganization affects cell cycle time in fertilized sea urchin eggs.</a> Mol Biol Cell. 15, 23(2004).</li>
<li>Horner, V. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Drosophila+calcipressin+sarah+is+required+for+several+aspects+of+egg+activation%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Biol%22%5BJournal%5D)">The Drosophila calcipressin sarah is required for several aspects of egg activation.</a> Curr Biol. 16 (14), 1441-1446 (2006).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Pierwszym krytycznym krokiem w tym protokole jest odizolowanie dojrzałych jaj bez uszkodzenia. Można to osiągnąć poprzez delikatne manewrowanie jajami za pomocą sondy preparucyjnej. Praktyka umożliwi wykonanie tej manipulacji bez uszkodzenia jaj. Drugim kluczowym krokiem jest uniknięcie utraty próbki po nałożeniu buforu aktywacyjnego na dojrzałą komórkę jajową w oleju. Nakładanie buforu aktywacyjnego powinno odbywać się powoli i bez kontaktu ze szkiełkiem nakrywkowym. Ten etap może być trudny, jeśli konfiguracja mikroskopu nie pozwala na łatwy dostęp do próbki. Wskazane jest poruszanie pachowych części mikroskopu, takich jak inkubator temperatury. 
Modyfikacje tego protokołu mogą być wprowadzone w celu wizualizacji innych czynników znakowanych fluorescencyjnie, zamiast Ca2+ podczas aktywacji jaja. Mówiąc bardziej ogólnie, za pomocą tego protokołu można analizować różne etapy rozwoju Drosophila lub wyniki dodania innego bufora. 
Rozwiązywanie problemów może być wymagane, jeśli ustawienia mikroskopu nie są optymalne do wizualizacji sygnału z próbki. Można to osiągnąć poprzez zwiększanie lub zmniejszanie mocy lasera, zmianę zasięgu przechwytywania i dostosowanie parametrów stosu Z. Innym problemem może być konsekwentne przemieszczanie się jaj poza pole widzenia po dodaniu bufora aktywacyjnego. Jeśli zdarza się to regularnie, pozwól dojrzałym jajom osiąść na szkiełkach nakrywkowych przez dłuższy czas, od 15 do 20 minut. Należy pamiętać, że użycie oleju o wyższej lepkości zmieni wyporność oleju przez bufor aktywacyjny. 
Ta przedstawiona tutaj technika jest ograniczona odległością roboczą obiektywu, odwodnieniem dojrzałych jaj i zdolnością do rozwarstwienia dojrzałych jaj bez uszkodzenia. Jednak w porównaniu z metodami obrazowania in vivo , w których dojrzały oocyt przechodzi przez dorosłą samicę i zostaje zdeponowany 13, nasza metoda umożliwia większą rozdzielczość przestrzenną, możliwość fizycznej manipulacji dojrzałą komórką jajową przed aktywacją oraz możliwość przetestowania roli aktywacji komórki jajowej bez zapłodnienia. 
Istnieje wiele potencjalnych przyszłych zastosowań tej techniki, w tym testowanie konstruktów reporterowych dla komponentów komórkowych podczas aktywacji jaj i wizualizacja fali Ca2+ w zmutowanym tle 14,24. Wraz z narzędziami eksperymentalnymi i genetycznymi, przedstawiony tutaj test aktywacji jaj ex vivo umożliwia badanie wyzwalania, propagacji i dalszych skutków uniwersalnie konserwatywnej fali Ca2+ .

Zmiana wewnątrzkomórkowego stężenia Ca2+ przy aktywacji jaja (oocytu) jest zachowanym składnikiem wszystkich badanych organizmów 1,2. Zdarzenie to inicjuje szeroki zakres procesów zależnych odCa2+, w tym wznowienie cyklu komórkowego i translację przechowywanych mRNA. Ze względu na to zapotrzebowanie na Ca2+, wizualizacja przejściowych zmian w wewnątrzkomórkowych stężeniach Ca2+ była kluczowa dla celu.
Historycznie, organizmy modelowe były wybierane do badań nad aktywacją jaj na podstawie wielkości i dostępności ich jaj. Zastosowano różne podejścia do wizualizacji w celu śledzenia i ilościowego określania zmian w wewnątrzkomórkowych stężeniach Ca2 + w tych systemach, w tym: fotoproteiny aequorin w rybach medaka 3; Ca2+ wrażliwe barwniki fluorescencyjne, takie jak Fura-2 w jeżowcu i chomiku 4,5; i zieleń wapniowa-1-dekstran w Xenopus 6.
Generowanie i ulepszanie genetycznie kodowanych wskaźników wapnia (GECI) zmieniło zdolność do wizualizacji dynamiki Ca2+ in vivo 7. Te konstrukty genetyczne ulegają ekspresji w określonych tkankach i ograniczają potrzebę stosowania inwazyjnych preparatów tkankowych 8.
GCaMPs to klasa GECI oparta na zielonym białku fluorescencyjnym (GFP), która okazała się bardzo skuteczna ze względu na ich wysokie powinowactwo do Ca2+, stosunek sygnału do szumu i możliwość dostosowania do 9-11. W obecnościCa2+ kompleks GCaMP ulega szeregowi zmian konformacyjnych, począwszy od wiązania Ca2+ z kalmoduliną, co skutkuje zwiększoną intensywnością fluorescencji składnika GFP 9.
GCaMPs były szeroko wykorzystywane w badaniach nad neuronami Drosophila do wizualizacji zmian w wewnątrzkomórkowym wapniu12. Niedawne zastosowanie technologii GCaMP do wizualizacji Ca2+ w dojrzałych jajach Drosophila ujawniło pojedynczą przejściową falę Ca2+ przy aktywacji jaj 13,14. Falę Ca2+ można uwidocznić w małym powiększeniu podczas owulacji in vivo 13 lub w większym powiększeniu za pomocą testu aktywacji ex vivo 13,14. W teście ex vivo poszczególne dojrzałe oocyty są izolowane z jajników i aktywowane za pomocą roztworu hipotonicznego, określanego jako bufor aktywacyjny, który, jak wykazano, podsumowuje zdarzenia aktywacji in vivo 15-17.
Ten test ex vivo umożliwia łatwą wizualizację fali Ca2+ w wysokiej rozdzielczości w różnych warunkach eksperymentalnych, w tym przy zakłóceniach farmakologicznych, manipulacjach fizycznych i genetycznych mutantach. W artykule przedstawiono przygotowanie dojrzałych jaj Drosophila do aktywacji ex vivo i późniejszą mikroskopię wykorzystywaną do wizualizacji fali Ca2+ za pomocą GCaMP. Podejście to można wykorzystać do przetestowania inicjacji i kontroli fali Ca2+ oraz do zbadania dalszych wyników.

<table><tbody><tr><td>Drożdże czynne suche</td><td>Fleischman' s</td><td>#2192</td><td></td></tr><tr><td>Mikroskop preparacyjny</td><td>Leica</td><td>MZ6</td><td>Różne będą działać</td></tr><tr><td>Lampa</td><td>Mircotec Światłowód</td><td>MF0-90</td><td>Różne będą działać</td></tr><tr><td>Chusteczki medyczne</td><td>Kimberly-Clark Corporation</td><td>KLEW3020&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Marker</td><td>Stabilo</td><td>841/46</td><td>OHPen uniwersalny, - dostępny w większości sklepów stacjonarnych. Bardzo drobna szerokość 0,4 mm</td></tr><tr><td>CO2 pad</td><td>&nbsp; Genesee Scientific</td><td>59-114 (789060 Dutscher)</td><td></td></tr><tr><td>Szkiełko nakrywkowe nr 1.5, 22 x 50 mm</td><td>międzynarodowe- Nr 1-VWR Kat=631-0137-22-50mm</td><td>Menzel-Glaser-22-50mm-MNJ 400-070T&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Olej halowęglowy, seria 95</td><td>Halocarbon Products Corp.</td><td>Dystrybutor w Europie:</td><td></td></tr><tr><td>Solvadis (GMBH)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Oil 10 S</td><td>VWR Chemicals</td><td>24627.188</td><td>Może być stosowany zamiast oleju halowęglowego, seria 95</td></tr><tr><td>Kleszcze</td><td>Fine Science Tools</td><td>11252-00</td><td>Chociaż narzędzia te powinny być czyste, użycie autoklawu nie jest konieczne, etanol byłby wystarczający.</td></tr><tr><td>Sonda</td><td>Fine Science Tools</td><td>10140-01</td><td></td></tr><tr><td>Pipeta szklana</td><td>Fisherbrand,FB50251</td><td></td> <td>Pasteur Pipety, szklane, bez zasilania, 150 mm długości&nbsp;</td></tr><tr><td>Fiolka</td><td>Regina Industries</td><td>P1014</td><td>GPPS&nbsp; 80 mm x 25 mm</td></tr></tbody></table>

obrazowanie wapnia u drosophila podczas aktywacji jaj

Imaging Calcium in Drosophila at Egg Activation

Aktywacja jaj to uniwersalny proces, który obejmuje serię zdarzeń, które pozwalają zapłodnionemu jaju zakończyć mejozę i zainicjować rozwój embrionalny. Jednym z aspektów aktywacji jaj, zachowanym we wszystkich badanych organizmach, jest zmiana wewnątrzkomórkowego stężenia wapnia (Ca2+) często nazywana "falą Ca2+". Podczas gdy prędkość i liczba oscylacji fali Ca2+ różni się w zależności od gatunku, zmiana wewnątrzkomórkowego Ca2 + ma kluczowe znaczenie dla wywołania wydarzeń niezbędnych dla rozwoju embrionalnego. Zmiany te obejmują wznowienie cyklu komórkowego, regulację mRNA, egzocytozę ziarnistości korowej i rearanżację cytoszkieletu.
W dojrzałym jaju Drosophila, aktywacja następuje w jajowodzie samicy przed zapłodnieniem, inicjując serię zdarzeń zależnych odCa2+. W tym miejscu przedstawiamy protokół obrazowania fali Ca2+ u Drosophila. Podejście to zapewnia manipulowalny system modelowy do badania mechanizmu fali Ca2+ i związanych z nią dalszych zmian.

W niniejszej pracy zademonstrowaliśmy sposób przygotowania dojrzałych jaj Drosophila do aktywacji ex vivo. Jaja wykazujące ekspresję GECI umożliwiają obrazowanie dynamiki Ca2+ podczas aktywacji jaja oraz na początku rozwoju embrionalnego (Rycina 1). Należy zauważyć, że w zależności od zastosowanego GCaMP, a w szczególności od obecności grupy mirystoilowej, wyniki mogą wykazywać niewielkie różnice jakościowe13 14. Zademonstrowaliśmy również rolę funkcjonalnej aktyny podczas aktywacji jaja poprzez dodanie do buforu aktywacyjnego cytochalazyny D, inhibitora polimeryzacji aktyny (Rycina 2) 14. 
  
Konieczność udziału cytoszkieletu podczas aktywacji jaja jest cechą konserwatywną. U C. elegans po zapłodnieniu składniki cytoszkieletu ulegają reorganizacji, aby przygotować jednokomórkowy embrion do pierwszego podziału asymetrycznego 21,22. Wykazano, że u jeżowca zaburzenie reorganizacji cytoszkieletu po aktywacji wpływa na cykl komórkowy poprzez zapobieganie tworzeniu się pierścienia kurczliwego 23. Rola aktyny w pośredniczeniu fali Ca2+ oraz jej późniejsza funkcja podczas aktywacji jaja u Drosophila nie została jeszcze w pełni wyjaśniona. 
  
U Drosophila współwizualizacja fali Ca2+ i cytoszkieletu aktynowego jest możliwa dzięki zastosowaniu tego testu aktywacji ex vivo. Można pozyskiwać serie czasowe z wielu kanałów, a dynamikę wewnątrzkomórkowego Ca2+ dopasować do zmian w organizacji aktyny w oocycie (Rycina 3).
<img alt="Mikroskopia fluorescencyjna time-lapse, aktywność komórkowa w rozwijającym się embrionie, seria obrazów w odstępach czasu." src="/files/ftp_upload/54311/54311fig1.jpg" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Rysunek 1"> 
Rysunek 1: Pojedynczy jon Ca2+2+ Fala w Muszka owocówka Aktywacja komórki jajowej. Szereg czasowy ex vivo dojrzały Muszka owocówka jajo wykazujące ekspresję UASt-myrGCaMP5 po dodaniu buforu aktywującego (A-H)Wzrost stężenia Ca2+ w cytoplazmie2+ rozpoczyna się na biegunie tylnym (B) i namnaża (B-F) z przeciętną prędkością wynoszącą około 1.5 µm/secRozpoczęcie fali jest zazwyczaj obserwowane w ciągu 3 min od dodania buforu aktywacyjnego. Po aktywacji wewnątrzkomórkowe poziomy wapnia w dojrzałym oocyte powracają do wartości sprzed aktywacji. (G,H)Patrz film uzupełniający 1 (czas całkowity 33 min). Paski skali = 50 µmMaksymalna projekcja = 40 µm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54311/54311fig1large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ilustracji.</a>

<img alt="Lokalizacja białek w czasie rzeczywistym in vivo; obrazy z mikroskopii fluorescencyjnej; analiza ruchu komórkowego." src="/files/ftp_upload/54311/54311fig2.jpg" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Rysunek 2"> 
Rysunek 2: Dodanie cytochalazyny D do buforu aktywacyjnego zaburza poziom Ca2+2+ Propagacja fal. Szeregi czasowe ex vivo dojrzały Muszka owocówka jajo wykazujące ekspresję UASt-myrGCaMP5 po dodaniu buforu aktywacyjnego zawierającego 10 µg/ml stężenie końcowe cytochalazyny D (A-H)Podczas gdy Ca2+ fala rozpoczyna się w biegunie tylnym (A)jest on upośledzony i nie dociera do przedniej części jaja (F) (białe groty strzałek wskazują czoło fali). Brak dalszego Ca2+ obserwowano zmiany w ciągu 30 min). Patrz: dodatkowy film 2 (całkowity czas 30 min). Paski skali = 50 µmMaksymalna projekcja = 40 µm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54311/54311fig2large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.</a>
<img alt="Mikroskopia poklatkowa, sygnał fluorescencyjny, rozwój komórki, stadia A-H, lokalizacja białka." src="/files/ftp_upload/54311/54311fig3.jpg" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Rysunek 3"> 
Rysunek 3: Współwizualizacja aktyny i Ca2+ podczas aktywacji oocytu w Muszka owocówka. Szeregi czasowe ex vivo dojrzały Muszka owocówka jajo wykazujące ekspresję UASt-myrGCaMP5 (Cyjan) oraz UASp-F-Tractin.tdTomato (Magenta) po dodaniu buforu aktywującego (A-H). Ca2+ fala rozpoczyna się od bieguna tylnego i powraca w sposób analogiczny do Rycina 1Aktyna wydaje się zmieniać w czasie, białe groty strzałek (A kontra H) Brak Ca2+ wykrycie sygnału w centrum dojrzałej komórki jajowej wynika z przemieszczania się próbki podczas przechwytywania obrazu. Paski skali = 50 µmMaksymalna projekcja = 40 µm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54311/54311fig3large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.</a>

Ten artykuł opisuje adaptowalny protokół ex vivo do wizualizacji Ca2+ podczas aktywacji jaj u Drosophila.

Obrazowanie wapnia u Drosophila podczas aktywacji jaj

Egg activation is a universal process that includes a series of events to allow the fertilized egg to complete meiosis and initiate embryonic development. ...

Ogólnym celem niniejszej procedury jest wizualizacja wapnia podczas aktywacji jaja u Drosophila melanogaster. Metoda ta może pomóc w uzyskaniu odpowiedzi na kluczowe pytania z zakresu biologii rozwoju, takie jak źródło, dynamika oraz funkcje efektorowe wapnia podczas aktywacji jaja. Głównymi zaletami tej techniki są możliwość uzyskania wyższej rozdzielczości przestrzennej, fizyczna manipulacja dojrzałym jajem przed aktywacją oraz badanie roli aktywacji jaja bez zapłodnienia.Zazwyczaj osoby rozpoczynające pracę z tą metodą mają trudności z izolacją dojrzałych jaj bez ich uszkodzenia oraz z aplikacją buforu aktywacyjnego do dojrzałego jaja bez utraty próbki. Aby rozpocząć tę procedurę, ustaw powiększenie mikroskopu stereoskopowego na 4X. Na pierwszym szkiełku nakrywkowym oddziel dwa jajniki, rozrywając jajowody za pomocą zamkniętej pęsety i sondy sekcyjnej, dbając o to, aby nie przebić żadnej z komór jajowych.Następnie wprowadź standardową sondę preparacyjną do centrum jajnika, obok zamkniętej pincety. Delikatnie przesuń sondę przez jajnik w kierunku bieguna tylnego, w którym znajdują się dojrzałe jaja. Gdy dojrzałe jaja staną się widoczne na szkiełku nakrywkowym poza jajnikiem, ustaw trzy do pięciu z nich w linii w centrum.Następnie usuń pozostałą tkankę jajnika, odsuwając ją od wyrównanych komórek jajowych. Potem usuń nadmiar oleju, przykładając róg chusteczki medycznej. Za pomocą markera narysuj na szkiełku nakrywkowym celownik, aby ułatwić zlokalizowanie próbki pod mikroskopem.Następnie pozostaw przygotowane komory z jajami na szkiełku nakrywce na od 5 do 10 minut, aby jaja osiadły w oleju. Przenieś do pracowni obrazowania przygotowane szkiełka nakrywkie, bufor aktywacyjny w temperaturze pokojowej oraz pipety szklane. Wybierz obiektyw odpowiedni do obrazowania całego dojrzałego jaja.Następnie zamocuj pierwszą przygotowaną lamellkę na stoliku mikroskopu. W kolejnym kroku wybierz w polu widzenia dojrzałą komorę jajeczkową do aktywacji. Ustaw parametry obrazowania dla standardowej ekscytacji i emisji GFP.Następnie ustaw widok w jasnym polu, aby zwizualizować i zorientować dojrzałe jajo oraz przemieszczony olej. Teraz wybierz najniższą płaszczyznę Z, na której widoczne są dojrzałe jaja. Następnie ustaw pełny stos Z (Z-stack), który zostanie wykonany dla 40 micrometers z krokiem 2 micrometers.Następnie ustaw serię czasową tak, aby obrazowanie trwało 30 minut. W tej procedurze rozpocznij przechwytywanie obrazów i wykonaj jeden lub dwa pełne stosy Z (Z-stacks), aby ukazać dojrzałą komórkę jajową przed aktywacją. Następnie pobierz około 300 µl buforu aktywacyjnego do pipety szklanej.Ustaw końcówkę szklanej pipety zawierającej bufor aktywacyjny pod kątem 45 stopni nad szkiełkiem nakrywką, a następnie powoli przesuń pipetę w stronę wiązki, aż znajdzie się ona bezpośrednio nad obrazowanym dojrzałym jajeczkiem. Dodaj od jednej do dwóch kropli buforu aktywacyjnego w czasie krótszym niż pięć sekund, aby wyprzeć olej. Dodanie jednej lub dwóch kropli buforu aktywacyjnego musi zostać wykonane pod odpowiednim kątem, delikatnie i szybko.Podczas dodawania buforu aktywacyjnego w trakcie akwizycji obrazu, należy sprawdzić kanał w polu jasnym, aby upewnić się, że olej został usunięty. Po pomyślnym usunięciu oleju należy pozwolić na zakończenie serii czasowej. Aby utworzyć projekcję pozyskanych danych, należy wybrać początkowy i końcowy przekrój Z dla całej sekcji.Następnie wybierz typ projekcji, na przykład maksymalną intensywność. Dalej zaznacz pole wyboru Wszystkie klatki czasowe, aby zastosować wybrane ustawienia do całej serii. Aby dostosować jasność i kontrast obrazu, wybierz Image, następnie Adjust, a potem Brightness/Contrast.Aby wyeksportować szereg czasowy jako film, wybierz Plik, następnie Zapisz jako, a potem AVI. Następnie wybierz liczbę klatek na sekundę. Przedstawiono tutaj szereg czasowy dojrzałego jaja Drosophila ex vivo wykazującego ekspresję genetycznie zakodowanego wskaźnika wapnia po dodaniu buforu aktywacyjnego.Wzrost stężenia wapnia cytoplazmatycznego rozpoczyna się na biegunie tylnym, a następnie rozprzestrzenia się ze średnią prędkością około 1,5 micrometers per second. Inicjację fali obserwuje się zazwyczaj w ciągu trzech minut od dodania buforu aktywacyjnego. Po aktywacji poziomy wapnia wewnątrzkomórkowego w dojrzałym jajku powracają do normy.U Drosophila co-wizualizację fali wapniowej i cytoszkieletu aktynowego można przeprowadzić za pomocą tego testu aktywacji ex vivo. Aktyna wydaje się zmieniać w czasie, co wskazują białe groty strzałek. Brak detekcji sygnału wapniowego w centrum dojrzałego jaja wynika z ruchu próbki podczas przechwytywania obrazu.Po opanowaniu, cała ta technika może zostać wykonana w czasie krótszym niż godzina, jeśli jest przeprowadzona prawidłowo. Podczas wykonywania tej procedury ważne jest, aby nie spieszyć się podczas manipulowania komorami z jajami oraz podczas ustawiania parametrów akwizycji. Procedurę tę można dostosować do wizualizacji innych białek znakowanych fluorescencyjnie, organelli lub wskaźników wapnia podczas aktywacji jaj.Może to pomóc w wyjaśnieniu kwestii dotyczących źródła wapnia oraz efektów następczych.

imaging-calcium-in-drosophila-at-egg-activation

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Biologia rozwojowa

Opisujemy uznaną technikę pomiaru i analizy odpowiedzi wapniowych wywołanych zapachami w płacie antennym żywych Drosophila melanogaster.

Obrazowanie wapniowe odpowiedzi wywołanych zapachami w płacie antennym Drosophila

Ten film opisuje obrazowanie in vivo wapnia w neuronach Drosophila za pomocą GCaMP. Prezentowany klip protokołu pokazuje, jak rejestrować zmiany we fluorescencji GCaMP z neuronów ciała grzyba podczas eksperymentu kondycjonowania węchowego.

Drosophila In Vivo (Drosophila) in vivo (Drosophila) Obrazowanie wapnia: metoda funkcjonalnego obrazowania aktywności neuronalnej

Ten film demonstruje technikę obrazowania wapnia w pojedynczych neuronach zachowujących się Caenorhabditis elegans za pomocą genetycznie kodowanych fluorescencyjnych białek reporterowych. Przedstawiono w nim etapy związane z obrazowaniem ruchu robaków i pomiarem współczynników fluorescencji reporterowej z neuronów w celu skorelowania wewnątrzkomórkowego poziomu wapnia z aktywnością neuronów i zmianami behawioralnymi podczas składania jaj.

Obrazowanie wapnia w poszczególnych neuronach regulujących składanie jaj u Caenorhabditis elegans

Źródło: Ishimoto, H. et. al.,, Obrazowanie wapnia ex vivo do wizualizacji reakcji mózgu na sygnalizację endokrynologiczną u Drosophila. J. Vis. exp. (2018) Ten film przedstawia obrazowanie wapnia do badaniaDrosophila reakcje mózgu na neuropeptydy. Neurony wyrażające fluorescencyjny wskaźnik wapnia ujawniają wewnątrzkomórkową dynamikę wapnia i funkcjonalne odpowiedzi na cząsteczki sygnałowe.

Obrazowanie wapnia ex vivo w celu zbadania reakcji mózgu Drosophila na neuropeptydy

Metoda obrazowania pionowego opisana w tym protokole pozwala na szczegółową wizualizację biegunów rozwijającego się jaja Drosophila melanogaster.  Ten widok od początku zapewnia nową perspektywę na rozmieszczenie i morfologię wielu typów komórek w nabłonku pęcherzykowym.

Obrazowanie pionowe komór jajowych Drosophila

Ten artykuł opisuje protokół obrazowania ex vivo wapnia mózgu Drosophila. W tej metodzie do buforu można zastosować naturalne lub syntetyczne związki, aby przetestować ich zdolność do aktywacji określonych neuronów w mózgu.

Ex vivo Obrazowanie wapnia do wizualizacji reakcji mózgu na sygnalizację endokrynologiczną u Drosophila

Tutaj prezentujemy protokół, za pomocą którego można wizualizować wapń pre- i/lub postsynaptyczny w kontekście uczenia się i zapamiętywania Drosophila. Obrazowanie wapnia in vivo przy użyciu synaptycznie zlokalizowanych czujników wapnia jest połączone z klasycznym paradygmatem warunkowania węchowego, dzięki czemu można określić plastyczność synaptyczną leżącą u podstaw tego typu uczenia się asocjacyjnego.

Optyczne obrazowanie wapnia in vivo plastyczności synaptycznej indukowanej uczeniem się u Drosophila melanogaster

Tutaj opisujemy protokół wykrywania i lokalizacji białka zarodka Drosophila i RNA od pobrania do wstępnego osadzenia i osadzenia, barwienia immunologicznego i hybrydyzacji mRNA in situ.

Protokół immunohistochemii i dystrybucji RNA in-situ we wczesnym zarodku Drosophila

Tutaj prezentujemy protokół obrazowania ex vivo wapnia u dorosłych Drosophila wykazujących ekspresję GCaMP6 w celu monitorowania aktywności epileptiformalnej. Protokół stanowi cenne narzędzie do badania zdarzeń moczowych u dorosłych Drosophila poprzez obrazowanie wapnia ex vivo, co pozwala na zbadanie potencjalnych mechanizmów padaczki na poziomie komórkowym.

Ex vivo Obrazowanie wapnia w modelu padaczki Drosophila

Tutaj prezentujemy protokoły i narzędzia do wizualizacji wapnia podczas zapłodnienia i wczesnej embriogenezy za pomocą genetycznie kodowanego reportera wapnia wyrażonego w linii zarodkowej modelowego nicienia C. elegans.

Wizualizacja in vivo stanów przejściowych wapnia podczas nawożenia i wczesnego rozwoju C. elegans

Przedstawiamy protokoły obrazowania wapnia dla larwalnego neuronu węchowego Drosophila , wykorzystując miejscowy klej tkankowy do unieruchomienia. Ta metoda zwiększa stabilność, ułatwiając wiarygodne eksperymenty in vivo i ex-vivo . Niestandardowe skrypty R analizują sygnały wapnia, zapewniając efektywną platformę do szczegółowych badań neurofizjologicznych.

Obrazowanie wapnia in vivo i ex vivo neuronu obwodu węchowego u larwy Drosophila melanogaster w trzecim stadium

Poznaj metodę obrazowania wapnia podczas aktywacji jaj u Drosophila melanogaster. Technika ta pozwala badać dynamikę jonów wapnia z wysoką rozdzielczością przestrzenną w biologii rozwoju.

Obrazowanie wapnia u Drosophila podczas aktywacji jaj

Przeglądaj więcej filmów