Obrazowanie wapnia u Drosophila podczas aktywacji jaj

Ogólnym celem tej procedury jest wizualizacja wapnia podczas aktywacji jaj u Drosophila melanogaster. Metoda ta może pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytania w biologii rozwoju, takie jak źródło, dynamika i dalsza rola wapnia podczas aktywacji jaj. Głównymi zaletami tej techniki są umożliwienie wyższej rozdzielczości przestrzennej, fizyczna manipulacja dojrzałą komórką jajową przed aktywacją oraz testowanie roli aktywacji komórki jajowej bez zapłodnienia.

Ogólnie rzecz biorąc, osoby, które nie mają doświadczenia w tej metodzie, będą miały trudności z wyizolowaniem dojrzałych jaj bez uszkodzenia i zastosowaniem bufora aktywacyjnego do dojrzałej komórki jajowej bez utraty próbki. Aby rozpocząć tę procedurę, ustaw powiększenie mikroskopu preparacyjnego na 4X. Na pierwszym szkiełku nakrywkowym oddziel dwa jajniki, rozrywając jajowód parą zamkniętych kleszczy i sondą preparacyjną, uważając, aby nie przebić żadnych komór jajowych.

Następnie włóż standardową sondę preparacyjną do środka jajnika, obok zamkniętych kleszczy. Delikatnie przeciągnij sondę preparacyjną przez jajnik w kierunku tylnego bieguna, gdzie znajdują się dojrzałe jaja. Gdy dojrzałe jaja będą widoczne na szkiełku nakrywkowym na zewnątrz jajnika, manewruj trzema do pięciu z nich w linii pośrodku.

Następnie usuń resztę tkanki jajnika, odciągając ją od wyrównanych komórek jajowych. Następnie usuń nadmiar oleju, przecierając go rogiem chusteczki medycznej. Narysuj krzyżyk na szkiełku nakrywkowym za pomocą markera, aby zlokalizować próbkę pod mikroskopem.

Następnie pozostaw przygotowane komory na jajka na szkiełku nakrywkowym na pięć do 10 minut, aby jajka mogły osiąść w oleju. Przynieś do urządzenia do obrazowania przygotowane szkiełka nakrywkowe, bufor aktywacyjny do pomiaru temperatury pokojowej i szklane pipety. Wybierz obiektyw odpowiedni do obrazowania całej dojrzałej komórki jajowej.

Następnie zamontuj pierwsze przygotowane szkiełko nakrywkowe na stoliku mikroskopu. Następnie wybierz pole view dojrzałej komory jajowej do aktywacji. Ustawić parametry obrazowania dla standardowego wzbudzenia i emisji GFP.

Następnie ustaw jasny widok pola, aby zwizualizować i zorientować dojrzałe jajo i przemieszczony olej. Teraz wybierz najniższą płaszczyznę Z, na której widoczne są dojrzałe jaja. I ustaw pełny stos Z, który ma być wykonany dla 40 mikrometrów przy dwóch mikrometrach na krok.

Następnie ustaw szereg czasowy, aby przechwytywać obrazy przez 30 minut. W tej procedurze rozpocznij przechwytywanie obrazu i zdobądź jeden lub dwa pełne stosy Z, aby pokazać dojrzałe jajo przed aktywacją. Następnie pobrać około 300 mikrolitrów buforu aktywacyjnego do szklanej pipety.

Umieścić końcówkę szklanej pipety zawierającej bufor aktywacyjny pod kątem 45 stopni powyżej szkiełka nakrywkowego i powoli przesuwać pipetę na ścieżkę wiązki, aż znajdzie się bezpośrednio nad obrazowaną dojrzałą komórką jajową. Dodaj jedną do dwóch kropli buforu aktywacyjnego w mniej niż pięć sekund, aby wyprzeć olej. Dodanie jednej lub dwóch kropli buforu aktywacyjnego musi odbywać się pod odpowiednim kątem, delikatnie i szybko.

Podczas dodawania bufora aktywacyjnego podczas akwizycji obrazu, sprawdź kanał jasnego pola, aby upewnić się, że olej został przemieszczony. Po pomyślnym przemieszczeniu oleju pozwól, aby szereg czasowy działał aż do zakończenia. Aby utworzyć projekcję uzyskanych danych, wybierz początkowy wycinek Z i końcowy wycinek Z dla całej sekcji.

Następnie wybierz typ projekcji, na przykład maksymalną intensywność. Następnie zaznacz pole wyboru Wszystkie ramy czasowe, aby zastosować wybrane ustawienia do całej serii. Aby dostosować jasność i kontrast obrazu, wybierz Obraz, następnie Dostosuj, a następnie Jasność/Kontrast.

Aby wyeksportować szereg czasowy jako film, wybierz Plik, następnie Zapisz jako, a następnie AVI. Następnie wybierz liczbę klatek na sekundę. Pokazano tutaj szereg czasowy dojrzałego jaja Drosophila ex vivo wykazującego ekspresję genetycznie kodowanego wskaźnika wapnia po dodaniu buforu aktywacyjnego.

Wzrost cytoplazmatycznego wapnia zaczyna się na tylnym biegunie, a następnie rozprzestrzenia się ze średnią prędkością około 1,5 mikrometra na sekundę. Inicjacja fali jest zwykle obserwowana w ciągu trzech minut od dodania buforu aktywacyjnego. Po aktywacji wewnątrzkomórkowy poziom wapnia w dojrzałej komórce jajowej odzyskuje się.

U Drosophila współwizualizację falowania wapniowego i cytoszkieletu aktynowego można osiągnąć za pomocą tego testu aktywacji ex vivo. Wydaje się, że aktyna zmienia się w czasie, na co wskazują białe groty strzałek. Brak detekcji sygnału wapnia w środku dojrzałej komórki jajowej jest spowodowany ruchem próbki podczas przechwytywania obrazu.

Po opanowaniu całą tę technikę można wykonać w mniej niż godzinę, jeśli zostanie wykonana prawidłowo. Próbując wykonać tę procedurę, należy pamiętać, aby nie spieszyć się podczas manewrowania komorami jajowymi oraz podczas ustawiania parametrów pozyskiwania. Procedurę tę można dostosować do wizualizacji innych znakowanych fluorescencyjnie białek, organelli lub wskaźników wapnia podczas aktywacji jaj

Może to pomóc w odpowiedzi na pytania dotyczące źródła wapnia i jego dalszych skutków.