Metoda celowanej izolacji komórek poprzez funkcjonalizację powierzchni szkła

Ogólnym celem procesu funkcjonalizacji powierzchni szklanej jest umożliwienie łagodnego wychwytywania i uwalniania wybranych komórek. Metoda ta może pomóc w udzieleniu odpowiedzi na kluczowe pytania z zakresu angiogenezy nowotworowej, umożliwiając przesiewowe badanie biomarkerów komórkowych wskazujących na lekooporność. Główną zaletą tej techniki jest to, że można ją w pełni dostosować do niemal każdego rodzaju interesujących nas komórek.

O ile istnieje przeciwciało specyficzne dla danego typu komórek, powierzchnię można dostosować do ich wychwytywania. Choć metoda ta może dostarczyć wiedzy na temat angiogenezy nowotworowej, może być ona również zastosowana w innych chorobach, ponieważ oczyszczone próbki są niezbędne do opracowania bardziej spersonalizowanych schematów leczenia. Pomysł na tę metodę pojawił się u nas podczas prób opracowania odwracalnego mechanizmu uwalniania do wychwytywania komórek, z wykorzystaniem oddziaływania między desthiobiotyną a rodziną adawin.

Po oczyszczeniu szklanej powierzchni w maszynie do plazmy tlenowej przez pięć minut zgodnie z protokołem tekstowym, przygotuj 2,5 ml 2% roztworu 3-aminopropylotrietoksysilanu (APTES), łącząc 50 µl APTES oraz 2,45 ml etanolu w probówce stożkowej. Nanieś pipetą roztwór APTES na powierzchnie szklane, a następnie przykryj je i umieść na wytrząsarce platformowej w temperaturze pokojowej na 50 minut, aby równomiernie rozprowadzić warstwę APTES. W międzyczasie rozgrzej piekarnik do 55 °C w przypadku płytek 8- i 24-dołkowych lub do 90 °C w przypadku szalek szklanych.

Po wyjęciu płytek z wytrząsarki, należy wypłukać szklane powierzchnie etanolem zgodnie z protokołem tekstowym. Powierzchnie należy wysuszyć za pomocą 100% azotu w fazie gazowej. Następnie płytki 8- i 24-dołkowe należy umieścić w piekarniku na dwie godziny, a szklane naczynia w piekarniku na jedną godzinę.

Następnie należy przygotować 2,5 mililitra roztworu d-desthiobiotyny (DSB), mieszając 1,5 miligrama na mililitr DSB w 37,5 mikrolitrach DMSO oraz dodając 5 miligramów na mililitr EDC do 2 462,5 mikrolitrów buforu MES 0,1 M, pH 6. Następnie należy połączyć oba roztwory. Po 15 minutach należy dodać jeden mikrolitr BME, aby zatrzymać reakcję między DSB a EDC.

Wyjmij gorące powierzchnie szklane funkcjonalizowane APTES z pieca i pozostaw je do ostygnięcia na pięć do 10 minut. Dodaj bufor MES na powierzchnie szklane, aby je wypłukać, trzymając pipetę pod kątem 70 stopni, tak aby końcówka nie była skierowana bezpośrednio na powierzchnię. Następnie odprowadź i pobierz bufor z jednego, stałego punktu, na przykład z narożnika studzienki.

Następnie użyć buforu MES do dwukrotnego opłukania. Nanieść roztwór DSB na powierzchnie szklane. Przenieść je na wilgotny ręcznik papierowy wewnątrz szalki Petriego, przykryć szalkę i inkubować w lodówce przez 18 do 24 godzin.

Po inkubacji w temperaturze czterech stopni Celsjusza przemyj każdą szklaną powierzchnię trzy razy za pomocą PBS, zgodnie z wcześniejszą prezentacją w tym filmie. Następnie rozcieńcz Streptawidynę, czyli roztwór stokowy SAV, do stężenia 0,4 mg/mL i równomiernie nanieś go na powierzchnie szklane, aby utworzyła się cienka warstwa. Po inkubacji szkła przez 18 do 24 godzin przemyj każdą powierzchnię trzy razy, używając 150 µL PBS.

Następnie zwilżyć ręcznik papierowy wodą dejonizowaną i wyłożyć nim płasko 14-centymetrową szalkę Petriego wokół płytek, aby utrzymać wilgotność w studzienkach. Przykryć szalkę Petriego szklanymi powierzchniami i umieścić ją w lodówce poziomu bezpieczeństwa biologicznego 1 w temperaturze 4°C do czasu użycia. Aby przeprowadzić wychwyt komórek, odessać medium z kolb T175 z komórkami.

Następnie użyj PBS do wypłukania komórek i odessij bufor. Do kolby dodaj 10 ml nieenzymatycznego środka do odrywania komórek, takiego jak Cell Dissociation Solution. Następnie inkubuj w temperaturze 37°C przez sześć minut.

Po sześciu minutach dodaj 10 mililitrów zimnego HBSS, aby rozcieńczyć czynnik odrywający. Następnie pobierz pipetą 20 mikrolitrów komórek i policz je za pomocą hemocytometru. Odwiruj zawiesinę komórkową przy 500 x g w temperaturze czterech stopni Celsjusza przez pięć minut.

Następnie należy użyć HBSS, aby resuspendować komórki do stężenia 1 × 10⁶ komórek/ml. Należy pipetować zawiesinę w górę i w dół, aby resuspendować komórki w roztworze i ograniczyć ich agregację, która mogłaby zmniejszyć wiązanie przeciwciał. Następnie zawiesinę komórkową należy podzielić na oddzielne roztwory kontrolne i doświadczalne.

Dodaj biotynilowane przeciwciała do odpowiednich roztworów komórek i inkubuj na mieszalniku obrotowym w temperaturze czterech stopni Celsjusza przez 30 minut. Użyj 150 µL HBSS, aby trzykrotnie przemyć funkcjonalizowane szkło w płytkach ośmiodołkowych, zgodnie z wcześniejszą demonstracją w filmie. Dodaj roztwór komórek do dołków i inkubuj na lodzie na wytrząsarce przez 45 minut.

W międzyczasie należy przygotować 20 milimolarne roztwór biotyny w sterylnym HBSS. Następnie, po inkubacji, delikatnie wypłukać roztwór komórek ze szkła, używając 150 mikrolitrów HBSS. Po powtórzeniu płukania jeszcze dwa razy, dodać 150 mikrolitrów roztworu biotyny do każdego odpowiedniego dołka uwalniającego i inkubować przez 20 minut, aby umożliwić zajście reakcji.

Odzyskaj niespecyficznie związane komórki, przemywając je za pomocą HBSS. Następnie przeprowadź obrazowanie fluorescencyjne i analizę zgodnie z opisanym protokołem. Jako kontrolę dołącz obrazy żywych komórek w kolbie.

W tym eksperymencie komórki MCF7GFP poddano działaniu funkcjonalizowanej powierzchni. 60% komórek zostało wychwyconych przy użyciu przeciwciała anty-HLA-ABC. Po podaniu 20 millimolarnej biotyny uwolniono 80% wychwyconych komórek.

Jak pokazano tutaj, gdy komórki MCF7GFP zmieszano z komórkami RAW 264.7, wychwycono 50% makrofagów RAW, a następnie dodanie 20 µM biotyny spowodowało uwolnienie 80% wychwyconych komórek RAW. Rysunek ten ilustruje, że makrofagi RAW stanowiące kontrolę pozytywną nie wykazują aktywności fluorescencyjnej. Natomiast komórki MCF7GFP stanowiące kontrolę negatywną są pozytywne pod kątem fluorescencji GFP.

Ponieważ nadmiar przeciwciał może zmniejszyć wydajność wychwytywania komórek, stężenie przeciwciał zoptymalizowano poprzez miareczkowanie od 0 do 10 000 ng/mL przeciwciał HLA. Wyniki wykazały, że optymalne stężenie przeciwciał mieściło się w zakresie od 100 do 1 000 ng/mL. Ponadto eksperymenty optymalizacji liczby komórek wykazały, że optymalna liczba komórek możliwych do wychwycenia wynosi od 1×10⁵ do 1×10⁶ komórek, ponieważ ilości poniżej tej wartości są niższe od poziomu tła.

Po opanowaniu, technika ta może zostać wykonana w ciągu trzech dni, przy nakładzie czasu eksperymentalnego wynoszącym mniej niż sześć godzin, nie licząc inkubacji nocnych. Podczas wykonywania tej procedury ważne jest pamiętanie o zbieraniu płuczek komórkowych podczas eksperymentów, ponieważ mogą one dostarczyć kluczowych informacji o skuteczności powierzchni. Po zastosowaniu tej procedury można wykonać inne metody, takie jak cytometria przepływowa, aby odpowiedzieć na dodatkowe pytania, np. dotyczace poziomu ekspresji receptorów w analizowanych komórkach.

Po opracowaniu, funkcjonalizacja powierzchni utorowała drogę badaczom w dziedzinie biomateriałów do eksploracji biostabilnej integracji materiałów, takich jak implanty u pacjentów z różnymi chorobami i urazami. Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze rozumieć, jak funkcjonalizować powierzchnie szklane w celu wychwytywania i uwalniania wybranych komórek, co umożliwia dalsze analizy. Pamiętaj, że praca z żywymi komórkami w obecności azotku sodu może być niezwykle niebezpieczna, dlatego podczas wykonywania tej procedury należy zawsze przestrzegać środków ostrożności, takich jak odpowiednie szkolenie, stosowanie środków ochrony osobistej oraz właściwa utylizacja odpadów.