Name: Metoda celowanej izolacji komórek poprzez funkcjonalizację powierzchni szkła (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-09-20T08:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 40 s
Description: Poznaj metodę funkcjonalizacji powierzchni szkła z wykorzystaniem desthiobiotyny i streptawidyny do izolacji komórek. Technika umożliwia łagodne pobieranie i odwracalne uwalnianie komórek w badaniach nad angiogenezą nowotworową i opornością na leki.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Chcielibyśmy podziękować American Cancer Society, Illinois Division (282802) oraz National Science Foundation CBET (1512598) za wsparcie finansowe. Chcielibyśmy również podziękować dr Dianwen Zhang z University of Illinois Beckman Institute za szkolenie z mikroskopii. Na koniec chcielibyśmy podziękować Jaredowi Weddellowi, Stacie Chen i Spencerowi Mamerowi za wnikliwe dyskusje.

1. Czyszczenie powierzchni szkła i przygotowanie odczynników
<ol>
	<li>Umieść szklaną powierzchnię w maszynie plazmowej tlenu na 5 minut przy 50% mocy, aby ją wyczyścić.</li>
	<li>Przygotować 2,5 ml 2% odtworzonego (3-aminopropylo) trietoksysilanu (APTES), dodając 50 μl APTES i 2,45 ml etanolu w stożkowej probówce.</li>
</ol>
2. Funkcjonalność APTES i DSB
<ol>
	<li>Dodaj roztwór APTES na powierzchnie. Pipeta 150 μl na dołek dla płytek 8-dołkowych. Odpipetować 100 μl na studzienkę dla płytek 24-dołkowych. Pipeta 1,1 ml do naczyń szklanych o wymiarach 60 x 15 mm. Przykryj powierzchnie, aby zapobiec parowaniu i nierównomiernemu rozprowadzaniu roztworu APTES. Umieść powierzchnie na wytrząsarce platformowej na 50 minut w temperaturze pokojowej, co spowoduje równomierne rozłożenie warstwy APTES. 
	UWAGA: APTES to aminozlan, który tworzy pierwszą warstwę powierzchni. Jeśli używasz innej powierzchni, heurystycznie określ objętość roztworu potrzebną do pokrycia powierzchni.</li>
	<li>Wybierz temperaturę piekarnika, gdy powierzchnie znajdują się na shakerze: Podgrzej do 55 °C przez 2 godziny dla płytek 8-dołkowych i płytek 24-dołkowych. Podgrzewaj naczynia szklane do temperatury 90 °C przez 1 godzinę.</li>
	<li>Spłucz powierzchnie etanolem.
	<ol>
		<li>Podawaj wymaganą ilość etanolu, odnosząc się do użytej powierzchni. Dodaj 150 μl etanolu do każdego dołka na 8 dołków. Dodaj 125 μl etanolu do każdego dołka na 24 płytki. Dodaj 1,1 ml etanolu do szklanych naczyń.</li>
		<li>Spłucz powierzchnię, odprowadzając i wciągając ciecz z ustalonego punktu, takiego jak róg studni. Trzymaj pipetę pod kątem około 70°, tak aby końcówka nie była skierowana bezpośrednio na powierzchnię. Spłukać jeszcze dwa razy za pomocą etanolu. 
		UWAGA: Jeśli którakolwiek ze szklanych płyt studzienki ma w sobie plastik, nie podgrzewaj jej powyżej 65 °C, ponieważ plastik zacznie się topić i wypaczać.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Suszyć 100% azotem gazowym dozowanym ze zbiornika. Umieść powierzchnie w piekarniku.</li>
	<li>Przygotować 2,5 ml roztworu d-destiobiotyny (DSB), łącząc 1,5 mg/ml DSB w 37,5 μl dimetylosulfotlenku (DMSO) i 5 mg/ml 1-etylo-3-(3-dimetyloaminopropylo)karbodimidu (EDC) w 2462,5 μl 0,1 M hydratu kwasu 4-morfolinoetanosulfonowego (MES) (pH 6). Następnie połącz oba rozwiązania.</li>
	<li>Dodać 1 μl 2-β merkaptoetanolu po 15 minutach do roztworu, aby wygasić reakcję między DSB i EDC. Wyjmij z piekarnika gorące powierzchnie ze szkła funkcjonalnego APTES. Odczekaj 5-10 minut, aż szklane powierzchnie ostygną.</li>
	<li>Dodaj bufor MES do spłukania, używając ilości w zależności od powierzchni. Dodać 150 μl buforu MES do każdej studzienki na 8 płytek dołkowych. Dodać 125 μl buforu MES do każdego dołka na 24 płytki. Dodać 1,1 ml buforu MES do naczyń szklanych.</li>
	<li>Spłucz powierzchnię, odprowadzając i wciągając ciecz z ustalonego punktu, takiego jak róg studni. Trzymaj pipetę pod kątem około 70°, tak aby końcówka nie była skierowana bezpośrednio na powierzchnię. Przepłukać jeszcze dwa razy buforem MES.</li>
	<li>Nałóż roztwór DSB na powierzchnie, aby umożliwić im inkubację. Dodać 150 μl roztworu DSB na dołek dla 8 płytek dołkowych. Dodać 100 μl roztworu DSB na dołek dla 24 płytek. Dodać 1,1 ml do szklanych naczyń roztworu DSB.</li>
	<li>Umieść szklane powierzchnie pokryte DSB na adamp ręcznik papierowy wewnątrz szalki Petriego. Przykryć i inkubować w lodówce o temperaturze 4°C przez 18-24 godziny.</li>
</ol>
3. Funkcjonalizacja streptawidyny
<ol>
	<li>Opłucz każdą szklaną powierzchnię trzykrotnie 1 ml 1,0x soli fizjologicznej buforowanej fosforanami (PBS). Spłucz powierzchnię, odprowadzając i wciągając ciecz z ustalonego punktu, takiego jak róg studni. Trzymaj pipetę pod kątem około 70°, tak aby końcówka nie była skierowana bezpośrednio na powierzchnię. Rozcieńczyć roztwór podstawowy streptawidyny (SAv) do 0,4 mg/ml (zalecane). 
	UWAGA: PBS jest izotoniczny, więc może być stosowany jako pożywka do rozcieńczania i płukania. PBS jest stosowany jako rozpuszczalnik dla SAv, a zatem nie wpływa na zdolność SAv do wiązania się z powierzchnią.</li>
	<li>Nanieść 0,4 mg/ml roztworu SAv równomiernie na powierzchnie, tak aby na dnie szklanki utworzyła się cienka warstwa, dobrać ilość roztworu w zależności od powierzchni. W przypadku płytek 8-dołkowych dodać 150 μl 0,4 mg/ml roztworu SAv na dołek. W przypadku płytek 24-dołkowych dodać 100 μl 0,4 mg/ml roztworu SAv na studzienkę. W przypadku naczyń szklanych dodać 1,1 ml 0,4 mg/ml roztworu SAv.</li>
	<li>Przykryj i przenieś talerze na szalkę Petriego o średnicy 14 cm, aby zatrzymać wilgoć. Inkubować szalkę Petriego w lodówce przez 18-24 godz. 
	UWAGA: Niezbędne jest stosowanie stałych objętości APTES, DSB i SAv na każdej powierzchni.</li>
	<li>Przepłukać każdą szklaną powierzchnię trzykrotnie 150 μl PBS w celu usunięcia SAv. Spłucz powierzchnię, odprowadzając i wciągając ciecz z ustalonego punktu, takiego jak róg studni. Trzymaj pipetę pod kątem około 70°, tak aby końcówka nie była skierowana bezpośrednio na powierzchnię.</li>
	<li>Zwilż ręcznik papierowy wodą dejonizowaną i umieść ręcznik papierowy płasko na 14-centymetrowej szalce Petriego otaczającej talerze, aby zatrzymać wilgoć w studzienkach. Przykryj szalkę Petriego zawierającą studzienki. Inkubować szalkę Petriego w lodówce o temperaturze 4 °C z poziomem bezpieczeństwa biologicznego 1 (BSL-1) do momentu, gdy będzie potrzebna.</li>
</ol>
4. Przechwytywanie i uwalnianie komórek
<ol>
	<li>Rozpocząć od kolby (kolb) T175 komórek przeznaczonych do eksperymentu. Odessać pożywkę z kolby(-ów). Pozostałe podłoże przepłukać 5 ml PBS o temperaturze pokojowej. Odessać PBS z kolby(-i).</li>
	<li>Dodać 10 ml nieenzymatycznego środka liftingującego, takiego jak roztwór do dysocjacji komórek, do kolby komórek T-175. Umieścić kolbę w inkubatorze na 6 minut, aby umożliwić wyjęcie komórek z kolby.</li>
	<li>Po 6 minutach dodaj 10 ml zimnego roztworu soli Hank's Balanced Salt Solution (HBSS; Patrz Lista materiałów), aby dezaktywować czynnik podnoszący. Pobrać 20 μl komórek, aby policzyć liczbę komórek w roztworze za pomocą hemacytometru. 
	UWAGA: W zależności od funkcjonalizowanych powierzchni użytych w eksperymencie przechwytywania, liczba potrzebnych komórek jest różna. W przypadku funkcjonalizowanych płytek 8-dołkowych należy użyć 300 000 komórek na dołek. W przypadku funkcjonalizowanych naczyń szklanych użyj 1,1 miliona komórek. W przypadku funkcjonalizowanych płytek 24-dołkowych zaleca się 125 000 komórek. Więcej informacji na temat zliczania komórek znajduje się w Suplemencie.</li>
	<li>Powtórzyć kroki 4.1-4.3 dla innej kolby komórek, jeśli obecna jest mniejsza liczba komórek niż jest to potrzebne w doświadczeniu. Połącz zawiesiny komórek i ponownie przelicz komórki, aby uzyskać całkowitą liczbę komórek w roztworze.</li>
	<li>Odwirować zawiesinę komórek w wirówce o sile 500 x g przez 5 minut w temperaturze 4 °C, aby uzyskać osad ze skoncentrowanych komórek. Znajdź odpowiednią ilość HBSS, aby dodać ją do zawiesiny komórek, aby uzyskać stężenie 1 x 106 komórek na ml, a następnie odessać supernatant z odwirowanych komórek i dodać obliczoną objętość. Objętość tę można obliczyć za pomocą równań zawartych w suplemencie.</li>
	<li>Pipetować w górę i w dół (rozcierać), aby ponownie zawiesić komórki w roztworze i zmniejszyć zlepianie się komórek w roztworze, co może zmniejszyć wiązanie przeciwciał. Podziel roztwór komórkowy na oddzielne roztwory kontrolne i eksperymentalne. Wyświetl plik uzupełniający dla komponentów i obliczeń.</li>
	<li>Dodać biotynylowane przeciwciała do odpowiednich roztworów komórkowych zgodnie z opisem w pliku uzupełniającym. Inkubować przez 30 minut w temperaturze 4 °C na mieszalniku typu "end -over-end. 
	UWAGA: W przypadku komórek MCF7GFP zaleca się przeciwciała HLA-ABC 0,5 mg/ml lub 0,5 mg/ml. W przypadku makrofagów RAW zaleca się 1 mg/ml mCD11b w połowie objętości, aby uwzględnić różnice w rozcieńczeniu. W przypadku ludzkich komórek śródbłonka żyły pępowinowej (HUVEC) zaleca się 0,5 mg/ml hCD31.</li>
	<li>Umyj funkcjonalizowaną powierzchnię szkła za pomocą HBSS. W tym eksperymencie zalecana jest płytka 8-dołkowa.
	<ol>
		<li>Dodać 150 μl HBSS do każdego dołka na 8 dołków. Spłucz jeszcze dwa razy za pomocą HBSS. Spłucz powierzchnię, odprowadzając i wciągając ciecz z ustalonego punktu, takiego jak róg studni. Trzymaj pipetę pod kątem około 70°, tak aby końcówka nie była skierowana bezpośrednio na powierzchnię. Przechowywać w chłodzie w temperaturze 4 °C.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Dodaj roztwory komórkowe do studzienek i odczekaj 45 minut, aż komórki zaczną inkubować na lodzie na wytrząsarce. Przygotować roztwór biotyny w sterylnym HBSS, używając obliczonych objętości zgodnie z opisem w suplemencie.</li>
	<li>Usunąć roztwór komórkowy ze szklanych studzienek za pomocą HBSS.
	<ol>
		<li>Delikatnie odpipetować 150 μl HBSS do każdego dołka. Następnie odpipetować HBSS. Spłucz powierzchnię, odprowadzając i wciągając ciecz z ustalonego punktu, takiego jak róg studni. Trzymaj pipetę pod kątem około 70°, tak aby końcówka nie była skierowana bezpośrednio na powierzchnię.</li>
		<li>Powtórz jeszcze dwa razy. Po umyciu dodaj HBSS do studzienek, aby komórki były mokre.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Dodaj 150 μl 20 mM roztworu biotyny do każdej odpowiedniej studzienki uwalniającej, a następnie odczekaj 20 minut, aby umożliwić reakcję.</li>
	<li>Przypomnij sobie niespecyficznie związane komórki, przemywając HBSS, jak wspomniano powyżej, a następnie, jeśli używasz komórek znakowanych fluorescencyjnie, przystąp do obrazowania fluorescencyjnego komórek. Zobrazuj również żywe komórki w kolbie (jako kontrolę, aby porównać z komórkami w studzience). W przypadku stosowania komórek transfekowanych białkiem zielonej fluorescencji (GFP) wzbudzenie wyniesie 470 nm, a emisja 515 nm.</li>
</ol>
5. Optymalizacja przeciwciał: Miareczkowanie przeciwciał
<ol>
	<li>Zacznij od wyjęcia komórek z kolby T75 lub T175, jak wyjaśniono w kroku 4.1- 4.3. 
	UWAGA: Objętości te są skalibrowane dla płytek 24-dołkowych, ale można je zmienić, aby dopasować je do dowolnych powierzchni funkcjonalizowanych szkłem za pomocą testów heurystycznych. Reprezentatywne miareczkowanie przeciwciał przedstawiono na rysunku 1.</li>
	<li>Policzyć komórki za pomocą hemekytometru, a następnie odwirować roztwór komórek w stożkowej probówce o stężeniu 500 x g przez 5 minut w temperaturze 4 °C. Rozpuścić komórki do 1 miliona komórek na ml, korzystając z obliczeń opisanych w suplemencie.</li>
	<li>Podzielić 1 milion komórek na ml roztworu na sześć różnych roztworów po 500 μl w różnych probówkach wirówkowych do roztworów przeciwciał (Ab).
	<ol>
		<li>Rozcieńczyć roztwór podstawowy przeciwciała do 10 μg/ml, 1 μg/ml, 100 ng/ml, 10 ng/ml, 1 ng/ml. Utworzyć kontrole, używając 100 μl buforu barwnikowego (PBS + 1% azydek sodu + 1% BSA) i 500 μl komórek do kontroli bez Ab. Do ślepej próby kontrolnej (brak Ab i brak komórek) należy użyć roztworu 300 μl PBS. 
		UWAGA: UWAGA: Azydek sodu jest niezwykle toksyczny, wybuchowy i należy zachować szczególną ostrożność podczas jego używania. Prosimy o zapoznanie się z kartą charakterystyki substancji niebezpiecznej (MSDS) i stosowanie odpowiedniego sprzętu ochronnego.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Połączyć i inkubować roztwory Ab z roztworami komórkowymi w mieszalniku typu end-over-end w temperaturze 4 °C przez 30 minut. Przepłukać funkcjonalizowane płytki 24-dołkowe trzykrotnie HBSS. Spłucz powierzchnię, odprowadzając i wciągając ciecz z ustalonego punktu, takiego jak róg studni. Trzymaj pipetę pod kątem około 70°, tak aby końcówka nie była skierowana bezpośrednio na powierzchnię.</li>
	<li>Porcję 125 μl każdego roztworu próbki do odpowiednich dobrze funkcjonalizowanych APTES, DSB i SAv. Inkubować w temperaturze 4 °C lub na lodzie przez 45 minut na szklanej powierzchni. Spłucz powierzchnię HBSS trzy razy, aby usunąć niespecyficznie przyczepione komórki. Spłucz powierzchnię, odprowadzając i wciągając ciecz z ustalonego punktu, takiego jak róg studni. Trzymaj pipetę pod kątem około 70°, tak aby końcówka nie była skierowana bezpośrednio na powierzchnię. NIE płucz dolnego rzędu, ponieważ są to elementy sterujące.</li>
	<li>Dodać 150 μl HBSS do każdej umytej studzienki, umieścić 24-dołkowe płytki na lodzie, a następnie użyć czytnika płytek do pomiaru fluorescencji komórek GFP (wzbudzenie 485 nm / emisja 528 nm) .</li>
</ol>
6. Optymalizacja komórek: Miareczkowanie komórek
<ol>
	<li>Podnieś ogniwa, jak wspomniano w krokach 4.1 -4.3.</li>
	<li>Policz komórki za pomocą hemekytometru. Odwirować roztwór komórek w stożkowej probówce o stężeniu 500 x g przez 5 minut w temperaturze 4 °C. Rozpuścić komórki do 1 miliona komórek na ml. 
	UWAGA: Więcej informacji na temat stosowania hemacytometru można znaleźć w Suplemencie.</li>
	<li>Odpipetować 1,6 ml z roztworu komórkowego dla 1,6 miliona komórek i umieścić w stożkowej probówce. Pobrać pipetą 800 μl komórek z roztworu komórkowego na 800 000 komórek i umieścić w stożkowej probówce. Odpipetować 80 μl z puli komórek dla 80 000 komórek i umieścić w stożkowej probówce. Odpipetować 8 μl z puli na 8 000 komórek i umieścić w stożkowej probówce. 
	UWAGA: Stężenia są podane dla pomiarów na płytce 8-dołkowej, powtórzyć w razie potrzeby. Przykład wyjścia płyty pokazano na rysunku 2.</li>
	<li>Pobrać cztery roztwory podstawowe i wirować w wirówce o stężeniu 500 x g przez 5 minut w temperaturze 4 °C. Ponownie zawiesić wszystkie roztwory podstawowe w 400 μl HBSS.</li>
	<li>Dodać 1,6 μl przeciwciała 100 ng/ml do 1,6 miliona komórek, 0,8 μl do 800 000 komórek i 0,5 μl do wszystkich innych zapasów. Inkubować przeciwciało przez 30 minut w mieszalniku typu end-of-end przez 30 minut w temperaturze 4 °C. Przemyć funkcjonalizowaną powierzchnię szkła trzykrotnie HBSS. 
	UWAGA: Funkcjonalizowana płytka 8-dołkowa jest zalecana do ilościowego oznaczania pod mikroskopem, podczas gdy funkcjonalizowana płytka 24-dołkowa jest zalecana do ilościowego oznaczania czytnika płytek. Stężenie przeciwciał dla 8000 komórek nie zostało zmniejszone, aby czynnikiem ograniczającym powierzchnię wychwytywania nie był brak przeciwciał w roztworze, ale raczej właściwości wychwytywania powierzchni.</li>
	<li>Nanieść 150 μl roztworów próbek do każdej studzienki. Zastosuj 1,6 miliona komórek do pierwszej kolumny studzienek po lewej stronie. Zastosuj zasób 800 000 komórek do drugiej kolumny od lewej. Zastosuj zasób 80 000 komórek do trzeciej kolumny od lewej. Na koniec zastosuj zasób 8 000 komórek do ostatniej kolumny. Inkubować przez 45 minut w temperaturze 4 °C na wytrząsarce. 
	UWAGA: Zapas 1,6 miliona komórek służy jako najwyższe stężenie do przetestowania i jest dwukrotnie większą ilością komórek, która jest zwykle używana w eksperymentach separacji komórek (600 000 komórek na studzienkę) Zapas 800 000 komórek służy jako kontrola eksperymentu, ponieważ jest to typowe stężenie komórkowe, które jest używane w eksperymentach separacji komórek (3 000 000 komórek na studzienkę). Zapas 80 000 komórek służy jako dziesięciokrotne rozcieńczenie do testowania niższych stężeń do wychwytywania komórek (30 000 komórek na studzienkę). Zapas 8000 komórek służy jako stukrotne rozcieńczenie do użycia jako test sprawdzający dolną granicę separacji komórkowej (3000 komórek na studzienkę).</li>
	<li>Spłucz HBSS trzy razy. Spłucz powierzchnię, odprowadzając i wciągając ciecz z ustalonego punktu, takiego jak róg studni. Trzymaj pipetę pod kątem około 70°, tak aby końcówka nie była skierowana bezpośrednio na powierzchnię. Zbierz wszystkie prania.</li>
	<li>Zobrazować komórki pod mikroskopem fluorescencyjnym, w przypadku użycia płytek 8-dołkowych wykonać zdjęcia każdej powierzchni i nałożyć 150 μl biotyny na każdą powierzchnię przez jedną godzinę w temperaturze 4 °C na wytrząsarce. Po godzinie spłucz studzienki uwalniające biotynę HBSS 3 razy, tak jak poprzednio. Zbierz wszystkie popłuczyny ze studzienek do zliczenia za pomocą hemocytometru i zobrazuj studzienki uwalniające.</li>
	<li>Nałożyć 150 μl 20 mM nadmiaru roztworu biotyny do odpowiednich studzienek uwalniających biotynę na 1 godzinę, jeśli używasz płytek 24-dołkowych, a następnie przepłukać te studzienki 3 razy HBSS. Określić ilościowo płytki 24-dołkowe za pomocą czytnika płytek. Użyj hemytometru, aby policzyć komórki ze wszystkich zebranych dobrze popłuczeń.</li>
</ol>
7. Analiza obrazu
Uwaga: Pakiet oprogramowania FIJI (http://fiji.sc/Fiji) jest zalecany do analizy obrazu. Początkowo obrazy zostały przekonwertowane na obraz w skali szarości, a następnie jasność/kontrast został zmieniony, aby wydobyć komórki.
<ol>
	<li>Załaduj obraz i przekonwertuj go na skalę szarości, klikając kartę obrazu, a następnie przewijając w dół do "Typ", a następnie klikając "8 bitów".</li>
	<li>Zwiększ kontrast obrazu, klikając kartę obrazu, a następnie przewijając do "Dostosuj". Kliknij "Jasność i kontrast", a następnie użyj pasków przewijania, aby wyróżnić komórki. Jeśli używasz obrazów fluorescencyjnych, odwróć obrazy, aby komórki były bardziej zdefiniowane.</li>
	<li>Załaduj wtyczkę do ImageJ o nazwie ITCN (http://rsb.info.nih.gov/ij/plugins/itcn.html), aby przeanalizować obrazy.</li>
	<li>Otwórz plik ITCN. Gdy pojawi się okno dialogowe, w którym użytkownik z kilkoma parametrami monituje o oszacowanie rozmiaru komórki, najpierw ustaw minimalną szerokość interesującej go komórki. Kliknij opcję "Wykryj ciemne szczyty", jeśli obraz jest fluorescencyjny, a komórki są przyciemnione.</li>
	<li>Początkowo ustaw wartość progową na 2, a następnie naciśnij przycisk "Policz". Pojawi się nowo policzona wersja obrazu z czerwonymi kropkami wyznaczającymi miejsca, w których zostały policzone komórki.</li>
	<li>Dostosuj parametr progu i szerokości, aby uzyskać dokładniejsze dane komórkowe, definiując rozmiar "komórki". Uwaga: Liczba zliczonych komórek będzie wyświetlana w oknie dialogowym po prawej stronie. Zmiana parametrów da różną liczbę zliczonych komórek.</li>
	<li>Kontynuuj iterację po parametrach progu i szerokości, aż zostanie osiągnięte prawidłowe oszacowanie liczby komórek.</li>
</ol>

<ol><li>Erdbruegger, U., Haubitz, M., Woywodt, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Circulating+endothelial+cells%3A+a+novel+marker+of+endothelial+damage%5BTitle%5D)+AND+%22Clin.+Chim.+Acta%22%5BJournal%5D)">Circulating endothelial cells: a novel marker of endothelial damage.</a> Clin. Chim. Acta. 373 (1-2), 17-26 (2006).</li>
<li>De Spiegelaere, W., Cornillie, P., Van Poucke, M., Peelman, L., Burvenich, C., Van den Broeck, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+mRNA+expression+analysis+in+kidney+glomeruli+using+microdissection+techniques%5BTitle%5D)+AND+%22Histol.+Histopathol%22%5BJournal%5D)">Quantitative mRNA expression analysis in kidney glomeruli using microdissection techniques.</a> Histol. Histopathol. 26 (2), 267-275 (2011).</li>
<li>Chen, S., Guo, X., Imarenezor, O., Imoukhuede, P. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantification+of+VEGFRs%2C+NRP1%2C+and+PDGFRs+on+Endothelial+Cells+and+Fibroblasts+Reveals+Serum%2C+Intra-Family+Ligand%2C+and+Cross-Family+Ligand+Regulation%5BTitle%5D)+AND+%22Cell.+Mol.+Bioeng%22%5BJournal%5D)">Quantification of VEGFRs, NRP1, and PDGFRs on Endothelial Cells and Fibroblasts Reveals Serum, Intra-Family Ligand, and Cross-Family Ligand Regulation.</a> Cell. Mol. Bioeng. 8 (3), 383-403 (2015).</li>
<li>Cheung, L. S. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Detachment+of+captured+cancer+cells+under+flow+acceleration+in+a+bio-functionalized+microchannel%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+Chip%22%5BJournal%5D)">Detachment of captured cancer cells under flow acceleration in a bio-functionalized microchannel.</a> Lab Chip. 9 (12), 1721-1731 (2009).</li>
<li>Privorotskaya, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+thermal+lysis+of+cells+using+silicon-diamond+microcantilever+heaters%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+Chip%22%5BJournal%5D)">Rapid thermal lysis of cells using silicon-diamond microcantilever heaters.</a> Lab Chip. 10 (9), 1135-1141 (2010).</li>
<li>Park, K., Akin, D., Bashir, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Electrical+capture+and+lysis+of+vaccinia+virus+particles+using+silicon+nano-scale+probe+array%5BTitle%5D)+AND+%22Biomed.+Microdevices%22%5BJournal%5D)">Electrical capture and lysis of vaccinia virus particles using silicon nano-scale probe array.</a> Biomed. Microdevices. 9 (6), 877-883 (2007).</li>
<li>Galletti, G., Sung, M., Vahdat, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+of+breast+cancer+and+gastric+cancer+circulating+tumor+cells+by+use+of+an+anti+HER2-based+microfluidic+device%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+Chip%22%5BJournal%5D)">Isolation of breast cancer and gastric cancer circulating tumor cells by use of an anti HER2-based microfluidic device.</a> Lab Chip. 14 (1), 147-156 (2014).</li>
<li>Schudel, B. R., Choi, C. J., Cunningham, B. T., Kenis, P. J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microfluidic+chip+for+combinatorial+mixing+and+screening+of+assays%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+Chip%22%5BJournal%5D)">Microfluidic chip for combinatorial mixing and screening of assays.</a> Lab Chip. 9 (12), 1676-1680 (2009).</li>
<li>Lien, K. Y., Chuang, Y. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+isolation+and+detection+of+cancer+cells+by+utilizing+integrated+microfluidic+systems%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+Chip%22%5BJournal%5D)">Rapid isolation and detection of cancer cells by utilizing integrated microfluidic systems.</a> Lab Chip. 10 (21), 2875-2886 (2010).</li>
<li>Stott, S. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+of+circulating+tumor+cells+using+a%5BTitle%5D)+AND+%22PNAS%22%5BJournal%5D)">Isolation of circulating tumor cells using a.</a> PNAS. 107 (35), 18392-18397 (2010).</li>
<li>Yu, M., Ting, D., Stott, S., Wittner, B., Ozsolak, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RNA+sequencing+of+pancreatic+circulating+tumour+cells+implicates+WNT+signalling+in+metastasis%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">RNA sequencing of pancreatic circulating tumour cells implicates WNT signalling in metastasis.</a> Nature. 487 (7408), 510-513 (2012).</li>
<li>Sheng, W., Ogunwobi, O., Chen, T., Zhang, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((%3ECapture%2C+release+and+culture+of+circulating+tumor+cells+from+pancreatic+cancer+patients+using+an+enhanced+mixing+chip%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+Chip%22%5BJournal%5D)">>Capture, release and culture of circulating tumor cells from pancreatic cancer patients using an enhanced mixing chip.</a> Lab Chip. 14 (1), 89-98 (2014).</li>
<li>Zheng, X., Cheung, L. S. L., Schroeder, J. A., Jiang, L., Zohar, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+high-performance+microsystem+for+isolating+circulating+tumor+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+Chip%22%5BJournal%5D)">A high-performance microsystem for isolating circulating tumor cells.</a> Lab Chip. 11 (19), 3269-3276 (2011).</li>
<li>Imoukhuede, P. I., Popel, A. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantification+and+cell-to-cell+variation+of+vascular+endothelial+growth+factor+receptors%5BTitle%5D)+AND+%22Exp.+Cell+Res%22%5BJournal%5D)">Quantification and cell-to-cell variation of vascular endothelial growth factor receptors.</a> Exp. Cell Res. 317 (7), 955-965 (2011).</li>
<li>Imoukhuede, P. I., Popel, A. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expression+of+VEGF+receptors+on+endothelial+cells+in+mouse+skeletal+muscle%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Expression of VEGF receptors on endothelial cells in mouse skeletal muscle.</a> PLoS One. 7 (9), e44791(2012).</li>
<li>Ludwig, A., Kretzmer, G., Schügerl, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Determination+of+a+%26%2334%3Bcritical+shear+stress+level%26%2334%3B+applied+to+adherent+mammalian+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Enzyme+Microb.+Technol%22%5BJournal%5D)">Determination of a &#34;critical shear stress level&#34; applied to adherent mammalian cells.</a> Enzyme Microb. Technol. 14 (3), 209-213 (1992).</li>
<li>Ansari, A., Lee-Montiel, F. T., Amos, J., Imoukhuede, P. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Secondary+anchor+targeted+cell+release%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechnol.+Bioeng%22%5BJournal%5D)">Secondary anchor targeted cell release.</a> Biotechnol. Bioeng. 112 (11), 2214-2227 (2015).</li>
<li>Drenan, R. M., Nashmi, R., Imoukhuede, P., Just, H., McKinney, S., Lester, H. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Subcellular+trafficking%2C+pentameric+assembly%2C+and+subunit+stoichiometry+of+neuronal+nicotinic+acetylcholine+receptors+containing+fluorescently+labeled+alpha6+and+beta3+subunits%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Pharmacol%22%5BJournal%5D)">Subcellular trafficking, pentameric assembly, and subunit stoichiometry of neuronal nicotinic acetylcholine receptors containing fluorescently labeled alpha6 and beta3 subunits.</a> Mol. Pharmacol. 73 (1), 27-41 (2008).</li>
<li>Imoukhuede, P. I., Dokun, A. O., Annex, B. H., Popel, A. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Endothelial+cell-by-cell+profiling+reveals+temporal+dynamics+of+VEGFR1+and+VEGFR2+membrane-localization+following+murine+hindlimb+ischemia%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Physiol+Hear.+Circ+Physiol%22%5BJournal%5D)">Endothelial cell-by-cell profiling reveals temporal dynamics of VEGFR1 and VEGFR2 membrane-localization following murine hindlimb ischemia.</a> Am J Physiol Hear. Circ Physiol. 4 (8), H1085-H1093 (2013).</li>
<li>van Beijnum, J. R., Rousch, M., Castermans, K., van der Linden, E., Griffioen, A. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+of+endothelial+cells+from+fresh+tissues%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Protoc%22%5BJournal%5D)">Isolation of endothelial cells from fresh tissues.</a> Nat. Protoc. 3 (6), 1085-1091 (2008).</li>
<li>Imoukhuede, P. I., Popel, A. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+fluorescent+profiling+of+VEGFRs+reveals+tumor+cell+and+endothelial+cell+heterogeneity+in+breast+cancer+xenografts%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Med%22%5BJournal%5D)">Quantitative fluorescent profiling of VEGFRs reveals tumor cell and endothelial cell heterogeneity in breast cancer xenografts.</a> Cancer Med. 3 (2), 225-244 (2014).</li>
<li>BD Biosciences. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%22CD+Marker+Handbook%3A+Human+and+Mouse%22">CD Marker Handbook: Human and Mouse</a>. , at: 
 <a target="_blank" href="https://www.bdbiosciences.com/documents/cd_marker_handbook.pdf">https://www.bdbiosciences.com/documents/cd_marker_handbook.pdf</a> (2010).</li>
<li>Tanzeglock, T., Soos, M., Stephanopoulos, G., Morbidelli, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Induction+of+mammalian+cell+death+by+simple+shear+and+extensional+flows%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechnol.+Bioeng%22%5BJournal%5D)">Induction of mammalian cell death by simple shear and extensional flows.</a> Biotechnol. Bioeng. 104 (2), 360-370 (2009).</li>
<li>Processing Blood. , at: 
 <a target="_blank" href="https://www.google.com/patents/US20140030238">https://www.google.com/patents/US20140030238</a> (2014).</li>
<li>Fukuda, S., Schmid-Schönbein, G. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Centrifugation+attenuates+the+fluid+shear+response+of+circulating+leukocytes%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Leukoc.+Biol%22%5BJournal%5D)">Centrifugation attenuates the fluid shear response of circulating leukocytes.</a> J. Leukoc. Biol. 72 (July), 133-139 (2002).</li>
<li>dela Paz, N. G., Walshe, T. E., Leach, L. L., Saint-Geniez, M., D'Amore, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Role+of+shear-stress-induced+VEGF+expression+in+endothelial+cell+survival%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cell+Sci%22%5BJournal%5D)">Role of shear-stress-induced VEGF expression in endothelial cell survival.</a> J. Cell Sci. 125 (Pt 4), 831-843 (2012).</li>
<li>Allard, W. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tumor+Cells+Circulate+in+the+Peripheral+Blood+of+All+Major+Carcinomas+but+not+in+Healthy+Subjects+or+Patients+With+Nonmalignant+Diseases+Tumor+Cells+Circulate+in+the+Peripheral+Blood+of+All+Major+Carcinomas+but+not+in+Healthy+Subjects+or+Patients+With+Nonmalignant+diseases.%26%2334%5BTitle%5D)+AND+%22Clinical+Cancer+Research%22%5BJournal%5D)">Tumor Cells Circulate in the Peripheral Blood of All Major Carcinomas but not in Healthy Subjects or Patients With Nonmalignant Diseases Tumor Cells Circulate in the Peripheral Blood of All Major Carcinomas but not in Healthy Subjects or Patients With Nonmalignant diseases.&#34.</a> Clinical Cancer Research. 10, 6897-6904 (2005).</li>
<li>Nagrath, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+of+rare+circulating+tumour+cells+in+cancer+patients+by+microchip+technology%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Isolation of rare circulating tumour cells in cancer patients by microchip technology.</a> Nature. 450 (7173), 1235-1239 (2007).</li>
<li>Chen, S., Weddel, J., Gupta, P., Conard, G., Parkin, J., Imoukhuede, P. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((QFlow+Cytometer-Based+Receptoromic+Screening%3A+A+High-throughput+Quantification+Approach+Informing+Biomarker+Selection+and+Nanosensor%5BTitle%5D)+AND+%22Submiss%22%5BJournal%5D)">QFlow Cytometer-Based Receptoromic Screening: A High-throughput Quantification Approach Informing Biomarker Selection and Nanosensor.</a> Submiss. , (2016).</li>
<li>Vasa, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Number+and+migratory+activity+of+circulating+endothelial+progenitor+cells+inversely+correlate+with+risk+factors+for+coronary+artery+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Circ.+Res%22%5BJournal%5D)">Number and migratory activity of circulating endothelial progenitor cells inversely correlate with risk factors for coronary artery disease.</a> Circ. Res. 89 (1), E1-E7 (2001).</li>
<li>Hirsch, J. D., Eslamizar, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Easily+reversible+desthiobiotin+binding+to+streptavidin%2C+avidin%2C+and+other+biotin-binding+proteins%3A+uses+for+protein+labeling%2C+detection%2C+and+isolation%5BTitle%5D)+AND+%22Anal.+Biochem%22%5BJournal%5D)">Easily reversible desthiobiotin binding to streptavidin, avidin, and other biotin-binding proteins: uses for protein labeling, detection, and isolation.</a> Anal. Biochem. 308 (2), 343-357 (2002).</li>
<li>Wilchek, M., Bayer, E. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Applications+of+Avidin-Biotin+Technology%3A+Literature+Survey%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Enzymol%22%5BJournal%5D)">Applications of Avidin-Biotin Technology: Literature Survey.</a> Methods Enzymol. 152 (1), 183-189 (1987).</li>
<li>Wu, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immunofluorescent+labeling+of+cancer+marker+Her2+and+other+cellular+targets+with+semiconductor+quantum+dots%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Immunofluorescent labeling of cancer marker Her2 and other cellular targets with semiconductor quantum dots.</a> Nat. Biotechnol. 21 (1), 41-46 (2002).</li>
<li>Lee-Montiel, F. T., Imoukhuede, P. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Engineering+quantum+dot+calibration+standards+for+quantitative+fluorescent+profiling%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Mater.+Chem.+B%22%5BJournal%5D)">Engineering quantum dot calibration standards for quantitative fluorescent profiling.</a> J. Mater. Chem. B. 1, 6434(2013).</li>
<li>Oligonucleotide-linked magnetic particles and uses thereof. , Available from: 
 <a target="_blank" href="http://www.google.com/patents/US5512439">http://www.google.com/patents/US5512439</a> (1996).</li>
<li>Naranbhai, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Impact+of+blood+processing+variations+on+natural+killer+cell+frequency%2C+activation%2C+chemokine+receptor+expression+and+function%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Immunol.+Methods%22%5BJournal%5D)">Impact of blood processing variations on natural killer cell frequency, activation, chemokine receptor expression and function.</a> J. Immunol. Methods. 366 (1-2), 28-35 (2011).</li>
<li>Yadav, A. R., Sriram, R., Carter, J. A., Miller, B. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparative+study+of+solution-phase+and+vapor-phase+deposition+of+aminosilanes+on+silicon+dioxide+surfaces%5BTitle%5D)+AND+%22Mater.+Sci.+Eng.+C%22%5BJournal%5D)">Comparative study of solution-phase and vapor-phase deposition of aminosilanes on silicon dioxide surfaces.</a> Mater. Sci. Eng. C. 35 (1), 283-290 (2014).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Ulepszenia w technikach izolacji komórek naprzód badania naukowe nad relacjami struktura-funkcja w neurobiologii18, programowaniem komórek macierzystych w biologii regeneracyjnej i sygnalizacją angiogenną w biologii naczyniowej19. Rzeczywiście, pierwotna hodowla komórkowa20 (np. HUVEC) w biologii naczyniowej odbywa się głównie poprzez zastosowanie technik izolacji komórek. Izolacja komórek została również niedawno wykorzystana do analizy cytometrii ilościowej przepływu (qFlow) re...

Obecne metody separacji komórek metodą laboratoryjną (np. sortowanie komórek aktywowane fluorescencją1, mikro-dysekcja laserowa2, immunomagnetyczna separacja kulek1) mogą zająć kilka godzin przygotowania i sortowania. Te duże skale czasowe mogą wpływać na reakcje fizjologiczne i poziomy ekspresji, co skutkuje analizami, które nie są reprezentatywne dla odpowiedzi fizjologicznej3. Potrzebne są systemy, które mogą szybko i skutecznie izolować określone typy komórek bez zakłócania poziomów receptorów na powierzchni komórki, aby poprawić izolację i wzbogacanie komórek do zastosowań biomedycznych. Dlatego uzasadnieniem dla naszego podejścia jest opracowanie łagodnego podejścia do izolacji komórek.
Koncepcja "laboratorium na chipie" oferuje obietnicę szybszej o rzędy wielkości (od godzin do minut) izolacji komórek, a najczęściej polega na wychwytywaniu komórek na powierzchni i uwalnianiu komórek lub zawartości wewnątrzkomórkowej za pomocą metod fizycznych4,5 lub chemicznych6. Chociaż podejścia te oferują kilka korzyści, takich jak identyfikacja ekspresji białka7,8, identyfikacja ekspresji RNA9-11, a nawet dostarczanie komórek do hodowli in vitro 12,13, wielu z tych technik nie można przełożyć na diagnostykę, taką jak profilowanie receptorów komórkowych, ze względu na ich niefizjologiczne środowisko. Enzymatyczne środki liftingujące, takie jak kolagenazy, mogą również wpływać na te ilości receptorów14,15, co oznacza, że techniki kwantyfikacji receptorów komórkowych, które wykorzystują te środki podnoszące, nie będą generować dokładnych danych fizjologicznych. Liza komórkowa zapobiega różnicowaniu się między natywnymi receptorami powierzchniowymi a tymi, które zostały wcześniej zinternalizowane16. Protokół ten opisuje szybkie i delikatne podejście do izolacji komórek.

<table><tbody><tr><td>(3-Aminopropylo)trietoksysilan (APTES)</td><td>Acros Organics</td><td>919-30-2</td><td>Służy do wytwarzania 2% roztworu APTES</td></tr><tr><td>Środek do czyszczenia plazmowego Pico</td><td>Diener</td><td>Model 1</td><td>Czyści powierzchnie i pozwala na wiązanie PDMS ze szkłem</td></tr><tr><td>d-Desthiobiotin (DSB)</td><td>Sigma</td><td>D20655</td><td>Stosowany jako mechanizm uwalniający w powierzchni wychwytu komórkowego.&nbsp;</td></tr><tr><td>dimetylosulfotlenek (DMSO)</td><td>Brytyjskie domy leków (BDH)</td><td>BDH1115-1LP</td><td>Rozpuszcza DSB w roztworze</td></tr><tr><td>1-etylo-3-(3-dimetyloaminopropylo)karbodimidu (EDC)</td><td>Thermo-Scientific</td><td>5g: 22980 25g: 22981</td><td>Aktywuje kwasy karboksylowe i umożliwia wiązanie białek z powierzchnią szkła.</td></tr><tr><td>niepowlekane 8-dołkowe szkiełko hodowlane</td><td>BD Falcon</td><td>Opakowanie 24 szt.: 354118 Opakowanie 96: 354108</td><td>Używany w eksperymentach komórkowych z udziałem mikroskopu fluorescencyjnego Zeiss, takich jak początkowe eksperymenty ilościowe wychwytywania i uwalniania</td></tr><tr><td>Płytki 24-dołkowe ze szklanym dnem</td><td>MatTek</td><td>P24G-0-13-F</td><td>Używany w eksperymentach komórkowych z udziałem czytnika płytek, takich jak eksperymenty z przeciwciałami i miareczkowaniem komórkowym</td></tr><tr><td>Merkaptoetanol</td><td>Science Lab</td><td>60-24-2</td><td>Służy do wygaszania reakcji między EDC a DSB</td></tr><tr><td>Hydrat kwasu 4-morfolinoetanosulfonowego (Hydrat MES 99%)</td><td>Fisher Scientific</td><td>AC172590250</td><td>Służy do wytwarzania 0,1 M buforu MES do stosowania w reakcji EDC</td></tr><tr><td>Piec precyzyjny</td><td>Thermo Scientific</td><td>11-475-153</td><td>Stosowany do utwardzania warstwy PDMS i APTES.</td></tr><tr><td>Wytrząsarka Titramax 1000</td><td>Heidolph</td><td>13-889-420</td><td>Służy do zapewnienia równomiernego rozprowadzania APTES na powierzchniach.</td></tr><tr><td>1x Streptawidyna 5 mg [e7105-5mg]</td> <td>Proteo Chem</td><td>9013-20-1</td><td>Białko wiążące biotynę. Może powodować podrażnienie.</td></tr><tr><td>Naczynie szklane 5 cm</td><td>Fisher Scientific</td><td>08748A</td><td>Używane w badaniach HUVEC, a także w przyszłych badaniach profilowania.</td></tr><tr><td>14 cm szalka Petriego z pokrywą</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Z717231</td><td>Służy do przechowywania funkcjonalizowanych próbek i ich transportu.</td></tr><tr><td>Komórki MCF7-GFP</td><td>Cell Biolabs</td><td>AKR211</td><td>Przechowywane w ciekłym azocie</td></tr><tr><td>RAW264.7 makrofagi myszy</td><td>ATCC</td><td>TIB-71</td><td>Podarowane nam przez laboratorium Smith na Uniwersytecie Illinois. Przechowywany w ciekłym azocie.</td></tr><tr><td>TrypLE</td><td>Life Technologies</td><td>12605036</td><td>Przechowywany w 100 ml w temperaturze pokojowej</td></tr><tr><td>Dulbecco' s zmodyfikowany Eagle medium</td><td>Cell Media Facility w School of Chemical Sciences w UIUC</td><td>50003PC</td><td>Dostawca: Corning</td></tr><tr><td>Nonessential aminoacids</td><td>Cell Media Facility w School of Chemical Sciences w UIUC</td><td>25-025-CI</td><td>Już dodany do DMEM przez obiekt. Dostawca: Corning.</td></tr><tr><td>Skrobak do komórek</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-565-58</td><td>Mały 23 cm 50 sztuk</td></tr><tr><td>Roztwór do dysocjacji komórek</td><td>Corning</td><td>MT-25-056CI</td><td>Służy do nieenzymatycznego podnoszenia komórek do stosowania w eksperymentach komórkowych</td></tr><tr><td>Hemacytometr</td><td>Hausser</td><td>02-671-54</td><td>Służy do liczenia komórek w celu ilościowego oznaczania roztworów komórkowych oraz skuteczności wychwytywania i uwalniania.</td></tr><tr><td>Biotyna</td><td>Amresco</td><td>58-85-5</td><td>Służy do uwalniania komórek z powierzchni.</td></tr><tr><td>HBSS</td><td>Utworzony na podstawie receptury</td><td>Nie dotyczy</td><td>Służy do utrzymywania komórek przy życiu w zawiesinie, a także do mycia powierzchni o niespecyficznym wiązaniu. Na podstawie protokołów Cold Spring Harbor: In 500&nbsp; ML, użyj 4&nbsp; g NaCl, 0,2&nbsp; g KCl, 0.0402&nbsp; g Na2PO4&#8226; 7H2O, 0.03&nbsp; g KH2PO4 oraz 0,5&nbsp; g glukozy. Dodaj wodę DI, aby się dostać do&nbsp; 500 ml, przefiltrować, a następnie wstawić do lodówki.</td></tr><tr><td>Przeciwciało HLA-ABC</td><td>BioLegend</td><td>311402</td><td>Przeciwciało używane do wychwytywania komórek MCF7gfp</td></tr><tr><td>Przeciwciało hIgG</td><td>BioLegend</td><td>HP6017</td><td>Przeciwciało używane do wychwytywania komórek MCF7gfp</td></tr><tr><td>Komórki MCF7 GFP</td><td>Cell Biolabs</td><td>AKR-211</td><td>Linia Luminal Breast Cancer, która została transfekowana zielonym białkiem fluorescencyjnym.</td></tr><tr><td>Assorted Conicals</td><td>Thermo-Scientific</td><td>15mL: 12-565-268</td><td>50/15 ml plastikowe stożki do przechowywania roztworów i podwielokrotności.</td></tr><tr><td>Rotatory mini-rurek (mikser end over end)</td><td>Fisher Scientific</td><td>05-450-127</td><td>Służy do inkubacji przeciwciał i mieszania innych roztworów komórkowych w celu wymieszania</td></tr><tr><td>Axiovert 200M (mikroskop fluorescencyjny)</td><td>Zeiss</td><td>N/A</td><td>Mikroskop odwrócony fluorescencji Zeiss Axiovert 200 M.</td></tr><tr><td>Kolumny odsalające Zeba</td><td>Thermo-Scientific</td><td>PI-87770</td><td>Służy do oczyszczania nowo biotynylowanych przeciwciał po użyciu zestawu do biotynylacji. Instrukcje znajdują się pod adresem: http://www.funakoshi.co.jp/data/datasheet/PCC/89894.pdf</td></tr><tr><td>EZ Link Sulfo NHS Low Weight Biotinylation Kit</td><td>Thermo-Scientific</td><td></td><td>Służy do biotynylacji przeciwciał, aby umożliwić ich integrację z powierzchnią wychwytywania</td></tr><tr><td>Czytnik płytek</td><td>BioTek</td><td>Synergy HTX Multimode Reader</td><td>Służy do ilościowego pomiaru intensywności fluorescencji w eksperymentach miareczkowych.</td></tr></tbody></table>

metoda celowanej izolacji komórek poprzez funkcjonalizację powierzchni szkła

A Method of Targeted Cell Isolation via Glass Surface Functionalization

Jednym z czynników ograniczających przyjęcie i rozwój medycyny spersonalizowanej jest niezdolność do opracowania narzędzi diagnostycznych do badania indywidualnych niuansów w ekspresji od pacjenta do pacjenta. Obecne metodologie, które próbują rozdzielić komórki, aby wypełnić tę niszę, powodują zakłócenie ekspresji fizjologicznej, co sprawia, że technika separacji jest bezużyteczna jako narzędzie diagnostyczne. W tym protokole opisujemy funkcjonalizację i optymalizację powierzchni pod kątem wychwytywania i uwalniania komórkowego. Ta funkcjonalizowana powierzchnia integruje biotynylowane przeciwciała ze szklaną powierzchnią funkcjonalizowaną aminosilem (APTES), destiobiotyną i streptawidyną. Uwalnianie komórek jest ułatwione dzięki wprowadzeniu biotyny, która umożliwia zebranie i oczyszczenie komórek uchwyconych przez powierzchnię. Uwalnianie to odbywa się poprzez ukierunkowanie wtórnej cząstki destiobiotyny, co skutkuje znacznie łagodniejszym paradygmatem uwalniania. To zmniejszenie ostrych odczynników i sił ścinających zmniejsza zmiany w ekspresji komórkowej. Funkcjonalizowana powierzchnia wychwytuje do 80% komórek w mieszaninie pojedynczej komórki i wykazała 50% wychwytywania w mieszaninie dwukomórkowej. Badane są zastosowania tej technologii w badaniach nad ksenoprzeszczepami i separacją nowotworów. Opisano również techniki kwantyfikacji do weryfikacji powierzchni, takie jak czytnik płytek i analizy ImageJ.

Stosując ten protokół, prezentujemy wychwyt komórek (Rysunek 3A) oraz uwalnianie komórek (Rysunek 3C) linii MCF7GFP, a także kontrole żywych komórek (Rysunek 4). Ilościowo określony wychwyt komórek wyniósł 60%, a uwolnionych zostało 80% (Rysunek 3C). Po zastosowaniu tego podejścia do mieszaniny makrofagów RAW 264.7 i komórek MCF7GFP, wychwycono 50% makrofagów RAW (Rys. 3D), a 80% makrofagów RAW uwolniono ...

Ten protokół opisuje konfigurowalną funkcjonalizację powierzchni systemu destiobiotyny, streptawidyny i APTES w celu wyizolowania określonych typów komórek. Ponadto w niniejszym manuskrypcie omówiono zastosowania, optymalizację i weryfikację tego procesu.

Metoda celowanej izolacji komórek poprzez funkcjonalizację powierzchni szkła

One of the limiting factors to the adoption and advancement of personalized medicine is the inability to develop diagnostic tools to probe individual ...

Ogólnym celem procesu funkcjonalizacji powierzchni szklanej jest umożliwienie łagodnego wychwytywania i uwalniania wybranych komórek. Metoda ta może pomóc w udzieleniu odpowiedzi na kluczowe pytania z zakresu angiogenezy nowotworowej, umożliwiając przesiewowe badanie biomarkerów komórkowych wskazujących na lekooporność. Główną zaletą tej techniki jest to, że można ją w pełni dostosować do niemal każdego rodzaju interesujących nas komórek.O ile istnieje przeciwciało specyficzne dla danego typu komórek, powierzchnię można dostosować do ich wychwytywania. Choć metoda ta może dostarczyć wiedzy na temat angiogenezy nowotworowej, może być ona również zastosowana w innych chorobach, ponieważ oczyszczone próbki są niezbędne do opracowania bardziej spersonalizowanych schematów leczenia. Pomysł na tę metodę pojawił się u nas podczas prób opracowania odwracalnego mechanizmu uwalniania do wychwytywania komórek, z wykorzystaniem oddziaływania między desthiobiotyną a rodziną adawin.Po oczyszczeniu szklanej powierzchni w maszynie do plazmy tlenowej przez pięć minut zgodnie z protokołem tekstowym, przygotuj 2,5 ml 2% roztworu 3-aminopropylotrietoksysilanu (APTES), łącząc 50 µl APTES oraz 2,45 ml etanolu w probówce stożkowej. Nanieś pipetą roztwór APTES na powierzchnie szklane, a następnie przykryj je i umieść na wytrząsarce platformowej w temperaturze pokojowej na 50 minut, aby równomiernie rozprowadzić warstwę APTES. W międzyczasie rozgrzej piekarnik do 55 °C w przypadku płytek 8- i 24-dołkowych lub do 90 °C w przypadku szalek szklanych.Po wyjęciu płytek z wytrząsarki, należy wypłukać szklane powierzchnie etanolem zgodnie z protokołem tekstowym. Powierzchnie należy wysuszyć za pomocą 100% azotu w fazie gazowej. Następnie płytki 8- i 24-dołkowe należy umieścić w piekarniku na dwie godziny, a szklane naczynia w piekarniku na jedną godzinę.Następnie należy przygotować 2,5 mililitra roztworu d-desthiobiotyny (DSB), mieszając 1,5 miligrama na mililitr DSB w 37,5 mikrolitrach DMSO oraz dodając 5 miligramów na mililitr EDC do 2 462,5 mikrolitrów buforu MES 0,1 M, pH 6. Następnie należy połączyć oba roztwory. Po 15 minutach należy dodać jeden mikrolitr BME, aby zatrzymać reakcję między DSB a EDC.Wyjmij gorące powierzchnie szklane funkcjonalizowane APTES z pieca i pozostaw je do ostygnięcia na pięć do 10 minut. Dodaj bufor MES na powierzchnie szklane, aby je wypłukać, trzymając pipetę pod kątem 70 stopni, tak aby końcówka nie była skierowana bezpośrednio na powierzchnię. Następnie odprowadź i pobierz bufor z jednego, stałego punktu, na przykład z narożnika studzienki.Następnie użyć buforu MES do dwukrotnego opłukania. Nanieść roztwór DSB na powierzchnie szklane. Przenieść je na wilgotny ręcznik papierowy wewnątrz szalki Petriego, przykryć szalkę i inkubować w lodówce przez 18 do 24 godzin.Po inkubacji w temperaturze czterech stopni Celsjusza przemyj każdą szklaną powierzchnię trzy razy za pomocą PBS, zgodnie z wcześniejszą prezentacją w tym filmie. Następnie rozcieńcz Streptawidynę, czyli roztwór stokowy SAV, do stężenia 0,4 mg/mL i równomiernie nanieś go na powierzchnie szklane, aby utworzyła się cienka warstwa. Po inkubacji szkła przez 18 do 24 godzin przemyj każdą powierzchnię trzy razy, używając 150 µL PBS.Następnie zwilżyć ręcznik papierowy wodą dejonizowaną i wyłożyć nim płasko 14-centymetrową szalkę Petriego wokół płytek, aby utrzymać wilgotność w studzienkach. Przykryć szalkę Petriego szklanymi powierzchniami i umieścić ją w lodówce poziomu bezpieczeństwa biologicznego 1 w temperaturze 4°C do czasu użycia. Aby przeprowadzić wychwyt komórek, odessać medium z kolb T175 z komórkami.Następnie użyj PBS do wypłukania komórek i odessij bufor. Do kolby dodaj 10 ml nieenzymatycznego środka do odrywania komórek, takiego jak Cell Dissociation Solution. Następnie inkubuj w temperaturze 37°C przez sześć minut.Po sześciu minutach dodaj 10 mililitrów zimnego HBSS, aby rozcieńczyć czynnik odrywający. Następnie pobierz pipetą 20 mikrolitrów komórek i policz je za pomocą hemocytometru. Odwiruj zawiesinę komórkową przy 500 x g w temperaturze czterech stopni Celsjusza przez pięć minut.Następnie należy użyć HBSS, aby resuspendować komórki do stężenia 1 × 10⁶ komórek/ml. Należy pipetować zawiesinę w górę i w dół, aby resuspendować komórki w roztworze i ograniczyć ich agregację, która mogłaby zmniejszyć wiązanie przeciwciał. Następnie zawiesinę komórkową należy podzielić na oddzielne roztwory kontrolne i doświadczalne.Dodaj biotynilowane przeciwciała do odpowiednich roztworów komórek i inkubuj na mieszalniku obrotowym w temperaturze czterech stopni Celsjusza przez 30 minut. Użyj 150 µL HBSS, aby trzykrotnie przemyć funkcjonalizowane szkło w płytkach ośmiodołkowych, zgodnie z wcześniejszą demonstracją w filmie. Dodaj roztwór komórek do dołków i inkubuj na lodzie na wytrząsarce przez 45 minut.W międzyczasie należy przygotować 20 milimolarne roztwór biotyny w sterylnym HBSS. Następnie, po inkubacji, delikatnie wypłukać roztwór komórek ze szkła, używając 150 mikrolitrów HBSS. Po powtórzeniu płukania jeszcze dwa razy, dodać 150 mikrolitrów roztworu biotyny do każdego odpowiedniego dołka uwalniającego i inkubować przez 20 minut, aby umożliwić zajście reakcji.Odzyskaj niespecyficznie związane komórki, przemywając je za pomocą HBSS. Następnie przeprowadź obrazowanie fluorescencyjne i analizę zgodnie z opisanym protokołem. Jako kontrolę dołącz obrazy żywych komórek w kolbie.W tym eksperymencie komórki MCF7GFP poddano działaniu funkcjonalizowanej powierzchni. 60% komórek zostało wychwyconych przy użyciu przeciwciała anty-HLA-ABC. Po podaniu 20 millimolarnej biotyny uwolniono 80% wychwyconych komórek.Jak pokazano tutaj, gdy komórki MCF7GFP zmieszano z komórkami RAW 264.7, wychwycono 50% makrofagów RAW, a następnie dodanie 20 µM biotyny spowodowało uwolnienie 80% wychwyconych komórek RAW. Rysunek ten ilustruje, że makrofagi RAW stanowiące kontrolę pozytywną nie wykazują aktywności fluorescencyjnej. Natomiast komórki MCF7GFP stanowiące kontrolę negatywną są pozytywne pod kątem fluorescencji GFP.Ponieważ nadmiar przeciwciał może zmniejszyć wydajność wychwytywania komórek, stężenie przeciwciał zoptymalizowano poprzez miareczkowanie od 0 do 10 000 ng/mL przeciwciał HLA. Wyniki wykazały, że optymalne stężenie przeciwciał mieściło się w zakresie od 100 do 1 000 ng/mL. Ponadto eksperymenty optymalizacji liczby komórek wykazały, że optymalna liczba komórek możliwych do wychwycenia wynosi od 1×10⁵ do 1×10⁶ komórek, ponieważ ilości poniżej tej wartości są niższe od poziomu tła.Po opanowaniu, technika ta może zostać wykonana w ciągu trzech dni, przy nakładzie czasu eksperymentalnego wynoszącym mniej niż sześć godzin, nie licząc inkubacji nocnych. Podczas wykonywania tej procedury ważne jest pamiętanie o zbieraniu płuczek komórkowych podczas eksperymentów, ponieważ mogą one dostarczyć kluczowych informacji o skuteczności powierzchni. Po zastosowaniu tej procedury można wykonać inne metody, takie jak cytometria przepływowa, aby odpowiedzieć na dodatkowe pytania, np. dotyczace poziomu ekspresji receptorów w analizowanych komórkach.Po opracowaniu, funkcjonalizacja powierzchni utorowała drogę badaczom w dziedzinie biomateriałów do eksploracji biostabilnej integracji materiałów, takich jak implanty u pacjentów z różnymi chorobami i urazami. Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze rozumieć, jak funkcjonalizować powierzchnie szklane w celu wychwytywania i uwalniania wybranych komórek, co umożliwia dalsze analizy. Pamiętaj, że praca z żywymi komórkami w obecności azotku sodu może być niezwykle niebezpieczna, dlatego podczas wykonywania tej procedury należy zawsze przestrzegać środków ostrożności, takich jak odpowiednie szkolenie, stosowanie środków ochrony osobistej oraz właściwa utylizacja odpadów.

a-method-targeted-cell-isolation-via-glass-surface

Research

JoVE Journal

Cancer Research

Badania nad rakiem

W niniejszym artykule opisujemy sposób uzyskiwania przebiegów FRET z pojedynczych cząsteczek DNA unieruchomionych na powierzchni przy użyciu zautomatyzowanego konfokalnego mikroskopu skanującego.

Zautomatyzowany system do pomiarów fluorescencji pojedynczych cząsteczek dla unieruchomionych na powierzchni biomolekuł

Źródło: Fattahi, N., et al. Fotodegradowalne interfejsy hydrożelowe do badań przesiewowych, selekcji i izolacji bakterii. J. Vis. Exp. (2021).Ten film pokazuje ekstrakcję kolonii bakteryjnych z fotodegradowalnego hydrożelu za pomocą światła UV. Wybierana jest określona kolonia, a wzorzysta ekspozycja na światło ma na celu zainicjowanie miejscowej degradacji hydrożelu. Po dostosowaniu natężenia i czasu trwania światła stosuje się światło UV, uwalniając kolonię. Kolonia jest następnie zasysana...

Ukierunkowana izolacja kolonii bakteryjnych za pomocą degradacji hydrożelu o jasnym wzorze

W tym filmie pokazujemy izolację komórek raka nabłonka wykazującego ekspresję EpCAM z próbek krwi obwodowej. Technika ta polega na użyciu drutu klasy medycznej funkcjonalizowanego przeciwciałami EpCAM w celu wychwycenia komórek docelowych. Schwytane komórki są następnie ekstrahowane do roztworu buforowego.

Funkcjonalizowana izolacja komórek docelowych na bazie drutów: technika ex vivo izolowania komórek rakowych z wzbogaconej krwi obwodowej

Bezkontaktowa dielektroforeza (cDEP) umożliwia sortowanie i wzbogacanie cząstek dzięki ich wewnętrznym właściwościom dielektrycznym. Kanały elektrod przepływowych zastępują elektrody metalowe tradycyjne dla DEP, dostosowując cDEP do nieuszkadzającego sterylnego charakteryzowania i sortowania cząstek biologicznych. Pokazujemy, jak przygotować mikrourządzenie cDEP oraz przeprowadzić eksperymenty z charakterystyką i sortowaniem komórek.

Bezznacznikowa izolacja i wzbogacanie komórek poprzez bezdotykową dielektroforezę

Tradycyjne techniki wytwarzania żeli poliakrylamidowych (PA) zawierających sondy fluorescencyjne polegają na umieszczaniu żelu pomiędzy przylegającą powierzchnią a szkiełkiem. Tutaj pokazujemy, że pokrycie tego szkiełka poli-D-lizyną (PDL) i sondami fluorescencyjnymi lokalizuje sondy z dokładnością do 1,6 μm od powierzchni żelu.

Nowatorska metoda lokalizacji reporterowych kulek fluorescencyjnych w pobliżu powierzchni hodowli komórkowej na potrzeby mikroskopii sił trakcyjnych

Tutaj prezentujemy protokół izolacji i hodowli pojedynczych komórek za pomocą platformy mikroprzepływowej, który wykorzystuje nową koncepcję projektowania mikrostudzienek, aby umożliwić wysokowydajną izolację pojedynczych komórek i długoterminową hodowlę klonalną.

Platforma mikroprzepływowa do wysokowydajnej izolacji i hodowli pojedynczych komórek

Ten protokół ma na celu odzyskanie i przygotowanie rzadkich komórek docelowych z mieszaniny z komórkami tła niebędącymi celem, do molekularnej charakterystyki genetycznej na poziomie pojedynczej komórki. Jakość DNA jest równa jakości pojedynczych komórek niepoddanych działaniu metody i pozwala na zastosowanie pojedynczych komórek (zarówno w oparciu o badania przesiewowe, jak i analizę celowaną).

Wstępne wzbogacanie komórek docelowych i amplifikacja całego genomu w celu dalszej charakterystyki pojedynczej komórki

Opisujemy prostą procedurę litograficzną do unieruchamiania cząsteczek DNA o długości genu na powierzchni, która może być użyta do przeprowadzenia eksperymentów z ekspresją genów na biochipach bez komórek.

Funkcjonalne powierzchniowe unieruchomienie genów za pomocą wieloetapowej litografii przemieszczenia nici

Zgłoszono użycie fotodegradowalnych hydrożeli do izolowania komórek bakteryjnych za pomocą narzędzia do próbkowania światła o wysokiej rozdzielczości. Dokonano przeglądu podstawowych procedur eksperymentalnych, wyników i zalet procesu. Metoda ta umożliwia szybką i niedrogą izolację docelowych bakterii wykazujących rzadkie lub unikalne funkcje z heterogenicznych społeczności lub populacji.

Fotodegradowalne interfejsy hydrożelowe do badań przesiewowych, selekcji i izolacji bakterii

Dostosowaliśmy przepuszczalną mikroporowatą wkładkę membranową do naśladowania mikrośrodowiska guza (TME). Model składa się z mieszanej hodowli komórek, pozwala na uproszczone generowanie wysoce wzbogaconych pojedynczych populacji komórek bez użycia znakowania fluorescencyjnego lub sortowania komórek oraz pozwala na badanie komunikacji międzykomórkowej w obrębie TME w warunkach normalnych lub stresowych.

Naśladownictwo mikrośrodowiska guza: prosta metoda generowania wzbogaconych populacji komórek i badania komunikacji międzykomórkowej

Poznaj metodę funkcjonalizacji powierzchni szkła z wykorzystaniem desthiobiotyny i streptawidyny do izolacji komórek. Technika umożliwia łagodne pobieranie i odwracalne uwalnianie komórek w badaniach nad angiogenezą nowotworową i opornością na leki.

Metoda celowanej izolacji komórek poprzez funkcjonalizację powierzchni szkła

Przeglądaj więcej filmów