Metoda celowanej izolacji komórek poprzez funkcjonalizację powierzchni szkła

Ogólnym celem tego procesu funkcjonalizacji powierzchni szkła jest umożliwienie delikatnego wychwytywania i uwalniania komórek będących przedmiotem zainteresowania. Metoda ta może pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytania w dziedzinie angiogenezy nowotworów, umożliwiając badania przesiewowe biomarkerów komórkowych wskazujących na oporność na leki. Główną zaletą tej techniki jest to, że można ją w pełni dostosować do praktycznie każdego rodzaju komórek.

Dopóki istnieje przeciwciało specyficzne dla danego typu komórki, powierzchnia może być przystosowana do jego wychwytywania. Chociaż metoda ta może dostarczyć informacji na temat angiogenezy raka, może być również stosowana w innych chorobach, ponieważ oczyszczone próbki są niezbędne do opracowania bardziej spersonalizowanych schematów leczenia. Po raz pierwszy wpadliśmy na pomysł tej metody, gdy próbowaliśmy opracować odwracalny mechanizm uwalniania do wychwytywania komórek, wykorzystując interakcję między destiobiotyną a rodziną adivin.

Po oczyszczeniu szklanej powierzchni w maszynie do plazmy tlenowej przez pięć minut zgodnie z protokołem tekstowym, przygotuj 2,5 mililitra 2% rozpuszczonego roztworu 3-aminopropylotrietoksysilanu lub APTES, łącząc 50 mikrolitrów APTES i 2,45 mililitrów etanolu w stożkowej probówce. Odpipetuj roztwór APTES na szklane powierzchnie, a następnie przykryj powierzchnie i umieść je na wytrząsarce platformowej w temperaturze pokojowej na 50 minut, aby równomiernie rozprowadzić warstwę APTES. W międzyczasie rozgrzej piekarnik do 55 stopni Celsjusza w przypadku płytek ośmio- i 24-dołkowych lub 90 stopni Celsjusza w przypadku naczyń szklanych.

Po wyjęciu płytek z wytrząsarki należy użyć etanolu do spłukania powierzchni szklanych zgodnie z protokołem tekstowym. Za pomocą 100% azotu osusz powierzchnie. Następnie umieść talerze ośmio- i 24-dołkowe w piekarniku na dwie godziny lub szklane naczynia w piekarniku na godzinę.

Następnie przygotuj 2,5 mililitra d-Destiobiotyny lub roztworu DSB, mieszając 1,5 miligrama na mililitr DSB w 37,5 mikrolitrze DMSO i dodając pięć miligramów na mililitr EDC do 2 462,5 mikrolitrów 0,1 molowego buforu MES, pH 6. Następnie połącz te dwa rozwiązania. Po 15 minutach dodaj jeden mikrolitr BME, aby wygasić reakcję między DSB i EDC.

Wyjmij gorące szklane powierzchnie funkcjonalizowane APTES z piekarnika i pozwól im ostygnąć przez pięć do 10 minut. Dodaj bufor MES do szklanych powierzchni, aby je przepłukać, trzymając pipetę pod kątem 70 stopni, tak aby końcówka nie była skierowana bezpośrednio na powierzchnię. Następnie rozładuj i narysuj bufor z ustalonego punktu, takiego jak róg studni.

Następnie użyj bufora MES, aby przepłukać jeszcze dwa razy. Nałóż roztwór DSB na szklane powierzchnie. Przełóż je na wilgotny ręcznik papierowy wewnątrz szalki Petriego, przykryj naczynie i inkubuj w lodówce przez 18 do 24 godzin.

Po inkubacji w temperaturze czterech stopni Celsjusza użyj PBS, aby trzykrotnie spłukać każdą powierzchnię szkła, jak pokazano wcześniej w tym filmie. Następnie rozcieńczyć streptawidynę lub roztwór podstawowy SAV do 0,4 miligrama na mililitr i równomiernie nałożyć na powierzchnie szklane, tak aby powstała cienka warstwa. Po inkubacji szkła przez 18 do 24 godzin, użyj 150 mikrolitrów PBS, aby trzykrotnie spłukać każdą powierzchnię.

Następnie zwilż ręcznik papierowy wodą dejonizowaną i umieść go płasko na 14-centymetrowej szalce Petriego otaczającej płytki, aby zatrzymać wilgoć w studzienkach. Przykryj szalkę Petriego szklanymi powierzchniami i umieść ją w lodówce o czterech stopniach Celsjusza i poziomie bezpieczeństwa biologicznego 1, aż będzie potrzebna. Aby przeprowadzić wychwyt komórek, należy odessać pożywkę z kolb komórek T175.

Następnie użyj PBS do przepłukania komórek i odessania buforu. Dodaj 10 mililitrów nieenzymatycznego środka podnoszącego, takiego jak roztwór dysocjacyjny komórek, do kolby. Następnie inkubować w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez sześć minut.

Po sześciu minutach dodaj 10 mililitrów zimnego HBSS, aby rozcieńczyć środek liftingujący. Następnie odpipetuj 20 mikrolitrów komórek i użyj hemocytometru, aby je policzyć. Odwirować zawiesinę komórkową o sile 500 x g w czterech stopniach Celsjusza przez pięć minut.

I użyj HBSS, aby ponownie zawiesić komórki do jednego razy 10 do szóstego ogniwa na mililitr. Pipetować w górę i w dół, aby ponownie zawiesić komórki w roztworze i zmniejszyć zlepianie się komórek, co może zmniejszyć wiązanie przeciwciał. Następnie podziel zawiesinę komórkową na oddzielne roztwory kontrolne i eksperymentalne.

Dodać biotynylowane przeciwciała do odpowiednich roztworów komórkowych i inkubować na mieszalniku typu end -do-end w temperaturze czterech stopni Celsjusza przez 30 minut. Użyj 150 mikrolitrów HBSS, aby trzykrotnie umyć funkcjonalizowane szkło na płytkach ośmiodołkowych, jak pokazano wcześniej w filmie. Dodaj roztwór komórkowy do studzienek i inkubuj na lodzie na shakerze przez 45 minut.

W międzyczasie przygotuj 20 milimolowy roztwór biotyny w sterylnym HBSS. Następnie, po inkubacji, delikatnie użyj 150 mikrolitrów HBSS, aby wypłukać roztwór komórkowy ze szkła. Po powtórzeniu płukania jeszcze dwa razy, dodaj 150 mikrolitrów roztworu biotyny do każdej odpowiedniej studzienki uwalniania i inkubuj przez 20 minut, aby reakcja mogła postępować.

Przypomnij sobie niespecyficznie związane komórki, używając HBSS do mycia komórek. Następnie przystąp do obrazowania i analizy fluorescencji zgodnie z protokołem tekstowym. Dołącz obrazy dynamicznych komórek w kolbie jako kontrolkę.

W tym eksperymencie MCF7GFP komórki wystawiono na działanie funkcjonalizowanej powierzchni. 60% komórek zostało wychwyconych przy użyciu przeciwciała HLA-ABC. Po wystawieniu na działanie 20-milimolowej biotyny 80% wychwyconych komórek zostało uwolnionych.

Jak pokazano tutaj, gdy MCF7GFP komórki zmieszano z komórkami RAW 264.7, wychwycono 50% makrofagów RAW, a dodanie 20 mikromolowej biotyny następnie uwolniło 80% wychwyconych komórek RAW. Rysunek ten ilustruje, że makrofagi RAW kontroli pozytywnej nie wykazują aktywności fluorescencyjnej. Jednak komórki kontroli ujemnej MCF7GFP są dodatnie pod względem fluorescencji GFP.

Ponieważ nadmiar przeciwciał może zmniejszać wychwytywanie komórek, stężenie przeciwciał zoptymalizowano poprzez miareczkowanie od zera do 10 000 nanogramów na mililitr przeciwciała HLA. Wyniki wykazały, że idealne stężenie przeciwciał wynosiło od 100 do 1000 nanogramów na mililitr. Ponadto eksperymenty z optymalizacją komórek wykazały, że idealne stężenie komórek, które można przechwycić, wynosi od 1 razy 10 do piątej komórki i od 1 razy 10 do szóstej komórki, ponieważ ilości poniżej tej liczby są niższe niż tło.

Po opanowaniu tej techniki można ją wykonać w ciągu trzech dni, przy mniej niż sześciu godzinach eksperymentu, nie licząc inkubacji przez noc. Próbując wykonać tę procedurę, należy pamiętać o zebraniu płynów do płukania komórek podczas eksperymentów, ponieważ mogą one dostarczyć istotnych informacji na temat skuteczności powierzchni. Po tej procedurze można wykonać inne metody, takie jak cytometria przepływowa, aby odpowiedzieć na dodatkowe pytania, takie jak poziomy ekspresji receptorów, jakie mogą mieć interesujące komórki.

Po jego opracowaniu, funkcjonalizacja powierzchni utorowała drogę naukowcom zajmującym się biomateriałami do zbadania bezpiecznej biologicznie integracji materiałów, takich jak implanty, u pacjentów z różnymi chorobami i urazami. Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, w jaki sposób funkcjonalizować powierzchnie szklane w celu przechwytywania i uwalniania interesujących komórek, co pozwala na dalszą analizę. Nie zapominaj, że praca z żywymi komórkami w azydku sodu może być niezwykle niebezpieczna, a podczas wykonywania tej procedury należy zawsze podejmować środki ostrożności, takie jak odpowiednie szkolenie, środki ochrony osobistej i utylizacja.