Name: Trójwymiarowy test hodowli w celu zbadania inwazyjności komórek rakowych i tworzenia guzów satelitarnych (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-08-18T15:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 23 s
Description: Poznaj trójwymiarową hodowlę komórek rakowych w kolagenie i fibrynie do badania inwazyjności i tworzenia guzów satelitarnych. Ta metoda pozwala wizualizować migrację nowotworową i testować terapie przeciwnowotworowe.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Praca częściowo finansowana przez Prostate Cancer Canada (grant # D2014-4 dla SG i CJD) oraz Canadian Institutes of Health Research (grant # MOP-111069 dla SG). Chcielibyśmy podziękować dr Richardowi Poulinowi za pomoc redakcyjną oraz Pani Chanel Dupont za pomoc techniczną.

UWAGA: Brak względów etycznych, ponieważ zwierzęce i ludzkie komórki rakowe zostały zakupione lub uprzejmie nam dostarczone.
1. Wytwarzanie zatyczek kolagenowych (guz pseudo-pierwotny)
<ol>
	<li>Przygotuj dyspersję kolagenową. Kolagen typu I ze ścięgien ogona szczura (RTT) może być ekstrahowany i sterylizowany, jak wcześniej zgłoszono17, lub zakupiony. Zdyspergować liofilizowany kolagen RTT (3,25-3,50 mg/ml w 0,02 N kwasu octowego) za pomocą blendera (ustawienie wysokiej prędkości; pięć 2-minutowych przebiegów) w celu uzyskania równomiernego mieszania.</li>
	<li>Zbierz (zwykle trypsynę-EDTA) i użyj wykluczenia błękitu trypanowego do liczenia żywotnych komórek za pomocą hemocytometru. Dostosuj do żądanej gęstości komórek (5 x 10,4 ogniwa na wtyczkę).</li>
	<li>Przygotować wszystkie roztwory (NaOH, płodowa surowica bydlęca, DMEM 5x, NaHCO3) oddzielnie (Tabela 1) w sterylnych warunkach i przechowywać w chłodzie na lodzie. Uwaga: Kolejność dodawania różnych roztworów jest ważna, aby zapobiec wstrząsom osmotycznym lub kwaśnym w komórkach.</li>
	<li>Wykonaj dyspersję komórkową (1,25 x 106 komórek) do końcowego roztworu kolagenu (5 ml) tak szybko, jak to możliwe. Dobrze wymieszać (pipetując w górę i w dół), unikając pęcherzyków powietrza, a następnie szybko rozprowadzić 200 μl gotowego do użycia roztworu w każdym dołku na 96-dołkowej płytce. Delikatnie uderz płytką wielodołkową o powierzchnię roboczą okapu do hodowli komórkowych, aby usunąć pęcherzyki powietrza i równomiernie rozprowadzić roztwór wewnątrz studzienek.</li>
	<li>Po napełnieniu wszystkich studzienek (ten krok zajmuje około 15-20 minut na płytkę 96-dołkową), przechowuj je w inkubatorze.</li>
	<li>Inkubować płytkę w temperaturze 37 °C przez 2 godziny przez noc. Żelowanie kolagenu (czyli fibrylogeneza) następuje w ciągu 30 minut. Dodać pożywkę hodowlaną (100 μl/basenik) do kultury, aby przeprowadzić inkubację przez noc.</li>
</ol>
2. Pierwsza warstwa żelu fibrynowego
<ol>
	<li>Preparat roztworu fibrynogenu. 
	UWAGA: Ta sama partia żelu fibrynowego powinna być idealnie użyta, aby uzyskać bardziej powtarzalne wyniki, ponieważ tworzenie żelu fibrynowego może się różnić w zależności od różnych partii komercyjnego liofilizowanego fibrynogenu.
	<ol>
		<li>Zawsze używaj świeżo przygotowanego roztworu fibrynogenu. Doprowadź liofilizowany fibrynogen do temperatury pokojowej przed otwarciem fiolki, aby uniknąć tworzenia się kryształów hydratu.</li>
		<li>Stopniowo rozpuszczaj fibrynogen we wstępnie podgrzanym (37 °C) zrównoważonym roztworze soli Hanka (HBSS) z Ca2+/Mg2+ w stężeniu roboczym 3 mg / ml (rozważ przygotowanie 15% nadwyżki minimalnej wymaganej końcowej objętości: np. 17,25 mg w 5,75 ml dla 5 ml roztworu).
		<ol>
			<li>Na początku dodaj kroplami wstępnie podgrzany HBSS, aby rozpuścić fragmenty fibrynogenu. Rozbij większe fragmenty szpatułką w zlewce. Od czasu do czasu mieszaj zlewkę, aby ułatwić mieszanie. Podczas zabiegu nie należy używać mieszadła. Pozostały proszek rozpuścić, pipetując zawiesinę w górę i w dół.</li>
		</ol>
		</li>
		<li>Utrzymuj roztwór fibrynogenu w letnim miejscu podczas sterylizacji roztworu, przepuszczając go przez filtr 0,22 μm. Uwaga: Jeśli HBSS nie jest wystarczająco ciepły lub fibrynogen nie jest całkowicie rozpuszczony, roztwór może zatkać filtr. W razie potrzeby należy wymienić filtr raz lub dwa razy, co może zmniejszyć stężenie fibrynogenu, a tym samym sztywność skrzepów fibryny.</li>
		<li>Zawieś interesujące Cię komórki (np. komórki śródbłonka) w gotowym do użycia roztworze fibrynogenu, dostosowując jego ostateczną objętość, jako alternatywną procedurę.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Przygotowanie roztworów trombiny.
	<ol>
		<li>Przygotuj roztwór podstawowy w ddH2O (50 jednostek NIH / ml), a następnie wysterylizuj go za pomocą filtra 0,22 μm.</li>
		<li>Użyj stosunku fibrynogenu do trombiny ≥1:0,0075 (v/v) w celu wytworzenia żelu fibrynowego.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Wytwarzanie żelu fibrynowego.
	<ol>
		<li>Trzymaj sterylne roztwory podstawowe fibrynogenu i trombiny na lodzie podczas wszystkich następnych kroków. Żele fibrynowe mogą tworzyć się w płytkach 24-dołkowych.</li>
		<li>Natychmiast pokryj powierzchnię każdej studzienki roztworem fibrynogenu (200 μl/studzienkę), unikając tworzenia się pęcherzyków powietrza. Przetwarzaj 6 dołków na raz.</li>
		<li>Gdy roztwór fibrynogenu całkowicie pokryje powierzchnię studzienek, przechyl płytkę pod kątem 45° i dodaj 1,5 μl roztworu trombiny do pierwszego dołka, wrzucając trombinę do środka studzienki, a następnie delikatnie obracaj płytkę poziomo przez 1-2 sekundy.
		<ol>
			<li>Pozostawić płytkę w stabilnej pozycji pod pokrywą z przepływem laminarnym (5-10 min) do czasu zakończenia procesu żelowania/krzepnięcia (Uwaga: proces polimeryzacji nie może być zakłócany, np. przez transport płytki do inkubatora).</li>
		</ol>
		</li>
		<li>Po polimeryzacji pierwszych sześciu dołków powtórz tę samą sekwencję (tj. 3 poprzednie kroki) dla następnych sześciu dołków, aż wszystkie studzienki zostaną przetworzone.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
3. Druga warstwa żelu fibrynowego i warstwowego korka kolagenowego
<ol>
	<li>Opcja A: (Natychmiastowe użycie korka kolagenowego).
	<ol>
		<li>Upewnij się, że pierwsza warstwa żelu fibrynowego spolimeryzowała się we wszystkich studzienkach, delikatnie przechylając płytkę. Umieść 96-dołkową płytkę zawierającą zatyczki żelu kolagenowego obok płytki 24-dołkowej (zawierającej żele fibrynowe), aby ułatwić przenoszenie czopów kolagenowych.</li>
		<li>Dodaj jedną kroplę HBSS do każdego dołka płytki zawierającej czopki kolagenowe.</li>
		<li>Wyjmij każdy korek kolagenowy ze studzienki za pomocą cienkiej igły zamontowanej na strzykawce (używanej jako uchwyt) lub za pomocą mikrołyżeczki (patrz wideo). Przenieś każdą czopkę kolagenową na pierwszą warstwę żelu fibrynowego za pomocą jednej lub dwóch mikrołyżek, upewniając się, że czop kolagenowy jest dobrze wyśrodkowany w studzience i że sterylność jest dobrze zachowana.</li>
		<li>Na wcześniej utworzony żel fibrynowy nałożyć drugą warstwę roztworu fibrynogenu (300 μl/dołek) i wprowadzić trombinę zgodnie z opisem w ppkt 2.3, zachowując minimalny stosunek 1:0,0075 i sekwencję sześciu dołków na raz.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Opcja B (Powlekanie korka kolagenowego cienką warstwą błony podstawnej o obniżonym współczynniku wzrostu (GFRBM)).
	<ol>
		<li>Wszystkie przygotowane roztwory i przyrządy należy wcześniej schłodzić i przechowywać w temperaturze 4 °C lub na lodzie (np. pipety, końcówki, probówki) podczas pracy, ponieważ zamrożone podwielokrotności GFRBM są bardzo wrażliwe na nadmierne tempo nagrzewania podczas rozmrażania (należy postępować zgodnie z instrukcjami producenta).</li>
		<li>Po wyjęciu z dołków płytkowych zanurzyć każdy czop kolagenowy na 2 minuty w 1,5 ml probówce wirówkowej na lodzie zawierającej 100 μl czystego roztworu GRFBM.</li>
		<li>Przenieś każdą powlekaną zatyczkę na pierwszą warstwę fibryny, upewniając się, że jest dobrze wyśrodkowana, jak opisano wcześniej. Inkubować płytki zawierające czopki w temperaturze 37 °C przez 5 minut, aby umożliwić GRFBM utworzenie żelu. Dodaj drugą warstwę fibryny, jak w kroku 3.1.4.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
4. Warunki pożywki do hodowli komórkowej
<ol>
	<li>Wypełnić każdą studzienkę pożywką hodowlaną (400 μl). Pożywki hodowlane i suplementy zostaną wybrane na podstawie linii komórkowej i warunków eksperymentalnych.</li>
	<li>Dodać aprotyninę, środek przeciwfibrynolityczny do pożywki hodowlanej w końcowym stężeniu 100 jednostek inhibitora kalikreiny (KIU)/ml. 
	UWAGA: Przechowywać płytki w inkubatorze do hodowli komórkowych w warunkach stosowanych dla badanej linii komórkowej.</li>
	<li>Uzupełniaj kultury świeżą pożywką co drugi dzień lub zgodnie z harmonogramem eksperymentalnym i dodawaj aprotyninę. Przed dodaniem świeżej pożywki należy lekko przechylić płytkę (pod kątem 30-35°) i przychylić pipetę do boku studzienki, jednocześnie ostrożnie odsysając kondycjonowane podłoże pod stałą obserwacją.</li>
</ol>

<ol><li>Alizadeh, A. M., Shiri, S., Farsinejad, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Metastasis+review%3A+from+bench+to+bedside%5BTitle%5D)+AND+%22Tumour+Biol%22%5BJournal%5D)">Metastasis review: from bench to bedside.</a> Tumour Biol. 35 (9), 8483-8523 (2014).</li>
<li>Roudsari, L. C., West, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Studying+the+influence+of+angiogenesis+in+in+vitro+cancer+model+systems%5BTitle%5D)+AND+%22Adv+Drug+Deliv+Rev%22%5BJournal%5D)">Studying the influence of angiogenesis in in vitro cancer model systems.</a> Adv Drug Deliv Rev. , (2016).</li>
<li>Bill, R., Christofori, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+relevance+of+EMT+in+breast+cancer+metastasis%3A+Correlation+or+causality%5BTitle%5D)+AND+%22FEBS+Lett%22%5BJournal%5D)">The relevance of EMT in breast cancer metastasis: Correlation or causality.</a> FEBS Lett. 589 (14), 1577-1587 (2015).</li>
<li>Kimlin, L. C., Casagrande, G., Virador, V. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+Vitro+Three-Dimensional+%283D%29+Models+in+Cancer+Research%3A+an+Update%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Carcinog%22%5BJournal%5D)">In Vitro Three-Dimensional (3D) Models in Cancer Research: an Update.</a> Mol Carcinog. 52 (3), 167-182 (2013).</li>
<li>Obenauf, A. C., Massagué, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Surviving+at+a+Distance+Organ-Specific+Metastasis%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Cancer%22%5BJournal%5D)">Surviving at a Distance Organ-Specific Metastasis.</a> Trends Cancer. 1 (1), 76-91 (2015).</li>
<li>Sykes, J. A. Separation of Tumor Cells from Fibroblasts. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aSykes%2C+JA+%22Human+Tumor+Cells+In+Vitro%22">Human Tumor Cells In Vitro</a>. Fogh, J. 1, Chapter 1 1-22 (1975).</li>
<li>Lang, S. H., Stark, M., Collins, A., Paul, A. B., Stower, M. J., Maitland, N. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Experimental+Prostate+Epithelial+Morphogenesis+in+Response+to+Stroma+and+Three-Dimensional+Matrigel+Culture%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Growth+Differ%22%5BJournal%5D)">Experimental Prostate Epithelial Morphogenesis in Response to Stroma and Three-Dimensional Matrigel Culture.</a> Cell Growth Differ. 12 (12), 631-640 (2001).</li>
<li>Debnath, J., Muthuswamy, S. K., Brugge, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Morphogenesis+and+Oncogenesis+of+MCF-10A+Mammary+Epithelial+Acini+Grown+In+Three-Dimensional+Basement+Membrane+Cultures%5BTitle%5D)+AND+%22Methods%22%5BJournal%5D)">Morphogenesis and Oncogenesis of MCF-10A Mammary Epithelial Acini Grown In Three-Dimensional Basement Membrane Cultures.</a> Methods. 30 (3), 256-268 (2003).</li>
<li>Shaw, L. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tumor+cell+invasion+assays%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">Tumor cell invasion assays.</a> Methods Mol. Biol. 294, 97-105 (2005).</li>
<li>Nelson, C. M., Bissell, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modeling+Dynamic+Reciprocity%3A+Engineering+Three-Dimensional+Culture+Models+of+Breast+Architecture%2C+Function%2C+and+Neoplastic+Transformation%5BTitle%5D)+AND+%22Semin+Cancer+Biol%22%5BJournal%5D)">Modeling Dynamic Reciprocity: Engineering Three-Dimensional Culture Models of Breast Architecture, Function, and Neoplastic Transformation.</a> Semin Cancer Biol. 15 (5), 342-352 (2005).</li>
<li>Hedlund, T. E., Duke, R. C., Miller, G. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Three-Dimensional+Spheroid+Cultures+of+Human+Prostate+Cancer+Cell+Lines%5BTitle%5D)+AND+%22Prostate%22%5BJournal%5D)">Three-Dimensional Spheroid Cultures of Human Prostate Cancer Cell Lines.</a> Prostate. 41 (3), 154-165 (1999).</li>
<li>Le, V. M., Lang, M. D., Shi, W. B., Liu, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Collagen-Based+Multicellular+Tumor+Spheroid+Model+for+Evaluation+of+the+Efficiency+of+Nanoparticle+Drug+Delivery%5BTitle%5D)+AND+%22Artif.+Cells+Nanomed+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">A Collagen-Based Multicellular Tumor Spheroid Model for Evaluation of the Efficiency of Nanoparticle Drug Delivery.</a> Artif. Cells Nanomed Biotechnol. 15, 1-5 (2014).</li>
<li>Neto, A. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Novel+Hanging+Spherical+Drop+System+for+the+Generation+of+Cellular+Spheroids+and+High+Throughput+Combinatorial+Drug+Screening%5BTitle%5D)+AND+%22Biomater+Sci%22%5BJournal%5D)">A Novel Hanging Spherical Drop System for the Generation of Cellular Spheroids and High Throughput Combinatorial Drug Screening.</a> Biomater Sci. 3 (4), 581-585 (2015).</li>
<li>Janvier, R., Sourla, A., Koutsilieris, M., Doillon, C. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stromal+Fibroblasts+are+Required+for+PC-3+Human+Prostate+Cancer+Cells+to+Produce+Capillary-like+Formation+of+Endothelial+Cells+in+a+Three-dimensional+Co-culture+System%5BTitle%5D)+AND+%22Anticancer+Res%22%5BJournal%5D)">Stromal Fibroblasts are Required for PC-3 Human Prostate Cancer Cells to Produce Capillary-like Formation of Endothelial Cells in a Three-dimensional Co-culture System.</a> Anticancer Res. 17 (3A), 1551-1557 (1997).</li>
<li>Doillon, C. J., Gagnon, E., Paradis, R., Koutsilieris, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Three-dimensional+Culture+System+as+a+Model+for+Studying+Cancer+Cell+Invasion+Capacity+and+Anticancer+Drug+Sensitivity%5BTitle%5D)+AND+%22Anticancer+Res%22%5BJournal%5D)">Three-dimensional Culture System as a Model for Studying Cancer Cell Invasion Capacity and Anticancer Drug Sensitivity.</a> Anticancer Res. 24 (4), 2169-2177 (2004).</li>
<li>Gobeil, S., Zhu, X., Doillon, C. J., Green, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Genome-Wide+shRNA+Screen+Identifies+GAS1+as+a+Novel+Melanoma+Metastasis+Suppressor+Gene%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+Dev%22%5BJournal%5D)">A Genome-Wide shRNA Screen Identifies GAS1 as a Novel Melanoma Metastasis Suppressor Gene.</a> Genes Dev. 22 (21), 2932-2940 (2008).</li>
<li>Rajan, N., Habermehl, J., Coté, M. F., Doillon, C. J., Mantovani, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Preparation+Of+Ready-To-Use%2C+Storable+And+Reconstituted+Type+I+Collagen+From+Rat+Tail+Tendon+For+Tissue+Engineering+Applications%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">Preparation Of Ready-To-Use, Storable And Reconstituted Type I Collagen From Rat Tail Tendon For Tissue Engineering Applications.</a> Nat Protoc. 1 (6), 2753-2758 (2007).</li>
<li>Horie, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+Human+Lung+Cancer-associated+Fibroblasts+in+Three-dimensional+In+Vitro+Co-culture+Model%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem+Biophys+Res+Commun%22%5BJournal%5D)">Characterization of Human Lung Cancer-associated Fibroblasts in Three-dimensional In Vitro Co-culture Model.</a> Biochem Biophys Res Commun. 423 (1), 158-163 (2012).</li>
<li>Banyard, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+Genes+Regulating+Migration+and+Invasion+Using+a+New+Model+of+Metastatic+Prostate+Cancer%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Cancer%22%5BJournal%5D)">Identification of Genes Regulating Migration and Invasion Using a New Model of Metastatic Prostate Cancer.</a> BMC Cancer. 30 (14), 387(2014).</li>
<li>Palumbo, J. S., Degen, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fibrinogen+and+Tumor+Cell+Metastasis%5BTitle%5D)+AND+%22Haemostasis%22%5BJournal%5D)">Fibrinogen and Tumor Cell Metastasis.</a> Haemostasis. 31, Suppl. 1 11-15 (2001).</li>
<li>Dvorak, H. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tumor+Stroma%2C+Tumor+Blood+Vessels%2C+and+Antiangiogenesis+Therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+J%22%5BJournal%5D)">Tumor Stroma, Tumor Blood Vessels, and Antiangiogenesis Therapy.</a> Cancer J. 21 (4), 237-243 (2015).</li>
<li>Luoto, K. R., Kumareswaran, R., Bristow, R. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tumor+Hypoxia+as+a+Driving+Force+in+Genetic+Instability%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Integr%22%5BJournal%5D)">Tumor Hypoxia as a Driving Force in Genetic Instability.</a> Genome Integr. 4 (1), 5(2013).</li>
<li>Das, V., Bruzzese, F., Konečný, P., Iannelli, F., Budillon, A., Hajdúch, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pathophysiologically+Relevant+In+Vitro+Tumor+Models+for+Drug+Screening%5BTitle%5D)+AND+%22Drug+Discov+Today%22%5BJournal%5D)">Pathophysiologically Relevant In Vitro Tumor Models for Drug Screening.</a> Drug Discov Today. 20 (7), 848-855 (2015).</li>
<li>Longati, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((3D+Pancreatic+Carcinoma+Spheroids+Induce+a+Matrix-rich%2C+Chemoresistant+Phenotype+Offering+a+Better+Model+for+Drug+Testing%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Cancer%22%5BJournal%5D)">3D Pancreatic Carcinoma Spheroids Induce a Matrix-rich, Chemoresistant Phenotype Offering a Better Model for Drug Testing.</a> BMC Cancer. 13 (95), (2013).</li>
<li>Tan, P. H., Chia, S. S., Toh, S. L., Goh, J. C., Nathanm, S. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Three-dimensional+Spatial+Configuration+of+Tumour+Cells+Confers+Resistance+to+Chemotherapy+Independent+of+Drug+Delivery%5BTitle%5D)+AND+%22J+Tissue+Eng+Regen+Med%22%5BJournal%5D)">Three-dimensional Spatial Configuration of Tumour Cells Confers Resistance to Chemotherapy Independent of Drug Delivery.</a> J Tissue Eng Regen Med. , (2013).</li>
<li>Koutsilieris, M., Reyes-Moreno, C., Choki, I., Sourla, A., Doillon, C., Pavlidis, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chemotherapy+Cytotoxicity+of+Human+MCF-7+and+MDA-MB+231+Breast+Cancer+Cells+is+Altered+by+Osteoblast-Derived+Growth+Factors%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Med%22%5BJournal%5D)">Chemotherapy Cytotoxicity of Human MCF-7 and MDA-MB 231 Breast Cancer Cells is Altered by Osteoblast-Derived Growth Factors.</a> Mol Med. 5 (2), 86-97 (1999).</li>
<li>Lang, N. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biphasic+Response+of+Cell+Invasion+to+Matrix+Stiffness+in+Three-Dimensional+Biopolymer+Networks%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Biomater%22%5BJournal%5D)">Biphasic Response of Cell Invasion to Matrix Stiffness in Three-Dimensional Biopolymer Networks.</a> Acta Biomater. 13, 61-67 (2015).</li>
</ol>

Autorzy nie ujawniają żadnych informacji.

Jako ważny przypis techniczny ważne jest, aby na styku żeli centralnej i obwodowej nie było żadnej przerwy. W przeciwnym razie może to zmniejszyć zdolność komórek do migracji/inwazji żelu fibrynowego. W ciągu pierwszych 24 godzin hodowli może powstać przestrzeń między kolagenem a żelami fibrynowymi, jeśli trombina nie została odpowiednio rozcieńczona. Możliwe jest również, że testowana linia komórkowa może prowadzić do kurczenia się żelu kolagenowego podczas hodowli, powodując w ten sposób tworzenie się stosunkowo dużej ...

Badanie podstawowych i biomedycznych właściwości inwazji/migracji komórek nowotworowych oraz następującego po nich tworzenia przerzutów jest przedmiotem intensywnych badań1,2. Przerzutowanie stanowi końcowy etap nowotworu, a jego zarządzanie kliniczne pozostaje trudne. Lepsze zrozumienie przerzutowania na poziomach komórkowym i molekularnym umożliwi opracowanie bardziej efektywnych terapii3.
Można zbadać kilka właściwości komórek przerzutowych in vitro4 w tym ich pluripotencję oraz zdolność do przechodzenia w stan przejściowy (np., przejście epitelialno-mezenchymalne), aby migrować i naciekać w obrębie oraz poza guzem pierwotnym5Jednakże in vitro ocena procesów inwazji/metastazy stanowiła wyzwanie, ponieważ praktycznie wyklucza ona udział krążenia krwi/limfy. W celu monitorowania agresywności nowotworów stosowano wcześniej hodowle organotypowe, w których fragmenty guza osadzano w żelach kolagenowych. Chociaż złożoność nowotworów zostaje zachowana (np., obecność komórek nowotworowych), fragmenty guza są narażone na ograniczoną dyfuzję pożywki, zmienność próbkowania oraz nadmierny rozrost komórek zrębu6Alternatywna metoda polega na hodowli komórek nowotworowych w obrębie komponentów macierzy zewnątrzkomórkowej (ECM), co naśladuje trójwymiarowe (3D) środowisko komórkowe. Proliferacja linii komórkowych raka piersi w żelu kolagenowym i/lub macierzy pochodzącej z błony podstawnej jest jednym z najlepiej opisanych przykładów trójwymiarowej hodowli komórkowej. Dzięki zastosowaniu specyficznych środowisk hodowli komórek 3D, dezorganizacja struktur obserwowana w przypadku komórek raka piersi hodowanych w standardowych warunkach może zostać odwrócona, prowadząc do spontanicznego tworzenia się cewek piersiowych i struktur cewkowatych.7-10Ponadto tworzenie wielokomórkowych sferoidów nowotworowych pochodzących z komórek raka gruczołowego, zgromadzonych przy użyciu różnych technik (np., kropel wiszących, pływających sferoidów, osadzania w agarze) stanowi obecnie najczęściej stosowany test 3D hodowli komórkowych11-13Jednakże metoda ta jest ograniczona przez niewielki zestaw linii komórek nowotworowych zdolnych do tworzenia sferoidów oraz krótki czas dostępny na badanie komórek w tych warunkach.
W tej wizualizowanej technice przedstawiamy zaawansowany test 3D hodowli komórkowej, w którym badane komórki nowotworowe są zatopione w żelu kolagenowym, aby umożliwić tworzenie in vitro pseudo-guza pierwotnego, który może być opcjonalnie powleczony macierzą pochodzącą z błony podstawnej. Po uformowaniu pseudo-guz pierwotny zostaje zamknięty w macierzy acellularnej (w niniejszym przypadku w żelu fibrynowym), co pozwala komórkom nowotworowym na przekroczenie granicy między dwoma przedziałami macierzy (patrz Rysunek 1). Co ciekawe, w żelu fibrynowym pojawiają się agresywne komórki nowotworowe oraz wtórne struktury przypominające guzy, wywodzące się z pseudo-guza pierwotnego. Taki system hodowli 3D zapewnia elastyczność niezbędną do badania na przykład leków przeciwnowotworowych, ekspresji genów oraz interakcji komórka-komórka i/lub komórka-ECM14-16.
<img alt="Tworzenie modelu guza 3D; komórki nowotworowe, żel kolagenowy w płytce 96-dołkowej; reakcja fibrynogen-trombina; płytka 24-dołkowa; inkubacja hodowli komórkowych." src="/files/ftp_upload/54322/54322fig1.jpg" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Rycina 1"> 
Rycina 1: Przegląd metody. Schematyczne podsumowanie metody generowania trójwymiarowego systemu hodowli komórkowej jako modelu do badań nad nowotworami. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54322/54322fig1large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić większą wersję tej ryciny.</a>

<table><tbody><tr><td>Liofilizowany kolagen</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C7661</td><td>ze ścięgna ogona szczura (rozpuszczalna dyspersja) lub domowej roboty (patrz Rajan et al., ref.#14)</td></tr><tr><td>Fibrynogen (liofilizowany)</td><td>Sigma-Aldrich&nbsp;</td><td>F8630</td><td>Typ I-S, 65 - 85% białka z &ge; 75% białka to krzepliwa</td></tr><tr><td>Trombin</td><td>EMD Chemicals Inc.</td><td>605157</td><td>&nbsp; Gibbstown, New Jersey; Jednostki NIH/mg suchej masy&nbsp;</td></tr><tr><td>Matrigel o obniżonym współczynniku wzrostu&nbsp;</td><td>Corning</td><td>356234</td><td>Wcześniej z BD Biosciences</td></tr><tr><td>Aprotinin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A6279&nbsp;</td><td>&nbsp; roztwór o stężeniu 5 - 10T j.m./ml (jednostka inhibitora trypsyny)&nbsp;</td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>&nbsp; Mikro-łyżki</td><td>Fisher Scientific</td><td>2140115</td><td>Fisherbrand Handi-Hold Mikroszpatułka</td></tr><tr><td>96-dołkowa, okrągła podstawa</td><td>Sarstedt</td><td>3925500</td><td></td></tr><tr><td>Płytka 24-dołkowa</td><td>Sarstedt</td><td>3922</td><td></td></tr><tr><td>Zmodyfikowana Dulbecco's Eagle's Medium</td><td>Sigma Chemical, Co.</td><td>D5546</td><td>DMEM</td></tr><tr><td>Płodowa surowica bydlęca</td><td>VWR</td><td>CAA15-701</td><td>FBS, pochodzenie kanadyjskie.</td></tr><tr><td>Trypsyna-EDTA</td><td>Sigma Chemical, Co.</td><td>T4049</td><td></td></tr><tr><td>Hank' s Zrównoważony roztwór soli&nbsp;</td><td>Sigma Chemical, Co.</td><td>H8264</td><td>HBSS</td></tr></tbody></table>

trójwymiarowy test hodowli w celu zbadania inwazyjności komórek rakowych i tworzenia guzów satelitarnych

Three-Dimensional Culture Assay to Explore Cancer Cell Invasiveness and Satellite Tumor Formation

Hodowla komórek ssaków w monowarstwach jest szeroko stosowana do badania różnych procesów fizjologicznych i molekularnych. Jednak takie podejście do badania rosnących komórek często generuje niechciane artefakty. Dlatego hodowla komórkowa w środowisku trójwymiarowym (3D), często z wykorzystaniem komponentów macierzy zewnątrzkomórkowej, okazała się interesującą alternatywą ze względu na bliskie podobieństwo do natywnej tkanki lub narządu in vivo. Opracowaliśmy system hodowli komórek 3D przy użyciu dwóch przedziałów, a mianowicie (i) centralnego przedziału zawierającego komórki rakowe osadzone w żelu kolagenowym działającym jako pseudo-pierwotny guz makrosferyczny oraz (ii) obwodowego przedziału wolnego od komórek wykonanego z żelu fibrynowego, tj. komponentu macierzy zewnątrzkomórkowej innego niż ten stosowany w centrum, w którym komórki rakowe mogą migrować (front inwazji) i / lub tworzyć guzy mikrosferyczne reprezentujące guzy wtórne lub satelitarne. Powstawanie guzów satelitarnych w przedziale obwodowym jest niezwykle skorelowane ze znaną agresywnością lub przerzutowym pochodzeniem natywnych komórek nowotworowych, co czyni ten system hodowli 3D wyjątkowym. To podejście do hodowli komórkowej może być brane pod uwagę w celu oceny inwazyjności i ruchliwości komórek nowotworowych, interakcji komórka-macierz zewnątrzkomórkowa oraz jako metoda oceny właściwości leków przeciwnowotworowych.

Jak wspomniano wcześniej, ciekawą cechą tego testu 3D z kulturą komórek jest fakt, że komórki nowotworowe mogą nie tylko migrować z kolagenowego zatyczki do sąsiedniego żelu fibrynowego, ale także tworzyć guzy wtórne (np. struktury przypominające guzy satelitarne). Można to zaobserwować bezpośrednio za pomocą odwróconego mikroskopu fazowego przy małych i dużych powiększeniach przez grubość żelu, szczególnie przy użyciu kondensora o dużej odległości roboczej (Rycina 2</str...

Komórki rakowe są umieszczane w żelu kolagenowym, a następnie umieszczane w bezkomórkowym żelu fibrynowym w celu wygenerowania systemu hodowli 3D, w którym można monitorować inwazyjność i powstawanie nowotworów satelitarnych.

Trójwymiarowy test hodowli w celu zbadania inwazyjności komórek rakowych i tworzenia guzów satelitarnych

Mammalian cell culture in monolayers is widely used to study various physiological and molecular processes. However, this approach to study growing cells ...

Ogólnym celem niniejszej procedury jest zamknięcie komórek nowotworowych osadzonych w kolagenie pomiędzy warstwami żelu fibrynowego w celu stworzenia trójwymiarowego systemu hodowli do monitorowania inwazywności i formowania się guzów satelitarnych. Nasz system obrazowania 3D może otwierać nowe możliwości badania różnych typów komórek i wielu kluczowych wariantów podczas apoptozy lub migracji komórek nowotworowych, a także oceny skuteczności leków przeciwnowotworowych. Atrakcyjną cechą tego modelu hodowli komórkowej 3D jest możliwość zmiany stężenia macierzy zewnątrzkomórkowej lub zastosowania innej macierzy zewnątrzkomórkowej do budowy systemu 3D.Procedurę zademonstrują Marie-France Cote, asystentka badawcza w moim laboratorium, oraz Audrey Turcotte, doktorantka pod moim kierownictwem. Należy rozpocząć od blendowania liofilizowanego kolagenu typu I z ścięgna ogona szczura poprzez pięć dwuminutowych cykli mieszania z ustawieniem wysokiej prędkości, aby uzyskać jednorodną dyspersję kolagenu.Podczas procesu wbudowywania kolagenu, należy zebrać interesujące nas komórki nowotworowe, używając odpowiedniego enzymatycznego roztworu odrywającego. Następnie należy przeprowadzić test wyklucz

three-dimensional-culture-assay-to-explore-cancer-cell-invasiveness

Research

JoVE Journal

Medicine

Medycyna

Opisano test do ilościowego pomiaru inwazji indukowanej przez czynnik wzrostu transformującego (TGF)-β w trójwymiarowych żelach kolagenowych. Test ten wykorzystuje serię linii komórkowych MCF10A, które reprezentują różne stadia rozwoju raka piersi. Metodę tę można dostosować do użytku z innymi liniami komórkowymi oraz wykorzystać do badania innych potencjalnych aktywatorów lub inhibitorów inwazji.

Test sferoidów do pomiaru inwazji indukowanej przez TGF-β

Ten film przedstawia szczegółową metodologię hodowli komórek raka piersi w matrycy białkowej błony podstawnej 3D, ilustrując potencjał hodowli 3D w ocenie inwazji komórek do otaczającego środowiska.

Test błony podstawnej hodowli 3D: hodowla komórek rakowych na matrycy białkowej błony podstawnej 3D w celu zbadania inwazji komórek

Ten film demonstruje metodę tworzenia trójwymiarowej kohodowli sferoidów guza i limfocytów T. Przygotowuje się odlew agarozowy z mikrostudzienkami zawierającymi sferoidy guza, a następnie dodaje się limfocyty T. Po inkubacji układ ten pozwala na badanie interakcji limfocytów T ze sferoidami guza w kontrolowanym trójwymiarowym środowisku.

Trójwymiarowy model kohodowli naciekających limfocytów T w sferoidach nowotworowych

Ten artykuł przedstawia metodę fluorescencyjnego znakowania kolagenu, która może być dalej wykorzystywana zarówno do obrazowania na żywo, jak i do obrazowania na żywo kultur komórkowych 3D. Zapewniamy również zoptymalizowany protokół wizualizacji endogennych białek cytoszkieletu komórek hodowanych w środowiskach 3D.

Odkrywanie organizacji cytoszkieletu inwazyjnych komórek nowotworowych w 3D

Trójwymiarowa hodowla komórek nabłonka sutka na odtworzonej błonie podstawnej jest użyteczną metodą do podsumowania in vivo architektury łagodnej piersi i odróżnienia złośliwego fenotypu od łagodnego fenotypu piersi. Co ważne, system ten może być stosowany do badania raków inwazyjnych w innych tkankach.

Hodowle trójwymiarowe: narzędzie do badania normalnej architektury zrazikowej a złośliwej transformacji komórek piersi

Ten artykuł zawiera szczegółowe metodologie wykorzystania testów trójwymiarowych (3D) do ilościowego określenia inwazji komórek raka piersi. W szczególności omawiamy procedury wymagane do skonfigurowania, takie jak testy, kwantyfikacja i analiza danych, a także metody badania utraty integralności błony, która ma miejsce podczas inwazji komórek.

Kwantyfikacja inwazyjności komórek raka piersi za pomocą modelu trójwymiarowego (3D)

Tutaj prezentujemy protokół do ko-hodowli w trzech wymiarach, który jest przydatny do badania interakcji wielokomórkowych i zależnej od macierzy zewnątrzkomórkowej modulacji zachowania komórek rakowych. W tym eksperymentalnym modelu komórki rakowe są hodowane na żelach kolagenowych osadzonych w ludzkich fibroblastach związanych z rakiem.

Trójwymiarowy model kokultury dla interakcji guz-zręb

Inwazja otaczających normalnych tkanek jest cechą charakterystyczną nowotworów złośliwych. Przedstawiamy tutaj prosty, półautomatyczny test mikropłytki inwazji do naturalnej biomatrycy 3D, który został zilustrowany za pomocą wielu modeli zaawansowanych nowotworów u ludzi.

Trójwymiarowy (3D) test inwazji sferoidów guza

Ta metoda ocenia inwazję komórek rakowych ze sferoid na otaczającą matrycę 3D.  Sferoidy są generowane metodą hodowli wiszącej kropli, a następnie osadzane w matrycy składającej się z materiałów błonowych i kolagenu typu I.  Inwazja sferoid jest następnie monitorowana.

Test sferoidalny komórek rakowych do oceny inwazji w warunkach 3D

Procesy rządzące inwazją raka pęcherza moczowego stanowią okazję do rozwoju biomarkerów i terapii. Poniżej przedstawiamy model inwazji raka pęcherza moczowego, który obejmuje hodowlę 3D sferoid guza, obrazowanie poklatkowe i mikroskopię konfokalną. Technika ta jest przydatna do definiowania cech procesu inwazyjnego oraz do badań przesiewowych środków terapeutycznych.

System hodowli komórkowych 3D do badania inwazji i oceny terapii w raku pęcherza moczowego

Przedstawione podejście jednocześnie ocenia inwazję komórek rakowych w testach sferoidalnych 3D i cytotoksyczność limfocytów T. Sferoidy są generowane w odlewie wielodołkowym z agarozy bez rusztowań. Kohodowla i osadzanie w macierzy kolagenu typu I są wykonywane w tym samym urządzeniu, które pozwala monitorować inwazję komórek rakowych i cytotoksyczność za pośrednictwem limfocytów T.

Monitorowanie inwazji komórek nowotworowych i cytotoksyczności limfocytów T w hodowli 3D

Poznaj trójwymiarową hodowlę komórek rakowych w kolagenie i fibrynie do badania inwazyjności i tworzenia guzów satelitarnych. Ta metoda pozwala wizualizować migrację nowotworową i testować terapie przeciwnowotworowe.

Trójwymiarowy test hodowli w celu zbadania inwazyjności komórek rakowych i tworzenia guzów satelitarnych

Przeglądaj więcej filmów