Name: Laser tulowy o fali ciągłej do ogrzewania hodowanych komórek w celu zbadania komórkowych efektów termicznych (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-06-30T13:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 49 s
Description: Poznaj metodę ogrzewania komórek nabłonka barwnikowego siatkówki laserem tulowym o fali ciągłej 1,94 µm. Technika umożliwia precyzyjną kontrolę temperatury i czasu, co pozwala badać odpowiedzi biologiczne na hipertermię w warunkach in vitro.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Ta praca była wspierana przez grant badawczy z niemieckiego Federalnego Ministerstwa Edukacji i Badań (BMBF) (grant #13GW0043C) oraz Europejskiego Biura Badań i Rozwoju Lotniczego (EOARD, grant # FA9550-15-1-0443)

1. Hodowla komórek RPE
<ol>
	<li>Izolacja komórek RPE z oczu świni
	<ol>
		<li>Pozyskać świeżo enukleowane oczy świni z lokalnej rzeźni. Przechowywać je w chłodzie (4 °C) i w ciemności.</li>
		<li>Usunąć tkanki pozagałkowe za pomocą nożyczek i namoczyć oczy w roztworze antyseptycznym przez 5 min.</li>
		<li>Umieścić oczy w wysterylizowanym fosforanie buforze solnym bez jonów wapnia i magnezu (PBS (-)) do czasu użycia.</li>
		<li>Za pomocą skalpela przebić twardówkę w odległości około 5 mm za limbusem rogówki. Wyciąć całą przednią część oka, przecinając nożyczkami przez całą grubość, równolegle do limbusu rogówki.</li>
		<li>Usunąć przednią część oka (tj. rogówkę i soczewkę) oraz ciało szkliste. Dodać 1 mL PBS (-) i delikatnie usunąć siatkówkę neuronową. 
		UWAGA: Tak przygotowana „czara oka”, składająca się z twardówki, naczyniówki i RPE, jest teraz gotowa.</li>
		<li>Do czary oka dodać podgrzaną (37 °C) 0,25% trypsynę w PBS (-). Dostosować objętość tak, aby roztwór trypsyny wypełniał około 80% czary oka.</li>
		<li>Inkubować czarę oka z roztworem trypsyny w inkubatorze z 5% CO2 w temperaturze 37 °C przez 10 min.</li>
		<li>Wyjąć czarę oka z inkubatora i zastąpić 0,25% roztwór trypsyny roztworem PBS (-) z 0,05% trypsyny + 0,2% soli tetrasodowej kwasu etylenodiaminotetraoctowego (EDTA·4N). Inkubować czarę oka w inkubatorze przez 45 min. 
		UWAGA: Po 45 min komórki RPE będą albo słabo przylegające do błony Blocha, albo już oddzielone i pływające w roztworze trypsyny-EDTA.</li>
		<li>Zebrać komórki RPE poprzez delikatne pipetowanie. Przenieść komórki wraz z roztworem do probówki stożkowej wypełnionej 10 mL pożywki hodowlanej (DMEM z wysoką zawartością glukozy z L-glutaminą), zawierającej 10% surowicy świńskiej, antybiotyk/antytykotyk oraz pirogronian sodu (1 mM). 
		UWAGA: Surowica może zneutralizować działanie trypsyny.</li>
		<li>Wirować zawiesinę komórkową przy 400 x g przez 5 min w temperaturze pokojowej.</li>
		<li>Usunąć nadsącz i dodać 10 mL świeżej pożywki. Wirować ponownie w tych samych warunkach przez 5 min.</li>
		<li>Usunąć nadsącz i dodać nową pożywkę tak, aby stężenie komórek wyniosło 5 x 105 komórek/mL (wyznaczone poprzez zliczenie komórek za pomocą komory licznikowej). Wymieszać dokładnie przez delikatne pipetowanie.</li>
		<li>Rozdzielić zawiesinę komórkową do naczyń hodowlanych. Użyć 3 mL na naczynie hodowlane o średnicy 60 mm. 
		UWAGA: Hodowlę tę nazywa się pasażem zero (P0).</li>
		<li>Utrzymywać komórki w inkubatorze z 5% CO2 w temperaturze 37 °C. Co drugi dzień wymieniać połowę pożywki warunkującej na świeżą pożywkę.</li>
		<li>Przeprowadzić subkulturę (krok 1.2), gdy komórki osiągną konfluencję.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Subkultura hodowli komórek RPE
	<ol>
		<li>Usunąć pożywkę hodowlaną i dwukrotnie wypłukać komórki roztworem PBS (-).</li>
		<li>Inkubować komórki z roztworem PBS (-) z 0,05% trypsyny + 0,2% EDTA w inkubatorze z 5% CO2 w temperaturze 37 °C przez 5 min.</li>
		<li>Oddzielić komórki RPE przez delikatne pipetowanie i zebrać zawiesinę komórkową do probówki stożkowej wypełnionej 10 mL pożywki hodowlanej zawierającej 10% surowicy świńskiej.</li>
		<li>Wirować zawiesinę komórkową przy 400 x g przez 5 min w temperaturze pokojowej.</li>
		<li>Usunąć nadsącz i dodać nową pożywkę hodowlaną, tak aby stężenie komórek wyniosło 5 x 105 komórek/mL (wyznaczone poprzez zliczenie liczby komórek za pomocą komory licznikowej). Rozdzielić komórki do nowych naczyń hodowlanych o średnicy 60 mm, zgodnie z opisem w kroku 1.1.13. 
		UWAGA: Hodowla komórkowa stanowi teraz pasaż 1 (P1).</li>
		<li>Po osiągnięciu konfluencji przenieść hodowlę P1 do pasażu P2, stosując tę samą procedurę opisaną w krokach 1.2.1-1.2.5. Z hodowli P2 wysiać komórki do mniejszych naczyń hodowlanych (średnica wewnętrzna 30 mm) zamiast naczyń o średnicy 60 mm.</li>
		<li>Do eksperymentów używać hodowli P2 lub P3.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. Naświetlanie laserem tulowym
<ol>
	<li>Budowa stacji naświetlań
	<ol>
		<li>Podłączyć urządzenie laserowe tulowe (1.94 µm, zakres mocy: 0-20 W) do włókna o aperturze numerycznej 0.22-NA i średnicy rdzenia 365 µm.</li>
		<li>Utrwalić mechanicznie końcówkę włókna na metalowym ramieniu, które jest zamocowane poziomo do pionowego metalowego słupka stacji naświetlań. Ustawić pionowy słupek tak, aby końcówka włókna laserowego znajdowała się nad płytką grzewczą, na której podczas naświetlania będzie umieszczana szalka z hodowlą komórkową.</li>
		<li>Położyć biały papier na płytce grzewczej i włączyć wiązkę celowniczą (λ = 635 nm, max = 1 mW, średnica na poziomie papieru ≈ 30 mm). Zaznaczyć obwód wiązki celowniczej na białym papierze, aby określić miejsce, w którym szalka z hodowlą powinna zostać umieszczona podczas naświetlania. 
		UWAGA: Położenie końcówki włókna w osi z może być regulowane. Bez dodatkowej optyki obrazującej średnica plamki laserowej w płaszczyźnie hodowli komórkowej, umieszczonej 12 cm poniżej końcówki włókna, wynosi około 30 mm, co jest niemal równoważne średnicy wewnętrznej szalki do hodowli komórkowej. Schematycznego rysunku układu przedstawiono na Rysunku 1.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
<img alt="Schemat grzania laserowego; układ lasera tulowego do dyfuzji termicznej w komórkach RPE w szalce hodowlanej." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/54326/54326fig1.jpg" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Rycina 1"> 
Rycina 1: Schemat stacji naświetlania laserem tulowym. Szalka hodowlana zostaje umieszczona na płycie grzewczej. Komórki znajdują się 12 cm poniżej końcówki włókna lasera tulowego, tak aby rozmiar wiązki był niemal identyczny z średnicą wewnętrzną szalki hodowlanej (około 30 mm). Procedura naświetlania laserem jest kontrolowana przez program czasowy autorskiej platformy projektowej systemu. Ustawienie mocy musi zostać określone przed uruchomieniem programu naświetlania. <a href="http://cloudfront.jove.com/files/ftp_upload/54326/54326fig1large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.</a>
<ol start="2">
	<li>Naświetlanie laserowe hodowli komórkowej
	<ol>
		<li>Na 1 h przed napromieniowaniem należy całkowicie wymienić pożywkę hodowlaną na 1,2 ml świeżej pożywki. 
		UWAGA: Jest to KROK KRYTYCZNY, który musi być ściśle przestrzegany.</li>
		<li>Umieść stację naświetlania (t. j. płytkę grzejną oraz trzpień do mocowania włókna laserowego) w komorze z laminarnym przepływem powietrza.</li>
		<li>Wyjmij naczynie z hodowlą komórkową z inkubatora i umieść je w wyznaczonym miejscu na płycie grzejnej (krok 2.1.3).</li>
		<li>Założyć okulary ochronne. Włączyć laser tulowy. Na urządzeniu laserowym ustawić żądaną moc (zakres regulacji od 0 do 20 W). Włączyć emisję.</li>
		<li>Uruchom platformę projektowania systemu, która kontroluje protokół naświetlania laserowego i synchronizację czasową (plik uzupełniający).</li>
		<li>Niezwłocznie po umieszczeniu szalki hodowlanej na płycie grzejnej należy kliknąć „pre-heating time”, aby uruchomić timer na 140 s („pre-heating time 1”); pozwoli to utrzymać temperaturę pożywki na poziomie 37 °C przed napromienianiem. 
		UWAGA: Po 140 s rozlegnie się sygnał dźwiękowy, a następny timer („czas wstępnego podgrzewania 2”) automatycznie rozpocznie odliczanie 8 s. W ciągu tych 8 s badacz może otworzyć szalkę hodowlaną. Po 148 s wstępnego podgrzewania automatycznie zostanie przeprowadzona 10-sekundowa irradiancja laserowa hodowli komórkowej. Na wypadek sytuacji awaryjnej należy wyposażyć urządzenie laserowe w przycisk wymuszonego zatrzymania, aby natychmiast wyłączyć laser. Jest to KROK KRYTYCZNY, który musi być ściśle przestrzegany. Szczególną ostrożność należy zachować przy otwieraniu pokrywy szalki tuż przed irradiancją, na początku 8-sekundowego czasu wstępnego podgrzewania. Otwarcie pokrywy może spowodować bardzo szybkie ochłodzenie powierzchni medium.</li>
		<li>Po napromieniowaniu natychmiast założyć pokrywkę z powrotem na szalkę hodowlaną, pozostawić szalkę na płycie grzejnej na dodatkowe 7 s, a następnie umieścić ją z powrotem w inkubatorze z 5% CO2.2 inkubator w temperaturze 37 °C.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Pomiar rozkładu temperatury na poziomie komórkowym (kalibracja temperatury)
	<ol>
		<li>Wykonaj małe otwory (około 300 µm o średnicy) blisko dna z czterech stron (każda 90°) szalki hodowlanej o średnicy 30 mm (bez komórek); należy użyć czubka igły (20G) podgrzanej palnikiem Bunsena. Otwory należy uszczelnić od zewnątrz taśmą izolacyjną i wykonać mały otwór cienką igłą, tak aby jedynie cienka termopara (200 µm (o tej średnicy) można wprowadzić przez ten otwór w warunkach wodoszczelności.</li>
		<li>Na zewnętrznej stronie dna naczynia hodowlanego narysuj dwie prostopadłe średnice i wyznacz punkt ich przecięcia (t.j. środek dolnej strony) jako punkt zero (0) układu współrzędnych. Zaznaczyć co 3 mm promieniście na zewnątrz szalki (t.j. 0, 3, 6, 9, 12 i 15 mm) w każdym kierunku wzdłuż linii (Rysunek 2, niebieskie kropki); łączna liczba punktów powinna wynosić 21.</li>
		<li>Napełnić naczynie hodowlane 1,2 ml nowej pożywki hodowlanej. Umieścić naczynie hodowlane na płycie grzewczej przy 37 °C, wprowadzić cienką termoparę (200 µm (o średnicy) do otworu bocznego i umieść jego czułą końcówkę w wyznaczonym miejscu przeznaczonym do pomiaru.</li>
		<li>Założyć okulary ochronne. Włączyć laser tulowy i ręcznie ustawić moc urządzenia laserowego (w zakresie od 0 do 20 W, w przyrostach 0,1 W). 
		UWAGA: W przypadku kalibracji temperatury wystarczające powinny być pomiary przy mocy zwiększanej w przyrostach o 3 W.</li>
		<li>Włącz platformę projektową systemu i kliknij przycisk „Start Temp. Acquisition” (plik uzupełniający), aby rozpocząć pomiar temperatury.</li>
		<li>Należy przeprowadzić tę samą procedurę, co w kroku 2.2.6. 
		UWAGA: Program sterujący mierzy temperaturę wprowadzonej termopary co 100 ms i wyświetla przebieg zmian temperatury podczas napromieniowania w interfejsie graficznym użytkownika (GUI).</li>
		<li>Należy przeprowadzić te procedury dla wszystkich 21 punktów pomiarowych oraz przy różnych ustawieniach mocy. Całą procedurę należy powtórzyć trzykrotnie dla wszystkich punktów i wszystkich ustawień mocy w celu uzyskania wiarygodnych danych.</li>
		<li>Wyeksportuj dane o temperaturze do pliku CSV, który można będzie następnie przekonwertować na arkusz kalkulacyjny. Oblicz średnią temperaturę maksymalną osiągniętą pod koniec naświetlania dla pomiarów wykonanych w trzech powtórzeniach w każdym punkcie. Wyciągnij średnią z wartości uzyskanych w punktach położonych na tym samym okręgu (łącznie 4 punkty, z wyłączeniem punktu centralnego).</li>
		<li>Nanieś uzyskaną średnią temperaturę maksymalną na wykres, przyjmując odległość od środka szalki (mm) jako oś x oraz wzrost temperatury (ΔT, °C) jako oś Y. Użyj funkcji dopasowania w programie do obliczeń matematycznych, aby dopasować model Gaussa do surowych danych. Stwórz rozkład temperatur z dopasowaniem gaussowskim.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
<img alt="Schemat punktów pomiarowych; koncentryczne okręgi, niebieskie znaczniki co 3mm do analizy przestrzennej." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/54326/54326fig2.jpg" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Rycina 2"> 
Rycina 2: Punkty kalibracji temperatury w jednej szalce hodowlanej. Dane dotyczące temperatury mierzono w centrum oraz w 5 punktach promieniowych pod 4 różnymi kątami (niebieskie kropki). <a href="http://cloudfront.jove.com/files/ftp_upload/54326/54326fig2large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.</a>
3. Oceny biologiczne odpowiedzi komórkowych po różnych irradiacjach termicznych
<ol>
	<li>Ocena żywotności komórek ( t. j. żywe, apoptotyczne i martwe) po zastosowaniu różnych ustawień mocy oraz określenie progu śmierci komórkowej
	<ol>
		<li>W wyznaczonych punktach czasowych (tj. 3, 24 i 48 h po napromieniowaniu), przemyć komórki buforem PBS (-) i użyć dostępnego komercyjnie zestawu do oceny żywotności komórek (tj. (żywe, apoptotyczne, martwe) zgodnie z protokołem producenta.</li>
		<li>Przygotować roztwór barwiący poprzez dodanie 5 µL annelksyny V znakowanej izotiocyjanianem fluoresceiny (FITC), 5 µL etydium homodimeru III oraz 5 µL Hoechst 33342 do 100 µL buforu wiążącego 1x (wszystkie są komponentami zestawu). Przygotować wystarczającą ilość roztworu barwiącego, aby pokryć komórki. Inkubować komórki przez 15 min.</li>
		<li>Przemyj hodowlę komórkową dwukrotnie buforem wiążącym, zastąp bufor wiążący roztworem PBS (-) i umieść hodowlę na stoliku mikroskopu fluorescencyjnego.</li>
		<li>Przełącz ścieżkę światła na okular, wybierz filtr 4',6-diamidyno-2-fenyloindolu (DAPI), włącz oświetlenie i odszukaj płaszczyznę ostrości przy użyciu obiektywu 4x.</li>
		<li>Przełącz ścieżkę światła na kamerę, odszukaj obraz na ekranie komputera w oprogramowaniu do obrazowania mikroskopowego i ustaw ostrość.</li>
		<li>Użyj funkcji łączenia (stitch) (t. j. funkcję oprogramowania dedykowanego do mikroskopu (pozwalającą na rejestrację wielu obrazów z całej szalki, a następnie stworzenie z nich jednego, dużego obrazu) w celu uzyskania obrazu fluorescencyjnego całej hodowli komórkowej na szalce. Należy zastosować 3 różne zestawy filtrów – DAPI, FITC oraz tetrametylorodaminę (TRITC) – aby odpowiednio zobrazować komórki wykazujące pozytywną reakcję z Hoechst 33342 (wszystkie jądra komórkowe), komórki pozytywne z FITC-anneksyną V (apoptotyczne) oraz komórki pozytywne z etydinium homodimerem III (martwe).</li>
		<li>Zmierz promień (mm) obszaru martwego (dodatniego pod kątem etydyny homodimeru III) oraz promień zewnętrzny i wewnętrzny obszaru apoptotycznego w formie pierścienia (dodatniego pod kątem aneksyny V) w barwionych kulturach komórkowych. Podstaw otrzymane promienie do dopasowanej funkcji Gaussa rozkładu temperatury dla odpowiadającego ustawienia mocy. Oblicz dokładną temperaturę na krawędzi obszaru martwego lub apoptotycznego, aby określić temperatury progowe dla śmierci komórkowej i zmian apoptotycznych.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

<ol><li>Inagaki, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparative+efficacy+of+pure+yellow+%28577-nm%29+and+810-nm+subthreshold+micropulse+laser+photocoagulation+combined+with+yellow+%28561-577-nm%29+direct+photocoagulation+for+diabetic+macular+edema%5BTitle%5D)+AND+%22Jpn+J+Ophthalmol%22%5BJournal%5D)">Comparative efficacy of pure yellow (577-nm) and 810-nm subthreshold micropulse laser photocoagulation combined with yellow (561-577-nm) direct photocoagulation for diabetic macular edema.</a> Jpn J Ophthalmol. 59 (1), 21-28 (2015).</li>
<li>Roider, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Selective+retina+therapy+%28SRT%29+for+clinically+significant+diabetic+macular+edema%5BTitle%5D)+AND+%22Graefes+Arch+Clin+Exp+Ophthalmol%22%5BJournal%5D)">Selective retina therapy (SRT) for clinically significant diabetic macular edema.</a> Graefes Arch Clin Exp Ophthalmol. 248 (9), 1263-1272 (2010).</li>
<li>Brinkmann, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Real-time+temperature+determination+during+retinal+photocoagulation+on+patients%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biomed+Opt%22%5BJournal%5D)">Real-time temperature determination during retinal photocoagulation on patients.</a> J Biomed Opt. 17 (6), 061219(2012).</li>
<li>Yoshimura, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Photocoagulated+human+retinal+pigment+epithelial+cells+produce+an+inhibitor+of+vascular+endothelial+cell+proliferation%5BTitle%5D)+AND+%22Invest+Ophthalmol+Vis+Sci%22%5BJournal%5D)">Photocoagulated human retinal pigment epithelial cells produce an inhibitor of vascular endothelial cell proliferation.</a> Invest Ophthalmol Vis Sci. 36 (8), 1686-1691 (1995).</li>
<li>Denton, M. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Damage+Thresholds+for+Exposure+to+NIR+and+Blue+Lasers+in+an+In+Vitro+RPE+Cell+System%5BTitle%5D)+AND+%22Invest+Ophthalmol+Vis+Sci%22%5BJournal%5D)">Damage Thresholds for Exposure to NIR and Blue Lasers in an In Vitro RPE Cell System.</a> Invest Ophthalmol Vis Sci. 47 (7), 3065-3073 (2006).</li>
<li>Shrestha, R., Choi, T. Y., Chang, W., Kim, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+high-precision+micropipette+sensor+for+cellular-level+real-time+thermal+characterization%5BTitle%5D)+AND+%22Sensors+%28Basel%29%22%5BJournal%5D)">A high-precision micropipette sensor for cellular-level real-time thermal characterization.</a> Sensors (Basel). 11 (9), 8826-8835 (2011).</li>
<li>Gao, F., Ye, Y., Zhang, Y., Yang, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Water+bath+hyperthermia+reduces+stemness+of+colon+cancer+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Clin+Biochem%22%5BJournal%5D)">Water bath hyperthermia reduces stemness of colon cancer cells.</a> Clin Biochem. 46 (16-17), 1747-1750 (2013).</li>
<li>Jansen, E. D., van Leeuwen, T. G., Motamedi, M., Borst, C., Welch, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Temperature+dependence+of+the+absorption+coefficient+of+water+for+midinfrared+laser+radiation%5BTitle%5D)+AND+%22Lasers+Surg+Med%22%5BJournal%5D)">Temperature dependence of the absorption coefficient of water for midinfrared laser radiation.</a> Lasers Surg Med. 14 (3), 258-268 (1994).</li>
<li>Iwami, H., Pruessner, J., Shiraki, K., Brinkmann, R., Miura, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protective+effect+of+a+laser-induced+sub-lethal+temperature+rise+on+RPE+cells+from+oxidative+stress%5BTitle%5D)+AND+%22Exp+Eye+Res%22%5BJournal%5D)">Protective effect of a laser-induced sub-lethal temperature rise on RPE cells from oxidative stress.</a> Exp Eye Res. 124, 37-47 (2014).</li>
<li>Denton, M. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spatially+correlated+microthermography+maps+threshold+temperature+in+laser-induced+damage%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biomed+Optics%22%5BJournal%5D)">Spatially correlated microthermography maps threshold temperature in laser-induced damage.</a> J Biomed Optics. 16 (3), (2011).</li>
<li>Morgan, C. M., Schatz, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Atrophic+creep+of+the+retinal+pigment+epithelium+after+focal+macular+photocoagulation%5BTitle%5D)+AND+%22Ophthalmology%22%5BJournal%5D)">Atrophic creep of the retinal pigment epithelium after focal macular photocoagulation.</a> Ophthalmology. 96 (1), 96-103 (1989).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Omawiając biologiczne reakcje komórkowe związane z temperaturą, znaczenie ma nie tylko temperatura, ale także czas trwania podwyższonej temperatury, ponieważ większość procesów biochemicznych jest zależna od czasu. Szczególnie w dziedzinie hipertermii indukowanej laserem w okulistyce, ze względu na krótki zakres czasu - od milisekund do sekund - trudno jest zbadać efekty termiczne komórek przy precyzyjnej kontroli temperatury. Dlatego pożądana jest konfiguracja naświetlania laserowego odpowiednia dla modelu hodowli komór...

Zrozumienie zależnych od temperatury reakcji biologicznych komórek ma ogromne znaczenie dla skutecznego leczenia hipertermią. Fotokoagulacja laserowa siatkówki za pomocą lasera termicznego, stosowana w okulistyce, jest jednym z najbardziej uznanych zabiegów laserowych w medycynie. Światło widzialne, głównie o długości fali od zielonej do żółtej, jest wykorzystywane w leczeniu laserowym siatkówki. Światło jest silnie absorbowane przez melaninę w komórkach nabłonka barwnikowego siatkówki (RPE), które tworzą najbardziej zewnętrzną monowarstwę komórkową siatkówki. Ostatnio pojawiło się zainteresowanie wśród lekarzy i badaczy bardzo łagodnym promieniowaniem termicznym (fotokoagulacja w świetle widzialnym) jako nową strategią terapeutyczną dla różnych rodzajów zaburzeń siatkówki1,2. Podążając za tym trendem, naszym zainteresowaniem jest subletalne podgrzewanie ogniw RPE pod precyzyjną kontrolą temperatury, techniką zwaną terapią fototermiczną sterowaną temperaturą (TC-PTT).
Najnowsza technologia optoakustyczna z naszego instytutu pozwoliła na pomiar wzrostu temperatury w czasie rzeczywistym w napromieniowanych miejscach siatkówki. Umożliwia to kontrolę nad wzrostem temperatury podczas napromieniowania3. Ponieważ jednak subletalna hipertermia siatkówki, spowodowana subletalnym ogrzewaniem komórek RPE, nie była wcześniej brana pod uwagę ze względu na niemożność pomiaru i kontrolowania temperatury, zależne od temperatury reakcje komórek RPE na termiczne promieniowanie laserowe były do tej pory bardzo mało badane. Co więcej, nie tylko różnica temperatur nie została szczegółowo omówiona, ale także różnica w zachowaniu komórek, które przeżyły po subletalnym i śmiertelnym napromieniowaniu. Dlatego, aby zebrać dowody naukowe na temat leczenia opartego na TC-PTT, staramy się wyjaśnić zależne od temperatury reakcje biologiczne komórek RPE i ich mechanizmy za pomocą konfiguracji eksperymentalnych in vitro.
W tym celu konieczne jest stworzenie konfiguracji ogrzewania komórek, która spełnia następujące warunki: 1) możliwość szybkiego wzrostu temperatury, 2) precyzyjnie kontrolowany czas i temperatura, oraz 3) stosunkowo duża liczba badanych komórek do eksperymentów biologicznych. Jeśli chodzi o metodę ogrzewania, laser kliniczny, taki jak laser Nd.YAG o podwójnej częstotliwości (532 nm), niestety nie nadaje się do ogrzewania kultur komórkowych. Wynika to ze znacznie zmniejszonej liczby melanosomów w hodowanych komórkach RPE. Absorpcja światła laserowego może być niejednorodna, a wzrost temperatury na poziomie komórkowym jest zmienny między eksperymentami, nawet gdy jest naświetlany tą samą mocą promieniowania. Kilka wcześniejszych badań donosiło o użyciu czarnego papieru pod dnem naczynia podczas napromieniania4 lub użyciu dodatkowych melanosomów, które są fagocytowane przez komórki hodowlane przed eksperymentami5,6. Wiele badań biologicznych in vitro mających na celu ocenę odpowiedzi komórek wywołanych hipertermią przeprowadzono przy użyciu gorącej płyty, łaźni wodnej lub inkubatora CO2 z ustawieniem temperatury7. Metody te wymagają długiego okresu nagrzewania, ponieważ osiągnięcie pożądanej temperatury zajmuje trochę czasu (tj. kilka minut). Co więcej, przy użyciu tych metod trudno jest uzyskać szczegółową historię termiczną (tj. temperaturę pomnożoną przez czas) na poziomie komórkowym. Co więcej, temperatura między komórkami w różnych pozycjach w jednym naczyniu hodowlanym może się różnić ze względu na zmienną dyfuzję temperatury. W większości przypadków te czasowe i przestrzenne informacje o temperaturze podczas hipertermii nie były brane pod uwagę w analizach biologicznych, mimo że na biologiczną odpowiedź komórki może mieć krytyczny wpływ temperatura i czas trwania podwyższonej temperatury.
Aby przezwyciężyć te problemy, zastosowano tutaj laser tulowy o ciągłej fali do ogrzewania komórek. Promieniowanie lasera tulowego (λ = 1,94 μm) jest silnie absorbowane przez wodę8, a komórki na dnie szalki hodowlanej są stymulowane termicznie wyłącznie przez dyfuzję termiczną. Światłowód laserowy o średnicy 365 μm jest umieszczony około 12 cm nad naczynią hodowlaną, bez żadnej optyki pomiędzy nimi. Średnica wiązki laserowej różni się w taki sposób, że jest prawie równa wewnętrznej średnicy naczynia hodowlanego (30 mm) na powierzchni pożywki hodowlanej. Przy stałej ilości pożywki hodowlanej możliwe jest napromienianie komórek przy wzroście temperatury o wysokiej powtarzalności. Zmienne ustawienia mocy umożliwiają naświetlanie promieniowaniem do 20 W, a temperatura medium na poziomie komórkowym może wzrosnąć do ΔT ≈ 26 °C w ciągu 10 s.
Poprzez modyfikację warunków napromieniowania, możliwa jest również zmiana profilu wiązki laserowej, aby zmienić rozkład temperatury w naczyniu hodowlanym. Na przykład możliwe jest badanie z rozkładem temperatury podobnym do Gaussa, jak w obecnym badaniu, lub z jednorodnym rozkładem temperatury. To ostatnie może być korzystne dla badania wpływu zależnych od temperatury reakcji komórek w szczególności na subletalny wzrost temperatury, ale nie na stres związany ze śmiercią komórki lub reakcje gojenia się ran.
Łącznie, naświetlanie laserem tulowym może umożliwić badanie różnych rodzajów czynników biologicznych, takich jak ekspresja genów/białek, kinetyka śmierci komórki, proliferacja komórek i rozwój funkcjonalności komórek, po różnych ekspozycjach termicznych.

<table><tbody><tr><td><silny>Odczynniki</silny></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco' s Zmodyfikowany Orzeł" s Medium - wysoki poziom glukozy</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D5796-500ML</td><td>Dodaj (2)-(4) przed użyciem. Ciepło w 37 stopniach; C kąpiel wodna przed użyciem.</td></tr><tr><td>Antybiotykowy roztwór przeciwgrzybiczy (100 & razy;)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A5955-100ML</td><td>Zawiera 10 000 jednostek penicyliny, 10 mg streptomycyny i 25 &mu; g Amfoterycyna B w 1 ml. Przed użyciem dodać 5,5 ml do średniej butelki o pojemności 500 ml (1).</td></tr><tr><td>Pirogronian sodu (100 mM)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S8636-100ML</td><td>Przed użyciem dodać 5,5 ml do 500 ml średniej butelki (1) (stężenie końcowe: 1 mM)</td></tr><tr><td>Surowica</td> świńska <td>Sigma-Aldrich</td><td>12736C-500ML</td><td>Przed użyciem dodać 50 ml do 500 ml pożywki (1) (ostatecznie: 10%)</td></tr><tr><td>Sól fizjologiczna buforowana fosforanami (PBS)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D8537-500ML</td><td></td></tr><tr><td>Trypsyna z trzustki świni</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T4799-25G</td><td></td></tr><tr><td>Kwas etylenodiaminotetraoctowy (EDTA)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>ED-100G</td><td></td></tr><tr><td>Ludzki zestaw VEGF Quantikine ELISA</td><td>R& D System</td><td>DVE00</td><td></td></tr><tr><td>Oxiselect Zestaw do oznaczania całkowitego glutationu</td><td>Cell Biolabs, Inc</td><td>STA-312</td><td></td></tr><tr><td>Zestaw do wykrywania apoptotycznego/nekrottycznego/zdrowych komórek</td><td>PromoKine</td><td>PK-CA707-30018</td><td></td></tr><tr><td>Nazwa</td><td>Company</td><td>Numer katalogowy</td><td>Komentarze</td></tr><tr><td>Equipments</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Thulium laser</td><td>Starmedtec GmbH</td><td>Prototyp</td><td>0-20 W</td></tr><tr><td>365 mm średnica rdzenia fiber</td><td>KOMPONENTY LASEROWE Niemcy</td><td>CF01493-52</td><td></td></tr><tr><td>Termopara</td><td>Omega Engineering Inc</td><td>HYP-0-33-1-T-G-60-SMPW-M</td><td></td></tr><tr><td>Płyta grzewcza</td><td>MEDAX</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Czytnik mikropłytek ( spektrofluorometr)</td> <td>Urządzenie molekularne</td> Homogenizator komórkowy <td>Spectramax M4</td><td></td></tr><tr><td></td><td>QIAGEN</td><td>TissueLyser LT</td><td></td></tr><tr><td>Mikroskop fluorescencyjny</td><td>Nikon</td><td>ECLIPSE Ti</td><td></td></tr><tr><td>matematyczny program komputerowy</td><td>The Mathworks. Inc</td><td>MATLAB Release 2015b</td><td></td></tr> platforma <tr><td>projektowania systemu</td><td>National Instrument</td><td>Labview</td><td>Laboratory Virtual Instrument Engineering Workbench</td></tr></tbody></table>

laser tulowy o fali ciągłej do ogrzewania hodowanych komórek w celu zbadania komórkowych efektów termicznych

Continuous-wave Thulium Laser for Heating Cultured Cells to Investigate Cellular Thermal Effects

Oryginalna metoda ogrzewania hodowanych komórek za pomocą lasera tulowego o ciągłej fali 1,94 μm do oceny biologicznej została tutaj wprowadzona. Promieniowanie lasera tulowego jest silnie absorbowane przez wodę, a komórki na dnie naczynia hodowlanego są podgrzewane poprzez dyfuzję termiczną. Światłowód laserowy o średnicy 365 μm umieszcza się około 12 cm nad naczynią hodowlaną, bez żadnej optyki, tak aby średnica wiązki laserowej była prawie równa wewnętrznej średnicy szalki hodowlanej (30 mm). Utrzymując stałą ilość pożywki hodowlanej w każdym eksperymencie, możliwe jest napromienianie komórek z wysoce powtarzalnym wzrostem temperatury.
Aby skalibrować wzrost temperatury i jej rozkład w jednym naczyniu do hodowli komórkowych dla każdego ustawienia mocy, temperatura była mierzona podczas 10 s naświetlania w różnych pozycjach i na poziomie komórkowym. Rozkład temperatury został odwzorowany za pomocą programu do grafiki matematycznej, a jego wzór na szalce hodowlanej był w formie Gaussa. Po naświetlaniu laserowym można przeprowadzić różne eksperymenty biologiczne w celu oceny reakcji komórek zależnych od temperatury. W tym manuskrypcie wprowadzono barwienie żywotności (tj. rozróżnianie komórek żywych, apoptotycznych i martwych), aby pomóc określić temperatury progowe dla apoptozy i śmierci komórek w różnych punktach w czasie.
Zaletami tej metody są precyzja temperatury i czasu grzania, a także jej wysoka efektywność w podgrzewaniu komórek w całym naczyniu do hodowli komórkowej. Co więcej, pozwala na naukę w szerokim zakresie temperatur i czasu trwania, które mogą być dobrze kontrolowane przez skomputeryzowany system operacyjny.

Rozkład temperatury przy różnych ustawieniach mocy
Wszystkie zmiany temperatury dla każdego pojedynczego naświetlania były monitorowane podczas kalibracji temperatury. Z tych danych wyznaczono maksymalną temperaturę w punkcie pomiarowym, zdefiniowaną jako Tmax (°C). Jak pokazano na Rysunku 3A, program został uruchomiony w momencie umieszczenia naczynia hodowlanego na płycie grzewczej. Po 140...

Oryginalna eksperymentalna konfiguracja do ogrzewania komórek w naczyniu hodowlanym za pomocą promieniowania laserowego o ciągłej fali 1,94 μm jest tutaj wprowadzona. Za pomocą tej metody można badać reakcje biologiczne komórek nabłonka barwnikowego siatkówki (RPE) po różnych ekspozycjach termicznych.

Laser tulowy o fali ciągłej do ogrzewania hodowanych komórek w celu zbadania komórkowych efektów termicznych

An original method to heat cultured cells using a 1.94 &#181;m continuous-wave thulium laser for biological assessment is introduced here. Thulium laser ...

Ogólnym celem tej procedury jest zbadanie zależnych od dawki termicznej odpowiedzi biologicznych komórek in vitro poprzez ogrzewanie hodowanych komórek z precyzyjną kontrolą temperatury i czasu. Metoda ta może pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytania w dziedzinach zajmujących się reakcją komórek lub tkanek na hipertermię, takich jak badanie laserowego leczenia siatkówki. Główną zaletą tej techniki jest szybkie nagrzewanie komórek i precyzyjna kontrola czasu nagrzewania, co pozwala na wysoką powtarzalność ekspozycji termicznej podczas eksperymentów.Chociaż metoda ta może zapewnić wgląd w reakcje hodowanych komórek nabłonka barwnikowego siatkówki na termiczne promieniowanie laserowe, można ją również zastosować do innych modeli, takich jak komórki rakowe. Po raz pierwszy na pomysł tej metody wpadliśmy podczas ogrzewania komórek zawierających melaninę za pomocą widzialnego światła laserowego. Skutkowało to jednak różnymi profilami temperaturowymi ze względu na różnice w pigmentacji.Aby rozpocząć procedurę, umieść płytę grzejną w regulowanym metalowym stojaku laboratoryjnym na czystej ławce. Ustaw płytę grzejną na 39 stopni Celsjusza. Przymocuj włókno 0.22 NA o średnicy rdzenia 365 mikro

continuous-wave-thulium-laser-for-heating-cultured-cells-to

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Opracowaliśmy nowe, wielofunkcyjne nanopęcherzyki zwane porfisomami, które mają zależne od struktury samowygaszanie fluorescencji i unikalne właściwości fototermiczne, dzięki czemu działają jako silne środki terapii fototermicznej. Opracowaliśmy porfisomy za pomocą wytłaczania pod wysokim ciśnieniem i zbadaliśmy ich skuteczność terapii fototermicznej w modelu guza ksenoprzeszczepu.

Jednominutowa, sub-jednowatowa fototermiczna ablacja guza przy użyciu porfisomów, wewnętrznych wielofunkcyjnych nanopęcherzyków

Fale uderzeniowe są obecnie dobrze znane ze swoich efektów regeneracyjnych. W związku z tym eksperymenty in vitro cieszą się coraz większym zainteresowaniem. W związku z tym opracowaliśmy model do badań fal uderzeniowych in vitro (IVSWT), który umożliwia nam naśladowanie warunków in vivo, unikając w ten sposób rozpraszających efektów fizycznych.

Zastosowanie fali uderzeniowej w hodowlach komórkowych

AN został opracowany specjalnie zaprojektowany laserowy aparat grzewczy kompatybilny z MRI, aby zapewnić miejscowe ogrzewanie guzów podskórnych w celu aktywacji uwalniania czynników z termoczułych liposomów, szczególnie w obszarze guza.

Specjalnie zaprojektowane laserowe urządzenie grzewcze do wyzwalanego uwalniania cisplatyny z termoczułych liposomów z prowadzeniem obrazu rezonansu magnetycznego

Tenadrifluoroacetonian europu (EuTFC) ma linię luminescencji optycznej o długości fali 612 nm, której skuteczność aktywacji znacznie spada wraz z temperaturą. Jeśli próbka pokryta cienką warstwą tego materiału zostanie zmikroobrazowana, intensywność odpowiedzi luminescencyjnej 612 nm może zostać przekształcona w bezpośrednią mapę temperatury powierzchni próbki.

Mikroobrazowanie termiczne o wysokiej rozdzielczości z wykorzystaniem powłok luminescencyjnych z chelatem europu

Ta metoda ma na celu zlokalizowanie pionowych defektów podpowierzchniowych. W tym przypadku łączymy laser z przestrzennym modulatorem światła i uruchamiamy jego wejście wideo, aby deterministycznie podgrzać powierzchnię próbki za pomocą dwóch modulowanych linii antyfazowych, uzyskując jednocześnie obrazy termiczne o wysokiej rozdzielczości. Pozycja defektu jest uzyskiwana z oceny minimów zakłóceń fal termicznych.

Lokalizacja defektów podpowierzchniowych poprzez ogrzewanie strukturalne za pomocą laserowej termografii fototermicznej

Prezentowany tutaj jest protokół wytwarzania mikropęcherzyków z nanocząsteczkami tlenku żelaza (NSM) poprzez samoorganizację, synergię reakcji magnetycznej, akustycznej i optycznej w jednej nanoterapeutycznej platformie do hipertermii magnetycznej i fototermicznej terapii przeciwnowotworowej.

Mikropęcherzyki reagujące na magnesy, akustycznie i optycznie do hipertermii magnetycznej i potototermicznej skojarzonej terapii nowotworów

W protokole tym przedstawiono techniki i metodologię niezbędne do celowanej terapii hipertermicznej w modelach guzów litych. Podejście to wykorzystuje fototermiczną konwersję światła w bliskiej podczerwieni przez wstrzykiwane domięśniowo złote nanopręty w celu wywołania miejscowego ogrzewania w mikrośrodowisku guza.

Indukowanie ukierunkowanej łagodnej hipertermii w mysich modelach nowotworów poprzez fototermiczną konwersję światła w bliskiej podczerwieni za pomocą wewnątrznowotworowych nanoprętów złota

W tym artykule przedstawiono technikę termorefleksji w dziedzinie częstotliwości (FDTR) do lokalnej niedestrukcyjnej charakterystyki termicznej i obrazowania.

Technika termorefleksji w dziedzinie częstotliwości do pomiarów właściwości termicznych

Wpływ sztywności podłoża na funkcje komórkowe można modelować in vitro, wykorzystując hydrożele poliakryloamidowe o różnym stopniu podatności.

Badanie wpływu sztywności macierzy na funkcje komórkowe z wykorzystaniem hydrożeli na bazie akrylamidu

W tym filmie wykorzystujemy adenowirus niosący gen rekombinazy Cre do zakażenia pierwotnych embrionalnych fibroblastów myszy posiadających floxowany allel Rac1.

Genetyczne usuwanie cząsteczek sygnałowych w hodowanych pierwotnych fibroblastach embrionalnych myszy za pomocą adenowirusów

Poznaj metodę ogrzewania komórek nabłonka barwnikowego siatkówki laserem tulowym o fali ciągłej 1,94 µm. Technika umożliwia precyzyjną kontrolę temperatury i czasu, co pozwala badać odpowiedzi biologiczne na hipertermię w warunkach in vitro.

Laser tulowy o fali ciągłej do ogrzewania hodowanych komórek w celu zbadania komórkowych efektów termicznych

Przeglądaj więcej filmów