Laser tulowy o fali ciągłej do ogrzewania hodowanych komórek w celu zbadania komórkowych efektów termicznych

Ogólnym celem tej procedury jest zbadanie zależnych od dawki termicznej odpowiedzi biologicznych komórek in vitro poprzez ogrzewanie hodowanych komórek z precyzyjną kontrolą temperatury i czasu. Metoda ta może pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytania w dziedzinach zajmujących się reakcją komórek lub tkanek na hipertermię, takich jak badanie laserowego leczenia siatkówki. Główną zaletą tej techniki jest szybkie nagrzewanie komórek i precyzyjna kontrola czasu nagrzewania, co pozwala na wysoką powtarzalność ekspozycji termicznej podczas eksperymentów.

Chociaż metoda ta może zapewnić wgląd w reakcje hodowanych komórek nabłonka barwnikowego siatkówki na termiczne promieniowanie laserowe, można ją również zastosować do innych modeli, takich jak komórki rakowe. Po raz pierwszy na pomysł tej metody wpadliśmy podczas ogrzewania komórek zawierających melaninę za pomocą widzialnego światła laserowego. Skutkowało to jednak różnymi profilami temperaturowymi ze względu na różnice w pigmentacji.

Aby rozpocząć procedurę, umieść płytę grzejną w regulowanym metalowym stojaku laboratoryjnym na czystej ławce. Ustaw płytę grzejną na 39 stopni Celsjusza. Przymocuj włókno 0.22 NA o średnicy rdzenia 365 mikrometrów do poziomego ramienia stojaka.

Umieść metalowe ramię nad płytą grzejną i wyreguluj podstawę tak, aby końcówka światłowodu znajdowała się 12 centymetrów nad płytą grzejną. Podłącz 1,94 mikrometra 20-watowy laser Thulium z wiązką celowniczą 365 nular o mocy jednego miliwata do końcówki światłowodu. Umieść naczynie hodowlane o średnicy 30 milimetrów na płycie grzejnej.

Ostrożnie prześledź obwód naczynia na powierzchni płyty grzejnej, a następnie wyjmij naczynie. Włącz wiązkę celowniczą i wyreguluj podstawę, aż środek plamki wiązki na płycie grzejnej będzie pasował do narysowanego okręgu. Następnie wyłącz wiązkę celowniczą.

Aby rozpocząć procedurę kalibracji temperatury, podgrzej końcówkę igły o rozmiarze 20 za pomocą palnika Bunsena. Za pomocą podgrzanej końcówki igły przebij naczynie hodowlane o średnicy 30 milimetrów blisko dna w czterech punktach oddalonych od siebie o 90 stopni, aby wykonać otwory o średnicy około 300 mikrometrów. Umieść taśmę izolacyjną na otworach.

Użyj cienkiej igły, aby przebić otwór o średnicy około 200 mikrometrów przez taśmę zakrywającą każdy otwór. Na spodniej stronie naczynia hodowlanego narysuj linię między każdą parą otworów oddalonych od siebie o 180 stopni. Zaczynając od przecięcia linii, zaznacz co trzy milimetry promieniście wzdłuż każdej linii, aby wyznaczyć 21 punktów pomiarowych.

Następnie umieść w naczyniu dokładnie 1,2 mililitra świeżej pożywki hodowlanej podgrzanej do 37 stopni Celsjusza. Przykryj naczynie i ustaw naczynie w narysowanym okręgu na płycie grzejnej. Podłącz termoparę o średnicy 200 mikrometrów do komputera sterującego laserem i otwórz protokół kalibracji temperatury.

Włóż termoparę do jednego z otworów w naczyniu tak, aby końcówka znajdowała się na dnie naczynia w jednym z miejsc oznaczenia. Bardzo ważne jest, aby sprawdzić, czy końcówka termopary dotyka dna naczynia z zmierzoną precyzją, ponieważ temperatura może się zmieniać w zależności od głębokości. Poczekaj, aż pożywka hodowlana ustabilizuje się w temperaturze 37 stopni Celsjusza.

Następnie włącz laser Thulium i ustaw moc lasera na żądany poziom początkowy. Sprawdź, czy czas podgrzewania jest ustawiony na 140 i osiem sekund, a następnie rozpocznij sekwencję naświetlania podgrzewania. Po 140 sekundach, zgodnie z sygnałem dźwiękowym, natychmiast zdejmij pokrywę naczynia hodowlanego.

Poczekaj, aż zakończy się podgrzewanie i nastąpi 10-sekundowe napromieniowanie. Następnie natychmiast przykryj naczynie. Zmierz w ten sposób temperaturę w 21 miejscach.

Wykonaj tę procedurę trzy razy w odstępach trzech watów mocy w zakresie obejmującym zakres mocy lasera. Po zakończeniu wyłącz laser tulowy. Eksport i analiza danych dotyczących temperatury.

Przed eksperymentem należy wynająć komórki nabłonka barwnikowego w szalkach hodowlanych o średnicy 30 średnic. Utrzymuj hodowle komórkowe w temperaturze 37 stopni Celsjusza w atmosferze 5% dwutlenku węgla i sprawdzaj je za pomocą systemu obrazowania żywych komórek. Na godzinę przed napromienianiem należy zastąpić pożywkę hodowlaną w każdym naczyniu dokładnie 1,2 mililitra świeżej pożywki hodowlanej.

Zwróć kultury do inkubatora. Sprawdź, czy stacja naświetlania jest gotowa i czy płyta grzejna jest ustawiona na 39 stopni Celsjusza. Gdy będziesz gotowy do rozpoczęcia naświetlania, uruchom laser tulowy z żądaną mocą.

Otwórz protokół eksperymentu i sprawdź, czy czas podgrzewania jest ustawiony na 140 i osiem sekund. Umieść hodowlę komórek RPE w zamkniętym naczyniu w zaznaczonym miejscu na płycie grzejnej i natychmiast rozpocznij 140- i ośmiosekundową sekwencję naświetlania podgrzewającego. Zdejmij pokrywę naczynia po 140 sekundach podgrzewania.

Poczekaj, aż zakończy się podgrzewanie i nastąpi 10-sekundowe napromieniowanie. Natychmiast przykryj naczynie, odczekaj siedem sekund, a następnie włóż naczynie z powrotem do inkubatora. Napromieniuj dodatkowe próbki przy rosnących poziomach mocy lasera.

Po zakończeniu wyłącz laser tulowy. Aby rozpocząć ocenę żywotności komórek, należy przemyć napromieniowane komórki PBS. Uzyskaj zestaw zdolny do różnicowania żywych komórek apoptotycznych i nekrotycznych.

Następnie w słabym świetle połącz 500 mikrolitrów buforu wiążącego z 25 mikrolitrami homodimeru etydyny-3, aneksyny FITC i Hoechst 33342. Inkubuj komórki w tym roztworze barwiącym w temperaturze pokojowej przez 15 minut. Następnie dwukrotnie przemyj komórki buforem wiążącym 1X.

Zastąp bufor wiążący PBS i umieść komórkę na stoliku mikroskopu fluorescencyjnego z filtrami DAPI, FITC i TRITC. Ustaw ścieżkę światła mikroskopu do soczewki okularu i wybierz filtr DAPI. Włącz światło podświetlające i znajdź płaszczyznę ostrości za pomocą obiektywu 4X.

Ustaw ścieżkę światła do kamery mikroskopu. Użyj oprogramowania do obrazowania mikroskopowego, aby wyśrodkować i ustawić ostrość obrazu. Zdefiniuj parametry akwizycji obrazu za pomocą filtra DAPI.

Powtórz proces ustawiania ostrości i konfigurację akwizycji obrazu za pomocą filtrów FITC i TRITC. Następnie użyj oprogramowania do obrazowania, aby uzyskać wiele obrazów z trzema zestawami filtrów w poprzek naczynia i połączyć je w jeden obraz całego naczynia hodowlanego. Użyj oprogramowania analitycznego, aby określić progi temperatury dla apoptozy i śmierci komórki.

Proporcjonalna zależność między maksymalnym wzrostem temperatury w środku naczynia do hodowli komórkowej a mocą lasera została określona za pomocą opisanej procedury kalibracji termicznej. Maksymalny rozkład temperatury w szalce do hodowli komórkowej został następnie dopasowany do funkcji Gaussa. Po napromieniowaniu zaobserwowano trzy wzorce barwienia.

Nie zaobserwowano zmiany żywotności w kulturach poddanych działaniu temperatur równych lub niższych niż 43 stopnie Celsjusza. Apoptozę po raz pierwszy zaobserwowano trzy godziny po napromieniowaniu w temperaturze 47 stopni Celsjusza. Śmierć komórki obserwowano później niż trzy godziny po 51 stopniach Celsjusza i wyższych.

Średnie temperatury progowe dla apoptozy i śmierci komórki zostały następnie określone poprzez zastosowanie średniej zmierzonych promieni obszarów martwych i apoptotycznych do funkcji Gaussa opisującej rozkład temperatury. Po tej procedurze naświetlanie może być wykonywane w wielu różnych warunkach, takich jak różne profile lasera, rozmiary plamek i czasy naświetlania. Może to pomóc w zrozumieniu i zbadaniu pytań związanych z indywidualnymi przyczynami temperatury w czasie na poziomie komórkowym.

Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak podgrzać kulturę komórkową z dobrą kontrolą temperatury i czasu. Może to wpłynąć na możliwości badania reakcji biologicznych na różne warunki napromieniowania cieplnego. Nie zapominaj, że praca z laserami może być bardzo niebezpieczna dla oczu i skóry.

Bądź na bieżąco ze szkoleniami w zakresie bezpieczeństwa napromieniania laserowego. Podczas wykonywania tej procedury należy zawsze nosić odpowiednie okulary ochronne, fartuch laboratoryjny i rękawice.