Wytwarzanie rusztowania z poli(glikolu etylenowego) z odwróconego koloidalnego kryształu: trójwymiarowa platforma do hodowli komórek do inżynierii tkankowej wątroby
27 sierpnia 2016
Ten manuskrypt przedstawia szczegółowy protokół wytwarzania powstającej trójwymiarowej platformy hodowli hepatocytów, odwróconego koloidalnego kryształowego rusztowania oraz towarzyszących technik oceny zachowania hepatocytów. Kontrolowane pory o kontrolowanej wielkości, wzajemne połączenia i zdolność do koniugacji białek macierzy zewnątrzkomórkowej z rusztowaniem z poli(glikolu etylenowego) (PEG) zwiększają wydajność komórek Huh-7,5.
Ogólnym celem tej procedury jest wytworzenie odwróconych koloidalnych rusztowań krystalicznych na bazie PEG z kodowaniem macierzy zewnątrzkomórkowej do zastosowań w inżynierii tkankowej wątroby. Inżynieria tkankowa wątroby to ekscytująca dziedzina inżynierii tkankowej i medycyny regeneracyjnej. Tworzymy rusztowania inżynieryjne 3D, które pozwalają komórkom wątroby zachować swoją funkcję przez długi czas.
Implikacje tej techniki rozciągają się na testowanie leków, ponieważ komórki wątroby hodowane za pomocą tego systemu mogą dłużej zachowywać swoją funkcję i lepiej reagować na lek. Chociaż metoda ta może dostarczyć informacji na temat inżynierii tkankowej, może być również stosowana w innych systemach, takich jak te wykorzystujące komórki macierzyste. Procedurę zademonstruje Hitomi, doktorantka z mojego laboratorium.
Aby przygotować foremki do mikrokulek, najpierw odetnij końcówki z 0,2 mililitrowych, odpornych na gotowanie probówek do mikrowirówek na poziomie 40 mikrolitrów. Użyj wodoodpornego kleju, aby przykleić wierzchołki ciętych rurek do szklanych szkiełek okładkowych mikroskopu, a następnie przyklej wokół foremek. Następnie zastąp wodę w fiolce z mikrosferami polistyrenu 70% etanolem.
Umieść roztwór kulki w łaźni ultradźwiękowej i poddaj mieszaninę sonikacji o mocy 30 watów przez trzy minuty, aby poluzować zagregowane kule. Po przygotowaniu mikrosfer należy wlać pipetą 100 mikrolitrów etanolu do każdej z foremek. Następnie odetnij cztery milimetry od górnej części końcówki pipety o pojemności 200 mikrolitrów i użyj jej do dwukrotnego pipetowania 25 mikrolitrów mikrosfer polistyrenu do formy.
Umieść foremki na bujanej wytrząsarce i ustaw ją na 120 obr./min. Pozostaw próbki na noc na wytrząsarce. Następnego dnia umieść formy pod mikroskopem i sprawdź, czy kulki są ułożone sześciokątnie.
Pozwól etanolowi odparować w temperaturze pokojowej przez dwie noce. W tym czasie ostrożnie umieść kompleks formy i koralików w piecu o temperaturze 130 stopni Celsjusza na sześć godzin, aby wyżarzać kulki polistyrenowe i uformować negatyw rusztowania 3D. Po pierwsze, zsyntetyzuj makromery diakrylanu glikolu polietylenowego przy użyciu ustalonych protokołów, jak opisano w tych dwóch odniesieniach.
Następnie przygotuj 50% roztwór PEGDA w wodzie dejonizowanej i odwiruj mieszaninę aż do całkowitego rozpuszczenia. W przypadku rusztowań sprzężonych z macierzą zewnątrzkomórkową dodać 10% oleju z kryla PEG NHS do 50% roztworu PEGDA. Następnie przygotuj 20% roztwór podstawowy fotoinicjatora w 70% etanolu.
Dodać 50 mikrolitrów roztworu fotoinicjatora na każdy mililitr mieszaniny PEGDA. Następnie mieszaj mieszaninę przez minutę. Następnie oderwij foremki od szkiełek szkiełkowych, ostrożnie wypchnij kratki za pomocą szpatułki i umieść je w osobnych 1,5-mililitrowych probówkach wirówkowych.
Odpipetować 300 mikrolitrów roztworu PEGDA do każdej probówki, a następnie odwirować probówki, aby umożliwić infiltrację roztworu PEGDA do sieci polistyrenowej. Następnie usuń kratkę z rurki za pomocą pęsety i ostrożnie zetrzyj nadmiar roztworu PEGDA z powierzchni. Umieść siatkę na szkle pokrytym folią parafinową płaską, okrągłą powierzchnią do góry.
Następnie wystaw rusztowanie na działanie światła ultrafioletowego o długości 365 nanometrów przez pięć minut za pomocą lampy punktowej UV. Umieść około dziesięciu spolimeryzowanych sieci krystalicznych PEGDA w nowej fiolce i dodaj 20 mililitrów THF. Potrząsać fiolkami na wytrząsarce orbitalnej z prędkością 300 obr./min przez sześć godzin.
Fiolkę należy wyjmować co jedną do dwóch godzin i wymieniać rozpuszczalnik zawierający polimer na świeży THF. Po ostatnim płukaniu dodaj wodę do zużytego roztworu THF, aby sprawdzić, czy kulki PS całkowicie się rozpuściły. Jeśli roztwór jest biały, wykonaj dodatkowe płukania, aż roztwór stanie się przezroczysty.
Aby wysterylizować rusztowania, przygotuj 50-mililitrową probówkę do mikrowirówki z dwoma mililitrami 70% etanolu na rusztowanie i umieść rusztowania w rurze za pomocą szpatułki. Pozwól rusztowaniu moczyć się w etanolu przez godzinę. Po godzinie ostrożnie wylej etanol i zastąp go równą objętością sterylnego PBS.
Następnie odwiruj rusztowania, aby usunąć wszelkie pęcherzyki. Przechowywać rusztowania wirówki w temperaturze czterech stopni Celsjusza i usuwać je co jedną do dwóch godzin, aby zastąpić roztwór świeżym PBS. Po kilku zmianach w PBS usuń rusztowania, które mają być pokryte kolagenem i umieść je w probówce zawierającej jeden mililitr kolagenu typu jeden na rusztowanie, które ma być pokryte.
Następnie odwiruj probówkę jak poprzednio, a następnie potrząśnij rusztowaniami z prędkością 400 obr./min na wytrząsarce orbitalnej przez 30 minut. Rusztowania należy przechowywać przez noc w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Hoduj komórki raka wątroby w 100-milimetrowych szalkach do hodowli komórkowych z 10 mililitrami pożywki hodowlanej.
Zmieniaj pożywkę co trzy dni, aż gęstość komórek osiągnie 75 do 80% powierzchni hodowli. Gdy komórki są gotowe, ostrożnie umieść rusztowania płaską powierzchnią skierowaną do góry na 24-dołkowej płytce. Następnie opłucz każde rusztowanie dwoma mililitrami PBS.
Odessać PBS i dodać dwa mililitry pożywki wzrostowej do rusztowań. Po 30 minutach usuń podłoże i pozostaw rusztowanie do wyschnięcia na godzinę. Następnie zbierz komórki raka wątroby metodą trawienia trypsyny.
Po osadzeniu komórek należy usunąć supernatant i ponownie zawiesić osad tak, aby na 25 mikrolitrów przypadało milion komórek. Powoli odpipetować 25 mikrolitrów zawiesiny komórek bezpośrednio na każdym rusztowaniu. Następnie przykryj płytkę i umieść ją na noc w inkubatorze.
Następnie ostrożnie przenieś rusztowania na nową 24-dołkową płytkę i odpipetuj dwa mililitry pożywki do każdej studzienki przed powrotem płytki do inkubatora. Na zdjęciu pokazano skaningowy mikroskop elektronowy rusztowania. Składa się z sześciokątnego, najbliżej upakowanego układu porów o średnicy średnio od 100 do 105 mikronów, które tworzą połączenia z sąsiednimi porami, które w większości mają średnicę od 35 do 40 mikronów.
Po wysianiu komórkami raka wątroby komórki rosną i namnażają się na rusztowaniach, które są wstępnie pokryte kolagenem typu pierwszego, ale nie rozszerzają się w liczbie na gołych rusztowaniach. Ponadto komórki wątroby wątrobowej na rusztowaniach pokrytych kolagenem wykazywały większą funkcję komórek w sposób zależny od stężenia. W dniu 14 komórki raka wątroby wyhodowane w rusztowaniach ICC pokrytych 400 mikrogramami na mililitr wydzielały ponad trzy razy więcej albuminy niż te hodowane na gołym rusztowaniu.
Podejmując się tej procedury, należy pamiętać o tym, aby upewnić się, że kulki styropianowe w kratownicy są prawidłowo ułożone. Złe ułożenie doprowadzi do słabych połączeń, co może niekorzystnie wpłynąć na aktywność komórek. Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak wytwarzać celcyjne rusztowania z odwróconych kryształów koloidalnych na bazie PEG z powłoką.
Nie zapominaj, że praca z tetrahydrofuranem może być niebezpieczna, a podczas wykonywania tej procedury należy zawsze zachować środki ostrożności, takie jak praca w dygestoriach oraz noszenie rękawic i okularów.
Wyświetl pełny transkrypt i uzyskaj dostęp do tysięcy filmów naukowych
Przegląd
Niniejszy manuskrypt przedstawia szczegółowy protokół wytwarzania trójwymiarowej platformy do hodowli hepatocytów, opartej na rusztowaniu z odwróconego kryształu koloidalnego, oraz techniki oceny zachowania hepatocytów. Metoda ta pozwala komórkom wątroby na zachowanie ich funkcji przez dłuższy czas, co usprawnia zastosowania w testowaniu leków.
Kluczowe elementy badania
Dziedzina nauki
- Inżynieria tkankowa
- Medycyna regeneracyjna
- Kultura hepatocytów
Wstęp
- Inżynieria tkankowa wątroby jest obiecującą dziedziną.
- Utrzymanie funkcji komórek wątroby jest kluczowe dla testowania leków.
- Rusztowania z odwróconych kryształów koloidalnych zapewniają środowisko 3D.
- Białka macierzy zewnątrzkomórkowej mogą zostać sprzężone w celu poprawy wydajności.
Cel badania
- Wytworzenie rusztowań w postaci odwróconych kryształów koloidalnych na bazie PEG.
- Poprawa warunków hodowli komórek wątroby.
- Zbadanie możliwości zastosowania w testowaniu leków i systemach komórek macierzystych.
Zastosowane metody
- Wytwarzanie rusztowań na bazie PEG.
- Ocena zachowania hepatocytów.
- Koniugacja białek macierzy zewnątrzkomórkowej.
- Prezentacja procedury przeprowadzona przez studenta studiów drugiego stopnia.
Główne wyniki
- Opracowano rusztowania z porami o kontrolowanym rozmiarze.
- Zaobserwowano poprawę parametrów funkcjonalnych komórek Huh-7.5.
- Osiągnięto dłuższe utrzymanie funkcji komórek wątroby.
- Zidentyfikowano potencjalne zastosowania w testach leków.
Wnioski
- Odwrócone rusztowanie z kryształu koloidalnego jest skuteczne w inżynierii tkankowej wątroby.
- Metoda ta może dostarczyć cennych informacji na temat innych systemów inżynierii tkankowej.
- Przyszłe badania mogą rozszerzyć zakres zastosowań w medycynie regeneracyjnej.
Najczęściej zadawane pytania
Znaczenie dla przemysłu
Niniejszy protokół umożliwia wytworzenie trójwymiarowego rusztowania w postaci odwróconego kryształu koloidalnego na bazie PEG, które wspiera funkcje hepatocytów oraz oddziaływanie z macierzą zewnątrzkomórkową, rozwiązując tym samym kluczowy problem w inżynierii tkankowej wątroby w kontekście predykcyjnych testów leków. Dzięki zapewnieniu regulowanej architektury porowatej o kontrolowanej wielkości porów i ich wzajemnym połączeniu, system ten usprawnia komunikację między komórkami a ECM oraz perfuzję pożywki, co jest krytyczne dla utrzymania fenotypu wątrobowego in vitro. Platforma ta oferuje powtarzalne i skalowalne podejście do minimalizacji ryzyka w testach opartych na hepatocytach na wczesnym etapie procesu odkrywania leków, zwiększając pewność w zakresie walidacji celów terapeutycznych oraz identyfikacji związków wiodących.
Zastosowania strategiczne w badaniach i rozwoju biofarmaceutycznym
Wczesne odkrywanie i walidacja celu
- Wartość naukowa: Umożliwia badanie funkcji hepatocytów oraz sygnalizacji zależnej od ECM w fizjologicznie istotnym mikrośrodowisku 3D.
- Wartość operacyjna: Zapewnia spójne wysiewanie komórek i długoterminową stabilność hodowli, co redukuje zmienność wyników funkcjonalnych.
- Wartość prognostyczna: Zwiększa sekrecję albuminy i inne funkcje wątrobowe, poprawiając możliwości translacyjne testów toksyczności i metabolizmu in vitro.
Przesiewanie i opracowywanie testów
- Wartość naukowa: Zapewnia połączoną sieć porowatą o dużej powierzchni właściwej, co ułatwia jednorodną ekspozycję związku i dyfuzję metabolitów.
- Wartość operacyjna: Umożliwia standaryzowane wytwarzanie rusztowań oraz powlekanie białkami, co zapewnia powtarzalność testów pomiędzy partiami i laboratoriami.
- Skalowalność: Kompatybilność z formatami płytek wielodołkowych oraz możliwość automatyzacji w celu prowadzenia przesiewów o średniej i wysokiej przepustowości.
Badania translacyjne i przedkliniczne
- Ciągłość translacyjna: Łączy testy hepatocytów na etapie odkrywania z walidacją przedkliniczną poprzez utrzymanie kluczowych funkcji specyficznych dla wątroby podczas przedłużonych okresów hodowli.
- Mechanistyczne ograniczanie ryzyka: Umożliwia ocenę oddziaływań białek ECM (np. kolagenu) na wydajność hepatocytów, co pozwala na wybór modelu istotnego dla markerów biologicznych.
- System istotny dla patologii chorób: Wspiera modelowanie patofizjologii wątroby w połączeniu ze specyficznymi dla danej choroby bodźcami lub modyfikacjami genetycznymi.
Integracja potoków i przepływów pracy
Platforma ICC wpisuje się w kontinuum procesu odkrywania leków, od wczesnej walidacji celu po optymalizację związku wiodącego, szczególnie w przypadku terapii ukierunkowanych na wątrobę, gdzie utrzymanie funkcji hepatocytów jest niezbędne do dokładnego profilowania farmakokinetycznego i toksykologicznego.
- Biologia odkrywcza: Wspiera testowanie hipotez dotyczących specyficznych dla wątroby szlaków oraz metabolizmu leków poprzez zachowanie fenotypu i funkcji hepatocytów.
- Screening: Umożliwia niezawodny screening związków dzięki zastosowaniu ustandaryzowanych, porowatych rusztowań, które zapewniają jednorodne rozprowadzenie składników odżywczych i leków.
- Analityka: Ułatwia ilościowe odczyty funkcjonalne, takie jak sekrecja albuminy, produkcja mocznika i aktywność CYP450, jako wskaźniki stanu zdrowia wątroby.
- Badania translacyjne: Stanowi platformę zapewniającą ciągłość przedkliniczną, umożliwiając długotrwałą hodowlę oraz modulację ECM w celu naśladowania mikrośrodowiska wątroby in vivo.
- Ponowne wykorzystanie w przedsiębiorstwie: Stanowi modularną, adaptowalną platformę, którą można stosować w przypadku wielu źródeł hepatocytów (pierwotnych, pochodzących z komórek macierzystych, linii komórkowych) i rozszerzać na inne typy tkanek.
Wpływ operacyjny i przedsiębiorczy
- Wartość naukowa: Zwiększa wiarygodność predykcyjną modeli hepatocytów poprzez poprawę interakcji z ECM i ograniczenie dedyferencjacji.
- Wartość operacyjna: Zapewnia zestandaryzowany, oparty na rozpuszczalnikach proces wytwarzania z kontrolą jakości poprzez weryfikację architektury porów.
- Wartość strategiczna: Zmniejsza odsetek niepowodzeń w późnych fazach badań dzięki poprawie istotności fizjologicznej wczesnych testów toksyczności i skuteczności w wątrobie.
- Wpływ na portfolio: Umożliwia podejmowanie decyzji go/no-go w oparciu o dane dzięki bardziej przekładalnym sygnałom skuteczności i bezpieczeństwa w badaniach przedklinicznych.
Kwestie związane z wdrożeniem
- Wymaga doświadczenia w zakresie formowania mikrofluidycznego, polimeryzacji UV oraz technik wymywania rozpuszczalnikami.
- Zależność od dostępu do sprzętu do sonikacji, źródeł światła UV oraz inkubatorów orbitalnych do obróbki rusztowań.
- Konieczność stosowania zstandaryzowanych protokołów w zakresie uporządkowania mikrosfer, infiltracji PEGDA oraz usuwania cząstek za pomocą THF w celu zapewnienia jednolitości porów.
- Obejmuje kwestie optymalizacji gęstości powłoki ECM oraz sterylizacji rusztowania w celu zachowania biokompatybilności i powtarzalności.
- Wiąże się z obchodzeniem się z tetrahydrofuranem (THF), co ze względu na jego niebezpieczny charakter wymaga pracy pod wyciągiem i stosowania środków ochrony indywidualnej (PPE).
