Wytwarzanie rusztowania z poli(glikolu etylenowego) z odwróconego koloidalnego kryształu: trójwymiarowa platforma do hodowli komórek do inżynierii tkankowej wątroby

Ogólnym celem niniejszej procedury jest wytwarzanie rusztowań z odwróconych kryształów koloidalnych na bazie PEG z macierzą pozakomórkową do zastosowań w inżynierii tkanki wątroby. Inżynieria tkanki wątroby jest fascynującą dziedziną inżynierii tkankowej i medycyny regeneracyjnej. Tworzymy trójwymiarowe rusztowania inżynieryjne, które pozwalają komórkom wątroby zachować swoją funkcję przez długi czas.

Zastosowania tej techniki obejmują testowanie leków, ponieważ komórki wątroby hodowane w tym systemie mogą dłużej zachowywać swoją funkcjonalność i lepiej reagować na działanie leków. Choć metoda ta może dostarczyć cennych informacji w zakresie inżynierii tkankowej, może być ona również zastosowana w innych systemach, na przykład takich wykorzystujących komórki macierzyste. Procedurę zaprezentuje Hitomi, doktorantka z mojego laboratorium.

Aby przygotować formy do mikrokulek, należy najpierw odciąć końcówki probówek do mikrocentryfugi o objętości 0,2 mililitra, odpornych na gotowanie, na poziomie 40 µL. Używając wodoodpornego kleju, należy przykleić wierzchołki odciętych probówek do szklanych szkiełek nakrywkowych do mikroskopu, a następnie zakleić obszar wokół form. Następnie wodę w fiolce z mikrosferami polistyrenowymi należy zastąpić 70% etanolem.

Umieść roztwór sfer w kąpieli ultradźwiękowej i poddaj mieszaninę sonikacji przy mocy 30 watów przez trzy minuty, aby rozluźnić zagregowane sfery. Po przygotowaniu mikrosfer pipetuj 100 µl etanolu do każdej z form. Następnie odetnij cztery milimetry z górnej części końcówki pipety 200 µl i użyj jej do dwukrotnego przeniesienia 25 µl mikrosfer polistyrenowych do formy.

Umieść formy na wytrząsarce kołyszącej i ustaw prędkość na 120 RPM. Pozostaw próbki na wytrząsarce na noc. Następnego dnia umieść formy pod mikroskopem i sprawdź, czy sfery są ułożone w strukturze heksagonalnej.

Pozostaw etanol do odparowania w temperaturze pokojowej przez dwie noce. Następnie ostrożnie umieść kompleks formy i kulek w piekarniku nagrzanym do 130 stopni Celsjusza na sześć godzin, aby przeprowadzić wyżarzanie kulek polistyrenowych i utworzyć negatyw rusztowania 3D. Najpierw zsyntezuj makromery polietylenoglikolu diakrylanu zgodnie z uznanymi protokołami opisanymi w tych dwóch referencjach.

Następnie należy przygotować 50% roztwór PEGDA w wodzie dejonizowanej i wirować mieszaninę do czasu całkowitego rozpuszczenia substancji. W przypadku rusztowań koniugowanych z macierzą zewnątrzkomórkową do 50% roztworu PEGDA należy dodać dodatkowe 10% PEG NHS z olejem z kryla. Następnie należy przygotować 20% roztwór zapasowy fotoinicjatora w 70% etanolu.

Dodaj 50 µL roztworu fotoinicjatora na każdy mililitr mieszaniny PEGDA. Następnie mieszaj mieszaninę w wirówce typu vortex przez jedną minutę. W kolejnym kroku odklej formy od szkiełek przedmiotowych, ostrożnie wyjmij kratki za pomocą szpatułki i umieść je w oddzielnych probówkach do wirowania o pojemności 1,5 ml.

Do każdej probówki pipetuj 300 µL roztworu PEGDA, a następnie wiruj probówki, aby roztwór PEGDA mógł przeniknąć do sieci polistyrenowej. Następnie wyjmij sieć z probówki za pomocą pęsety i ostrożnie osusz nadmiar roztworu PEGDA z powierzchni. Umieść sieć na szkle pokrytym folią parafinową płaską, okrągłą powierzchnią skierowaną do góry.

Następnie naświetlaj rusztowanie światłem ultrafioletowym o długości fali 365 nanometrów przez pięć minut, używając lampy punktowej UV. Umieść około dziesięciu spolimeryzowanych sieci krystalicznych PEGDA w nowej fiolce i dodaj 20 mililitrów THF. Inkubuj fiolki na wytrząsarce orbitalnej przy 300 RPM przez sześć godzin.

Wyjmuj fiolkę co jedną do dwóch godzin i wymieniaj rozpuszczalnik zawierający polimer na świeży THF. Po ostatnim płukaniu dodaj wodę do zużytego roztworu THF, aby sprawdzić, czy sfery PS całkowicie się rozpuściły. Jeśli roztwór jest biały, wykonaj dodatkowe płukania, aż roztwór stanie się przezroczysty.

Aby wysterylizować rusztowania, należy przygotować probówkę do mikrocentryfugi o pojemności 50 ml z dwiema mililitrami 70% etanolu na każde rusztowanie i umieścić rusztowania w probówce za pomocą szpatułki. Pozostawić rusztowania do namoczenia w etanolu przez jedną godzinę. Po upływie godziny ostrożnie wylać etanol i zastąpić go równą objętością sterylnego PBS.

Następnie wiruj rusztowania, aby usunąć pęcherzyki powietrza. Przechowuj wirówki z rusztowaniami w temperaturze czterech stopni Celsjusa i wyjmuj je co jedną do dwóch godzin w celu wymiany roztworu na świeży PBS. Po kilku wymianach PBS wyjmij rusztowania przeznaczone do powlekania kolagenem i umieść je w probówce zawierającej jeden mililitr kolagenu typu I na każde powlekane rusztowanie.

Następnie odwiruj probówkę w taki sam sposób jak wcześniej, a potem wstrząsaj rusztowania z prędkością 400 RPM na wytrząsarce orbitalnej przez 30 minut. Przechowuj rusztowania przez noc w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Hoduj komórki raka hepatokomórkowego w 100 milimetrowych naczyniach hodowlanych z 10 mililitrami pożywki hodowlanej.

Wymieniaj pożywkę co trzy dni, aż gęstość komórek osiągnie 75 do 80% powierzchni hodowli. Gdy komórki będą gotowe, ostrożnie umieść rusztowania płaską powierzchnią do góry w płytce 24-dołkowej. Następnie przepłucz każde rusztowanie dwiema mililitrami PBS.

Odessać PBS i dodać dwa mililitry pożywki wzrostowej do rusztowań. Po 30 minutach usunąć pożywkę i pozostawić rusztowanie do wyschnięcia na jedną godzinę. Następnie zebrać komórki raka wątrobowego, stosując metodę trawienia trypsyną.

Po odwirowaniu komórek należy usunąć nadsącz i ponownie zawiesić pellet w taki sposób, aby uzyskać stężenie jednego miliona komórek na 25 µL. Powolnym ruchem nanieść pipetą 25 µL zawiesiny komórkowej bezpośrednio na każdy rusztowanie. Następnie przykryć płytkę i umieścić ją w inkubatorze na noc.

Następnie ostrożnie przenieś rusztowania do nowej płytki 24-dołkowej i pipetuj dwa mililitry pożywki do każdego dołka, po czym wprowadź płytkę z powrotem do inkubatora. Tutaj przedstawiono obraz rusztowania wykonany za pomocą skaningowego mikroskopu elektronowego. Składa się ono z sześciokątnej, najgęstszej struktury upakowania porów o średnicy od 100 do 105 mikronów, które tworzą połączenia z sąsiednimi porami o średnicy zazwyczaj od 35 do 40 mikronów.

Po wysianiu komórek raka wątroby, komórki te rosły i proliferowały na rusztowaniach uprzednio pokrytych kolagenem typu I, jednak nie zwiększały swojej liczby na rusztowaniach niepokrytych. Ponadto komórki raka wątroby na rusztowaniach pokrytych kolagenem wykazywały większą aktywność funkcjonalną w sposób zależny od stężenia. W 14. dniu komórki raka wątroby hodowane na rusztowaniach ICC pokrytych stężeniem 400 µg/mL wydzieliły ponad trzykrotnie większą ilość albuminy niż komórki hodowane na rusztowaniu niepokrytym.

Podczas wykonywania tej procedury należy pamiętać o zapewnieniu prawidłowego ułożenia sfer polistyrenowych w sieci. Nieprawidłowe ułożenie doprowadzi do słabej łączności między sferami, co może niekorzystnie wpłynąć na aktywność komórek. Po obejrzeniu tego filmu powinni Państwo posiadać wiedzę na temat tego, jak wytwarzać celulowane rusztowania z odwróconych kryształów koloidalnych na bazie PEG z powłoką.

Należy pamiętać, że praca z tetrahydrofuranem może być niebezpieczna, dlatego podczas wykonywania tej procedury zawsze należy zachować środki ostrożności, takie jak praca w dygestorium oraz stosowanie rękawic i okularów ochronnych.