Name: Wytwarzanie rusztowania z poli(glikolu etylenowego) z odwróconego koloidalnego kryształu: trójwymiarowa platforma do hodowli komórek do inżynierii tkankowej wątroby (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-08-27T13:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 18 s
Description: Poznaj metodę wytwarzania rusztowań PEG z odwróconego kryształu koloidalnego do inżynierii tkankowej wątroby. Technika ta umożliwia długotrwałe utrzymanie funkcji hepatocytów, poprawiając testowanie leków.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Autorzy pragną podziękować za wsparcie ze strony National Research Foundation Fellowship (NRF -NRFF2011-01) oraz Competitive Research Programme (NRF-CRP10-2012-07).

Autorzy nie mają żadnych konkurencyjnych interesów finansowych do ujawnienia.

Rusztowania inżynierii tkankowej szybko ewoluują, aby zapewnić wszystkie fizyczne i biochemiczne wskazówki niezbędne do regeneracji, utrzymania lub naprawy tkanek w celu zastosowania wymiany narządów, badania chorób, opracowywania leków iwielu innych. W inżynierii tkankowej wątroby pierwotne ludzkie hepatocyty szybko tracą swoje funkcje metaboliczne po odizolowaniu od organizmu, co stwarza ogromne zapotrzebowanie na rusztowania inżynieryjne i opracowywanie platform do utrzymania funkcji wątroby. Obecne platfor...

Wątroba jest wysoce unaczynionym organem o wielu funkcjach, w tym detoksykacji krwi, metabolizmie ksenobiotyków i produkcji białek surowicy. Tkanka wątroby ma złożoną trójwymiarową (3D) mikrostrukturę, składającą się z wielu typów komórek, kanalików żółciowych, sinusoid i stref o różnym składzie biomatrycy i różnych stężeniach tlenu. Biorąc pod uwagę tę skomplikowaną strukturę, trudno było stworzyć właściwy model wątroby in vitro1. Istnieje jednak rosnące zapotrzebowanie na funkcjonalne modele in vitro, w których ludzkie hepatocyty służą jako platformy do badania toksycznościleków2 i badań nad chorobami związanymi z wątrobą3.
Obecne platformy inżynierii tkankowej wątroby uprościły złożoność wątroby, izolując jeden lub skupiając się na kilku parametrach wątroby, a mianowicie kokulturze komórek4, składzie biochemicznym mikrośrodowisk strefowych5, dynamice przepływu6,7 i konfiguracji biomatrycy8. Konfigurację biomatrycy można podzielić na takie parametry, jak materiały rusztowań, skład białek macierzy zewnątrzkomórkowej (ECM), sztywność matrycy, a także konstrukcja i struktura rusztowania. Nastąpił wzrost liczby badań inżynierii tkankowej z wykorzystaniem syntetycznych hydrożeli, zwłaszcza hydrożeli z poli(glikolu etylenowego) (PEG)9, biorąc pod uwagę możliwość dostrajania właściwości mechanicznych, bioaktywności i szybkości degradacji hydrożelu. Jeśli chodzi o badania związane z wątrobą, biokompatybilny hydrożel zastosowano do badania infekcji wirusowych chorób wątroby3. Jako projekt platformy hepatocytów, w licznych badaniach wykorzystano kultury kanapkowe hepatocytów10,11 i enkapsulację komórek w hydrożelu12,13, aby zapewnić środowisko 3D oraz interakcję komórka-ECM i komórka-komórka, które są niezbędne do naśladowania mikrośrodowiska in vivo. Platformy te nie posiadają jednak wysokiego stopnia kontroli i organizacji przestrzennej, co prowadzi do niejednorodnych właściwości przez rusztowanie14.
Rusztowanie koloidalne z odwróconym kryształem (ICC)14 to wysoce zorganizowane rusztowanie 3D do hodowli komórek, które zostało po raz pierwszy wprowadzone na początku 2000 roku. Unikalną strukturę rusztowania można przypisać prostemu procesowi wytwarzania przy użyciu kryształu koloidalnego, uporządkowanej sieci cząstek koloidalnych o zmiennej średnicy. Krótko mówiąc, aby podsumować proces, cząstki są starannie układane i wyżarzane za pomocą ciepła, aby utworzyć sieć. Wypłukiwanie tej sieci przez rozpuszczalnik organiczny w spolimeryzowanym hydrożelu powoduje powstanie sześciokątnie upakowanych kulistych wnęk15 o dużej powierzchni. To wysoce uporządkowane rusztowanie zostało wcześniej wykonane zarówno z materiałów syntetycznych, jak i naturalnych, w tym między innymi poli(akrylamidu)16-21, poli(kwasu mlekowo-ko-glikolowego)15,22-30, poli(glikolu etylenowego)31,32, poli(metakrylanu 2-hydroksyetylu)21,33-35 i chitozanu36-39. Rusztowania ICC wykonane z materiałów niepowodujących zanieczyszczeń mają tendencję do promowania sferoid komórkowych w jamach14,23,40. Wykazano, że wiele typów komórek z powodzeniem proliferuje, różnicuje się i funkcjonuje w tej konfiguracji, w tym chondrocyty41, komórki zrębu szpiku kostnego42 i komórki macierzyste43,44. Jeśli chodzi o hepatocyty, przeprowadzono badania z rusztowaniami ICC wykonanymi z Na2SiO3 i poli(akrylamidu), ale nie PEG. Dzięki prostym strategiom biokoniugacji (tj. sprzężeniu amin przez EDC/NHS) można wytwarzać rusztowania na bazie PEG sprzężone z białkami ECM, które mogą udowodnić, że więcej miejsc wiązania komórek jest środowiskiem bardziej podobnym do in vivo i poprawia funkcję wątroby.
W tym manuskrypcie i powiązanym filmie, szczegółowo opisujemy produkcję rusztowania ICC przy użyciu hydrożelu z poli(glikolu etylenowego) diakrylanu (PEGDA) i polistyrenowej siatki mikrosferycznej, zoptymalizowanej pod kątem hodowli raka wątroby (Huh-7.5). Pokazujemy różnice między ogólnie nieprzylepnymi rusztowaniami PEGDA ICC a rusztowaniem PEGDA ICC pokrytym kolagenem pod względem topologii rusztowania i wydajności komórek. Żywotność i funkcja komórek są mierzone jakościowo i ilościowo w celu oceny zachowania komórek Huh-7,5.

<table><tbody><tr><td>Probówka do PCR 0,2 ml</td><td>Axygen Scientific</td><td>PCR-02D-C</td><td>Odporny na gotowanie</td></tr><tr><td>klej Gorilla Glue</td><td>Gorilla Glue, Inc.</td><td>Zależy od dostawcy. Został on zakupiony w lokalnym sklepie.</td><td></td></tr><tr><td>Prowadnice szklane</td><td>VWR</td><td>631-1575</td><td>Wymiary: 24 razy; 60 mm2</td></tr><tr><td>Kulki polistyrenowe</td><td>Fisher Scientific</td><td>TSS#4314A</td><td>Średnica = 140 &mikro; m; 3x104 cząstki na mililitr i 1,4% rozkład wielkości</td></tr><tr><td>Etanol</td><td>Merck</td><td>1.00983.1011</td><td>bezwzględny do analizy EMSURE; Rozcieńczyć do 70% wodą Milli-Q</td></tr><tr><td>Kąpiel ultradźwiękowa Piec</td><td>wyposażeniowy</td><td>Elma</td><td>S10H</td></tr><tr><td></td><td>Nabertherm</td><td>N7/H</td><td>Sprzęt</td></tr><tr><td>200 &micro; l końcówka do pipet</td><td>Axygen Scientific</td><td>T-210-Y-R-S</td><td></td></tr><tr><td>Wytrząsarka wahadłowa</td><td>VWR</td><td>444-0142</td><td></td></tr><tr><td>Glikol polietylenowy (PEG)</td><td>Merck</td><td>1.09727.0100</td><td>Mw= 4 kDa; arylacja monomerów PEG i oczyszczanie powstałego osadu wytwarza makromer PEGDA o Mw = 4,6&nbsp; kDa</td></tr><tr><td>Wirówka</td><td>Beckman Coulter</td><td>392932</td><td>Sprzęt</td></tr><tr><td>Akrylan - Poli(Glikol etylenowy) - Walerianian sukcynimidylu</td><td>Laysan Bio</td><td>ACRL-PEG-SVA-3400-1g</td><td>Mw = 3,4 kDa</td></tr><tr><td>2-hydroksy-4'-(2-hydroksyetoksy)-2-metylopropiofenon</td><td>Sigma Aldrich</td><td>410896</td><td></td></tr><tr><td>Vortex</td><td>VWR</td><td>58816-123</td><td>Sprzęt</td></tr><tr><td>Mikrowirówka</td><td>Eppendorf</td><td>5404 000.413</td><td></td></tr><tr>Parafilm z<td>folii parafinowej</td><td>M&nbsp;</td><td>#PM996</td><td>Utrzymywany na poziomie 9" z intensywnością 10,84&nbsp; mW/cm2</td></tr><tr><td>Reflektor UV Bluewave 200</td><td>Blaze Technology&nbsp;</td><td>120008, 122300</td><td></td></tr><tr><td>Tetrahydrofuran (THF)</td><td>Merck</td><td>107025</td><td></td></tr><tr><td>Wytrząsarka orbitalna</td><td>Heidolph</td><td>543-123120-00-5</td><td></td></tr><tr><td>Kolagen typu I</td><td>Sigma Aldrich</td><td>C3867-1VL</td><td>Od szczura 1x, bez CaCl2 & MgCl2; pH = 7,2</td></tr><tr><td>Sól fizjologiczna buforowana fosforanami (PBS)</td><td>Gibco</td><td>20012-027</td><td>16% w/v AQ. 10 x 10&nbsp; ml</td></tr><tr><td>Paraformaldehyd</td><td>VWR</td><td>43368.9M</td><td>Sprzęt</td></tr><tr><td>Freezone 4.5 liofilizator</td><td>Labconco</td><td>7750020</td><td>Equipment</td></tr><tr><td>Powlekarka do natryskiwania</td><td>Jeol Ltd.</td><td>JFC-1600</td><td></td></tr><tr><td>Sprzęt Skaningowy mikroskop elektronowy</td><td>Jeol Ltd.</td><td>JSM 5310</td><td></td></tr><tr><td>Przeciwciała pierwszorzędowe przeciwko kolagenowi typu I</td><td>Abcam</td><td>ab6308</td><td></td></tr><tr><td>Przeciwciało wtórne przeciw myszy sprzężone z Alexa Fluor 488</td><td>Life Technologies</td><td>A21121</td><td></td></tr><tr><td>Płytka, kultura tkankowa 24 dołki, płaskie dno (Nunclon)&nbsp;</td><td>Bio-Rev PTE LTD</td><td>3820-024</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM) 2,5 g / L glukozy z L-Gln</td><td>Lonza</td><td>12-604F</td><td></td></tr><tr><td>Płodowa surowica bydlęca (FBS)</td><td>Gibco</td><td>A15-151</td><td></td></tr><tr><td>Penicylina-Streptomycyna (P/S)</td><td>Life Tchnologies</td><td>15140-122 E</td><td></td></tr><tr><td>100 mm Corning niepoddane obróbce naczynia hodowlane</td><td>Sigma Aldrich</td><td>CLS430591</td><td></td></tr><tr><td>0,25% Trypsyna-EDTA</td><td>Gibco</td><td>25200-056</td><td>Sprzęt; 37&nbsp; &deg; C, 5% wilgotności</td></tr><tr><td>Forma Steri-Cycle CO2 Inkubatory</td><td>Thermofisher Scientific</td><td>371</td><td></td></tr><tr><td>Hemacytometr Hausser Bright-Line Phase</td><td>Thermofisher Scientific</td><td>02-671-6</td><td></td></tr><tr><td>Zestaw do żywej/martwej żywotności/cytotoksyczności dla komórek ssaków</td><td>Life Technologies</td><td>L3224&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Test CCK-8</td><td>Dojindo Laboratories</td><td>CK04-11</td><td>Odczynnik soli monosodowej (MSR)</td></tr><tr><td>Czytnik mikropłytek Infinite 200 PRO&nbsp;</td>Zestaw ELISA albuminy <td>tekanu</td><td></td><td></td></tr><tr><td>dla ludzi</td><td>Abcam abcam</td><td>ab108788</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Bio-Rad</td><td>#1610407</td><td></td></tr><tr><td>Albumina surowicy bydlęcej (BSA)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A2153-50G</td><td></td></tr><tr><td>Przeciwciała pierwotne przeciwko myszom (przeciwko CYP3A4, albuminie)</td><td>Santa Cruz Biotechnology</td><td>sc-53850; sc-271605</td><td></td></tr><tr><td>DAPI</td><td>Life Technologies</td><td>D3571</td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor 555 z oznaczeniem Phalloidin</td><td>Life Technologies</td><td>A34055</td><td></td></tr><tr><td>Trizol</td><td>Life Technologies</td><td>15596-026</td><td></td></tr><tr><td>Chloroform</td><td>VWR</td><td>22706.326</td><td></td></tr><tr><td>Izopropanol</td><td>Fisher Scientific</td><td>67-63-0</td><td></td></tr><tr><td>DPEC woda</td><td>Thermofisher Scientific</td><td>AM9916</td><td></td></tr><tr><td>Nanodrop Spektrofotometr 2000c</td><td>Thermofisher Scientific</td><td>ND-2000</td><td></td></tr><tr><td>iScript Odwrotna transkrypcja Supermix&nbsp;</td><td>Bio-Rad Laboratories</td><td>1708840</td><td></td></tr><tr><td>SYBR select Master Mix for CFX</td><td>Life Technology</td><td>4472937</td><td></td></tr><tr><td>Primery (do wyboru)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>CFX96 Real-Time System, C-1000 Touch Thermal Cycler</td><td>Bio Rad Laboratories</td><td>SOFT-CFX-31-PATCH&nbsp;</td><td></td></tr></tbody></table>

wytwarzanie rusztowania z poli(glikolu etylenowego) z odwróconego koloidalnego kryształu: trójwymiarowa platforma do hodowli komórek do inżynierii tkankowej wątroby

Fabrication of Inverted Colloidal Crystal Poly(ethylene glycol) Scaffold: A Three-dimensional Cell Culture Platform for Liver Tissue Engineering

Zdolność do utrzymania funkcji hepatocytów in vitro, w celu testowania cytotoksyczności ksenobiotyków, badania infekcji wirusowych i opracowywania leków ukierunkowanych na wątrobę, wymaga platformy, na której komórki otrzymują odpowiednie sygnały biochemiczne i mechaniczne. Najnowsze systemy inżynierii tkankowej wątroby wykorzystują trójwymiarowe (3D) rusztowania składające się z syntetycznych lub naturalnych hydrożeli, ze względu na ich wysoką retencję wody i zdolność do dostarczania bodźców mechanicznych potrzebnych komórkom. Rośnie zainteresowanie rusztowaniem z odwróconym kryształem koloidalnym (ICC), najnowszym osiągnięciem, które umożliwia wysoką organizację przestrzenną, homotypową i heterotypową interakcję komórek, a także interakcję komórka-macierz zewnątrzkomórkowa (ECM). W niniejszym artykule opisano protokół wytwarzania rusztowania ICC przy użyciu diakrylanu poli(glikolu etylenowego) (PEGDA) i metody ługowania cząstek. Krótko mówiąc, z cząstek mikrosfery wytwarza się sieć, po czym dodaje się roztwór prepolimeru, odpowiednio spolimeryzowany, a następnie cząstki są usuwane lub ługowane za pomocą rozpuszczalnika organicznego (np. Tetrahydrofuranu). Rozpuszczenie sieci powoduje powstanie wysoce porowatego rusztowania z kontrolowanymi rozmiarami porów i połączeniami, które umożliwiają mediom łatwiejsze dotarcie do komórek. Ta unikalna struktura pozwala na przyleganie komórek do dużej powierzchni, a także łatwą komunikację między porami, a zdolność do powlekania rusztowania PEGDA ICC białkami również wykazuje wyraźny wpływ na wydajność komórek. Analizujemy morfologię rusztowania, a także zachowanie komórek raka wątroby (Huh-7.5) pod względem żywotności i funkcji, aby zbadać wpływ struktury ICC i powłok ECM. Ogólnie rzecz biorąc, artykuł ten zawiera szczegółowy protokół powstającego rusztowania, które ma szerokie zastosowanie w inżynierii tkankowej, zwłaszcza w inżynierii tkankowej wątroby.

Reprezentatywne wyniki charakterystyki strukturalnej rusztowania ICC oraz porównanie skuteczności każdego wariantu rusztowania ICC w hodowli hepatocytów zostały przedstawione i omówione poniżej. Warianty rusztowania ICC zastosowane w tych wynikach obejmowały powłoki kolagenowe o stężeniach 0 µg/ml (Bare), 20 µg/ml (Collagen 20), 200 µg/ml (Collagen 200) i 400 µg/ml (Collagen 400), a początkowa liczba wysianych komórek Huh-7.5 wynosiła 1x106.
<p class="jove_content" fo:keep-...

Ten manuskrypt przedstawia szczegółowy protokół wytwarzania powstającej trójwymiarowej platformy hodowli hepatocytów, odwróconego koloidalnego kryształowego rusztowania oraz towarzyszących technik oceny zachowania hepatocytów. Kontrolowane pory o kontrolowanej wielkości, wzajemne połączenia i zdolność do koniugacji białek macierzy zewnątrzkomórkowej z rusztowaniem z poli(glikolu etylenowego) (PEG) zwiększają wydajność komórek Huh-7,5.

Wytwarzanie rusztowania z poli(glikolu etylenowego) z odwróconego koloidalnego kryształu: trójwymiarowa platforma do hodowli komórek do inżynierii tkankowej wątroby

The ability to maintain hepatocyte function in vitro, for the purpose of testing xenobiotics&#39; cytotoxicity, studying virus infection and developing ...

Ogólnym celem niniejszej procedury jest wytwarzanie rusztowań z odwróconych kryształów koloidalnych na bazie PEG z macierzą pozakomórkową do zastosowań w inżynierii tkanki wątroby. Inżynieria tkanki wątroby jest fascynującą dziedziną inżynierii tkankowej i medycyny regeneracyjnej. Tworzymy trójwymiarowe rusztowania inżynieryjne, które pozwalają komórkom wątroby zachować swoją funkcję przez długi czas.Zastosowania tej techniki obejmują testowanie leków, ponieważ komórki wątroby hodowane w tym systemie mogą dłużej zachowywać swoją funkcjonalność i lepiej reagować na działanie leków. Choć metoda ta może dostarczyć cennych informacji w zakresie inżynierii tkankowej, może być ona również zastosowana w innych systemach, na przykład takich wykorzystujących komórki macierzyste. Procedurę zaprezentuje Hitomi, doktorantka z mojego laboratorium.Aby przygotować formy do mikrokulek, należy najpierw odciąć końcówki probówek do mikrocentryfugi o objętości 0,2 mililitra, odpornych na gotowanie, na poziomie 40 µL. Używając wodoodpornego kleju, należy przykleić wierzchołki odciętych probówek do szklanych szkiełek nakrywkowych do mikroskopu, a następnie zakleić obszar wokół form. Następnie wodę w fiolce z mikrosferami polistyrenowymi należy zastąpić 70% etanolem.Umieść roztwór sfer w kąpieli ultradźwiękowej i poddaj mieszaninę sonikacji przy mocy 30 watów przez trzy minuty, aby rozluźnić zagregowane sfery. Po przygotowaniu mikrosfer pipetuj 100 µl etanolu do każdej z form. Następnie odetnij cztery milimetry z górnej części końcówki pipety 200 µl i użyj jej do dwukrotnego przeniesienia 25 µl mikrosfer polistyrenowych do formy.Umieść formy na wytrząsarce kołyszącej i ustaw prędkość na 120 RPM. Pozostaw próbki na wytrząsarce na noc. Następnego dnia umieść formy pod mikroskopem i sprawdź, czy sfery są ułożone w strukturze heksagonalnej.Pozostaw etanol do odparowania w temperaturze pokojowej przez dwie noce. Następnie ostrożnie umieść kompleks formy i kulek w piekarniku nagrzanym do 130 stopni Celsjusza na sześć godzin, aby przeprowadzić wyżarzanie kulek polistyrenowych i utworzyć negatyw rusztowania 3D. Najpierw zsyntezuj makromery polietylenoglikolu diakrylanu zgodnie z uznanymi protokołami opisanymi w tych dwóch referencjach.Następnie należy przygotować 50% roztwór PEGDA w wodzie dejonizowanej i wirować mieszaninę do czasu całkowitego rozpuszczenia substancji. W przypadku rusztowań koniugowanych z macierzą zewnątrzkomórkową do 50% roztworu PEGDA należy dodać dodatkowe 10% PEG NHS z olejem z kryla. Następnie należy przygotować 20% roztwór zapasowy fotoinicjatora w 70% etanolu.Dodaj 50 µL roztworu fotoinicjatora na każdy mililitr mieszaniny PEGDA. Następnie mieszaj mieszaninę w wirówce typu vortex przez jedną minutę. W kolejnym kroku odklej formy od szkiełek przedmiotowych, ostrożnie wyjmij kratki za pomocą szpatułki i umieść je w oddzielnych probówkach do wirowania o pojemności 1,5 ml.Do każdej probówki pipetuj 300 µL roztworu PEGDA, a następnie wiruj probówki, aby roztwór PEGDA mógł przeniknąć do sieci polistyrenowej. Następnie wyjmij sieć z probówki za pomocą pęsety i ostrożnie osusz nadmiar roztworu PEGDA z powierzchni. Umieść sieć na szkle pokrytym folią parafinową płaską, okrągłą powierzchnią skierowaną do góry.Następnie naświetlaj rusztowanie światłem ultrafioletowym o długości fali 365 nanometrów przez pięć minut, używając lampy punktowej UV. Umieść około dziesięciu spolimeryzowanych sieci krystalicznych PEGDA w nowej fiolce i dodaj 20 mililitrów THF. Inkubuj fiolki na wytrząsarce orbitalnej przy 300 RPM przez sześć godzin.Wyjmuj fiolkę co jedną do dwóch godzin i wymieniaj rozpuszczalnik zawierający polimer na świeży THF. Po ostatnim płukaniu dodaj wodę do zużytego roztworu THF, aby sprawdzić, czy sfery PS całkowicie się rozpuściły. Jeśli roztwór jest biały, wykonaj dodatkowe płukania, aż roztwór stanie się przezroczysty.Aby wysterylizować rusztowania, należy przygotować probówkę do mikrocentryfugi o pojemności 50 ml z dwiema mililitrami 70% etanolu na każde rusztowanie i umieścić rusztowania w probówce za pomocą szpatułki. Pozostawić rusztowania do namoczenia w etanolu przez jedną godzinę. Po upływie godziny ostrożnie wylać etanol i zastąpić go równą objętością sterylnego PBS.Następnie wiruj rusztowania, aby usunąć pęcherzyki powietrza. Przechowuj wirówki z rusztowaniami w temperaturze czterech stopni Celsjusa i wyjmuj je co jedną do dwóch godzin w celu wymiany roztworu na świeży PBS. Po kilku wymianach PBS wyjmij rusztowania przeznaczone do powlekania kolagenem i umieść je w probówce zawierającej jeden mililitr kolagenu typu I na każde powlekane rusztowanie.Następnie odwiruj probówkę w taki sam sposób jak wcześniej, a potem wstrząsaj rusztowania z prędkością 400 RPM na wytrząsarce orbitalnej przez 30 minut. Przechowuj rusztowania przez noc w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Hoduj komórki raka hepatokomórkowego w 100 milimetrowych naczyniach hodowlanych z 10 mililitrami pożywki hodowlanej.Wymieniaj pożywkę co trzy dni, aż gęstość komórek osiągnie 75 do 80% powierzchni hodowli. Gdy komórki będą gotowe, ostrożnie umieść rusztowania płaską powierzchnią do góry w płytce 24-dołkowej. Następnie przepłucz każde rusztowanie dwiema mililitrami PBS.Odessać PBS i dodać dwa mililitry pożywki wzrostowej do rusztowań. Po 30 minutach usunąć pożywkę i pozostawić rusztowanie do wyschnięcia na jedną godzinę. Następnie zebrać komórki raka wątrobowego, stosując metodę trawienia trypsyną.Po odwirowaniu komórek należy usunąć nadsącz i ponownie zawiesić pellet w taki sposób, aby uzyskać stężenie jednego miliona komórek na 25 µL. Powolnym ruchem nanieść pipetą 25 µL zawiesiny komórkowej bezpośrednio na każdy rusztowanie. Następnie przykryć płytkę i umieścić ją w inkubatorze na noc.Następnie ostrożnie przenieś rusztowania do nowej płytki 24-dołkowej i pipetuj dwa mililitry pożywki do każdego dołka, po czym wprowadź płytkę z powrotem do inkubatora. Tutaj przedstawiono obraz rusztowania wykonany za pomocą skaningowego mikroskopu elektronowego. Składa się ono z sześciokątnej, najgęstszej struktury upakowania porów o średnicy od 100 do 105 mikronów, które tworzą połączenia z sąsiednimi porami o średnicy zazwyczaj od 35 do 40 mikronów.Po wysianiu komórek raka wątroby, komórki te rosły i proliferowały na rusztowaniach uprzednio pokrytych kolagenem typu I, jednak nie zwiększały swojej liczby na rusztowaniach niepokrytych. Ponadto komórki raka wątroby na rusztowaniach pokrytych kolagenem wykazywały większą aktywność funkcjonalną w sposób zależny od stężenia. W 14. dniu komórki raka wątroby hodowane na rusztowaniach ICC pokrytych stężeniem 400 µg/mL wydzieliły ponad trzykrotnie większą ilość albuminy niż komórki hodowane na rusztowaniu niepokrytym.Podczas wykonywania tej procedury należy pamiętać o zapewnieniu prawidłowego ułożenia sfer polistyrenowych w sieci. Nieprawidłowe ułożenie doprowadzi do słabej łączności między sferami, co może niekorzystnie wpłynąć na aktywność komórek. Po obejrzeniu tego filmu powinni Państwo posiadać wiedzę na temat tego, jak wytwarzać celulowane rusztowania z odwróconych kryształów koloidalnych na bazie PEG z powłoką.Należy pamiętać, że praca z tetrahydrofuranem może być niebezpieczna, dlatego podczas wykonywania tej procedury zawsze należy zachować środki ostrożności, takie jak praca w dygestorium oraz stosowanie rękawic i okularów ochronnych.

fabrication-inverted-colloidal-crystal-poly-ethylene-glycol-scaffold

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Bioinżynieria

Opisujemy platformę opartą na chipie do trójwymiarowej hodowli komórek w mikrobioreaktorach. Jeden chip może pomieścić do 10 Mio. komórek, które mogą być hodowane w precyzyjnie określonych warunkach pod kątem przepływu cieczy, ciśnienia tlenu itp. w sterylnym, zamkniętym obiegu.

Trójwymiarowa hodowla komórek na chipie w przepływowych mikrobioreaktorach

Aby stworzyć wysoce zorganizowane struktury złożonej tkanki, należy złożyć wiele typów materiałów i komórek w zintegrowany kompozyt.  Ten kombinatoryczny projekt obejmuje warstwowe arkusze komórek specyficzne dla narządów z dwoma odrębnymi materiałami pochodzenia biologicznego, zawierającymi silną włóknistą podstawę macierzy oraz komórki śródbłonka w celu usprawnienia tworzenia nowych naczyń.

Inżynieria tkankowa: budowa wielokomórkowego rusztowania 3D do dostarczania warstwowych arkuszy komórkowych

Tkankowa matryca zewnątrzkomórkowa (ECM) jest kluczowym mediatorem funkcji komórki. W artykule opisano metody syntezy czystych pianek i mikronośników pochodzących z ECM, które są stabilne w hodowli bez konieczności sieciowania chemicznego do zastosowań w zaawansowanych modelach hodowli komórkowych 3D in vitro lub jako proregeneracyjne biorusztowania.

Wytwarzanie pianek i mikronośników pochodzących z macierzy zewnątrzkomórkowej jako specyficznych tkankowo platform do hodowli i dostarczania komórek

Ten protokół opisuje wytwarzanie elastycznych makroporowatych mikrokriożeli 3D poprzez integrację mikrofabrykacji z technologią kriożelacji. Po załadowaniu komórkami generowane są mikrotkanki 3D, które można łatwo wstrzyknąć in vivo w celu ułatwienia terapii regeneracyjnej lub złożyć w matryce do wysokoprzepustowych badań przesiewowych leków in vitro.

Mikrotkanki 3D do iniekcyjnej terapii regeneracyjnej i wysokoprzepustowych badań przesiewowych leków

Tutaj prezentujemy protokół uzyskiwania systemów hodowli 3D w samoorganizujących się rusztowaniach peptydowych, aby promować różnicowanie odróżnicowanych ludzkich chondrocytów stawowych w tkankę podobną do chrząstki.

Hodowla komórek ssaków w trójwymiarowych rusztowaniach peptydowych

Ten protokół przedstawia model biomimetyczny 3D z towarzyszącym zwłóknieniowym przedziałem zrębowym. Przygotowany z fizjologicznie odpowiednich hydrożeli w proporcjach naśladujących biofizyczne właściwości zrębu macierzy zewnątrzkomórkowej, aktywnego mediatora interakcji komórkowych, wzrostu guza i przerzutów.

Model biomimetyczny raka wątroby do badania interakcji guz-zręb w środowisku 3D o przestrajalnych właściwościach biofizycznych

Choroby wątroby są wywoływane przez wiele przyczyn, które sprzyjają zwłóknieniu lub marskości wątroby. Przeszczep to jedyna opcja na odzyskanie zdrowia. Biorąc jednak pod uwagę niedobór narządów nadających się do przeszczepu, należy zbadać alternatywne rozwiązania. Nasze badania proponują wszczepienie rusztowań kolagenowych w tkance wątroby z modelu zwierzęcego.

Implantacja trójwymiarowego rusztowania macierzy kolagenowej jako strategia regeneracji wątroby

Obecny protokół optymalizuje metody perfuzji/decelularyzacji wątroby in situ i mikroskopii dwufotonowej w celu stworzenia niezawodnej platformy do wizualizacji dynamiki przebudowy macierzy zewnątrzkomórkowej (ECM) podczas niealkoholowego stłuszczeniowego zapalenia wątroby (NASH).

Obrazowanie 3D macierzy zewnątrzkomórkowej wątroby w mysim modelu niealkoholowego stłuszczeniowego zapalenia wątroby

Organoidy rewolucjonizują spersonalizowane modelowanie tkanek do rozwoju narządów, odkrywania leków i badań nad chorobami. Inżynieria organoidowa się naprzód w tworzeniu skomplikowanych tkanek syntetycznych. Celem jest zintegrowanie morfogenezy, technologii asembloidów i biomatryc w celu poczynienia postępów w inżynierii tkankowej. Protokół ten pomaga w modelowaniu organogenezy wątroby i ustalaniu wytycznych dotyczących budowy tkanek syntetycznych.

Techniki uprawy in vitro do modelowania organogenezy wątroby, budowania asembloidów i projektowania tkanek syntetycznych przy użyciu ludzkich linii komórkowych

Ten protokół przedstawia zoptymalizowaną dwuetapową technikę perfuzji wątroby kolagenazy w modelu szczurzym i pokazuje użycie izolowanych hepatocytów do długoterminowej hodowli organoidów 3D in vitro.

Perfuzja wątroby szczura i izolacja pierwotnych hepatocytów: stara procedura kluczowa dla najnowocześniejszej hodowli organoidów 3D

Poznaj metodę wytwarzania rusztowań PEG z odwróconego kryształu koloidalnego do inżynierii tkankowej wątroby. Technika ta umożliwia długotrwałe utrzymanie funkcji hepatocytów, poprawiając testowanie leków.

Wytwarzanie rusztowania z poli(glikolu etylenowego) z odwróconego koloidalnego kryształu: trójwymiarowa platforma do hodowli komórek do inżynierii tkankowej wątroby (Wideo) | JoVE Journal

Wytwarzanie rusztowania z poli(glikolu etylenowego) z odwróconego koloidalnego kryształu: trójwymiarowa platforma do hodowli komórek do inżynierii tkankowej wątroby

Przeglądaj więcej filmów