Name: Przygotowanie i charakterystyka lipofilowych miceli prolekowych doksorubicyny (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-08-02T15:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 56 s
Description: Poznaj metodę przygotowania i charakteryzacji lipofilowych miceli prolekowych doksorubicyny. Technika ta poprawia ładunek leku i stabilność, umożliwiając skierowane dostarczanie do nowotworów przy zmniejszonej toksyczności.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Ta praca była wspierana przez następujące granty: grant NIH-SC3, grant NSF-PREM, grant badawczy Hampton University. Chcielibyśmy podziękować Pani Michele A. Cochran z Virginia Institute of Marine Science (VIMS) za korzystanie z analizatora wielkości cząstek. Chcielibyśmy również podziękować Pani Corinne R. Ramaley za zrecenzowanie manuskryptu.

1. Synteza DOX-PA
<ol>
	<li>Odważyć 390 mg doksorubicyny i 243 mg hydrazydu kwasu palmitynowego i przenieść do kolby okrągłodennej.</li>
	<li>Dodać 150 ml bezwodnego metanolu do kolby za pomocą szklanej strzykawki. Dodać pipetą 39 μl kwasu trifluorooctowego (TFA). Za pomocą mieszadła magnetycznego mieszać mieszaninę reakcyjną przez 18 godzin w temperaturze pokojowej w ciemności. 
	nuta: Ilości materiałów reakcyjnych można skalować w górę lub w dół, aby uzyskać różne ilości DOX-PA. Stosunek reagentów powinien być utrzymany w tych samych proporcjach. Reakcje z użyciem ilości DOX w zakresie od 78 mg do 1 170 mg można przeprowadzić w zwykłym laboratorium chemicznym.</li>
	<li>Oczyszczanie DOX-PA za pomocą kolumny z żelem krzemionkowym. 17
	<ol>
		<li>Usunąć rozpuszczalnik z mieszaniny reakcyjnej za pomocą wyparki obrotowej. Dodać 3 g żelu krzemionkowego po zmniejszeniu objętości mieszaniny do około 20 ml. Kontynuuj odparowywanie rotacyjne, aby uzyskać suche proszki i umożliwić adsorpcję produktów na żelu krzemionkowym. Próbkę należy przechowywać w próżni przez dodatkowe 30 minut po uformowaniu się suchych proszków.</li>
		<li>Umieścić 50 g żelu krzemionkowego w kolumnie, używając dichlorometanu jako rozpuszczalnika. Ostrożnie dodać do kolumny próbkę żelu krzemionkowego zawierającą zaadsorbowany produkt.</li>
		<li>Eluować kolumnę mieszaniną dichlorometanu i metanolu, stopniowo zwiększając zawartość procentową metanolu, zwiększając w ten sposób polarność rozpuszczalnika (tabela 1).</li>
		<li>Zebrać frakcje eluentu w probówkach (25 ml / probówkę) i monitorować postęp za pomocą chromatografii cienkowarstwowej (TLC).</li>
		<li>Połączyć wszystkie frakcje zawierające czysty DOX-PA i usunąć rozpuszczalnik za pomocą wyparki obrotowej, aż do uzyskania suchego proszku. Dalej suszyć produkt pod próżnią O/N.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Analiza DOX-PA przez TLC.
	<ol>
		<li>Wytnij odcinek płytki TLC o wymiarach 4 cm x 8 cm. Roztwory próbek punktowych w odległości 0,5 cm od dna płytki należy umieścić w kapilarnach punktowych TLC, stosując metanol jako rozpuszczalnik.</li>
		<li>Umieścić płytkę TLC w komorze wywoływania zawierającej mieszaninę dichlorometanu i metanolu (3/1, v/v). Głębokość rozpuszczalnika powinna być mniejsza niż 0,5 cm.</li>
		<li>Wyjąć płytkę z komory wywoływania, gdy czoło rozpuszczalnika dotrze do górnej części płytki. Zaznacz ołówkiem położenie czoła rozpuszczalnika i pozostaw płytkę do wyschnięcia. Umieścić płytkę TLC w komorze barwiącej zawierającej nasycone opary jodu w celu wizualizacji próbek.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Analiza DOX-PA za pomocą 1spektroskopii magnetycznego rezonansu jądrowego 1 H-(1H-NMR). Rozdział 18
	<ol>
		<li>Rozpuścić 15 mg DOX-PA w 1 ml suloctku metylu-d6 (DMSO) i przenieść próbkę do probówki NMR.</li>
		<li>Włóż rurkę NMR do magnesu przyrządu NMR. Zmierz widmo protonów, wybierając DMSO jako rozpuszczalnik. Wyjmij rurkę NMR z magnesu. Przeanalizuj wynik NMR18.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. Przygotowanie miceli DOX-PA metodą dyspersji filmu
<ol>
	<li>Rozpuścić DSPE-PEG (40 mg) i DOX-PA (4 mg) w 2 ml metanolu w szklanej fiolce o pojemności 10 ml.</li>
	<li>Usunąć rozpuszczalnik organiczny pod próżnią za pomocą wyparki obrotowej, aż w fiolce utworzy się cienka warstwa. 
	UWAGA: Alternatywnie, należy odparować rozpuszczalniki organiczne w gazie obojętnym (np. argonie lub azotze) w celu utworzenia filmu i przechowywać fiolkę w eksykatorze próżniowym w celu dalszego usunięcia pozostałości rozpuszczalnika.</li>
	<li>Przenieść 2 ml soli fizjologicznej buforowanej fosforanem (pH 7,4, DPBS) firmy Dulbecco do szklanej fiolki.</li>
	<li>Umieść fiolkę w kąpieli ultradźwiękowej na 3 minuty w temperaturze pokojowej w celu wytworzenia miceli. 
	UWAGA: Moc ultradźwięków różni się w zależności od różnych modeli wanien ultradźwiękowych. Wybierz jednostkę, która może wygenerować wystarczającą moc ultradźwiękową do rozproszenia cienkiego filmu polimerowo-lekowego. Moc wyjściowa łaźni ultradźwiękowej zastosowanej w tym protokole wynosi 110 W.</li>
	<li>Micele należy przechowywać w temperaturze 4 °C do krótkotrwałego przechowywania i -20 °C do długotrwałego przechowywania. 
	UWAGA: Alternatywnie, micele można również liofilizować i rozpuścić w wodzie przed użyciem. Zwykle do tego preparatu nie jest potrzebny krioprotektant ani lioprotektant.</li>
</ol>
3. Charakterystyka miceli DOX-PA
<ol>
	<li>Oznaczanie stężenia DOX-PA w micelach i skuteczności kapsułkowania leków
	<ol>
		<li>Rozpuścić DOX-PA zsyntetyzowany w poprzednich etapach w DMSO, aby przygotować roztwory DOX-PA o pięciu różnych stężeniach: 1 μg/ml, 5 μg/ml, 20 μg/ml, 50 μg/ml i 100 μg/ml. Zmierzyć absorpcję roztworów DOX-PA za pomocą spektrometru UV-VIS przy 490 nm. Wygeneruj krzywą wzorcową na podstawie stężeń leku DOX-PA i odpowiadającej im absorpcji przy 490 nm.</li>
		<li>Rozcieńczyć 25 μl miceli naładowanej lekiem w 500 μl DMSO. Zmierzyć absorpcję przy długości fali 490 nm za pomocą spektrometru UV-VIS. Obliczyć stężenia leku za pomocą krzywej wzorcowej utworzonej w ppkt 3.1.1.</li>
		<li>Oblicz wydajność hermetyzacji, korzystając z następującego równania: 
		Skuteczność kapsułkowania leku (%) = (ilość leków w miceli)/(ilość dodanego leku) × 100%</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Charakterystyka wielkości cząstek za pomocą dynamicznego rozpraszania światła (DLS)
	<ol>
		<li>Rozcieńczyć micele preparatem DPBS (pH 7,4) do końcowego stężenia DSPE-PEG 1 mg/ml. Przeanalizować próbkę o objętości 2 ml za pomocą analizatora wielkości cząstek, aby uzyskać średnią wielkość Z i wskaźnik polidyspersyjności (PDI).</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Ocena aktywności przeciwnowotworowej in vitro 
	UWAGA: Stosuj odpowiednią sterylną technikę i pracuj w komorze bezpieczeństwa biologicznego.
	<ol>
		<li>Wyjąć pożywkę do hodowli komórkowych z kolby do hodowli komórkowych (np. T25) zawierającej DU-145 ludzkie komórki raka gruczołu krokowego i przepłukać komórki 2 ml DPBS (pH 7,4).</li>
		<li>Odessać DPBS, dodać 1 ml roztworu trypsyny (0,25%) i inkubować przez 2 minuty w temperaturze 37 °C w celu odłączenia komórek.</li>
		<li>Dodać 10 ml pożywki do hodowli komórkowych (RPMI 1640 + 10% płodowej surowicy bydlęcej + 1% antybiotyku-antybiotyku przeciwgrzybiczego), gdy większość komórek zostanie odłączona od kolby. Przenieść komórki do probówki wirówkowej o pojemności 15 ml i odwirować komórki przy sile 1 000 x g przez 5 minut.</li>
		<li>Ponownie zawiesić osad komórkowy za pomocą 5 ml pożywki do hodowli komórkowych i usunąć próbkę do obliczenia liczby komórek za pomocą hemocytometru. Rozcieńczyć komórki pożywką do hodowli komórkowych do gęstości 50 000 komórek/ml. Dodać zawiesiny rozcieńczonych komórek do 96-dołkowej płytki do hodowli komórkowej (100 μl/dołek). Inkubować komórki w inkubatorze do hodowli komórkowych (37 °C, 5% CO2 ) przez 18 godzin, aby umożliwić przyłączenie komórek.</li>
		<li>Rozcieńczyć roztwór dimetylosulfotlenku DOX (DMSO) i roztwór DOX-PA DMSO z pożywką do hodowli komórkowych, aby uzyskać końcowe stężenia leku odpowiednio 0,1 μM, 0,5 μM, 2 μM, 5 μM i 10 μM. Utrzymuj końcowe stężenie DMSO we wszystkich powyższych próbkach na poziomie 0,5%. Rozcieńczyć micelę DOX-PA pożywką do hodowli komórkowych, aby uzyskać końcowe stężenia leku odpowiednio 0,1 μM, 0,5 μM, 2 μM, 5 μM i 10 μM. Użyć pożywki do hodowli ślepych komórek jako kontroli.</li>
		<li>Wyjąć 96-dołkową płytkę do hodowli komórkowych z inkubatora i zastąpić pożywkę do hodowli komórkowych 100 μl pożywki zawierającej różne środki poddane działaniu substancji, przygotowane w kroku 3.3.5 (n = 4 dla każdej grupy). Inkubować komórki w inkubatorze do hodowli komórkowych (37 °C, 5% CO2 ) przez dodatkowe 72 godziny.</li>
		<li>Odessać pożywkę i dodać 100 μl pożywki zawierającej 0,5 mg/ml bromku 3-(4,5-dimetylo-tiazol-2-ylo)-2,5-difenylotetrazolu (MTT).</li>
		<li>Inkubować komórki w inkubatorze do hodowli komórkowych przez dodatkowe 2 godziny. Ostrożnie usunąć pożywkę i dodać 100 μl DMSO, aby rozpuścić kryształy formazanu.</li>
		<li>Zmierzyć absorbancję za pomocą spektrofotometru mikropłytkowego przy długości fali 570 nm i długości fali odniesienia 670 nm.</li>
		<li>Oblicz żywotność komórki, korzystając z następującego równania: 
		Żywotność komórek (%) = (Test A ⁄ Kontrola A) × 100% 
		UWAGA: Porównaj żywotność komórek między różnymi grupami za pomocą testu statystycznego jednokierunkowej analizy wariancji (ANOVA). Oblicz IC50 na podstawie danych dotyczących żywotności komórek w porównaniu ze stężeniem leku.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

<ol><li>Hennenfent, K. L., Govindan, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Novel+formulations+of+taxanes%3A+a+review.+Old+wine+in+a+new+bottle%3F%5BTitle%5D)+AND+%22ESMO%22%5BJournal%5D)">Novel formulations of taxanes: a review. Old wine in a new bottle?</a> ESMO. 17 (5), 735-749 (2006).</li>
<li>Paliwal, S. R., Paliwal, R., Agrawal, G. P., Vyas, S. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Liposomal+nanomedicine+for+breast+cancer+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Nanomedicine%22%5BJournal%5D)">Liposomal nanomedicine for breast cancer therapy.</a> Nanomedicine. 6 (6), 1085-1100 (2011).</li>
<li>Mahapatro, A., Singh, D. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biodegradable+nanoparticles+are+excellent+vehicle+for+site+directed+in+vivo+delivery+of+drugs+and+vaccines%5BTitle%5D)+AND+%22J+Nanobiotechnology%22%5BJournal%5D)">Biodegradable nanoparticles are excellent vehicle for site directed in vivo delivery of drugs and vaccines.</a> J Nanobiotechnology. 9 (55), (2011).</li>
<li>Danquah, M., Li, F., Duke, C. B., Miller 3rd,, D, D., Mahato, R. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Micellar+delivery+of+bicalutamide+and+embelin+for+treating+prostate+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Pharm+Res%22%5BJournal%5D)">Micellar delivery of bicalutamide and embelin for treating prostate cancer.</a> Pharm Res. 26 (9), 2081-2092 (2009).</li>
<li>Li, F., Danquah, M., Mahato, R. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synthesis+and+characterization+of+amphiphilic+lipopolymers+for+micellar+drug+delivery%5BTitle%5D)+AND+%22Biomacromolecules%22%5BJournal%5D)">Synthesis and characterization of amphiphilic lipopolymers for micellar drug delivery.</a> Biomacromolecules. 11 (10), 2610-2620 (2010).</li>
<li>Li, F., Danquah, M., Singh, S., Hao, W., Mahato, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Paclitaxel-+and+lapatinib-loaded+lipopolymer+micelles+overcome+multidrug+resistance+in+prostate+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Drug+Deliv.+and+Transl.+Res%22%5BJournal%5D)">Paclitaxel- and lapatinib-loaded lipopolymer micelles overcome multidrug resistance in prostate cancer.</a> Drug Deliv. and Transl. Res. 1 (6), 9(2011).</li>
<li>Li, F., Lu, Y., Li, W., Miller, D. D., Mahato, R. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synthesis%2C+formulation+and+in+vitro+evaluation+of+a+novel+microtubule+destabilizer%2C+SMART-100%5BTitle%5D)+AND+%22J+Control+Release%22%5BJournal%5D)">Synthesis, formulation and in vitro evaluation of a novel microtubule destabilizer, SMART-100.</a> J Control Release. 143 (1), 151-158 (2010).</li>
<li>Minko, T., Kopeckova, P., Pozharov, V., Kopecek, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((HPMA+copolymer+bound+adriamycin+overcomes+MDR1+gene+encoded+resistance+in+a+human+ovarian+carcinoma+cell+line%5BTitle%5D)+AND+%22J+Control+Release%22%5BJournal%5D)">HPMA copolymer bound adriamycin overcomes MDR1 gene encoded resistance in a human ovarian carcinoma cell line.</a> J Control Release. 54 (2), 223-233 (1998).</li>
<li>Rosenholm, J. M., Mamaeva, V., Sahlgren, C., Linden, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nanoparticles+in+targeted+cancer+therapy%3A+mesoporous+silica+nanoparticles+entering+preclinical+development+stage%5BTitle%5D)+AND+%22Nanomedicine%22%5BJournal%5D)">Nanoparticles in targeted cancer therapy: mesoporous silica nanoparticles entering preclinical development stage.</a> Nanomedicine. 7 (1), 111-120 (2012).</li>
<li>Kaur, I. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Issues+and+concerns+in+nanotech+product+development+and+its+commercialization%5BTitle%5D)+AND+%22J+Control+Release%22%5BJournal%5D)">Issues and concerns in nanotech product development and its commercialization.</a> J Control Release. 193, 51-62 (2014).</li>
<li>Jones, M., Leroux, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Polymeric+micelles+-+a+new+generation+of+colloidal+drug+carriers%5BTitle%5D)+AND+%22Eur+J+Pharm+Biopharm%22%5BJournal%5D)">Polymeric micelles - a new generation of colloidal drug carriers.</a> Eur J Pharm Biopharm. 48 (2), 101-111 (1999).</li>
<li>Wang, H., Li, F., Du, C., Mahato, R. I., Huang, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Doxorubicin+and+lapatinib+combination+nanomedicine+for+treating+resistant+breast+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Pharm%22%5BJournal%5D)">Doxorubicin and lapatinib combination nanomedicine for treating resistant breast cancer.</a> Mol Pharm. 11 (8), 2600-2611 (2014).</li>
<li>Ma, P., Rahima Benhabbour, S., Feng, L., Mumper, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((2%27-Behenoyl-paclitaxel+conjugate+containing+lipid+nanoparticles+for+the+treatment+of+metastatic+breast+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Lett%22%5BJournal%5D)">2'-Behenoyl-paclitaxel conjugate containing lipid nanoparticles for the treatment of metastatic breast cancer.</a> Cancer Lett. 334 (2), 253-262 (2013).</li>
<li>Lundberg, B. B., Risovic, V., Ramaswamy, M., Wasan, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+lipophilic+paclitaxel+derivative+incorporated+in+a+lipid+emulsion+for+parenteral+administration%5BTitle%5D)+AND+%22J+Control+Release%22%5BJournal%5D)">A lipophilic paclitaxel derivative incorporated in a lipid emulsion for parenteral administration.</a> J Control Release. 86 (1), 93-100 (2003).</li>
<li>Perche, F., Patel, N. R., Torchilin, V. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Accumulation+and+toxicity+of+antibody-targeted+doxorubicin-loaded+PEG-PE+micelles+in+ovarian+cancer+cell+spheroid+model%5BTitle%5D)+AND+%22J+Control+Release%22%5BJournal%5D)">Accumulation and toxicity of antibody-targeted doxorubicin-loaded PEG-PE micelles in ovarian cancer cell spheroid model.</a> J Control Release. 164 (1), 95-102 (2012).</li>
<li>Gill, K. K., Kaddoumi, A., Nazzal, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mixed+micelles+of+PEG%282000%29-DSPE+and+vitamin-E+TPGS+for+concurrent+delivery+of+paclitaxel+and+parthenolide%3A+enhanced+chemosenstization+and+antitumor+efficacy+against+non-small+cell+lung+cancer+%28NSCLC%29+cell+lines%5BTitle%5D)+AND+%22Eur+J+Pharm+Sci%22%5BJournal%5D)">Mixed micelles of PEG(2000)-DSPE and vitamin-E TPGS for concurrent delivery of paclitaxel and parthenolide: enhanced chemosenstization and antitumor efficacy against non-small cell lung cancer (NSCLC) cell lines.</a> Eur J Pharm Sci. 46 (1-2), 67-71 (2012).</li>
<li>Still, W. C., Kahn, M., Mitra, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+Chromatographic+Technique+for+Preparative+Separations+with+Moderate+Resolution%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Org.+Chem%22%5BJournal%5D)">Rapid Chromatographic Technique for Preparative Separations with Moderate Resolution.</a> J. Org. Chem. 43 (14), 2923-2925 (1978).</li>
<li>New Mexico State University. NMR Protocols and Specifications. , Available from:
 <a target="_blank" href="http://web.nmsu.edu/~kburke/Instrumentation/NMSU_NMR_300.html">http://web.nmsu.edu/~kburke/Instrumentation/NMSU_NMR_300.html</a> (2015).</li>
<li>Morton, L. A., Saludes, J. P., Yin, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Constant+pressure-controlled+extrusion+method+for+the+preparation+of+Nano-sized+lipid+vesicles%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Constant pressure-controlled extrusion method for the preparation of Nano-sized lipid vesicles.</a> J Vis Exp. (64), (2012).</li>
<li>Ulbrich, K., Etrych, T., Chytil, P., Jelinkova, M., Rihova, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((HPMA+copolymers+with+pH-controlled+release+of+doxorubicin%3A+in+vitro+cytotoxicity+and+in+vivo+antitumor+activity%5BTitle%5D)+AND+%22J+Controlled+Release%22%5BJournal%5D)">HPMA copolymers with pH-controlled release of doxorubicin: in vitro cytotoxicity and in vivo antitumor activity.</a> J Controlled Release. 87 (1-3), 33-47 (2003).</li>
<li>Patil, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cellular+Delivery+of+Doxorubicin+via+pH-Controlled+Hydrazone+Linkage+Using+Multifunctional+Nano+Vehicle+Based+on+Poly%28beta-L-Malic+Acid%29%5BTitle%5D)+AND+%22Int+J+Mol+Sci%22%5BJournal%5D)">Cellular Delivery of Doxorubicin via pH-Controlled Hydrazone Linkage Using Multifunctional Nano Vehicle Based on Poly(beta-L-Malic Acid).</a> Int J Mol Sci. 13 (9), 11681-11693 (2012).</li>
<li>Hu, X., Liu, S., Huang, Y., Chen, X., Jing, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biodegradable+block+copolymer-doxorubicin+conjugates+via+different+linkages%3A+preparation%2C+characterization%2C+and+in+vitro+evaluation%5BTitle%5D)+AND+%22Biomacromolecules%22%5BJournal%5D)">Biodegradable block copolymer-doxorubicin conjugates via different linkages: preparation, characterization, and in vitro evaluation.</a> Biomacromolecules. 11 (8), 2094-2102 (2010).</li>
<li>Huynh, L., Neale, C., Pomes, R., Allen, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Computational+approaches+to+the+rational+design+of+nanoemulsions%2C+polymeric+micelles%2C+and+dendrimers+for+drug+delivery%5BTitle%5D)+AND+%22Nanomedicine%22%5BJournal%5D)">Computational approaches to the rational design of nanoemulsions, polymeric micelles, and dendrimers for drug delivery.</a> Nanomedicine. 8 (1), 20-36 (2012).</li>
<li>Shi, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+drug-specific+nanocarrier+design+for+efficient+anticancer+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Commun%22%5BJournal%5D)">A drug-specific nanocarrier design for efficient anticancer therapy.</a> Nat Commun. 6, 7449(2015).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

W niniejszej pracy opisujemy nieskomplikowaną, szybką metodę dyspersji filmowej do otrzymywania miceli. Metoda ta wykorzystuje właściwości samoorganizacji polimeru amfifilowego (np. DSPE-PEG) do tworzenia miceli o strukturze rdzeń-powłoka w środowisku wodnym. Ta metoda przygotowania miceli ma kilka zalet. 1. Obejmuje prosty proces formulacji, który pozwala uniknąć stosowania skomplikowanych etapów zmniejszania rozmiaru (takich jak wytłaczanie lub homogenizacja) powszechnie stosowanych w przygotowaniu liposomów, ...

Chemioterapia jest powszechnie stosowana w leczeniu różnych form raka. Większość, jeśli nie wszystkie, leki stosowane w chemioterapii mają toksyczne skutki uboczne, które mogą wahać się od łatwych do opanowania drobnych schorzeń, takich jak nudności i biegunka, do stanów bardziej zagrażających życiu. Ponieważ większość leków przeciwnowotworowych jest toksyczna, nieselektywna ekspozycja tych leków na normalne tkanki nieuchronnie powoduje toksyczność. W związku z tym istnieje ogromne zapotrzebowanie na podejście terapeutyczne, które może selektywnie dostarczać leki do komórek nowotworowych. Kolejnym wyzwaniem związanym z podawaniem leków przeciwnowotworowych jest ich słaba rozpuszczalność w wodzie. Zwykle do sformułowania tych słabo rozpuszczalnych leków potrzebne są środki solubilizujące. Jednak większość środków rozpuszczających, takich jak dimetylosulfotlenek (DMSO), Cremophor EL i Polysorbate 80 (Tween 80) może powodować toksyczne działanie na wątrobę i nerki, hemolizę, ostre reakcje nadwrażliwości i neuropatie obwodowe. 1 Dlatego do klinicznego stosowania słabo rozpuszczalnych leków przeciwnowotworowych potrzebne są bezpieczne i biokompatybilne preparaty. Nanonośniki są obiecującymi systemami dostarczania leków, które pozwolą sprostać powyższym wyzwaniom. Te nanonośniki obejmują liposomy2, nanocząstki, 3 micele,4-7 koniugaty polimer-lek,8 i materiały nieorganiczne. 9 Kilka produktów nanomedycznych (np. Doxil, Abraxane i Genexol) zostało zatwierdzonych przez agencje regulacyjne do leczenia pacjentów z rakiem. 10
Micele polimerowe są obiecującymi nośnikami leków na nanoskalę, które zostały z powodzeniem wykorzystane do dostarczania leków przeciwnowotworowych. 4-7,11,12 Typowe micele polimerowe są otrzymywane z polimerów amfifilowych w procesie samoorganizacji. Micele polimerowe o strukturze rdzeń-powłoka obejmują powłokę hydrofilową i rdzeń hydrofobowy. Hydrofilowa otoczka może sterycznie stabilizować micele i przedłużać ich krążenie w krwiobiegu. Hydrofobowy rdzeń może skutecznie kapsułkować leki hydrofobowe. Ze względu na mały rozmiar miceli (zwykle mniej niż 200 nm) i właściwości długiego krążenia, uważa się, że micele polimerowe osiągają celowanie w guz poprzez efekty zwiększonej przepuszczalności i retencji (EPR) (pasywne celowanie w guz).
Stabilność ładowania leku jest kluczowa dla zdolności miceli do celowania w nowotwór. Aby osiągnąć optymalne celowanie w guz, micele powinny mieć minimalny wyciek leku przed dotarciem do miejsca guza, a jednocześnie szybko uwalniać lek po dostaniu się do komórek rakowych. Ponadto stabilność receptury jest również niezbędnym wymogiem dla rozwoju produktu, ponieważ stabilność formuły decyduje o wykonalności opracowania produktu, a także o okresie trwałości opracowanych produktów. W ostatnim czasie podjęto wiele wysiłków w celu usprawnienia załadunku leków do przewoźników. Lipofilowe podejście prolekowe to strategia, która została zbadana w celu poprawy ładowania leków do nanocząsteczek lipidowych i emulsji. 13,14 Koniugacja lipidów z lekami może znacznie poprawić ich lipofilowość oraz zwiększyć obciążenie i retencję w lipofilowych składnikach nanonośników.
Tutaj opisujemy protokół przygotowania lipofilowych miceli naładowanych pro-lekami doksorubicyny. Po pierwsze, opisano procedurę syntezy lipofilowego proleku doksorubicyny. Następnie wprowadzany jest protokół generowania miceli metodą dyspersji filmowej. Metoda ta została z powodzeniem zastosowana w naszych poprzednich badaniach. 5 DSPE-PEG został wybrany jako materiał nośny do otrzymywania miceli, ponieważ jest z powodzeniem stosowany do dostarczania leków micelowych. 15,16 Na koniec opisujemy kilka testów in vitro stosowanych do charakteryzowania preparatów miceli i oceny aktywności przeciwnowotworowej.

<table><tbody><tr><td>DSPE-PEG2K</td><td>Cordenpharm</td><td>LP-R4-039</td><td>>95%</td></tr><tr><td>Doxorubicin</td><td>LC Laboratories</td><td>D-4000</td><td>>99%</td></tr><tr><td>Hydrazyd kwasu palmitynowego</td><td>TCI AMERICA&nbsp; &nbsp;</td><td>P000425G</td><td>>98,0%</td></tr><tr><td>Metanol</td><td>ACROS Organics</td><td>610981000</td><td>Bezwodny</td></tr><tr><td>chlorek metylenu&nbsp;</td><td>RYBACY&nbsp;</td><td>D151-4</td><td>99,90%</td></tr> <tr><td>Sultlenek metylu-d6</td><td>ACROS Organics</td><td>AC320760075</td><td>Rozpuszczalnik NMR</td></tr><tr><td>Kwas trifluorooctowy&nbsp;</td><td>ACROS Organics</td><td>AC293811000</td><td>99,50%</td></tr> <tr><td>żel krzemionkowy</td><td>FISHER&nbsp;</td><td>L-7446</td><td>230-400 siatka</td></tr><tr><td>Baker Flex TLC</td><td>FISHER&NBSP;</td><td></td><td></td>NC9990129</tr><tr><td>DPBS</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D8537</td><td></td></tr><tr><td>DU 145&nbsp; Komórki raka prostaty</td><td>ATCC</td><td>HTB-81</td><td></td></tr><tr><td>MTT</td><td>ACROS Organics</td><td>158990050</td><td>98%</td></tr><tr><td>RPMI 1640 Średni</td><td>MEDIATECH INC&nbsp;</td><td>10041CV</td><td></td></tr><tr><td>Antybiotyk-Antybiotyk Przeciwgrzybiczy&nbsp;</td><td>TECHNOLOGIE ŻYCIA&nbsp;</td><td>15240062</td><td>100x roztwór podstawowy</td></tr><tr><td>Surowica bydlęca płodu</td><td>TECHNOLOGIE ŻYCIA&nbsp;</td><td></td><td></td>10437077</tr><tr><td>Spektroskopia magnetycznego rezonansu jądrowego</td><td>Varian, Inc</td><td></td><td>300 NMR&nbsp;</td></tr><tr><td>B&uuml; chi R-3 Rotavapor</td><td>Buchi</td><td>1103022V1&nbsp;</td><td>Parownik obrotowy</td></tr><tr><td>Kąpiel ultradźwiękowa</td><td>BRANSON ULTRASONICS CORPORATION&nbsp;</td><td></td><td></td>CPX952318R</tr><tr><td>Spektrometr UV-VIS Biomate 3</td><td>Thermo Spectronic</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Zetasizer Nano ZS90&nbsp;</td><td>Malvern Instruments</td><td></td><td>Analizator wielkości cząstek</td></tr><tr><td>Spektrofotometr mikropłytkowy&nbsp;</td><td>Rio-Rad</td><td>Benchmark Plus&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Inkubator Kultur Komórkowych</td><td>Napco</td><td>CO2 6000</td><td></td></tr><tr><td>Szafa Bezpieczeństwa Biologicznego</td><td>Nuaire</td><td></td><td></td></tr><tr><td>SigmaPlot&nbsp;</td><td>Systat Software, Inc.</td><td></td><td>Oprogramowanie analityczne</td></tr><tr><td>96-dołkowa płytka do hodowli komórkowych</td><td>Becton Dickinson</td><td>353072</td><td></td></tr><tr><td>Trypsyna&nbsp; 0,25%</td><td>Corning Cellgro</td><td>25-053-CI</td><td></td></tr></tbody></table>

przygotowanie i charakterystyka lipofilowych miceli prolekowych doksorubicyny

Preparation and Characterization of Lipophilic Doxorubicin Pro-drug Micelles

Micele były z powodzeniem wykorzystywane do dostarczania leków przeciwnowotworowych. Polimery amfifilowe tworzą micele o strukturze rdzeń-powłoka w środowisku wodnym poprzez samoorganizację. Hydrofobowy rdzeń miceli działa jako rezerwuar leków hydrofobowych i zamyka leki hydrofobowe. Otoczka hydrofilowa zapobiega agregacji miceli, a także przedłuża ich krążenie ogólnoustrojowe in vivo. W tym protokole opisujemy metodę syntezy lipofilowego proleku doksorubicyny, kwasu doksorubicynowo-palmitynowego (DOX-PA), który zwiększy ładowanie leku do miceli. Do koniugacji doksorubicyny z lipidem użyto łącznika hydrazonu wrażliwego na pH, który ułatwia uwalnianie wolnej doksorubicyny do komórek nowotworowych. Zsyntetyzowany DOX-PA oczyszczono za pomocą kolumny z żelem krzemionkowym przy użyciu dichlorometanu/metanolu jako eluentu. Oczyszczony DOX-PA analizowano za pomocą chromatografii cienkowarstwowej (TLC) i 1spektroskopii H-jądrowego rezonansu magnetycznego (1H-NMR). Do przygotowania miceli DSPE-PEG obciążonych DOX-PA wykorzystano metodę dyspersji foliowej. Ponadto opisano kilka metod charakteryzowania preparatów micelowych, w tym oznaczanie stężenia DOX-PA i skuteczności enkapsulacji, pomiar wielkości i rozmieszczenia cząstek oraz ocenę aktywności przeciwnowotworowej in vitro. Protokół ten dostarcza użytecznych informacji na temat przygotowania i charakterystyki miceli obciążonych lekiem, a tym samym ułatwi badania i rozwój nowych nanoleków przeciwnowotworowych na bazie micel.

Rysunek 1 przedstawia schemat syntezy DOX-PA. DOX-PA został zsyntezowany poprzez koniugację kwasu palmitynowego z doksorubicyną za pomocą wrażliwego na pH wiązania hydrazonowego. Aby ułatwić całkowite przeprowadzenie reakcji, zastosowano niewielki nadmiar hydrazydy kwasu palmitynowego. Ta metoda reakcji charakteryzuje się bardzo wysoką wydajnością, a po 18 h reakcji pozostała jedynie niewielka ilość doksorubicyny (Rysunek 2). Wydajność wyniosła około 88%....

Opisano protokół przygotowania i charakterystyki lipofilowych miceli 1,2-distearoyl-sn-glycero-3-fosphoethanolamine-N-[amino(glikol polietylenowy)-2000] (DSPE-PEG).

Przygotowanie i charakterystyka lipofilowych miceli prolekowych doksorubicyny

Micelles have been successfully used for the delivery of anticancer drugs. Amphiphilic polymers form core-shell structured micelles in an aqueous ...

Ogólnym celem niniejszego protokołu jest opis procedur przygotowania i charakterystyki formulacji micelowych obciążonych lipofilnym prolekiem doksorubicyny. Metoda ta zapewnia prosty i niezawodny sposób przygotowania formulacji micelowej. Synteza lipofilnego proleku doksorubicyny może zwiększyć ładunek leku oraz stabilność, rozwiązując tym samym istotny problem w opracowywaniu formulacji micelowych.Formułacje micelarne mogą zwiększyć celowanie leku w guzy, a tym samym zmniejszyć toksyczność leczenia nowotworów. Poza zastosowaniem opisanym w tym projekcie, technika ta może być również wykorzystana do przygotowania nanoleków dla innych substancji czynnych. Aby zsyntetyzować lipofilne proleku doksorubicyny DOX-PA, odważ 390 mg doksorubicyny oraz 243 mg hydrazydy kwasu palmitynowego i przenieś je do kolby okrągłodennej.Za pomocą szklanej strzykawki dodaj do kolby 150 mililitrów bezwodnego metanolu. Następnie pipetą dodaj 39 mikrolitrów kwasu trifluorooctowego (TFA). Przy użyciu mieszadła magnetycznego mieszaj mieszaninę reakcyjną przez 18 godzin w temperaturze pokojowej, w ciemności.Aby oczyścić DOX-PA przy użyciu kolumny z żelem krzemianowym, najpierw usuń rozpuszczalnik z mieszaniny

preparation-characterization-lipophilic-doxorubicin-pro-drug

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Bioinżynieria

Celem tego protokołu jest opisanie przygotowania i charakterystyki fizycznie uwięzionych, słabo rozpuszczalnych w wodzie leków w systemach dostarczania leków micelarnych składających się z amfifilowych kopolimerów blokowych.

Przygotowanie i charakterystyka pojedynczych i wielolekowych, fizycznie uwięzionych miceli polimerowych

Informujemy o inteligentnym zastosowaniu nanorurek węglowych do kinetycznej stabilizacji cząsteczek lipidowych, które zawierają samoorganizujące się nanostruktury w swoich rdzeniach. Przygotowanie cząsteczek lipidowych wymaga raczej niskich stężeń nanorurek węglowych, co pozwala na ich wykorzystanie w zastosowaniach biomedycznych, takich jak dostarczanie leków.

Łatwe przygotowanie wewnętrznie samoorganizujących się cząstek lipidowych stabilizowanych przez nanorurki węglowe

Kluczowe etapy żywej anionowej polimeryzacji eteru fenyloglicydylowego (PheGE) na glikolu metoksy-polietylenowym (mPEG-b-PPheGE) są opisane. Otrzymane micele kopolimeru blokowego (BCM) obciążono doksorubicyną w 14% (wag.) i uzyskano trwałe uwalnianie leku przez 4 dni w fizjologicznie istotnych warunkach.

Polimeryzacja anionowa kopolimeru amfifilowego do otrzymywania miceli kopolimeru blokowego stabilizowanego oddziaływaniami π-π stacking

Aby dostarczyć leki przeciwnowotworowe do miejsc nowotworowych o wysokiej swoistości i zmniejszonych skutkach ubocznych, potrzebne są nowe metody oparte na nanocząsteczkach. Tutaj opisujemy usieciowane micele dwusiarczkowe, które można łatwo przygotować przez utlenianie za pośrednictwem nadtlenku wodoru i są w stanie skutecznie dysocjować w środowisku redukującym guza, aby uwolnić ładunki.

Łatwe i wydajne podejście do produkcji odwracalnych miceli usieciowanych dwusiarczkowym

Nanonośnik ciekłokrystalicznej nanocząstki (LCNP) jest wykorzystywany jako narzędzie do kontrolowanego dostarczania hydrofobowego ładunku do błony komórkowej żywych komórek.

Celowane dostarczanie przez błonę plazmatyczną hydrofobowego ładunku zamkniętego w nośniku nanocząstek ciekłokrystalicznych

Obrazowanie żywych komórek to potężne narzędzie do wizualizacji dynamicznych procesów. Badanie nieruchomych komórek dostarcza jedynie statycznych obrazów, co może prowadzić do błędnej interpretacji i zamieszania co do procesu. W pracy przedstawiono metodę badania wychwytu, uwalniania leków i lokalizacji wewnątrzkomórkowej nanocząstek liposomalnych w żywych komórkach.

Wykorzystanie obrazowania żywych komórek in vitro do badania chemioterapeutyków dostarczanych przez nanocząstki na bazie lipidów

Ten protokół opisuje efektywny i wygodny proces analityczny pobierania próbek i jednoczesnego oznaczania wielu leków, doksorubicyny (DOX), mitomycyny C (MMC) i kardiotoksycznego metabolitu DOX, doksorubicyny (DOXol), w próbkach biologicznych z przedklinicznego modelu guza piersi traktowanego preparatami nanocząsteczkowymi synergicznego połączenia leków.

Ekstrakcja próbki i jednoczesna chromatograficzna ocena ilościowa doksorubicyny i mitomycyny C po dostarczeniu kombinacji leków w nanocząstkach myszom z nowotworem

To badanie opisuje klasyczną hydratację przy użyciu metody cienkiego filmu lipidowego do przygotowania nanoliposomów, a następnie charakterystyki nanocząstek. Hydrofilowe i globularne białko o masie 47 kDa, taryna, jest z powodzeniem kapsułkowane jako strategia poprawiająca stabilność, unikająca szybkiego klirensu i promująca kontrolowane uwalnianie. Metoda może być dostosowana do enkapsulacji cząsteczek hydrofobowych.

Otrzymywanie i charakterystyka nanoliposomów do uwięzienia bioaktywnych hydrofilowych białek kulistych

Protokół przedstawia zoptymalizowane parametry przygotowania termoczułych liposomów za pomocą urządzenia mikrofluidycznego do mikromiksera w jodełkę. Umożliwia to również kokapsułkowanie doksorubicyny i zieleni indocyjaninowej do liposomów oraz fototermiczne uwalnianie doksorubicyny w celu kontrolowanego/wyzwalanego uwalniania leku.

Mikroprzepływowa produkcja liposomów wrażliwych na temperaturę zawierających lizolipidy

W tym protokole, nanocząstki złota modyfikowane doksorubicyną AS1411-g-PEI-g-PEG są syntetyzowane w trzyetapowych reakcjach amidowych. Następnie doksorubicyna jest ładowana i dostarczana do docelowych komórek rakowych w celu terapii przeciwnowotworowej.

Synteza nanocząstek złota modyfikowanych aptamerem-PEI-g-PEG obciążonych doksorubicyną w celu celowanego dostarczania leków

Poznaj metodę przygotowania i charakteryzacji lipofilowych miceli prolekowych doksorubicyny. Technika ta poprawia ładunek leku i stabilność, umożliwiając skierowane dostarczanie do nowotworów przy zmniejszonej toksyczności.

Przygotowanie i charakterystyka lipofilowych miceli prolekowych doksorubicyny

Przeglądaj więcej filmów