Wysokoprzepustowe znakowanie genów u Trypanosoma brucei

Ogólnym celem tej metody jest znakowanie białek w Trypansoma brucei w sposób wysokoprzepustowy. Metoda ta może pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytania w dziedzinie kinetoplacidu dotyczące lokalizacji i potencjalnej funkcji dużych kohort białek. Główną zaletą tej techniki jest to, że duża liczba białek może być szybko i łatwo znakowana równolegle.

Chociaż metoda ta może zapewnić wgląd w lokalizację, interakcje dużych kohort białek można również badać przy użyciu innych znaczników. Na przykład znacznik BirA dla eksperymentu mapowania bliskości identyfikatora biologicznego. Procedurę zademonstruje Ross Madden, asystent naukowy z naszego laboratorium.

Przed rozpoczęciem tej procedury należy wstępnie zamrozić 96-dołkową chłodziarkę do PCR w zamrażarce o temperaturze minus 80 stopni Celsjusza. Przygotuj Master Mix A, łącząc następujące elementy w 10-mililitrowej tubce. 2, 100 mikrolitrów destylowanej wody dejonizowanej, 105 mikrolitrów DMSO klasy PCR, 105 mikrolitrów 10 milimolowych dNTP i 105 mikrolitrów matrycy pPOT.

Wlej Master Mix A do zbiornika odczynnika i podnieś 23 mikrolitry Master Mix A do każdej studzienki 96-dołkowej płytki PCR. Używając 12-kanałowej pipety wielokanałowej P20, dodaj dwa mikrolitry 100 mikromolowych starterów do każdej załadowanej studzienki. Uszczelnij płytkę folią.

Umieść go we wstępnie schłodzonej chłodziarce PCR i pozwól mu zamarznąć przez co najmniej 20 minut w temperaturze minus 80 stopni Celsjusza. Zamrażanie PCR Master Mix A ma kluczowe znaczenie dla zapewnienia wydajnej reakcji gorącego startu, nawet w przypadku stosowania określonej polimerazy gorącego startu. Prowadzi to do powtarzalnego i wydajnego amplifikacji.

Gdy płytka PCR znajduje się w zamrażarce, przygotuj Master Mix B. Połącz następujące elementy w 10-mililitrowej probówce. 2 048 mikrolitrów destylowanej wody dejonizowanej, 525 mikrolitrów buforu 10X i 52,5 mikrolitrów polimerazy, co daje łączną objętość 2 626 mikrolitrów na płytkę. Wyjmij płytkę PCR i chłodziarkę PCR z zamrażarki o temperaturze minus 80 stopni Celsjusza.

Trzymając płytkę nadal w chłodnicy PCR, szybko dodaj 25 mikrolitrów Master Mix B na wierzch zamrożonego Master Mix A w każdym dołku, aby uzyskać całkowitą objętość reakcji 50 mikrolitrów. Jest to krytyczne czasowo i powinno zostać zakończone, zanim Master Mix A będzie mógł się rozmrozić. Uszczelnij płytkę folią.

Ustaw termocykler w następujący sposób: 94 stopnie Celsjusza przez 10 minut, następnie 30 cykli 94 stopni Celsjusza przez 15 sekund, 65 stopni Celsjusza przez 30 sekund i 72 stopnie Celsjusza przez dwie minuty, a następnie końcowy okres przedłużenia o 72 stopnie Celsjusza przez siedem minut. Gdy blok osiągnie 94 stopnie Celsjusza, załaduj płytkę PCR do termocyklera i uruchom program amplifikacji.

Rozpocznij tę procedurę od przygotowania dużego 1% żelu agarozowego w buforze Tris-acetate EDTA lub TAE, z czterema rzędami studzienek. Załaduj drabinkę DNA o pojemności jednego kb do pierwszego i 28. dołka w każdym rzędzie. Następnym krokiem jest przeniesienie dwóch mikrolitrów produktu PCR bezpośrednio, bez buforu ładującego DNA, do każdej linii żelu, zgodnie ze wzorem pokazanym tutaj.

Na przykład produkty PCR z rzędów A i B płytki PCR są ładowane na nieparzyste i parzyste pasy odpowiednio pierwszego rzędu żelu. Działając szybko, aby zmniejszyć możliwość zanieczyszczenia amplikonów, załaduj produkty PCR z rzędu A płytki PCR na nieparzyste pasy pierwszego rzędu żelu. Następnie załaduj produkty PCR z rzędu B płytki PCR na parzyste pasy pierwszego rzędu żelu.

Załadować produkty PCR z rzędów C i D płytki PCR według tego samego wzoru, tak aby rząd C wchodził na tory nieparzyste, a rząd D na parzyste pasy drugiego rzędu żelu. Kontynuuj ten schemat ładowania, aż każdy dołek płytki PCR zostanie załadowany na żel. Umieść żel w zbiorniku do pracy i napełnij zbiornik buforem do pracy TAE, aż żel zostanie zanurzony.

Uruchom pod napięciem 100 woltów przez 30 minut. Wizualizacja za pomocą transiluminatora UV. Pokazano tutaj reprezentatywny 96-dołkowy żel agarozowy walidacyjny PCR, w którym 95 z 96 PCR zakończyło się sukcesem.

Nieudany test PCR to H11. W tej procedurze wykorzystuje się Trypansoma brucei, formę procykliczną, linię komórkową SMOXP9. Hodować komórki do odpowiedniej gęstości opisanej w tekście protokołu i zbierać wymaganą liczbę komórek przez odwirowanie w temperaturze 800 razy G przez 10 minut.

Rozpocznij przygotowanie do elektroporacji podczas wirowania komórek. Podłączyć uchwyt do płytek do elektroporatora. W elektroporatorze ustaw napięcie na 1 500 woltów, długość impulsu na 100 mikrosekund, liczbę impulsów na 12, a interwał impulsów na 500 milisekund.

W module obsługi płytek ustaw liczbę impulsów na jeden. Za pomocą 12-kanałowej pipety wielokanałowej P200 przenieś reakcje PCR z płytki PCR na 96-dołkową jednorazową płytkę do elektroporacji. Umyj komórki w 10 mililitrach zmodyfikowanego cytomiksu i ponownie odwiruj w temperaturze 800 razy G przez 10 minut.

Ponownie zawiesić komórki w 23 mililitrach zmodyfikowanego cytomiksu, aby uzyskać końcowe stężenie pięć razy 10 do siódmych komórek na mililitr. Przenieść zawiesinę komórek do zbiornika odczynnika. Odpipetować 200 mikrolitrów roztworu ogniwa do każdego dołka płytki do elektroporacji i wymieszać z produktem PCR przez pipetowanie.

Użyj chusteczki, aby usunąć wszelkie kropelki z górnej części płytki, aby uniknąć zwarć. Nałożyć folię uszczelniającą na górną część płytki elektroporacyjnej, ustawiając ją tak, aby pozostawić otwarte otwory na elektrody na górze i na dole każdej kolumny. Unikaj zakrywania podniesionych punktów używanych do prowadzenia folii.

Załaduj płytkę elektroporacyjną do uchwytu do płytek i zamknij pokrywę. Naciśnij impuls "na zespole elektroporatora. Po elektroporacji komórki należy szybko przenieść do czterech 24-dołkowych płytek do hodowli tkankowych, które zawierają jeden mililitr pożywki SDM-79 na studzienkę w celu odzyskania.

Użyj 12-kanałowej pipety wielokanałowej P200 z brakującą co drugą końcówką, tak aby pozostałe sześć końcówek zrównało się z sześcioma rzędami na 24-dołkowej płytce do hodowli tkankowej. Po przeniesieniu komórek z płytki 96-dołkowej do płytki 24-dołkowej, należy umyć studzienki w płytce 96-dołkowej pożywką z odpowiednich dołków w płytce 24-dołkowej. Następnie przenieś popłucz z powrotem do studzienek w płytce 24-dołkowej.

Przenieś elektroporowane komórki z 96-dołkowej płytki do elektroporacji na 24-dołkowe płytki do hodowli tkankowych w predefiniowanym wzorze pokazanym tutaj. Na przykład komórki z dołków o numerach nieparzystych w rzędzie A płytki 96-dołkowej są przenoszone do rzędu A płytki A, podczas gdy komórki z dołków parzystych w rzędzie A z płytki 96-dołkowej są przenoszone do rzędu A płytki C. Po każdym przeniesieniu komórek z płytki 96-dołkowej do płytki 24-dołkowej, Umyć studzienki w płytce 96-dołkowej pożywką z odpowiedniego rzędu płytki 24-dołkowej. Następnie przenieś popłucz płyn z powrotem na płytkę 24-dołkową.

Przenoszenie komórek do płytek 24-dołkowych jest mylące, ale musisz być w stanie śledzić powstałe linie komórkowe do właściwego genu ID.It kluczowe jest szybkie wykonanie tego kroku, aby utrzymać komórki w zdrowiu. Po przeniesieniu wszystkich elektroporowanych ogniw na cztery płytki 24-dołkowe, umieść płytki 24-dołkowe w czystym plastikowym pudełku z pokrywką, która tworzy szczelne zamknięcie. Umieść pudełko w inkubatorze o temperaturze 28 stopni Celsjusza.

Między sześcioma do ośmiu godzin później dodaj do każdej studzienki jeden mililitr SDM-79 z 10% FCS zawierającym selektywny antybiotyk. Inkubuj w temperaturze 28 stopni Celsjusza przez dziewięć do 10 dni, aż transgeniczne linie komórkowe staną się widoczne. Po 96-dołkowej transfekcji w celu znakowania 96 różnych białek na końcu końcowym, komórki są przenoszone na 24-dołkowe płytki do hodowli tkankowych w celu odzyskania i selekcji.

Każdy studzienka jest następnie oceniany w celu określenia, czy zawiera zdrowe, odporne na leki komórki. Zdrowa studzienka zawiera głównie wysoce aktywne komórki, które są jasne w mikroskopii z kontrastem fazowym. Na tym schematycznym przykładzie kolor zielony reprezentuje studzienkę z udaną transfekcją, a szary reprezentuje studnię z tylko martwymi komórkami.

88 z 96 studzienek, czyli 92%, zawiera pomyślnie transfekowane pasożyty po 15 dniach selekcji. Po opanowaniu minie około godziny od zliczenia ogniw do ich posiewu po elektroporacji. Próbując wykonać tę procedurę, ważne jest, aby pamiętać o dodaniu selektywnych leków po sześciu do ośmiu godzinach od transfekcji.

Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak oznaczać duże kohorty białek w Trypansoma brucei.