Name: Wysokoprzepustowe znakowanie genów u Trypanosoma brucei (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-08-12T15:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 26 s
Description: Poznaj metodę wysokoprzepustowego znakowania białek u Trypanosoma brucei, umożliwiającą badanie lokalizacji i funkcji protein na dużą skalę. Technika ta wspiera genomowe studia kinetyczne.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

SD było wspierane przez Sir Henry Wellcome Fellowship [092201/Z/10/Z]. Praca ta została sfinansowana z grantów Wellcome Trust [WT066839MA][104627/Z/14/Z][108445/Z/15/Z] dla profesora Keitha Gull. Chcielibyśmy podziękować profesorowi Keithowi Gullowi za pomocne rozmowy i spostrzeżenia.

1. 96-dołkowy Long Primer PCR
<ol>
	<li>Wstępnie zamrozić 96-dołkową chłodziarkę PCR w zamrażarce o temperaturze -80 °C.</li>
	<li>W probówce o pojemności 10 ml przygotuj Master Mix A: 2 100 μl ddH2O, 105 μl DMSO klasy PCR, 105 μl 10 mM dNTP, 105 μl szablonu pPOT (25 ng/μl) 9, co daje całkowitą objętość 2 415 μl na płytkę.</li>
	<li>Podwielokrotność 23 μl do każdego dołka 96-dołkowej płytki PCR.</li>
	<li>Dodać 2 μl 100 μM zbiorczych starterów do każdego załadowanego dołka za pomocą 12-kanałowej pipety wielokanałowej P20. Uszczelnić folią, umieścić płytkę na wstępnie schłodzonej chłodziarce do PCR i pozostawić do zamrożenia na co najmniej 20 minut w temperaturze -80 °C.</li>
	<li>W probówce o pojemności 10 ml przygotować Master Mix B: 2,048 μl ddH2O, 525 μl 10x buforu, 52,5 μl polimerazy o całkowitej objętości 2,626 μl na płytkę.</li>
	<li>Wyjmij płytkę i chłodziarkę do PCR z zamrażarki w temperaturze -80 °C.</li>
	<li>Trzymając płytkę nadal w chłodnicy PCR, dodaj 25 μl Master Mix B na wierzch zamrożonej Master Mix A, aby uzyskać całkowitą objętość reakcji 50 μl. Ma to kluczowe znaczenie czasowe i powinno zostać zakończone, zanim mieszanka A będzie mogła się rozmrozić. Płyta uszczelniająca z folią.</li>
	<li>Ustaw termocykler w następujący sposób: 94 °C na 10 minut, następnie 30 cykli 94 °C przez 15 sekund, 65 °C przez 30 sekund, 72°C przez 2 minuty, a następnie końcowy okres przedłużenia 72 °C przez 7 minut.</li>
	<li>Załadować płytkę PCR po osiągnięciu przez blok temperatury 94 °C.</li>
</ol>
2. Walidacja 96-dołkowego długiego PCR startera
<ol>
	<li>Odlej duży 1% (w/v) żel agarozowy w buforze biegowym Tris Acetate EDTA (TAE) z 4 x 28-dołkowymi grzebieniami, aby uzyskać żel z 4 rzędami dołków. Dopasuj naprzemienne zęby grzebienia do końcówek 12-kanałowej pipety wielokanałowej. Ostrożnie zanurz żel w buforze do pracy TAE po załadowaniu pasów.</li>
	<li>Załaduj drabinkę DNA o pojemności 1 kb do 1. i 28. dołka w każdym rzędzie.</li>
	<li>Za pomocą 12-kanałowej pipety wielokanałowej P20 przenieś 2 μl produktu PCR bezpośrednio na każdą linię żelu (rysunek 1A). Zrób to szybko, aby zmniejszyć możliwość zanieczyszczenia amplikonów.
	<ol>
		<li>Załadować produkty PCR z rzędu A płytki PCR na nieparzyste ponumerowane pasy 1. rzędu żelu (A1 - tor 3, A2 - tor 5 ...... A11 - tor 23, A12 - tor 25) i załadować produkty PCR z rzędu B płytki PCR na parzyste pasy 1. rzędu żelu (B1 - tor 4, A2 - pas 6 ...... B11 - pas 24, B12 - pas 26).</li>
		<li>Załadować produkty PCR z rzędów C i D płytki PCR, stosując ten sam wzór, jak opisano powyżej, z rzędem C na tory o numerach nieparzystych, a rzędem D na tory o numerach parzystych. Kontynuuj ten schemat ładowania, aż każdy dołek płytki PCR zostanie załadowany na żel. Bufor ładujący DNA nie jest wymagany do załadowania tego żelu.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Umieść żel w zbiorniku do pracy i napełnij zbiornik buforem do pracy TAE, aż żel zostanie zanurzony. Uruchom przy napięciu 100 V przez 30 minut i wizualizuj za pomocą transiluminatora UV. Na rysunku 1B przedstawiono przykładowy gel. 
	Uwaga: Produkty PCR mogą być przechowywane w temperaturze -20 °C przez kilka tygodni przed transfekcją</li>
</ol>
3. Transfekcja 96-dołkowa
<ol>
	<li>Do tej procedury należy użyć procyklicznej linii komórkowej SMOXP9 10 w postaci procyklicznej T. brucei i hodować w pożywkach SDM-79 zawierających 10% FCS 10.</li>
	<li>Użyj 1 x 107 komórek na transfekcję (łącznie 1,1 x 109 komórek) podczas znakowania na końcu N białka i 2 x 107 komórek na transfekcję (łącznie 2,2 x 109 komórek) podczas znakowania na końcu C białka. Utrzymuj komórki w połowie log (1,2 x 106-1 x 107 komórek/ml) przez kilka dni przed transfekcją i zbierz komórki do transfekcji w gęstości 5-8 x 106 komórek/ml.</li>
	<li>Pozwól, aby zamrożone produkty PCR do transfekcji rozmroziły się w temperaturze pokojowej.</li>
	<li>Policz komórki za pomocą hemocytometru lub automatycznego licznika komórek.</li>
	<li>Granulka wymagana liczba komórek w wielu probówkach o pojemności 50 ml po 800 x g przez 10 min.</li>
	<li>Po odwirowaniu odrzucić supernatant i ponownie zawiesić komórki w 10 ml zmodyfikowanego cytomiksu (0,8 mM EGTA, 24 mM KCl, 0,15 mM CaCl2, 10 mM bufor fosforanu potasu pH 7,6, 25 mM HEPES-KOH pH7,6, 2,6 mM MgCl2, 0,5% (w/v) glukozy, 100 μg/ml BSA, 1 mM hipoksantyna, 144 mM sacharoza) na probówkę. Przenieść wszystkie roztwory komórek do jednej probówki i ponownie wirować z prędkością 800 x g przez 10 minut.</li>
	<li>Po odwirowaniu odrzucić supernatant i ponownie zawiesić komórki w 23 ml zmodyfikowanego cytomiksu do uzyskania końcowego stężenia 5 x 107 komórek/ml.</li>
	<li>Podczas wirowania komórek dodaj 1 ml pożywki SDM-79 do każdej studzienki 4 x 24-dołkowych płytek do hodowli tkankowych. Oznacz tabliczki A-D i narysuj pierścień wokół dołka A1 na każdej płytce trwałym markerem, aby ułatwić orientację płytki.</li>
	<li>Podłączyć uchwyt do płytek do elektroporatora. Na elektroporatorze ustaw napięcie na 1 500 V, długość impulsu na 100 μs, liczbę impulsów na 12, a interwał impulsów na 500 ms. Na uchwycie płytek ustaw liczbę impulsów na 1. Gwarantuje to, że elektroporator zastosuje pojedynczy impuls do każdej z 12 kolumn płytki elektroporacyjnej.</li>
	<li>Za pomocą 12-kanałowej pipety wielokanałowej P200 przenieś reakcje PCR z płytki PCR na 96-dołkowe jednorazowe płytki do elektroporacji w odstępie 4 mm.</li>
	<li>Gdy komórki zostaną odwirowane i ponownie zawieszone do końcowego stężenia 5 x 107 komórek/ml (etap 3.7), przenieść do zbiornika odczynnika. Odpipetować 200 μl roztworu ogniw do każdego dołka płytki elektroporacyjnej za pomocą 12-kanałowej pipety wielokanałowej P200, wymieszać z produktem PCR przez pipetowanie.</li>
	<li>Za pomocą chusteczki usuń wszelkie kropelki z górnej części płytki, aby uniknąć zwarć.</li>
	<li>Nałóż folię uszczelniającą dostarczoną w opakowaniu płyty na górną część płytki do elektroporacji, ustawiając ją tak, aby pozostawić otwarte otwory na elektrody na górze i na dole każdej kolumny. Unikaj zakrywania podniesionych punktów używanych do prowadzenia folii.</li>
	<li>Załaduj płytkę elektroporacyjną do uchwytu do płytek i zamknij pokrywę. Naciśnij przycisk "Pulse" na elektroporatorze.</li>
	<li>Po elektroporacji szybko przenieś komórki z 96-dołkowej płytki do elektroporacji na 4 x 24-dołkowe płytki do hodowli tkankowych. Aby przenieść komórki, użyj 12-kanałowej pipety wielokanałowej P200 z brakującą co drugą końcówką, tak aby pozostałe 6 końcówek pokrywało się z 6 rzędami na 24-dołkowej płytce do hodowli tkankowej. Przenieś elektroporowane komórki z 96-dołkowych płytek do elektroporacji według wstępnie zdefiniowanego wzoru na 24-dołkowe płytki do hodowli tkankowych (ryc. 2A).</li>
	<li>Przygotuj końcówki do pipet P200 - dla każdej transfekcji 96-dołkowej przygotuj 2 pudełka po 96 końcówek z usuniętą co drugą kolumną.
	<ol>
		<li>Przenieść studzienki A1/A3/A5/A7/A9/A11 na 96-dołkowej płytce elektroporacyjnej na płytkę A rzędu A 24-dołkowych płytek do hodowli tkankowych, B1/B3/B5/B7/B9/B11 do rzędu B, C1/C3/C5/C7/C9/C11 do rzędu C i D1/D3/D5/D7/D9/D11 do rzędu D. Po przeniesieniu każdego zestawu 6 dołków z płytki 96-dołkowej do płytki 24-dołkowej, dołki w płytce 96-dołkowej są następnie przemywane pożywką z odpowiednich dołków w płytce 24-dołkowej, a płukanie jest następnie przenoszone z powrotem do studzienek w płytce 24-dołkowej.</li>
		<li>Przenieś studzienki E1/E3/E5/E7/E9/E11 na 96-dołkowej płytce elektroporacyjnej na 24-dołkową płytkę B, rząd A, F1/F3/F5/F7/F9/F11 do rzędu B, G1/G3/G5/G7/G9/G11 do rzędu C i H1/H3/H5/H7/H9/H11 do rzędu D. Po przeniesieniu każdego zestawu 6 dołków z płytki 96-dołkowej do płytki 24-dołkowej, dołki w płytce 96-dołkowej są następnie przemywane pożywką z odpowiednich dołków w płytce 24-dołkowej, a płukanie jest następnie przenoszone z powrotem do studzienek w płytce 24-dołkowej.</li>
		<li>Przenieś studzienki A2/A4/A6/A8/A10/A12 na 96-dołkowej płytce elektroporacyjnej na 24-dołkową płytkę C, rząd A, B2/B4/B6/B8/B10/B12 do rzędu B, C2/C4/C6/C8/C10/C12 do rzędu C i D2/D4/D6/D8/D10/D12 do rzędu D. Po przeniesieniu każdego zestawu 6 dołków z płytki 96-dołkowej do płytki 24-dołkowej, dołki w płytce 96-dołkowej są następnie przemywane pożywką z odpowiednich dołków w płytce 24-dołkowej, a płukanie jest następnie przenoszone z powrotem do studzienek w płytce 24-dołkowej.</li>
		<li>Przenieś studzienki E2/E4/E6/E8/E10/E12 na 96-dołkowej płytce elektroporacyjnej na 24-dołkową płytkę D, rząd A, F2/F4/F6/F8/F10/F12 do rzędu B, G2/G4/G6/G8/G10/G12 do rzędu C i H2/H4/H6/H8/H10/H12 do rzędu D. Po przeniesieniu każdego zestawu 6 dołków z płytki 96-dołkowej do płytki 24-dołkowej, dołki w płytce 96-dołkowej są następnie przemywane pożywką z odpowiednich dołków w płytce 24-dołkowej, a płukanie jest następnie przenoszone z powrotem do studzienek w płytce 24-dołkowej.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Używając mikroskopu z kontrastem z odwróconymi fazami, zbadaj 1 studzienkę z każdej kolumny, aby sprawdzić komórki. Pojawi się mieszanina żywych i martwych komórek ze znaczną ilością szczątków komórkowych. Żywe komórki można odróżnić od martwych, ponieważ będą jasne pod mikroskopią kontrastu fazowego i będą się poruszać.</li>
	<li>Umieść 24-dołkowe płytki w czystym, plastikowym pudełku z pokrywką, która tworzy szczelne zamknięcie. Umieścić pudełko w inkubatorze o temperaturze 28 °C.</li>
	<li>Między 6-8 godzinami później dodaj 1 ml SDM-79 z 10% FCS zawierającym 2x selektywny antybiotyk do każdej studzienki. Z naszego doświadczenia wynika, że linie komórkowe, w których geny są znakowane na końcu N, są odporne na wyższe stężenia selektywnego leku. Dlatego, używając blasticydyny jako przykładu, znakowanie na końcu N wymaga końcowego stężenia 20 μg/ml blasticydyny, a znakowanie na końcu C wymaga końcowego stężenia 10 μg/ml blasticydyny. 
	Uwaga: Transgeniczne linie komórkowe staną się widoczne 9-10 dni po transfekcji.</li>
	<li>Pasaż co najmniej dwa razy w świeżym leku i pożywce przed analizą. Rysunek 2B przedstawia wyniki typowej 96-dołkowej transfekcji do znakowania 96 różnych białek na końcu N. Oceń każdą studzienkę za pomocą mikroskopii z kontrastem fazowym, aby określić, czy zawiera zdrowe, oporne na leki komórki. Zdrowa studzienka zawiera głównie (<95%) wysoce aktywne komórki, które są jasne w mikroskopii skurczowej fazowej. Późniejsza analiza za pomocą mikroskopii epifluorescencyjnej lub western blot jest wymagana w celu ustalenia, czy białko zostało pomyślnie oznakowane.</li>
</ol>

<ol><li>Kelly, S., Reed, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+genomics+in+Trypanosoma+brucei%3A+a+collection+of+vectors+for+the+expression+of+tagged+proteins+from+endogenous+and+ectopic+gene+loci%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Biochem+Parasitol%22%5BJournal%5D)">Functional genomics in Trypanosoma brucei: a collection of vectors for the expression of tagged proteins from endogenous and ectopic gene loci.</a> Mol Biochem Parasitol. 154 (1), 103-109 (2007).</li>
<li>Wirtz, L. E., Leal, S., Ochatt, C., Cross, G. A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+tightly+regulated+inducible+expression+system+for+conditional+gene+knock-outs+and+dominant-negative+genetics+in+Trypanosoma+brucei%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Biochem+Parasitol%22%5BJournal%5D)">A tightly regulated inducible expression system for conditional gene knock-outs and dominant-negative genetics in Trypanosoma brucei.</a> Mol Biochem Parasitol. 99 (1), 89-101 (1999).</li>
<li>Shi, H., Djikeng, A., Mark, T., Wirtz, L. E., Tschudi, C., Ullu, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetic+interference+in+Trypanosoma+brucei+by+heritable+and+inducible+double-stranded+RNA%5BTitle%5D)+AND+%22RNA%22%5BJournal%5D)">Genetic interference in Trypanosoma brucei by heritable and inducible double-stranded RNA.</a> RNA. 6 (7), New York, NY. 1069-1076 (2000).</li>
<li>Alsford, S., Turner, D. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-throughput+phenotyping+using+parallel+sequencing+of+RNA+interference+targets+in+the+African+trypanosome%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Res%22%5BJournal%5D)">High-throughput phenotyping using parallel sequencing of RNA interference targets in the African trypanosome.</a> Genome Res. 21 (6), 915-924 (2011).</li>
<li>Alsford, S., Eckert, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-throughput+decoding+of+antitrypanosomal+drug+efficacy+and+resistance%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">High-throughput decoding of antitrypanosomal drug efficacy and resistance.</a> Nature. 482 (7384), 232-236 (2012).</li>
<li>Mony, B. M., MacGregor, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genome-wide+dissection+of+the+quorum+sensing+signalling+pathway+in+Trypanosoma+brucei%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Genome-wide dissection of the quorum sensing signalling pathway in Trypanosoma brucei.</a> Nature. 505 (7485), 681-685 (2014).</li>
<li>Rigaut, G., Shevchenko, A., Rutz, B., Wilm, M., Mann, M., Séraphin, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+generic+protein+purification+method+for+protein+complex+characterization+and+proteome+exploration+%3A+Abstract+Nature+Biotechnology%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">A generic protein purification method for protein complex characterization and proteome exploration : Abstract Nature Biotechnology.</a> Nature Biotechnol. 17 (10), 1030-1032 (1999).</li>
<li>Los, G. V., Encell, L. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((HaloTag%3A+A+Novel+Protein+Labeling+Technology+for+Cell+Imaging+and+Protein+Analysis%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Chem+Biol%22%5BJournal%5D)">HaloTag: A Novel Protein Labeling Technology for Cell Imaging and Protein Analysis.</a> ACS Chem Biol. 3 (6), 373-382 (2008).</li>
<li>Dean, S., Sunter, J. D., Wheeler, R. J., Hodkinson, I., Gluenz, E., Gull, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+toolkit+enabling+efficient%2C+scalable+and+reproducible+gene+tagging+in+trypanosomatids%5BTitle%5D)+AND+%22Open+biol%22%5BJournal%5D)">A toolkit enabling efficient, scalable and reproducible gene tagging in trypanosomatids.</a> Open biol. 5 (1), 140197(2015).</li>
<li>Poon, S. K., Peacock, L., Gibson, W., Gull, K., Kelly, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+modular+and+optimized+single+marker+system+for+generating+Trypanosoma+brucei+cell+lines+expressing+T7+RNA+polymerase+and+the+tetracycline+repressor%5BTitle%5D)+AND+%22Open+biol%22%5BJournal%5D)">A modular and optimized single marker system for generating Trypanosoma brucei cell lines expressing T7 RNA polymerase and the tetracycline repressor.</a> Open biol. 2 (2), 110037(2012).</li>
<li>Lam, S. S., Martell, J. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Directed+evolution+of+APEX2+for+electron+microscopy+and+proximity+labeling%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+meth%22%5BJournal%5D)">Directed evolution of APEX2 for electron microscopy and proximity labeling.</a> Nature meth. 12 (1), 51-54 (2014).</li>
<li>Shu, X., Lev-Ram, V., Deerinck, T. J., Qi, Y., Ramko, E. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+genetically+encoded+tag+for+correlated+light+and+electron+microscopy+of+intact+cells%2C+tissues%2C+and+organisms%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+biology%22%5BJournal%5D)">A genetically encoded tag for correlated light and electron microscopy of intact cells, tissues, and organisms.</a> PLoS biology. , (2011).</li>
<li>Schimanski, B., Nguyen, T. N., Günzl, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Highly+efficient+tandem+affinity+purification+of+trypanosome+protein+complexes+based+on+a+novel+epitope+combination%5BTitle%5D)+AND+%22Eukaryotic+Cell%22%5BJournal%5D)">Highly efficient tandem affinity purification of trypanosome protein complexes based on a novel epitope combination.</a> Eukaryotic Cell. , (2005).</li>
<li>Burkard, G., Fragoso, C. M., Roditi, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Highly+efficient+stable+transformation+of+bloodstream+forms+of+Trypanosoma+brucei%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Biochem+Parasitol%22%5BJournal%5D)">Highly efficient stable transformation of bloodstream forms of Trypanosoma brucei.</a> Mol Biochem Parasitol. 153 (2), 220-223 (2007).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Radykalna poprawa czułości metod proteomiki i transkryptomiki w ciągu ostatnich 5-10 lat dostarczyła cennych danych na temat tysięcy genów i ich produktów. Jednak narzędzia do badania funkcji tych białek nie nadążają za zmianami.
Znakowanie białka ułatwia przeprowadzenie licznych eksperymentów w celu określenia jego funkcji. Na przykład białko może być połączone z białkiem fluorescencyjnym w różnych kolorach, aby ułatwić badania nad lokalizacją i kolokalizacją. Znaczniki opracowane dla mikroskopii elektronowej, takie jak APEX2 lub miniSOG 11,12, umożliwiają ultrastrukturalną lokalizację znakowanego białka. Znaczniki biochemiczne, takie jak znacznik TAP i znacznik ProtC-TEV-ProtA (PTP) 7,13 , umożliwiają oczyszczanie kompleksów związanych z białkiem w celu identyfikacji partnerów wiążących lub testów biochemicznych in vitro .
Konkretne kroki, które mają kluczowe znaczenie dla powodzenia protokołu, to: włączenie DMSO do PCR Master Mix 1, zamrożenie PCR Master Mix 1 przed dodaniem Master Mix 2, zastosowanie komercyjnej polimerazy w Master Mix 2 oraz modyfikacja buforu do elektroporacji cytomixu. Z naszego doświadczenia wynika, że konieczne jest użycie podwójnej liczby komórek do transfekcji znakowania końcówek C niż do transfekcji znakowania końcówek N, aby osiągnąć podobny odsetek dołków dodatnich. Dlatego wszystkie kroki należy wykonać zgodnie z opisem.
Technika ta może być skuteczna tylko w przypadku transfekcji trypanosomu w postaci procyklicznej owada. Formy krwi mają niższą skuteczność transfekcji 14, ponadto istnieje prawdopodobieństwo, że umrą podczas selekcji z powodu toksyczności zależnej od gęstości, która nie jest związana z selektywnym lekiem. Dlatego nasz poprzedni protokół reprezentuje obecnie najlepszą technologię znakowania trypanosomów z krwioobiegu 9. Jest również prawdopodobne, że skuteczność transfekcji będzie się różnić w zależności od konkretnego izolatu trypanosomu. Protokół ten został zoptymalizowany przy użyciu 927 form procyklicznych SMOX – inne szczepy mogą wymagać dodatkowej optymalizacji. Środki, które mogą zwiększyć prawdopodobieństwo sukcesu, obejmują: zwiększenie ilości amplikonu PCR, zwiększenie liczby komórek wchodzących w skład transfekcji.
Przedstawiamy metodę, w której setki białek mogą być znakowane równolegle. Ułatwi to zakrojone na szeroką skalę badania nad lokalizacją i interakcją, uzupełniając istniejące duże zbiory danych i dostarczając bezcennych informacji społeczności. Szablony podkładów są dostępne na życzenie, a lista szablonów plazmidów jest dostępna pod adresem: http://www.sdeanresearch.com/

Trypanosoma brucei to pasożyt pierwotniak, który powoduje u bydła ludzką afrykańską trypanosomasis i nagana. T. brucei jest idealnym organizmem do analizy funkcji białek ze względu na połączenie wysokiej jakości genomu, licznych zbiorów danych proteomicznych i transkryptomicznych oraz dobrze rozwiniętych narzędzi molekularnych 1-3. Postępy w proteomice i sekwencjonowaniu zaowocowały powstaniem dużych zbiorów danych, które podkreślają potencjalnie interesujące geny 4-6; Jednak wiele genów ma minimalną ilość informacji związanych z nimi w istniejących bazach danych. W związku z tym istnieje potrzeba opracowania metody wysokoprzepustowej, która wspomoże charakterystykę funkcjonalną białek.

Wyrażenie oznaczonego białka może dostarczyć wielu informacji na temat funkcji białka. Na przykład białko oznaczone białkiem fluorescencyjnym lub epitopem można zlokalizować za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej, która dostarcza informacji o tym, gdzie białko może wywierać swój efekt biologiczny. Alternatywnie, białko oznaczone znacznikiem TAP 7, HaloTag 8 lub His może zostać oczyszczone w celu przeprowadzenia testów biochemicznych i identyfikacji jego partnerów w interakcji.

Niedawno opracowaliśmy solidną metodologię tagowania dla T. brucei 9. W ten sposób wykorzystano PCR z długimi starterami do wygenerowania DNA do transfekcji i umożliwiono równoległe znakowanie dziesiątek białek – co stanowi znaczne ulepszenie istniejących protokołów. Poprawiliśmy teraz skalowalność tego protokołu w formach procyklicznych o rząd wielkości. Tutaj przedstawiamy naszą metodę, w której przeprowadzamy PCR i transfekcję na płytki 96-dołkowe, przy czym odzysk i selekcja zachodzą na płytkach 24-dołkowych. Ponieważ setki białek mogą być teraz znakowane równolegle, metoda ta zapewnia opłacalną i wykonalną metodę znakowania całego genomu trypanosomu.

<table><tbody><tr><td>Oligonukleotydy</td><td>Technologie życia</td><td>tylko do</td><td>odsalania (nie stosować dodatkowego oczyszczania)</td></tr><tr><td>DMSO</td><td>Roche</td><td>W zestawie z pakietem Expand HiFi</td><td>Musi być dNTP klasy PCR</td></tr><tr><td></td><td>, dowolny renomowany</td><td></td><td></td></tr><tr><td>polimeraza Expand HiFi</td><td>Roche</td><td>11759078001</td><td></td></tr><tr><td>BTX ECM830</td><td>Aparatura</td><td></td> Harvard <td>Electroporator</td></tr><tr><td>Uchwyt do płytek HT-200</td><td>Aparat Harvarda</td><td>HT-200</td><td>Obsługuje 96-dołkowe elektropłytki</td></tr><tr><td>MOS 96 GALWANIZACJA 4 mm</td><td>Aparat Harvard</td><td>45-0452</td><td>Galwanizacja do elektroporacji 96-dołkowej</td></tr><tr><td>Chlorowodorek blastycydyny S</td><td>Melford</td><td>3513-03-9</td><td></td></tr><tr><td>Higromycyna b Złoto</td><td>Invivogen</td><td>ant-hg-1</td><td></td></tr><tr><td>Fleomycyna</td><td>Melford</td><td>P0187</td><td></td></tr><tr><td>Kolba TC 225 cm, szyjka skośna, kapelusz fenolowy</td><td>Appletonwoods</td><td>BC006</td><td></td></tr><tr><td>24-dołkowe płytki</td><td>hodowlane Appletonwoods</td><td>BC017</td><td></td></tr><tr><td>Eppendorf&reg; PCR Cooler, bezlodowy system przechowywania w chłodni na 96-dołkowe płytki i probówki do PCR</td><td>Sigma Aldrich</td><td>Z606634-1EA</td><td></td></tr><tr><td>96-well Multiply&reg; Płytka PCR z fartuchem bocznym</td><td>Sarstedt</td><td>72.1979.203</td><td></td></tr></tbody></table>

wysokoprzepustowe znakowanie genów u trypanosoma brucei

High-throughput Gene Tagging in Trypanosoma brucei

Ulepszenia w spektrometrii mas, sekwencjonowaniu i bioinformatyce wygenerowały duże zbiory danych potencjalnie interesujących genów. Znakowanie tych białek może dać wgląd w ich funkcję, określając ich lokalizację w komórce i umożliwiając identyfikację partnera interakcji. Niedawno opublikowaliśmy szybką i skalowalną metodę generowania linii komórkowych Trypanosoma brucei, które wyrażają znakowane białko z endogennego locus. Metoda opierała się na wygenerowanym przez nas plazmidzie, który w połączeniu z PCR z długimi starterami może być wykorzystany do modyfikacji genu w celu zakodowania białka znakowanego na obu końcach. Pozwala to na równoległe znakowanie dziesiątek białek trypanosomów, co ułatwia walidację na dużą skalę genów kandydujących. System ten może być używany do znakowania białek w celu lokalizacji (przy użyciu białka fluorescencyjnego, znacznika epitopu lub znacznika mikroskopii elektronowej) lub biochemii (przy użyciu znaczników do oczyszczania, takich jak znacznik TAP (tandemowe oczyszczanie powinowactwa). W tym miejscu opisujemy protokół wykonywania długiego startera PCR i elektroporacji na płytkach 96-dołkowych, z odzyskiem i selekcją transgenicznych trypanosomów zachodzących na płytkach 24-dołkowych. Dzięki takiemu przepływowi pracy setki białek mogą być znakowane równolegle; Jest to ulepszenie o rząd wielkości w stosunku do naszego poprzedniego protokołu, a znakowanie w skali genomu jest teraz możliwe.

W tej reprezentatywnej transfekcji startery zostały zaprojektowane przy użyciu skryptu Perl TagIt 9 i zsyntetyzowane komercyjnie. Przeprowadzono i zwalidowano reakcję PCR w płytce 96-dołkowej zgodnie z opisem (Rysunek 1A); w tym przykładzie 95 z 96 reakcji PCR przebiegło pomyślnie (Rysunek 1B). W naszym doświadczeniu powtarzanie nieudanych reakcji, zarówno z oryginalnymi starterami, jak i z nowo zsyntetyzowanymi, nie prowadzi do uzyskania poprawnej reakcji PCR.
Amplikony przeniesiono do 96-dołkowych płytek do elektroporacji w celu przeprowadzenia elektroporacji (Rysunek 2A), a następnie przeniesiono do 24-dołkowych płytek hodowlanych w celu rekonwalescencji i selekcji. Po upływie czasu wystarczającego do zajścia selekcji, oceniono przeżywalność w dołkach przed dalszą analizą. W tym przykładzie 88/96 dołków (92%) było pozytywnych po 15 dniach selekcji.
<img alt="Ustawienie PCR w 96 dołkach i wyniki elektroforezy w żelu agarozowym wykazujące amplifikacje DNA." src="/files/ftp_upload/54342/54342fig1.jpg" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Rysunek 1"> 
Rysunek 1: Walidacja PCR z długimi starterami. (A) Schemat przenoszenia produktów PCR z płytki PCR 96-dołkowej na żel agarozowy w celu walidacji PCR. (B) Reprezentatywny żel walidacyjny PCR w 96 dołkach dla znakowania 95 genów na terminusie N oraz 1 amplikonu nieposiadającego homologii ukierunkowanej na koniec 5', służącego jako kontrola negatywna w transfekcji. Próbki naniesiono na żel agarozowy 1% (w/v) i rozdzielono przy napięciu 100 V przez 30 min. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54342/54342fig1large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.</a>
<img alt="Schemat ustawienia i rozkładu w 96-dołkowej płytce transfekcyjnej dla eksperymentów z hodowlą komórkową." src="/files/ftp_upload/54342/54342fig2.jpg" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Rycina 2"> 
Rycina 2: Elektroporacja i selekcja w płytce 96-dołkowej. (A) Schemat przenoszenia elektroporowanych komórek z 96-dołkowej płytki do elektroporacji do 24-dołkowych płytek hodowli tkankowej. (B) Schemat przedstawiający typową ocenę żywotności (live/dead) po 15 dniach selekcji w płytkach 24-dołkowych. Kolor zielony oznacza udaną transfekcję, kolor szary oznacza dołek zawierający wyłącznie martwe komórki. W tym przykładzie 88/96 (92%) dołków zawierało pomyślnie przetransfekowane pasożyty. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54342/54342fig2large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.</a>

Dodanie znacznika do białka to potężny sposób na uzyskanie wglądu w jego funkcję. W tym miejscu opisujemy protokół endogennego znakowania setek białek Trypanosoma brucei równolegle, tak aby możliwe było znakowanie skali genomu.

Wysokoprzepustowe znakowanie genów u Trypanosoma brucei

Improvements in mass spectrometry, sequencing and bioinformatics have generated large datasets of potentially interesting genes. Tagging these proteins ...

Ogólnym celem tej metody jest wysokoprzepustowe znakowanie białek w Trypansoma brucei. Metoda ta może pomóc w odpowiedzi na kluczowe pytania w dziedzinie kinetoplastid dotyczące lokalizacji i potencjalnej funkcji dużych grup białek. Główną zaletą tej techniki jest możliwość szybkiego i łatwego równoległego znakowania znacznej liczby białek.Chociaż metoda ta może dostarczyć informacji na temat lokalizacji, oddziaływania dużych grup białek można badać również przy użyciu innych znaczników. Przykładem jest znacznik BirA stosowany w eksperymentach mapowania bliskości Bio-ID. Procedurę zaprezentuje Ross Madden, asystent badawczy z naszego laboratorium.Przed rozpoczęciem tej procedury należy uprzednio zamrozić blok chłodzący do PCR z 96 dołkami w zamrażarce o temperaturze -80 °C. Przygotuj Master Mix A, łącząc w probówce o pojemności 10 ml następujące składniki: 100 µL destylowanej wody dejonizowanej, 105 µL DMSO klasy PCR, 105 µL 10 mM dNTPs oraz 105 µL matrycy pPOT.Nalej Master Mix A do zbiornika na odczynniki i odmierz 23 µL Master Mix A do każdej studni płytki PCR z 96 studniami. Używając 12-kanałowej pipety wielokanałowej P20, dodaj 2 µL połączonych starterów o stężeniu 100 µM do każdej wypełnionej studni. Uszczelnij płytkę folią.Umieść go w schłodzonym chłodniku do PCR i pozostaw do zamrożenia na minimum 20 minut w temperaturze -80°C. Zamrożenie PCR Master Mix A jest kluczowe dla zapewnienia wydajnej reakcji hot start, nawet przy zastosowaniu specyficznej polimerazy hot start. Pozwala to na uzyskanie powtarzalnej amplifikacji o wysokiej wydajności.Podczas gdy płytka PCR znajduje się w zamrażarce, przygotuj Master Mix B. Połącz następujące składniki w probówce o pojemności 10 ml: 2 048 µL wody destylowanej i dejonizowanej, 525 µL buforu 10X oraz 52,5 µL polimerazy, aby uzyskać całkowitą objętość 2 626 µL na płytkę. Wyjmij płytkę PCR oraz chłodniczkę do PCR z zamrażarki o temperaturze -80 °C.Gdy płytka wciąż znajduje się w chłodnice do PCR, szybko dodaj 25 µl Master Mix B na zamrożony Master Mix A w każdej studzience, tak aby całkowita objętość reakcji wynosiła 50 µL. Jest to krok krytyczny czasowo i musi zostać wykonany przed rozmrożeniem Master Mix A. Uszczelnij płytkę folią.Ustaw parametry termocyklera w następujący sposób: 94 °C przez 10 minut, następnie 30 cykli obejmujących 94 °C przez 15 sekund, 65 °C przez 30 sekund i 72 °C przez dwie minuty, a na koniec etap końcowej elongacji w temperaturze 72 °C przez siedem minut. Po osiągnięciu przez blok temperatury 94 °C, umieść płytkę PCR w termocyklerze i uruchom program amplifikacji.Procedurę należy rozpocząć od przygotowania dużego żelu agarozowego 1% w buforze do elektroforezy Tris-octan EDTA lub TAE, z czterema rzędami studzienek. Do pierwszej i 28. studzienki każdego rzędu należy nanieść marker DNA 1 kb. W następnym kroku należy przenieść dwa mikrolitry produktu PCR bezpośrednio, bez użycia buforu do nakładania DNA, do poszczególnych ścieżek żelu, zgodnie z przedstawionym tutaj schematem.Na przykład produkty PCR z rzędów A i B płytki PCR nanosi się odpowiednio do nieparzystych i parzystych ścieżek pierwszego rzędu żelu. Pracując szybko, aby zminimalizować ryzyko zanieczyszczenia amplikonów, nanieś produkty PCR z rzędu A płytki PCR do nieparzystych ścieżek pierwszego rzędu żelu. Następnie nanieś produkty PCR z rzędu B płytki PCR do parzystych ścieżek pierwszego rzędu żelu.Załaduj produkty PCR z rzędów C i D płytki PCR, stosując ten sam schemat: rząd C do nieparzystych ścieżek, a rząd D do parzystych ścieżek w drugim rzędzie żelu. Kontynuuj ładowanie według tego schematu, aż wszystkie studzienki z płytki PCR zostaną przeniesione na żel. Umieść żel w komorze elektroforetycznej i wypełnij ją buforem TAE do momentu całkowitego zanurzenia żelu.Elektroforezę prowadzono przy napięciu 100 V przez 30 minut. Wizualizacji dokonano przy użyciu transiluminatora UV. Przedstawiono reprezentatywny żel agarozowy do walidacji PCR w 96-dołkowym formacie, w którym 95 z 96 reakcji PCR zakończyło się powodzeniem.Nieudaną reakcją PCR była próbka H11. W tej procedurze wykorzystuje się linię komórkową SMOXP9 procyklicznej formy Trypanosoma brucei. Hoduj komórki do odpowiedniej gęstości, zgodnie z opisem w tekście protokołu, a następnie zbierz wymaganą liczbę komórek poprzez wirowanie przy 800 g przez 10 minut.Rozpocznij przygotowania do elektroporacji podczas wirowania komórek. Podłącz manipulator do płytek do elektroporatora. W urządzeniu do elektroporacji ustaw napięcie na 1 500 V, czas trwania impulsu na 100 µs, liczbę impulsów na 12 oraz odstęp między impulsami na 500 ms.W manipulatorze płytek ustaw liczbę impulsów na jeden. Używając 12-kanałowej pipety wielokanałowej P200, przenieś reakcje PCR z płytki PCR do jednorazowej płytki do elektroporacji z 96 dołkami. Przemyj komórki w 10 milliliters zmodyfikowanego cytomixu i ponownie odwiruj przy 800 ×g przez 10 minut.Resuspender komórki w 23 mililitrach zmodyfikowanego cytomixu, aby uzyskać stężenie końcowe 5 × 10⁷ komórek na mililitr. Przenieść zawiesinę komórkową do zbiornika na odczynniki. Pipetować 200 µL roztworu komórek do każdej studni płytki do elektroporacji i wymieszać z produktem PCR za pomocą pipety.Użyj chusteczki, aby usunąć wszelkie kropelki z górnej części płytki, aby uniknąć zwarć. Nałóż folię uszczelniającą na górną część płytki do elektroporacji, pozycjonując ją tak, aby otwory na elektrody na górze i na dole każdej kolumny pozostały odsłonięte. Unikaj zakrywania wypukłych punktów służących do prowadzenia folii.Umieść płytkę do elektroporacji w manipulatorze płytek i zamknij pokrywę. Naciśnij przycisk „pulse” na urządzeniu do elektroporacji. Po elektroporacji komórki należy szybko przenieść do czterech 24-dołkowych płytek hodowlanych, w których każdy dołek zawiera 1 ml pożywki SDM-79 w celu rekonwalescencji.Użyć 12-kanałowej pipety wielokanałowej P200 z pominięciem co drugiej końcówki, tak aby pozostałe sześć końcówek pokrywało się z sześcioma rzędami na 24-dołkowej płytce do hodowli tkanek. Po przeniesieniu komórek z płytki 96-dołkowej na płytkę 24-dołkową, przemyć dołki w płytce 96-dołkowej pożywką z odpowiadających im dołków w płytce 24-dołkowej. Następnie przenieść płuczkę z powrotem do dołków w płytce 24-dołkowej.Przenieś elektroporowane komórki z 96-dołkowej płytki do elektroporacji do 24-dołkowych płytek do hodowli tkanek zgodnie z określonym wcześniej schematem przedstawionym tutaj. Na przykład komórki z nieparzystych dołków w rzędzie A płytki 96-dołkowej przenosi się do rzędu A płytki A, natomiast komórki z parzystych dołków w rzędzie A płytki 96-dołkowej przenosi się do rzędu A płytki C. Po każdym przeniesieniu komórek z płytki 96-dołkowej do płytki 24-dołkowej przemyj dołki w płytce 96-dołkowej pożywką z odpowiadającego rzędu płytki 24-dołkowej. Następnie przenieś płuczkę z powrotem do płytki 24-dołkowej.Przenoszenie komórek do płytek 24-dołkowych może być mylące, jednak konieczne jest dokładne przypisanie uzyskanych linii komórkowych do odpowiedniego identyfikatora genu. Kluczowe jest szybkie wykonanie tego kroku, aby zachować żywotność komórek. Po przeniesieniu wszystkich elektroporowanych komórek do czterech płytek 24-dołkowych, należy umieścić płytki w czystym plastikowym pudełku z dopasowaną, szczelną pokrywą. Pudełko należy umieścić w inkubatorze w temperaturze 28 °C.Od sześciu do ośmiu godzin później do każdej studni należy dodać jeden mililitr SDM-79 z 10% FCS zawierającego antybiotyk selektywny. Inkubować w temperaturze 28°C przez od dziewięciu do 10 dni, aż linie komórkowe transgeniczne staną się widoczne. Po transfekcji w płytce 96-dołkowej w celu znakowania 96 różnych białek na terminie końcowym, komórki przenosi się do 24-dołkowych płytek hodowlanych w celu rekonwalescencji i selekcji.Następnie oceniane są poszczególne studzienki w celu ustalenia, czy zawierają one zdrowe komórki oporne na lek. Zdrowa studzienka zawiera głównie wysoce aktywne komórki, które są jasne w mikroskopii kontrastowej. Na tym schemacie kolor zielony oznacza studzienkę z udaną transfekcją, a kolor szary oznacza studzienkę zawierającą wyłącznie martwe komórki.88 z 96, czyli 92% studzienek, zawiera pomyślnie przetransfekowane pasożyty po 15 dniach selekcji. Po opanowaniu metody, czas od policzenia komórek do ich wysiania po elektroporacji wyniesie około godziny. Podczas wykonywania tej procedury należy pamiętać o dodaniu leków selekcyjnych od sześciu do ośmiu godzin po transfekcji.Po obejrzeniu tego filmu powinni Państwo posiadać gruntowną wiedzę na temat sposobu znakowania dużych kohort białek u *Trypanosoma brucei*.

high-throughput-gene-tagging-in-trypanosoma-brucei

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologia i infekcje

Telomery są niezbędne dla stabilności chromosomów, a struktura nawisu G telomeru jest kluczowa dla utrzymania telomerów za pośrednictwem telomerazy. Wprowadziliśmy niedawno dwie metody wykrywania struktury nawisu G telomeru w Trypanosoma brucei, którymi są natywna hybrydyzacja w żelu oraz wydłużanie startera za pomocą ligacji, które zostaną w niniejszym opracowaniu opisane.

Badanie struktury G-overhangu telomerów w Trypanosoma brucei

Tutaj przedstawiamy metodę wykorzystania szczepów Δku80 typu I i II Toxoplasma gondii do efektywnego generowania docelowych delecji genów i zamienników genów do funkcjonalnej analizy genomowej.

Manipulacja genetyczna w szczepach Δku80 do funkcjonalnej analizy genomowej Toxoplasma gondii

Dynamika glikosomów w afrykańskich trypanosomach jest trudna do zbadania za pomocą tradycyjnych technik biologii komórki, takich jak mikroskopia elektronowa i fluorescencyjna.  Jako sposób obserwacji dynamicznego zachowania organelli, zastosowano system reporterowy fluorescencyjno-organelli w połączeniu z cytometrią przepływową do monitorowania dynamiki glikosomów w czasie rzeczywistym u żywych pasożytów.

Wykorzystanie białek fluorescencyjnych do monitorowania dynamiki glikosomów w afrykańskim trypanosomie

W tym artykule opisano wysoce czuły test oparty na rybozymie, mający zastosowanie do wysokoprzepustowych badań przesiewowych substancji chemicznych ukierunkowanych na unikalny proces edycji RNA w patogenach trypanosomatidów. Inhibitory mogą być wykorzystywane jako narzędzia do opartej na hipotezach analizy procesu edycji RNA, a ostatecznie jako terapie.

Katalizator RNA jako reporter do badań przesiewowych leków przeciwko edycji RNA w trypanosomach

Ten manuskrypt opisuje użycie bioluminescencyjnego szczepu afrykańskich trypanosomów do śledzenia późnych stadiów infekcji i pokazuje, jak obrazowanie na żywo in vivo może być wykorzystane do wizualizacji infekcji w ośrodkowym układzie nerwowym w czasie rzeczywistym.

Obrazowanie bioluminescencyjne w celu wykrycia późnego stadium zakażenia trypanosomatozą afrykańską

Afrykańskie trypanosomy hodowane in vitro ulegają zmienności antygenowej w niskim tempie, tak że populacje składają się z pasożytów wyrażających dominujący wariant typu glikoproteiny powierzchniowej (VSG) i małej populacji "przełączonych" wariantów.  Protokół ten opisuje szybką metodę wykrywania i ilościowego określania tych populacji.

Wykrywanie zmiany glikoproteiny powierzchniowej wariantu Trypanosoma brucei za pomocą magnetycznego sortowania komórek i cytometrii przepływowej

Ta metoda oddzielania trypanosomów od krwi zależy od tego, czy ich ładunek powierzchniowy jest mniej ujemny niż u komórek krwi ssaków. Zakażoną krew umieszcza się i poddaje działaniu środka ciężkości na kolumnie wymieniacza anionowego. Ta metoda, najbardziej odpowiednia diagnostyka trypanosomatozy afrykańskiej, dostarcza oczyszczonych pasożytów do badań immunologicznych, biologicznych, biochemicznych, farmaceutycznych i biologii molekularnej.

Oczyszczanie trypanosomów zewnątrzkomórkowych, w tym afrykańskich, z krwi za pomocą wymieniaczy anionowych (kolumny dietyloaminoetylocelulozowe)

Tutaj opisujemy protokół wprowadzania nokautu genu do zewnątrzkomórkowego amastigotu Trypanosoma cruzi za pomocą systemu CRISPR/Cas9. Fenotyp wzrostu może być śledzony albo przez liczenie komórek w aksenowej kulturze amastigotów, albo przez proliferację wewnątrzkomórkowych amastigotów po inwazji komórek gospodarza.

Wprowadzenie nokautu genu bezpośrednio do stadium amastigoty Trypanosoma cruzi za pomocą systemu CRISPR/Cas9

Opisujemy wysokoprzepustowy test kolorymetryczny mierzący aktywność β-galaktozydazy w trzech etapach cyklu życia Trypanosoma cruzi, czynnika wywołującego chorobę Chagasa. Ten test może być używany do identyfikacji związków trypanobójczych w łatwy, szybki i powtarzalny sposób.

In vitro Badania przesiewowe leków przeciwko wszystkim etapom cyklu życia Trypanosoma cruzi przy użyciu pasożytów eksprymujących β-galaktozydazę

To badanie pokazuje szczegółowy protokół do przeprowadzenia mikroskopii ekspansji ultrastruktury w trzech etapach cyklu życia in vitro Trypanosoma cruzi, patogenu odpowiedzialnego za chorobę Chagasa. Uwzględniamy zoptymalizowaną technikę białek cytoszkieletu i znakowania pan-proteomu.

Mikroskopia ekspansji ultrastrukturalnej w trzech etapach cyklu życia Trypanosoma cruzi in vitro

Opisujemy metodę badania, jak pH reaguje na sygnały środowiskowe w glikosomy krwiobiegowej formy afrykańskich trypanosomów. Podejście to obejmuje czujnik białka dziedzicznego wrażliwego na pH w połączeniu z cytometrią przepływową w celu pomiaru dynamiki pH, zarówno jako test przebiegu w czasie, jak i w formacie wysokoprzepustowego badania przesiewowego.

Pomiar dynamicznych zmian pH glikosomalnego u żywego Trypanosoma brucei

Poznaj metodę wysokoprzepustowego znakowania białek u Trypanosoma brucei, umożliwiającą badanie lokalizacji i funkcji protein na dużą skalę. Technika ta wspiera genomowe studia kinetyczne.

Wysokoprzepustowe znakowanie genów u Trypanosoma brucei

Przeglądaj więcej filmów