Współhodowla żywego mikrobiomu z mikroinżynieryjnymi kosmkami jelitowymi człowieka w urządzeniu mikroprzepływowym typu gut-on-a-chip

Ogólnym celem niniejszego protokołu jest zademonstrowanie wzrostu kosmków ludzkich komórek jelitowych w warunkach przepływu i ruchów przypominających perystaltykę w mikroprzepływowym urządzeniu typu gut-on-a-chip, a także pokazanie sposobu kokultury tych komórek z żywym mikrobiomem jelitowym. Metoda ta może pomóc w rozwiązaniu kluczowych problemów w dziedzinie gastroenterologii, mikrobiologii klinicznej i nauk farmaceutycznych w celu zidentyfikowania mechanizmów chorobowych oraz walidacji skuteczności i toksyczności nowych związków leków. Główną zaletą tej techniki jest możliwość stworzenia przez badaczy żywego i funkcjonalnego ekosystemu mikrobiomu ludzkiego jelita in vitro przy użyciu systemu mikrofizjologicznego.

Zastosowanie tej techniki może zostać rozszerzone na choroby takie jak wrzodziejące zapalenie jelita grubego lub choroba Leśniowskiego-Crohna, ponieważ stabilna kokultura komórek gospodarza z mikrobiomem może naśladować złożoność tych schorzeń. Chociaż metoda ta pozwala na wgląd w skomplikowane oddziaływania między mikrobiomem jelitowym a układem odpornościowym w jelitach, może ona zostać zastosowana również w odniesieniu do innych układów narządowych, w których zachodzą interakcje między mikroorganizmami a gospodarzem, takich jak skóra, drogi rodne lub jama ustna. W celu rozpoczęcia pracy należy przygotować mikrofluidyczne urządzenie gut-on-a-chip zgodnie z opisem zawartym w towarzyszącym protokole tekstowym.

Urządzenie składa się z przezroczystego, przepuszczalnego dla gazów polimeru silikonowego zawierającego dwa równoległe mikrokanały, oddzielone elastyczną, porowatą membraną z PDMS. Po obu stronach kanałów znajdują się komory próżniowe, które mogą być wykorzystywane do przykładania cyklicznego naprężenia mechanicznego. Sterylizację urządzenia przeprowadza się, przepływając 70% ethanol przez kanały za pomocą strzykawki o pojemności jednego mililitra.

Następnie wysuszyć urządzenie w suszarce w temperaturze 60 °C przez noc. Następnego dnia poddać mikrosystem jelita-na-chipie wraz z podłączonymi rurkami jednoczesnemu działaniu światła UV i ozonu przez 40 minut. Schłodzić urządzenie, pozostawiając je pod światłem UV w komorze z laminarnym przepływem powietrza przez 15 minut.

Następnie nabierz 100 µL roztworu kodującego macierz zewnątrzkomórkową do strzykawki o pojemności 1 mL i wprowadź go do górnego mikrokanału urządzenia. Powtórz tę procedurę, aby pokryć również dolny mikrokanał. Cały układ umieść na jedną godzinę w inkubatorze z nawilżeniem, w temperaturze 37 °C i przy stężeniu 5% CO2.

Podczas inkubacji odgazuj uprzednio ogrzaną kompletną pożywkę hodowlaną, przepuszczając ją przez filtr 0,45 mikrona w systemie filtracyjnym o pojemności 50 ml przez jedną minutę. Delikatnie opukaj przefiltrowaną pożywkę przez jedną minutę, aby usunąć wszelkie pęcherzyki powietrza lub rozpuszczone gazy z pożywki. Następnie przenieś odgazowaną kompletną pożywkę do dwóch jednorazowych strzykawek o pojemności 3 ml i inkubuj strzykawki przez jedną godzinę.

Następnie podłącz strzykawki do górnego i dolnego mikrokanału układu gut-on-a-chip i wypłucz roztwór kodujący, przepływając pełną pożywkę przez górny i dolny mikrokanały za pomocą delikatnych pulsów. Następnie, używając pompy strzykawkowej, wprowadź odgazowaną, pełną pożywkę do hodowli komórkowej do górnego mikrokanału urządzenia, inkubując chip przez noc w temperaturze 37 °C i 5%CO2. Zbierz w pełni konfluencyjną flasks T75 zawierającą komórki nabłonka jelitowego Caco-2, najpierw płucząc komórki 10 ml PBS pozbawionego wapnia i magnezu.

Następnie odessać PBS i powtórzyć płukanie jeszcze dwa razy. Dalej dodać jeden mililitr 0,05% roztworu Trypsyny-EDTA i inkubować kolbę przez pięć minut w temperaturze 37 °C. Po odklejeniu komórek dodać 10 mililitrów podgrzanej pełnej pożywki do hodowli komórkowej i pipetować zawiesinę komórkową w górę i w dół od trzech do pięciu razy przed przeniesieniem jej do probówki do wirowania.

Odwiruj zawiesinę komórkową. Następnie usuń supernatant i ponownie zawieś komórki w podgrzanym do odpowiedniej temperatury medium kompletnym, zachowując gęstość 150 000 komórek na centymetr kwadratowy. Pobierz 500 µL zawiesiny komórkowej do jednorazowej strzykawki o pojemności 1 mL, wyposażonej w igłę 25G o długości 5/8 cala.

Następnie, przez rurkę wylotową, dozuj 100 µL zawiesiny komórkowej do górnego mikrokanału. Dalej, wszystkie wloty i wyloty połączone z górnym i dolnym mikrokanałem zaciśnij za pomocą żabek biurowych. Inkubuj cały układ przez jedną godzinę, aby umożliwić przyleganie komórek nabłonka jelitowego do powierzchni porowatej membrany.

Następnie zdejmij zaciski i podłącz rurkę górnego kanału do strzykawki wypełnionej pożywką hodowlaną, umieszczonej w pompie strzykawkowej. Wznów przepływ pożywki do górnego mikrokanału z prędkością 30 µL/h, aż komórki utworzą nienaruszoną warstwę jednowarstwową. Po uformowaniu się monowarstwy komórkowej podłącz dolny kanał do drugiej strzykawki i perfunduj pożywkę hodowlaną zarówno do górnego światła, jak i do dolnych mikrokanałów kapilarnych z tą samą prędkością przepływu wynoszącą 30 µL/h.

Aby wywołać ruch przypominający perystalsę w chipie, najpierw włącz pompę próżniową. Połącz komory próżniowe urządzenia z kontrolerem próżni za pomocą rurki z łącznikiem ze stali nierdzewnej. Następnie ustaw kontroler tak, aby generował cykliczny ruch rozciągający w formie sygnału sinusoidalnego, stanowiący 10% średniego odkształcenia komórki przy częstotliwości 0,15 Hertz, a następnie kliknij start.

Kontynuuj przepływ pożywki hodowlanej do górnego i dolnego mikrokanału w obecności deformacji mechanicznych przez co najmniej 80 godzin, aby indukować wzrost kosmków. Przygotuj mieszaninę Autoclaved Lactobacilli MRS Broth oraz Reinforced Clostridial Medium w stosunku 50/50. Następnie resuspenduj liofilizowaną mieszankę bakterii probiotycznych w 10 mililitrach tej mieszaniny.

Zmierz gęstość optyczną mieszaniny przy 600 nanometrach i dostosuj końcową gęstość komórek do około 0,2 jednostek gęstości optycznej. Odmierz trzy mililitry dostosowanej zawiesiny komórek drobnoustrojów do jednorazowych sterylnych probówek o pojemności 10 mililitrów. Umieść alikwoty w pojemniku beztlenowym i dodaj do pojemnika dwa opakowania saszetek generujących gaz beztlenowy.

Szczelnie zamknij pokrywkę pojemnika i inkubuj go w inkubatorze przez noc, bez wstrząsania. Następnie przygotuj odgazowane pożywkę do hodowli komórkowej bez antybiotyków i nabierz ją do jednorazowych strzykawek o pojemności trzech mililitrów. Przenieś urządzenie gut-on-a-chip zawierające mikroinżynieryjne kosmki do komory z laminarnym przepływem powietrza.

Usuń strzykawki podłączone do górnych i dolnych mikrokanałów urządzenia i zastąp je strzykawkami zawierającymi odgazowane, wolne od antybiotyków pożywki do hodowli komórkowej. Po zakończeniu tej czynności umieść urządzenie z powrotem w inkubatorze CO2. Następnie przepuszczaj pożywkę do hodowli bez antybiotyków przez urządzenie przez 12 godzin przed osadzeniem mikrobiomu.

Następnie odwirować mieszaninę uprzednio hodowanych komórek bakterii probiotycznych. Odessać naddatek, a następnie zawiesić bakterie ponownie w medium DMEM bez antybiotyków. Nabrać około 100 µL tej zawiesiny komórkowej do strzykawki o pojemności jednego mililitra z założoną igłą 25G o długości 5/8 cala.

Wprowadź bakterie do strony światła mikrokanału zawierającego uprzednio wolne od drobnoustrojów kosmki jelitowe. Pozostaw komórki mikrobiologiczne na półtorej godziny bez przepływu, poprzez zaklemowanie rurek, aby mogły one przywrzeć do powierzchni apikalnej kosmków jelitowych. Następnie przeprowadź perfuzję podgrzanej wcześniej pożywki hodowlanej bez antybiotyków do obu mikrokanałów (górnego i dolnego) z prędkością 40 µL na godzinę, stosując cykliczne odkształcenia rytmiczne.

Niniejszy protokół kokultury umożliwia stabilną kolonizację wielu gatunków bakterii probiotycznych w przestrzeni międzypłowej. Żywe mikrokolonie bakteryjne mogą być utrzymywane w kokulturze przez okres do dwóch tygodni. Przedstawiono tutaj inną kokulturę składającą się zarówno z E.coli znakowanej GFP, jak i kosmków jelitowych.

Powiększenie o wysokiej rozdzielczości wyraźnie pokazuje rozmieszczenie mikrokolonii bakteryjnych w 72. godzinie. Podczas wykonywania tej procedury należy pamiętać, aby delikatnie i powoli wstrzykiwać pożywkę do kanałów mikroprzepływowych, aby uniknąć uszkodzenia monowarstwy komórek nabłonkowych w wczesnych etapach hodowli. W oparciu o tę metodę, zastosowanie kokultury z ludzkimi komórkami odpornościowymi może również dostarczyć informacji na temat interakcji mikrobiomu z układem odpornościowym oraz jego wpływu na homeostazę i optymalny stan zdrowia jelit.

Po obejrzeniu tego filmu powinni Państwo dobrze rozumieć, jak odtworzyć mikrośrodowisko ludzkiego jelita oraz jak przeprowadzić hodowlę współdzieloną mikrobiomu i ludzkich kosmków jelitowych in vitro. Praca z bakteriami patogennymi i ludzkimi komórkami jest niezwykle niebezpieczna, dlatego należy pamiętać o pracy w komorze bezpieczeństwa biologicznego.