Name: Konkurencyjne przeszczepy w celu oceny sprawności hematopoetycznych komórek macierzystych (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-08-31T13:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 53 s
Description: Poznaj metodę konkurencyjnych przeszczepów szpiku kostnego myszy do oceny sprawności hematopoietycznych komórek macierzystych in vivo. Technika ta nie wymaga sortowania komórek i pozwala badać mechanizmy samoodnawiania.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Jesteśmy wdzięczni Roxann Hétu-Arbour za pomoc przy projektowaniu figur i demonstracji procedur. Badania w laboratorium zostały wsparte nagrodą Transition Award od Cole Foundation, grantem Discovery nr 419226-2012 od Natural Sciences and Engineering Research Council of Canada (NSERC) oraz Canada Foundation for Innovation (grant CFI Leaders Fund nr 31377). KMH jest Chercheur-Boursier Junior w Fonds de recherche du Québec - Santé (FRQS).

Wszystkie procedury opisane w tym protokole zostały zatwierdzone przez instytucjonalną komisję etyki zwierząt i są zgodne z wytycznymi Kanadyjskiej Rady ds. Opieki nad Zwierzętami.
Uwaga: Aby utrzymać sterylne/wolne od patogenów warunki przetrzymywania, przeprowadź wszystkie procedury związane z bezpośrednim obchodzeniem się z żywymi myszami w komorze bezpieczeństwa biologicznego lub okapie z przepływem laminarnym. Czyścić lub sterylizować klatki, urządzenia krępujące, materiały inwentarskie, karmę i wodę dostarczaną zwierzętom w odpowiedni sposób. Do wstrzykiwań i pobierania próbek krwi należy używać wyłącznie sterylnych, jednorazowych igieł. Technika aseptyczna ma kluczowe znaczenie podczas przygotowania przeszczepu.
1. Przygotowanie myszy biorcy
<ol>
	<li>Zidentyfikuj myszy biorców z nacięciami w uszach (lub inną metodą zatwierdzoną przez lokalną komisję etyczną ds. zwierząt8), aby umożliwić indywidualną obserwację rekonstytucji krwi obwodowej i szpiku kostnego w czasie. Zważ myszy w celu obserwacji po przeszczepie. Używaj myszy biorców, które mają od 7 do 12 tygodni (mniej niż 25 g). 
	Uwaga: W podanym przykładzie myszy biorcy CD45.1 + CD45.2 + zostały wyhodowane w domu przez skrzyżowanie myszy C57Bl / 6 z kongeniczną B6. Myszy SJL.</li>
	<li>Napromienij myszy biorców dwiema dawkami 450 rad w celu zniszczenia aktywności krwiotwórczej. Pierwszą dawkę należy podać dzień przed przeszczepieniem, a drugą 1-2 godziny przed przeszczepieniem. 
	Uwaga: Promieniowanie rentgenowskie lub gamma może być używane w zależności od dostępności odpowiednich urządzeń.</li>
</ol>
2. Przygotowanie komórek szpiku kostnego dawcy i konkurenta
<ol>
	<li>Eutanazja dawcy (test i kontrola; CD45.2+) i konkurenta (CD45.1+; Klasa B6. SJL) myszy przez uduszenie CO2 , a następnie zwichnięcie szyjki macicy lub przy użyciu metod zatwierdzonych przez lokalną komisję etyki zwierząt.</li>
	<li>Umieść myszy na plecach, z szeroko rozstawionymi nogami, na pustej szalce Petriego lub na sterylnej gazie (aby utrzymać powierzchnię roboczą w czystości) w komorze bezpieczeństwa biologicznego. Zwilżyć skórę i sierść 70% etanolem/30% H2O (v/v).</li>
	<li>Odetnij stopę ostrzem chirurgicznym lub ostrymi nożyczkami. Rozetnij skórę wzdłuż nogi i odciągnij skórę za pomocą ząbkowanych kleszczy. Odetnij nadmiar mięśni.</li>
	<li>Zwichnąć kość udową, ciągnąc za kość nogi i używając ostrzy nożyc do kości miednicy jako siły przeciwnej. Odłącz kość piszczelową i udową od rzepki i usuń pozostałe fragmenty mięśni i ścięgien. Umieść kości w 2-3 ml sterylnego roztworu soli fizjologicznej buforowanej fosforanami (PBS) na 6-dołkowej płytce do hodowli tkankowej.</li>
	<li>Zebrać komórki szpiku kostnego, przepłukując kości 5 ml sterylnego PBS.
	<ol>
		<li>Delikatnie przytrzymać kość kleszczami i włożyć igłę 25 G dołączoną do napełnionej strzykawki o pojemności 1 ml do jednego końca kości. Nacisnąć tłok i zebrać komórki w stożkowej probówce o pojemności 15 ml. Powtarzaj w razie potrzeby, aż środek kości będzie biały.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Dysocjuj komórki przez wielokrotne przechodzenie przez igłę, aby uzyskać zawiesinę pojedynczej komórki. Unikaj pęcherzyków i nadmiaru siły. Uwaga: Na tym etapie użyj nieco większej igły (22 G), aby poprawić żywotność komórek.</li>
	<li>Przepuść komórki przez nylonowe sitko o średnicy 70 μm, aby zapewnić równomierne zawieszenie komórek oraz usunąć zanieczyszczenia i grudki.</li>
	<li>Usuń podwielokrotność do zliczania komórek za pomocą hemocytometru. Odwirować pozostałą zawiesinę komórek o sile 200 x g przez 5 minut w temperaturze 4 °C. W sterylnym PBS (10-8 komórek/ml) ponownie dostosować gęstość komórek. Utrzymuj komórki na lodzie.</li>
</ol>
3. Ustalanie odpowiedników komórek dawcy HSC
<ol>
	<li>Przenieść ekwiwalent 3 x 106 komórek (30 μl) do probówki z polistyrenu o okrągłym dnie o pojemności 5 ml w celu barwienia metodą cytometrii przepływowej. Dodać równą objętość nieznakowanego przeciwciała przeciwko CD16/CD32 w celu zablokowania nieswoistego barwienia (rozcieńczonego w buforze barwiącym (PBS uzupełniony 0,1% albuminą surowicy bydlęcej (BSA) i 1 mM EDTA) dla końcowego stężenia 2,5 μg/ml). Inkubować 5 minut w temperaturze pokojowej.</li>
	<li>Dodać 90 μl mieszaniny głównej przeciwciał sprzężonych z fluorochromem przygotowanej w buforze barwiącym: biotynylowany koktajl Lineage (B220, CD3e, CD11b, GR1, Ter119), Sca1, CD117, CD135, CD150. Inkubować na lodzie przez 30 minut, chronić przed światłem. 
	Uwaga: Dla każdej partii przeciwciał należy oznaczyć odpowiednie rozcieńczenia. Zobacz tabelę materiałów, aby zapoznać się z rozcieńczeniami użytymi w tym badaniu.</li>
	<li>Dodać 2 ml buforu barwiącego do komórek, wirować i odwirowywać przy 200 x g przez 5 minut w temperaturze 4 °C w celu usunięcia niezwiązanego przeciwciała. Zdekantować supernatant i ponownie zawiesić osad przez strzepnięcie.</li>
	<li>Dodać 10 μl streptawidyny sprzężonej z fluorochromem rozcieńczonej w buforze barwiącym (patrz tabela materiałów). Inkubować na lodzie przez 20 minut, chronić przed światłem. Umyć jak w kroku 3.3, aby usunąć niezwiązaną streptawidynę.</li>
	<li>Pobrać próbki komórek za pomocą cytometru przepływowego z co najmniej sześcioma detektorami9. Określić częstość występowania komórek Lin-Sca1+ CD117+ CD135-CD150+ (szacowane HSC) w każdej próbce, korzystając z szablonu analitycznego pokazanego na rysunku 2 i jak wcześniej podawano10,11. 
	Uwaga: Częstość występowania funkcjonalnych HSC w tej populacji można oszacować w zakresie od 1/3 do 1/52,12.</li>
	<li>Ustal szacunkowe ekwiwalenty HSC dla wszystkich prób11, używając jednej próbki (zazwyczaj konkurenta, B6. SJL CD45.1+ w tym przykładzie) jako linię bazową, jak opisano poniżej i na rysunku 2.
	<ol>
		<li>Oblicz wymaganą liczbę komórek, korzystając z następujących wzorów: 
		#transplanted HSC / biorca = 5 x 105 komórek x szacowana częstość HSC (określona dla próbki wyjściowej; liczba ta wynosi zwykle od 75 do 125 dla myszy typu dzikiego C57Bl / 6) 10-12, 
		Uwaga: Na rysunku 2 dla próbki A wynik to 139 HSCs. 
		Całkowita liczba # przeszczepionych komórek (dla innych próbek; Na przykład. Próbka B na rysunku 2) = # przeszczepione HSC/częstotliwość HSC. 
		Uwaga: Na rysunku 2 dla próbki B wynik to 197 826 (lub około 2 x 105) całkowitych komórek szpiku kostnego.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Obliczyć całkowitą liczbę komórek wymaganych na biorcę przeszczepu dla każdej próbki, korzystając z wyników uzyskanych powyżej. 
	Uwaga: Liczba ta powinna wynosić 5 x 105 dla próby podstawowej (konkurenta).
	<ol>
		<li>Pomnóż liczbę uzyskaną w kroku 3.7 przez liczbę myszy biorców i dodaj wystarczającą ilość komórek dla co najmniej dwóch dodatkowych myszy, aby skompensować martwą objętość w strzykawce.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Wymieszać komory konkurencyjne (np. CD45.1+) i testowe (CD45.2+) w stosunku 1:1 równoważnym HSC, jak obliczono w kroku 3.6 i dostosować końcową objętość do 200 μl na wstrzyknięcie przy użyciu sterylnego PBS. 
	Uwaga: Dla grupy pięciu myszy biorców sugerowana objętość wynosiłaby zatem co najmniej 1,4 ml, zawierająca 3,5 x 106 konkurencyjnych komórek szpiku kostnego (lub 973 szacowane HSC dla próbki A na rysunku 2) i równoważną liczbę komórek testowych (na rysunku 2 odpowiednik dla próbki B wynosiłby 197 826 x 7 = 1 384 782 komórek szpiku kostnego).</li>
</ol>
4. Przeszczepy szpiku kostnego
<ol>
	<li>Rozgrzej myszy biorcy napromieniowane w kroku 1.2 czerwoną lampą grzewczą, aby zapewnić rozszerzenie naczyń krwionośnych i zwiększyć widoczność bocznych żył ogonowych.</li>
	<li>Przygotować strzykawkę tuberkulinową o pojemności 1 ml wyposażoną w igłę o pojemności 27 g (lub mniejszą). Odessać około 750 μl przygotowanej zawiesiny komórkowej (dla 3 myszy biorców). Upewnij się, że w strzykawce nie ma pęcherzyków powietrza.</li>
	<li>Włóż mysz do urządzenia krępującego. Zbadaj ogon i poszukaj bocznych żył ogonowych, które powinny być wyraźnie widoczne po obu stronach ogona. Przetrzeć miejsce wstrzyknięcia alkoholem etylowym. Wprowadzić igłę pod skosem do góry, równolegle do skóry i delikatnie nacisnąć tłok. Wstrzyknięcie powinno być łatwe. Jeśli wymagana jest siła, igła nie znajduje się w żyle. 
	Uwaga: Starsze myszy mają grubszą skórę, co może utrudniać znalezienie żyły. Jeśli igła nie znajduje się w żyle, należy ją ponownie wprowadzić proksymalnie do miejsca początkowego wstrzyknięcia.</li>
	<li>Wyjąć igłę i uciskać miejsce wstrzyknięcia jałową gazą przez kilka sekund, aby zatamować krwawienie. Przenieś mysz do czystej klatki. 
	Uwaga: Użyć tej samej strzykawki i igły do trzech wstrzyknięć, po których igła może stać się zbyt.</li>
	<li>W celu obserwacji po przeszczepie wstrzyknij podskórnie 1 ml sterylnego PBS, aby nawodnić myszy przez pierwsze pięć dni. Dodaj antybiotyki do wody pitnej, aby zapobiec infekcjom (w razie potrzeby; opcjonalnie). Waż myszy co dwa do trzech dni przez pierwsze trzy tygodnie i poddaj eutanazji myszy, które straciły więcej niż 15-20% swojej masy ciała przed przeszczepem (lub zgodnie z ustaleniami lokalnej komisji etyki zwierząt).</li>
</ol>
5. Analiza krwi obwodowej
<ol>
	<li>Zbierz kroplę krwi (ok. 50-100 μl) do probówek EDTA.
	<ol>
		<li>Aby pobrać krew z żyły żuchwy, użyj lancetu lub igły 22 G, aby przekłuć skórę twarzy w pobliżu bezwłosego miejsca znajdującego się pod kością żuchwy i umieść rurkę do pobierania kropli krwi13. Krew należy pobrać po 4, 8, 12 i 16 tygodniach od przeszczepu, aby śledzić rekonstytucję w wielu liniach.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Dodać 1 ml świeżo przygotowanego buforu do lizy czerwonych krwinek RT (9 części 0,16 M NH4Cl + 1 część 0,17 M Tris-HCl pH 7,65) do kropli krwi pobranej w kroku 5.1.1. Wymieszać i przenieść próbkę do probówki z polistyrenu o pojemności 5 ml okrągłodennej odpowiedniej do cytometrii przepływowej. Odstawić na 4 minuty w RT.</li>
	<li>Dodaj 4 objętości lodowatego PBS. Wymieszaj, obracając od końca do końca i natychmiast przenieś na lód. Wirować 10 minut przy 200 x g w temperaturze 4 °C.</li>
	<li>Zdekantować supernatant i ponownie zawiesić osad przez strzepnięcie. Supernatant powinien być klarowny i czerwony. Dodać 2 ml buforu barwiącego i krótko przemieszać. Wirować 5 minut przy 200 x g w temperaturze 4 °C.</li>
	<li>Zdekantować supernatant i ponownie zawiesić osad przez strzepnięcie.</li>
	<li>Przystąpić do barwienia metodą cytometrii przepływowej, stosując protokół ogólny opisany w krokach od 3.1 do 3.3 oraz następujące przeciwciała dla mieszaniny wzorcowej: CD45.1, CD45.2, CD3e, CD19, GR1.</li>
	<li>Pobrać próbki komórek za pomocą cytometru przepływowego z co najmniej sześcioma detektorami9. Określ częstość występowania komórek pochodzących od dawcy dla każdej linii (limfocyty B CD19 +, limfocyty T CD3e +,jasne granulocyty GR1) w każdej próbce, korzystając z szablonu analitycznego dostarczonego na rysunku 3 i opublikowanego10,11.</li>
</ol>
6. Analiza rekonstytucji szpiku kostnego
<ol>
	<li>Pobrać komórki szpiku kostnego zgodnie z opisem w punkcie 2. Wybarwić komórki do analizy metodą cytometrii przepływowej, stosując ogólny protokół szczegółowo opisany w krokach od 3.1 do 3.3 oraz następujące przeciwciała dla mieszanki wzorcowej: koktajl linii, Sca1, CD117, CD135, CD150, CD45.1, CD45.2. Wykryj przeciwciała koktajlu linii za pomocą streptawidyny sprzężonej z fluorochromem, jak opisano w kroku 3.4.</li>
	<li>Pobrać próbki komórek za pomocą cytometru przepływowego z co najmniej ośmioma detektorami9. Jeśli dostępnych jest tylko sześć, dodaj CD135 do tego samego kanału co panel pochodzenia, ponieważ komórki CD135 + zostaną wykluczone. Określić częstość występowania HSC Lin-Sca1+ CD117+ CD135- CD150+ pochodzących od dawcy w każdej próbce, korzystając z szablonu analitycznego przedstawionego na rysunku 4 i opublikowanego10.</li>
</ol>

<ol><li>Li, H. W., Sykes, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Emerging+concepts+in+haematopoietic+cell+transplantation%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Immunol%22%5BJournal%5D)">Emerging concepts in haematopoietic cell transplantation.</a> Nat Rev Immunol. 12 (6), 403-416 (2012).</li>
<li>Kiel, M. J., Yilmaz, O. H., Iwashita, T., Terhorst, C., Morrison, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((SLAM+family+receptors+distinguish+hematopoietic+stem+and+progenitor+cells+and+reveal+endothelial+niches+for+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">SLAM family receptors distinguish hematopoietic stem and progenitor cells and reveal endothelial niches for stem cells.</a> Cell. 121 (7), 1109-1121 (2005).</li>
<li>Kim, I., He, S., Yilmaz, O. H., Kiel, M. J., Morrison, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enhanced+purification+of+fetal+liver+hematopoietic+stem+cells+using+SLAM+family+receptors%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Enhanced purification of fetal liver hematopoietic stem cells using SLAM family receptors.</a> Blood. 108 (2), 737-744 (2006).</li>
<li>Mayle, A., Luo, M., Jeong, M., Goodell, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Flow+cytometry+analysis+of+murine+hematopoietic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cytometry+A%22%5BJournal%5D)">Flow cytometry analysis of murine hematopoietic stem cells.</a> Cytometry A. 83 (1), 27-37 (2013).</li>
<li>Rossi, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Less+Is+More%3A+Unveiling+the+Functional+Core+of+Hematopoietic+Stem+Cells+through+Knockout+Mice%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Less Is More: Unveiling the Functional Core of Hematopoietic Stem Cells through Knockout Mice.</a> Cell Stem Cell. 11 (3), 302-317 (2012).</li>
<li>Till, J. E., McCulloch, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+direct+measurement+of+the+radiation+sensitivity+of+normal+mouse+bone+marrow+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Radiat+Res%22%5BJournal%5D)">A direct measurement of the radiation sensitivity of normal mouse bone marrow cells.</a> Radiat Res. 14, 213-222 (1961).</li>
<li>Shen, F. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cloning+of+Ly-5+cDNA%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Cloning of Ly-5 cDNA.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 82 (21), 7360-7363 (1985).</li>
<li><a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+GM+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Laboratory+Animals%22%5BJournal%5D)">Identification of GM mice.</a> Laboratory Animals. 37 (suppl 1), 33-35 (2003).</li>
<li>Rundberg Nilsson, A., Bryder, D., Pronk, C. J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Frequency+determination+of+rare+populations+by+flow+cytometry%3A+A+hematopoietic+stem+cell+perspective%5BTitle%5D)+AND+%22Cytometry+Part+A%22%5BJournal%5D)">Frequency determination of rare populations by flow cytometry: A hematopoietic stem cell perspective.</a> Cytometry Part A. 83A (8), 721-727 (2013).</li>
<li>Abidin, B. M., Owusu Kwarteng, E., Heinonen, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Frizzled-6+Regulates+Hematopoietic+Stem%2FProgenitor+Cell+Survival+and+Self-Renewal%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol%22%5BJournal%5D)">Frizzled-6 Regulates Hematopoietic Stem/Progenitor Cell Survival and Self-Renewal.</a> J Immunol. 195 (5), 2168-2176 (2015).</li>
<li>Heinonen, K. M., Vanegas, J. R., Lew, D., Krosl, J., Perreault, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Wnt4+enhances+murine+hematopoietic+progenitor+cell+expansion+through+a+planar+cell+polarity-like+pathway%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Wnt4 enhances murine hematopoietic progenitor cell expansion through a planar cell polarity-like pathway.</a> PLoS One. 6 (4), e19279(2011).</li>
<li>Oguro, H., Ding, L., Morrison, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((SLAM+family+markers+resolve+functionally+distinct+subpopulations+of+hematopoietic+stem+cells+and+multipotent+progenitors%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">SLAM family markers resolve functionally distinct subpopulations of hematopoietic stem cells and multipotent progenitors.</a> Cell Stem Cell. 13 (1), 102-116 (2013).</li>
<li>Golde, W. T., Gollobin, P., Rodriguez, L. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+rapid%2C+simple%2C+and+humane+method+for+submandibular+bleeding+of+mice+using+a+lancet%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+Anim+%28NY%29%22%5BJournal%5D)">A rapid, simple, and humane method for submandibular bleeding of mice using a lancet.</a> Lab Anim (NY). 34 (9), 39-43 (2005).</li>
<li>Santaguida, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((JunB+protects+against+myeloid+malignancies+by+limiting+hematopoietic+stem+cell+proliferation+and+differentiation+without+affecting+self-renewal%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Cell%22%5BJournal%5D)">JunB protects against myeloid malignancies by limiting hematopoietic stem cell proliferation and differentiation without affecting self-renewal.</a> Cancer Cell. 15 (4), 341-352 (2009).</li>
<li>Czechowicz, A., Kraft, D., Weissman, I. L., Bhattacharya, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+transplantation+via+antibody-based+clearance+of+hematopoietic+stem+cell+niches%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Efficient transplantation via antibody-based clearance of hematopoietic stem cell niches.</a> Science. 318 (5854), 1296-1299 (2007).</li>
<li>Zhang, C. C., Lodish, H. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Murine+hematopoietic+stem+cells+change+their+surface+phenotype+during+ex+vivo+expansion%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Murine hematopoietic stem cells change their surface phenotype during ex vivo expansion.</a> Blood. 105 (11), 4314-4320 (2005).</li>
<li>Benveniste, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intermediate-Term+Hematopoietic+Stem+Cells+with+Extended+but+Time-Limited+Reconstitution+Potential%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Intermediate-Term Hematopoietic Stem Cells with Extended but Time-Limited Reconstitution Potential.</a> Cell Stem Cell. 6 (1), 48-58 (2010).</li>
<li>Fazekasde St Groth, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+evaluation+of+limiting+dilution+assays%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol+Methods%22%5BJournal%5D)">The evaluation of limiting dilution assays.</a> J Immunol Methods. 49 (2), R11-R23 (1982).</li>
<li>Louis, I., Heinonen, K. M., Chagraoui, J., Vainio, S., Sauvageau, G., Perreault, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+signaling+protein+Wnt4+enhances+thymopoiesis+and+expands+multipotent+hematopoietic+progenitors+through+beta-catenin-independent+signaling%5BTitle%5D)+AND+%22Immunity%22%5BJournal%5D)">The signaling protein Wnt4 enhances thymopoiesis and expands multipotent hematopoietic progenitors through beta-catenin-independent signaling.</a> Immunity. 29 (1), 57-67 (2008).</li>
<li>Cui, Y. Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optimal+protocol+for+total+body+irradiation+for+allogeneic+bone+marrow+transplantation+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Bone+Marrow+Transplant%22%5BJournal%5D)">Optimal protocol for total body irradiation for allogeneic bone marrow transplantation in mice.</a> Bone Marrow Transplant. 30 (12), 843-849 (2002).</li>
<li>Benz, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hematopoietic+Stem+Cell+Subtypes+Expand+Differentially+during+Development+and+Display+Distinct+Lymphopoietic+Programs%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Hematopoietic Stem Cell Subtypes Expand Differentially during Development and Display Distinct Lymphopoietic Programs.</a> Cell Stem Cell. 10 (3), 273-283 (2012).</li>
<li>Eppert, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stem+cell+gene+expression+programs+influence+clinical+outcome+in+human+leukemia%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Med%22%5BJournal%5D)">Stem cell gene expression programs influence clinical outcome in human leukemia.</a> Nat Med. 17 (9), 1086-1093 (2011).</li>
<li>McIntosh, B. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nonirradiated+NOD%2CB6.SCID+Il2rgamma-%2F-+Kit%28W41%2FW41%29+%28NBSGW%29+mice+support+multilineage+engraftment+of+human+hematopoietic+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">Nonirradiated NOD,B6.SCID Il2rgamma-/- Kit(W41/W41) (NBSGW) mice support multilineage engraftment of human hematopoietic cells.</a> Stem Cell Reports. 4 (2), 171-180 (2015).</li>
</ol>

Autorzy oświadczają, że nie mają konkurencyjnych interesów finansowych.

Opisany tutaj protokół ma na celu ocenę względnej przydatności HSC dawcy (testowego) w porównaniu ze znanymi konkurencyjnymi HSC. Sytuacja konkurencji zwiększa względną czułość testu (bardziej prawdopodobne jest, że wykryje umiarkowane spadki sprawności komórek macierzystych) i zapewnia wewnętrzną kontrolę techniczną skuteczności napromieniania i iniekcji. Nie należy go jednak stosować jako bezwzględnej miary sprawności HSC; spadek liczby odbudów konkurencyjności nie oznacza automatycznie, że KBZ nie osiągałyby dobrych w...

Hematopoeza to proces regeneracyjny, który zapewnia uzupełnienie komórek krwi, które zostały utracone w wyniku urazu, promieniowania i śmierci komórki. Proces ten jest zapewniony przez hematopoetyczne komórki macierzyste (HSC), które w dużej mierze znajdują się w dorosłym szpiku kostnym. Ponadto hematopoetyczne komórki macierzyste mogą być stosowane w celach terapeutycznych w chorobach autoimmunologicznych, nowotworach hematologicznych i niedoborach odporności1. Istnieje zatem potrzeba lepszego zrozumienia mechanizmów regulujących funkcję HSC, w tym ich ekspansji proliferacyjnej oraz zdolności do dotarcia do szpiku kostnego biorcy i wszczepienia go po przeszczepie. Chociaż ostatnie badania wykazały kilka markerów powierzchniowych komórek, w tym CD150 i CD48 członków rodziny SLAM, w celu prospektywnego wzbogacenia HSC dorosłych i płodowych HSC do około 50% czystości2-4, złotym standardem dla funkcjonalnych HSC pozostaje test repopulacji in vivo w celu określenia ich zdolności do przywrócenia produkcji komórek krwi w napromieniowanym gospodarzu5.
Test repopulacji klonów in vivo został początkowo opracowany przez Tilla i McCullocha6 i od tego czasu został udoskonalony i rozszerzony. Zgodnie z pierwotną definicją, HSC zapewniają produkcję komórek krwi przez całe życie poprzez samoodnawianie i różnicowanie. Przeniesienie HSC do napromieniowanego biorcy pozwala zatem ocenić: ich zdolność do różnicowania się poprzez analizę różnych linii komórek krwi (limfocyty T, limfocyty B, granulocyty, monocyty) oraz ich zdolność do samoodnawiania się poprzez seryjne przeszczepy. Test zwykle obejmuje porównanie funkcjonalności i/lub ilości dwóch populacji HSC, np. komórek pochodzących od dwóch myszy o różnych genotypach lub komórek, które były leczone lub niepoddawane działaniu różnych czynników, które mogą wpływać na utrzymanie lub ekspansję HSC w hodowli. Chimeryzm dawcy, czyli udział przeniesionych HSC dawcy w produkcji komórek krwi, można następnie określić za pomocą analizy cytometrii przepływowej we krwi obwodowej i szpiku kostnym przy użyciu markerów powierzchniowych komórek lub innych metod, które pozwolą odróżnić komórki dawcy od biorcy lub gospodarza. Najczęściej stosowanymi markerami są z pewnością dwa allele genu Ptprc lub antygenu leukocytów7 CD45, które wybraliśmy dla poniższych przykładów.
Test repopulacji klonalnej może być konkurencyjny lub niekonkurencyjny. W warunkach niekonkurencyjnych kontrolne i testowe HSC są przenoszone do oddzielnych myszy biorców, a wynik dla każdego typu komórek będzie niezależny od drugiego. W warunkach konkurencji funkcja zarówno testowych, jak i kontrolnych HSC jest mierzona w odniesieniu do populacji konkurencyjnych HSC. Opisany tutaj protokół wykorzystuje warunki konkurencyjne, ale może być również dostosowany do sytuacji niekonkurencyjnych. Oba podejścia mają swoje zalety i ograniczenia, a my szczegółowo je porównamy w dyskusji. Opisujemy również różne podejścia mające na celu zapewnienie równości w liczbie przeszczepionych HSC, wyjaśniamy, jak dostosować test do oznaczania ilościowego HSC poprzez ograniczenie testu rozcieńczania (LDA) oraz podajemy przykłady zarówno udanych, jak i nieudanych przeszczepów w celu interpretacji wyników.

<table><tbody><tr><td>Probówki mikrotainerowe z K2EDTA</td><td>BD Biosciences</td><td>365974</td><td></td></tr><tr><td>Igła 20 G</td><td>Strzykawka</td><td></td> BD <td>Do pobierania krwi z żyły żuchwowej</td></tr><tr><td>LabQuake Shaker rożen</td><td>Thermo&nbsp; Naukowe</td><td>C415110</td><td></td></tr><tr><td>Oczyszczony anty-mysz CD16/CD32 (klon 2.4G2, blok Fc)</td> <td>BD Biosciences</td><td>553142</td><td>2,50 &mu; g / ml</td></tr><tr><td>Pe-Cy7-sprzężony anty-mysie CD3e (klon 145-2C11)</td><td>eBioscience</td><td>25-0031</td><td>0,25 &mu; g / ml</td></tr><tr><td>PE-sprzężony anty-mysz CD19 (klon 1D3)</td><td>eBioscience</td><td>12-0193</td><td>0,25 &mu; g/ml</td></tr><tr><td>APC-eFluor780 (odpowiednik APC-Cy7)-sprzężony anty-mysz GR1 (klon RB6-8C5)</td><td>eBioscience</td><td>47-5931</td><td>0,25 &mu; g / ml</td></tr><tr><td>FITC-koniugat anty-myszy CD45.1 (klon A20)</td><td>eBioscience</td><td>11-0453</td><td>2.50 &mu; g/ml</td></tr><tr><td>eFluor450-sprzężony anty-mysz CD45.2 (klon 104)</td><td>eBioscience</td><td>48-0454</td><td>1.00 &mu; g / ml</td></tr><tr><td>Biotynylowany anty-ludzki/mysi CD45R (B220) (klon RA3-6B2)</td><td>eBioscience</td><td>13-0452</td><td>1,25 &mu; g/ml</td></tr><tr><td>Biotynylowany anty-mysz CD3e (klon 145-2C11)</td><td>eBioscience</td><td>13-0031</td><td>1,25 &mu; g/ml</td></tr><tr><td>Biotynylowany anty-mysz CD11b (klon M1/70)</td><td>eBioscience</td><td>13-0112</td><td>1.25 &mu; g/ml</td></tr><tr><td>Biotynylowany anty-mysz GR1 (klon RB6-8C5)</td><td>eBioscience</td><td>13-5931</td><td>1,25 &mu; g/ml</td></tr><tr><td>Biotynylowany anty-mysz TER119 (klon TER119)</td><td>eBioscience</td><td>13-5921</td><td>0,625 &mu; g/ml</td></tr><tr><td>V500 streptawidyna</td><td>BD Biosciences</td><td>56149</td><td>0,5 & mu; g/ml</td></tr><tr><td>anty-mysi CD117 (klon 2B8) sprzężony z PE</td> BD <td>Biosciences</td><td>553355</td><td>0,25 & mu; g / ml</td></tr><tr><td>PE-Cy7-sprzężony z mysim Ly6A/E (Sca1) (klon D7)</td> <td>BD Biosciences</td><td>558162</td><td>0,25 & mu; g/ml</td></tr><tr><td>PerCP-eFluor710-sprzężony anty-mysz CD135 (klon A2F10)</td><td>eBioscience</td><td>46-1351</td><td>0,5 &mu; g / ml</td></tr><tr><td>Alexa fluor 647-sprzężony anty-mysz CD150 (klon TC15-12F12.2)</td><td>Biolegend</td><td>115918</td><td>0,625 i mu; g/ml
BD Biosciences i eBioscience nie posiadają tego samego klonu:</td></tr><tr><td>strzykawki tuberkulinowej 1 ml ze strzykawką BD z igłą 27 G</td><td></td><td>309623</td><td></td></tr><tr><td>strzykawki tuberkulinowej 1 ml z igłą 25 G</td><td>Strzykawka BD</td><td>309626</td><td></td></tr><tr><td>70 &mu; m sitko komórkowe</td><td>BD Falcon</td><td>352350</td><td></td></tr></tbody></table>

konkurencyjne przeszczepy w celu oceny sprawności hematopoetycznych komórek macierzystych

Competitive Transplants to Evaluate Hematopoietic Stem Cell Fitness

Złoty standard definicji hematopoetycznej komórki macierzystej (HSC) to komórka, która po przeniesieniu do napromieniowanego biorcy będzie miała zdolność do przywrócenia produkcji komórek krwi na całe życie biorcy. Protokół ten wyjaśnia, jak skonfigurować test funkcjonalny w celu porównania zdolności HSC dwóch różnych populacji komórek, takich jak szpik kostny od myszy o dwóch różnych genotypach, oraz jak analizować myszy biorców za pomocą cytometrii przepływowej. Protokół wykorzystuje odpowiedniki HSC, a nie sortowanie komórek do standaryzacji i omawia zalety i wady obu podejść. Dalej omawiamy różne warianty podstawowego protokołu, w tym przeszczepy seryjne, testy ograniczające rozcieńczanie, testy naprowadzające i przeszczepy niekonkurencyjne, w tym zalety i preferowane zastosowania tych różnych podejść. Testy te mają zasadnicze znaczenie dla badania funkcji HSC i mogą być wykorzystywane nie tylko do badania podstawowych wewnętrznych aspektów HSC w biologii, ale także do opracowywania testów przedklinicznych do przeszczepu szpiku kostnego i ekspansji HSC w hodowli.

Ogólny opis konkurencyjnego modelu przeszczepu, w tym przeszczepów wtórnych (omówionych poniżej), przedstawiono na Ryc. 1. Reprezentatywną analizę HSC z szpiku kostnego przed przeszczepem można znaleźć na Ryc. 2. Bardziej szczegółowe informacje na temat wykluczania dubletów i martwych komórek znajdują się w innym źródle9.
Rysunki 3 i 4 przedstawiają p...

Ten protokół zawiera instrukcje krok po kroku dotyczące przeprowadzania konkurencyjnych eksperymentów z przeszczepem szpiku kostnego myszy w celu zbadania funkcji krwiotwórczych komórek macierzystych/progenitorowych bez wcześniejszego oczyszczania komórek macierzystych przez sortowanie komórek.

Konkurencyjne przeszczepy w celu oceny sprawności hematopoetycznych komórek macierzystych

The gold standard definition of a hematopoietic stem cell (HSC) is a cell that when transferred into an irradiated recipient will have the ability to ...

Ogólnym celem tego eksperymentu jest określenie sprawności hematopoietic stem cells szpiku kostnego in vivo przy użyciu konkurencyjnego testu transplantacyjnego. Metoda ta pozwala odpowiedzieć na kluczowe pytania w dziedzinie biologii komórek macierzystych i transplantacji komórek krwiotwórczych dotyczące wpływu różnych manipulacji na samoodnowienie komórek macierzystych po przeszczepie. Głównymi zaletami tej techniki są ograniczona liczba wymaganych zwierząt oraz brak konieczności sortowania komórek.Choć metoda ta może dostarczyć wiedzy na temat funkcji komórek macierzystych, może być również użyteczna w innych dziedzinach, takich jak immunologia, poprzez zastosowanie mieszanych chimer szpiku kostnego. Początkowy rozwój tej techniki w latach 60. XX wieku utorował drogę badaczom z zakresu biologii komórek macierzystych do zgłębiania tożsamości i funkcji hematopoetycznych komórek macierzystych u ludzi i myszy. Procedurę zaprezentują Roxanne Hetu-Arbour, studentka studiów magisterskich w laboratorium, oraz Edward Owusu Kwarteng, doktorant.Zacznij od umieszczenia myszy w komorze bezpieczeństwa biologicznego na platformie chirurgicznej, a następnie zwilż skórę i futro 70% ethanol. Nast

competitive-transplants-to-evaluate-hematopoietic-stem-cell-fitness

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Biologia rozwojowa

Ten manuskrypt zawiera opis metodologii użytej do ustanowienia modeli myszy transdukcyjno-transplantacyjnych. Przedstawiono szczegółowe informacje na temat błędów technicznych, których należy unikać podczas wykonywania przeszczepów szpiku kostnego. Należy uzyskać jasne zrozumienie znaczenia wysokiego miana wirusa, transfekcji/transdukcji i napromieniania.

Mysi model transdukcyjno-transplantacyjny nowotworu mieloproliferacyjnego

Kwantyfikacja komórek pochodzących od dawcy jest wymagana do monitorowania wszczepienia po przeszczepie komórek macierzystych u pacjentów z hemoglobinopatiami. Połączenie sortowania komórek opartego na cytometrii przepływowej, testu tworzenia kolonii i późniejszej analizy krótkich powtórzeń tandemowych można zastosować do oceny proliferacji i różnicowania komórek progenitorowych w przedziale erytroidalnym.

Wykrywanie resztkowych erytroidalnych komórek progenitorowych dawcy po przeszczepieniu krwiotwórczych komórek macierzystych u pacjentów z hemoglobinopatiami

Opisujemy zastosowanie przeszczepu krwiotwórczych komórek macierzystych (HSCT) do oceny potencjału nowotworowego genetycznie modyfikowanych komórek krwiotwórczych. HSCT jest przydatny do oceny różnych złośliwych komórek krwiotwórczych in vivo, a także do generowania dużej kohorty myszy z zespołami mielodysplastycznymi (MDS) lub białaczką w celu oceny nowych terapii.

Zastosowanie przeszczepu krwiotwórczych komórek macierzystych do oceny pochodzenia zespołu mielodysplastycznego

Celem tego protokołu jest wyizolowanie komórek CD34+ naczelnych innych niż człowiek z przygotowanego szpiku kostnego, modyfikowanie genów tych komórek za pomocą wektorów lentiwirusowych oraz przygotowanie produktu do infuzji do autologicznego gospodarza. Łączna długość protokołu wynosi około 48 godzin.

Przygotowanie i modyfikacja genów hematopoetycznych komórek macierzystych i progenitorowych naczelnych

Opisane są protokoły wysoce efektywnej edycji genomu mysich hematopoetycznych komórek macierzystych i progenitorowych (HSPC) przez system CRISPR/Cas9 w celu szybkiego rozwoju mysich systemów modelowych z modyfikacjami genów specyficznymi dla układu krwiotwórczego.

Edycja genomu za pośrednictwem lentiwirusowego CRISPR/Cas9 w celu badania komórek krwiotwórczych w modelach chorobowych

Tutaj opisujemy wiarygodną metodę pomiaru masy mitochondriów i potencjału błonowego w hodowanych ex vivo hematopoetycznych komórkach macierzystych i limfocytach T.

Pomiar masy mitochondrialnej i potencjału błonowego w hematopoetycznych komórkach macierzystych i limfocytach T metodą cytometrii przepływowej

Opisujemy trzy metody przeszczepu szpiku kostnego (BMT): BMT z napromienianiem całego ciała, BMT z napromienianiem ekranowanym oraz metoda BMT bez wstępnego kondycjonowania (adoptywna BMT) do badania hematopoezy klonalnej w modelach mysich.

Procedury przeszczepu szpiku kostnego u myszy w celu zbadania hematopoezy klonalnej

Ten protokół umożliwia utrzymanie w stanie spoczynku ludzkich hematopoetycznych komórek macierzystych in vitro poprzez naśladowanie mikrośrodowiska szpiku kostnego przy użyciu obfitych kwasów tłuszczowych, cholesterolu, niższych stężeń cytokin i niedotlenienia.

Metoda hodowli w celu utrzymania w stanie spoczynku ludzkich hematopoetycznych komórek macierzystych

Ten protokół opisuje doudowe wstrzyknięcie kilku krwiotwórczych lub białaczkowych komórek macierzystych, w tym komórek z edytowanymi genami, w mysich modelach ksenoprzeszczepów, co nie tylko umożliwi szybki i bezpieczny przeszczep komórek, ale także seryjne analizy szpiku kostnego.

Uproszczone iniekcje doudowe przy użyciu żywych myszy pozwalają na ciągłą analizę szpiku kostnego

Zastrzyki doudowe pozwalają na wszczepienie niewielkiej liczby hematopoetycznych komórek macierzystych i progenitorowych (HSPC), poprzez umieszczenie komórek bezpośrednio w jamie szpiku kostnego. Tutaj opisujemy eksperymentalny protokół wstrzykiwania do kości udowej ludzkich HSPC myszom z niedoborem odporności.

Wstrzyknięcie doudowe ludzkich hematopoetycznych komórek macierzystych i progenitorowych myszom z obniżoną odpornością

Tutaj prezentujemy protokół, który integruje technologię CRISPR/Cas9 z testem Cell Counting Kit-8 (CCK-8) w celu identyfikacji genów kandydujących, które są kluczowe dla nieprawidłowej zdolności proliferacyjnej hematopoetycznych komórek macierzystych i progenitorowych.

Ocena nieprawidłowych genów związanych ze wzrostem hematopoetycznych komórek macierzystych i progenitorowych poprzez połączenie technologii CRISPR/Cas9 ze zliczaniem komórek

Poznaj metodę konkurencyjnych przeszczepów szpiku kostnego myszy do oceny sprawności hematopoietycznych komórek macierzystych in vivo. Technika ta nie wymaga sortowania komórek i pozwala badać mechanizmy samoodnawiania.

Konkurencyjne przeszczepy w celu oceny sprawności hematopoetycznych komórek macierzystych

Przeglądaj więcej filmów