Konkurencyjne przeszczepy w celu oceny sprawności hematopoetycznych komórek macierzystych

Ogólnym celem tego eksperymentu jest określenie przydatności hematopoetycznych komórek macierzystych szpiku kostnego in vivo przy użyciu konkurencyjnego testu transplantacyjnego. Metoda ta może więc pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytania z zakresu biologii komórek macierzystych i transplantacji komórek krwiotwórczych dotyczące wpływu różnych manipulacji na samoodnowę komórek macierzystych po przeszczepie. Główną zaletą tej techniki jest to, że wymaga ograniczonej liczby zwierząt i nie wymaga sortowania komórek.

Chociaż metoda ta może zapewnić wgląd w funkcję komórek macierzystych, może być również przydatna w innych dziedzinach, takich jak immunologia, dzięki zastosowaniu mieszanych chimer szpiku kostnego. Początkowy rozwój tej techniki w latach sześćdziesiątych XX wieku utorował drogę naukowcom zajmującym się biologią komórek macierzystych do zbadania tożsamości i funkcji hematopoetycznych komórek macierzystych u ludzi i myszy. Procedurę zademonstrują Roxanne Hetu-Arbour, studentka studiów magisterskich w laboratorium, oraz Edward Owusu Kwarteng, doktorant.

Zacznij od umieszczenia myszy w komorze bezpieczeństwa biologicznego na platformie chirurgicznej i zwilż skórę i sierść 70% etanolem. Następnie chwyć tylną stopę i przetnij skórę wzdłuż nogi. Przystąp do odciągania skóry i odcinania nadmiaru mięśni.

Następnie, trzymając ostrza nożyc przy kościach miednicy jako siłę przeciwną, pociągnij za kość nogi, aby zwichnąć kość udową. Odłącz kość piszczelową i kość udową od rzepki, a następnie usuń stopę i usuń pozostałe części mięśni i ścięgien. Następnie umieść kości w dwóch do trzech mililitrach sterylnego PBS w jednym dołku sześciodołkowej płytki do hodowli tkankowej.

Kiedy wszystkie kości zostaną pobrane, chwyć kości pojedynczo kleszczami i włóż igłę o rozmiarze 25 dołączoną do jednomililitrowej strzykawki wypełnionej sterylnym PBS do jednego końca kości. Wciśnij tłok, zbierając komórki w 15-mililitrowej stożkowej probówce, aż środek każdej kości będzie biały. Za pomocą igły o rozmiarze 22 rozdziel komórki na zawiesinę pojedynczej komórki, wielokrotnie przepuszczając je przez końcówkę igły.

Po pobraniu całego szpiku kostnego przefiltruj komórki przez nylonowe sitko o grubości 70 mikronów i policz powstałe zawiesiny komórek. Następnie odwirować komórki szpiku kostnego, usunąć supernatant i rozcieńczyć próbki do stężenia jeden razy dziesięć do ośmiu komórek na mililitr w świeżym PBS na lodzie. Aby ustalić ekwiwalenty krwiotwórczych komórek macierzystych dawcy, należy przenieść 30 mikrolitrowych podwielokrotności komórek do pięciomililitrowych okrągłodennych probówek polistyrenowych i dodać równą objętość nieznakowanego przeciwciała przeciwko CD16 i CD32 do próbek przez pięć minut w temperaturze pokojowej, aby zablokować wszelkie niespecyficzne barwienie.

Następnie inkubować komórki w 90 mikrolitrach odpowiedniej mieszaniny głównej przeciwciał pierwszorzędowych sprzężonych z fluorochromem na lodzie, chronionej przed światłem. Po 30 minutach dodaj dwa mililitry buforu barwiącego do komórek i wymieszaj probówki. Następnie wykonaj wirowanie.

Zdekantować supernatanty i ponownie zawiesić granulki przez strzepnięcie. Następnie oznacz komórki 10 mikrolitrami streptawidyny sprzężonej z fluorochromem na lodzie przez 20 minut w ciemności. Pod koniec inkubacji umyć komórki w dwóch dodatkowych mililitrach buforu i przeanalizować próbki za pomocą cytometrii przepływowej.

Przyjmując jedną próbkę jako punkt odniesienia, ustal szacunkowe ekwiwalenty krwiotwórczych komórek macierzystych dla każdej z próbek. Po obliczeniu liczby krwiotwórczych komórek macierzystych w próbce, jak opisano w tekście, wymieszaj konkurenta i przetestuj hematopoetyczne komórki macierzyste w stosunku jeden do jednego i dostosuj końcową objętość komórek do 200 mikrolitrów na wstrzyknięcie w sterylnym PBS. W celu adoptywnego transferu krwiotwórczych komórek macierzystych należy rozgrzać napromieniowaną mysz biorcy lampą grzewczą.

Następnie odessać 750 mikrolitrów komórek do jednej mililitrowej strzykawki tuberkulinowej wyposażonej w igłę o rozmiarze 27 i usunąć pęcherzyki. Następnie, trzymając mysz w odpowiednim urządzeniu krępującym, przetrzyj miejsce wstrzyknięcia etanolem. Wprowadzić igłę do bocznej żyły ogonowej, skośnie do góry i równolegle do skóry, a następnie delikatnie wcisnąć tłok.

Po wstrzyknięciu wszystkich komórek należy usunąć igłę i ściskać miejsce wstrzyknięcia sterylną gazą przez kilka sekund, aby zatrzymać krwawienie. Następnie umieść mysz w czystej klatce. Aby przeanalizować krew obwodową, przebij skórę twarzy w pobliżu bezwłosego miejsca znajdującego się pod kością szczęki i zbierz jedną do dwóch kropli krwi w probówce EDTA.

Umieść rurkę w rotatorze, aby zapobiec krzepnięciu podczas oczekiwania na kontynuację. Następnie wymieszaj jeden mililitr świeżo przygotowanego buforu do lizy czerwonych krwinek o temperaturze pokojowej z krwią i przenieś próbkę do pięciomililitrowej probówki z polistyrenu o okrągłym dnie. Po czterech minutach w temperaturze pokojowej dodaj cztery objętości lodowatego PBS do każdej probówki i przykryj otwór nakrętką.

Wymieszaj probówkę kilka razy przez odwrócenie i natychmiast umieść komórki na lodzie. Po odwirowaniu zdekantować klarowne czerwone supernatanty i ponownie zawiesić granulki przez strzepnięcie. Następnie dodaj dwa mililitry buforu barwiącego do komórek i krótko je zwiruj.

Następnie wykonaj drugie wirowanie. Ponownie zawiesić osady, przesuwając je i przystąpić barwienia cytometrią przepływową, jak opisano w tekście. Komórki pochodzące od konkurentów powinny być obecne we wszystkich trzech liniach mieloidalnych, limfoidalnych B i limfoidalnych T.

Komórki konkurencyjne i dawcy znajdują się również zarówno w populacjach komórek szpiku kostnego linii ujemnej, jak i hematopoetycznych komórek macierzystych. Gdy krwiotwórcze komórki macierzyste dawcy są funkcjonalnie równoważne komórkom konkurencyjnym, proporcje komórek dawcy i komórek pochodzących od konkurenta są równe. Pozostałe komórki gospodarza to zazwyczaj prawie wyłącznie limfocyty T, ponieważ komórki te są bardziej odporne na radio.

Gdy obserwuje się, że komórki dawcy mają znacznie niższy odsetek leukocytów krwi obwodowej niż komórki konkurencyjne, niektóre aspekty funkcji hematopoetycznych komórek macierzystych są wadliwe i wymagają dalszych badań. Gdy zarówno komórki dawcy, jak i komórki konkurencyjne są obecne w niewielkiej liczbie, a komórki gospodarza stanowią większość komórek krwi obwodowej, przeszczep uważa się za nieudany i nie można wyciągnąć żadnych wniosków na temat względnej funkcjonalności dawcy w porównaniu z komórkami konkurencyjnymi. Po opanowaniu, przygotowanie szpiku kostnego i etapy przeszczepu można zakończyć w ciągu sześciu do siedmiu godzin, jeśli zostaną wykonane prawidłowo.

Podejmując się tej procedury, należy pamiętać o zachowaniu sterylnych warunków podczas przygotowywania komórek i etapów manipulacji zwierzętami. Po tej procedurze można zastosować inne metody, takie jak test rozcieńczenia ograniczającego, aby odpowiedzieć na dodatkowe pytania dotyczące funkcjonalnej liczby komórek macierzystych. Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak wykonywać konkurencyjne przeszczepy szpiku kostnego.

Nie zapominaj, że praca z napromienianiem może być bardzo niebezpieczna i że podczas wykonywania tej procedury należy zawsze zachować odpowiednie środki ostrożności.