Name: Fuzja pojedynczych proteoliposomów za pośrednictwem SNARE z dwuwarstwami na uwięzi w mikroprzepływowej komórce przepływowej monitorowanej za pomocą spolaryzowanej mikroskopii TIRF (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-08-24T15:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 58 s
Description: Poznaj metodę obserwacji pojedynczych zdarzeń fuzji błon mediowanych przez białka SNARE przy użyciu mikroskopii TIRF. Technika umożliwia badanie kinetyki egzocytozy i uwalniania ładunku.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Dziękujemy Vladimirowi Polejaevowi (Yale West Campus Imaging Core) za zaprojektowanie i zbudowanie spolaryzowanego mikroskopu TIRF, Davidowi Baddeleyowi (Yale University) za pomoc w dwukolorowym oprzyrządowaniu do detekcji, a także Jamesowi E. Rothmanowi (Yale University) i Benowi O'Shaughnessy'emu (Columbia University) oraz członkom ich grup za inspirację do dyskusji. EK jest wspierany przez Kavli Neuroscience Scholar Award od Kavli Foundation i grant NIH 1R01GM108954.

Autorzy oświadczają, że nie mają konkurencyjnych interesów finansowych.

Pomyślna implementacja opisanego tutaj testu fuzji SUV-SBL zależy w sposób krytyczny od kilku kluczowych etapów, takich jak funkcjonalna rekonstytucja białek w liposomach, uzyskanie wysokiej jakości SBL oraz wybór odpowiednich parametrów obrazowania w celu detekcji pojedynczych cząsteczek. Choć osiągnięcie sukcesu może wymagać czasu i wysiłku, raz pomyślnie wdrożony test dostarcza bogatego zestawu informacji o procesie fuzji, które nie są dostępne w żadnym innym teście fuzji in vitro omówionym we Wstępie. Można ...

Fuzja błon jest uniwersalnym procesem biologicznym niezbędnym do wewnątrzkomórkowego transportu lipidów i białek, sekrecji, zapłodnienia, rozwoju oraz wnikania wirusów otoczkowych do organizmów gospodarzy1-3. W większości wewnątrzkomórkowych reakcji fuzji, w tym podczas uwalniania hormonów i neuroprzekaźników drogą egzocytozy, energia niezbędna do połączenia dwóch dwuwarstw lipidowych jest dostarczana poprzez tworzenie wiązki czterech helis między pokrewnymi rozpuszczalnymi białkami receptorowymi czynnika N-etylomaleimidu-wrażliwego (SNARE), zakotwiczonymi odpowiednio w pęcherzyku (v-SNARE) i błonie docelowej (t-SNARE)4. Egzocytoza pęcherzyków synaptycznych jest najściślej regulowaną reakcją fuzji i zachodzi w ciągu milisekundy po dotarciu potencjału czynnościowego1,4,5. Por fuzyjny, będący początkowym połączeniem między dwiema fuzującymi komorami, może wielokrotnie otwierać się i zamykać przed ponownym uszczelnieniem lub nieodwracalnym rozszerzeniem5-7. Ten pierwszy przypadek skutkuje przejściową fuzją typu „kiss &amp; run”, podczas gdy ten drugi prowadzi do pełnej fuzji. Czynniki sterujące równowagą między tymi dwoma trybami fuzji oraz mechanizmy regulujące migotanie poru nie są jeszcze dobrze poznane5,8.
Białka SNARE są niezbędne do egzocytozy; fuzja pęcherzyków synaptycznych zostaje zniesiona po rozszczepieniu białek SNARE przez neurotoksyny9. Eksperymenty z fuzją masową z użyciem małych pęcherzyków jednowarstwowych (SUVs) wykazały, że białka SNARE są nie tylko niezbędne, ale również wystarczające do indukowania fuzji błon10. W tym teście masowym pęcherzyki SUVs zrekonstytuowane z białkami v-SNARE (v-SUV) zostały domieszkowane fluorescencyjnymi fosfolipidami (N-(7-nitro-2-1,3-benzoksadiazol-4-yl)-fosfoetanolaminą (NBD-PE) oraz (N-(lissamina rodamina B sulfonyl)-fosfoetanolaminą (LR-PE) i zmieszane z nieznakowanymi pęcherzykami zawierającymi białka t-SNARE (t-SUV). Początkowo fluorescencja NBD-PE w v-SUV jest wygaszana poprzez Försterowski rezonansowy transfer energii (FRET) do LR-PE. W miarę jak znakowane v-SUV łączą się z nieznakowanymi t-SUV, gęstość powierzchniowa fluoroforu w nowo połączonej błonie zmniejsza się, a wynikający z tego wzrost fluorescencji NBD-PE informuje o stopniu mieszania lipidów10. Ponieważ test masowy jest łatwy do przygotowania i analizy, był on powszechnie stosowany do badania mechanizmów fuzji pośredniczonej przez białka SNARE10-14. Wykazuje on jednak kilka ograniczeń, takich jak niska czułość i słaba rozdzielczość czasowa. Co najważniejsze, jako pomiar zespołowy, uśrednia on wyniki ze wszystkich zdarzeń, co utrudnia rozróżnienie między dokowaniem a fuzją, a także detekcję stanów pośrednich hemifuzji.
W ciągu ostatniej dekady kilka grup, w tym nasza, opracowało nowe testy do monitorowania zdarzeń fuzji na poziomie pojedynczych pęcherzyków15-27. Ha i współpracownicy wykorzystali v-SUV-y przytwierdzone do powierzchni i monitorowali ich fuzję z wolnymi t-SUV-ami18,19. Mieszanie lipidów monitorowano za pomocą FRET pomiędzy parą fluoroforów związanych z lipidami, wbudowanych odpowiednio w v- i t-SUV-y, wykorzystując mikroskopię TIRF (całkowitego wewnętrznego odbicia)18. Później laboratorium Brungera zastosowało pojedynczy gatunek znacznika lipidowego wraz ze znacznikiem zawartości do jednoczesnego wykrywania mieszania się lipidów i zawartości20,28. Zarówno markery lipidowe, jak i markery zawartości wprowadzono w wysokich, samogaszących stężeniach; fuzja z nieznakowanymi SUV-ami skutkowała odgaszeniem fluorescencji20,28.
Inni łączyli v-SUV z płaskimi dwuwarstwami zrekonstytuowanymi z t-SNARE15-17,21-27,29. Płaska geometria docelowej dwuwarstwy (zawierającej t-SNARE) lepiej naśladuje fizjologiczny proces fuzji małych, silnie zakrzywionych pęcherzyków z płaską błoną plazmatyczną. Grupa Steinema wykorzystała membrany spinające pory, zrekonstytuowane z t-SNARE i zawieszone nad porowatym podłożem z azotku krzemu, a fuzję z pojedynczymi v-SUV wykryto za pomocą konfokalnej skaningowej mikroskopii laserowej23. Inni przeprowadzali fuzję v-SUV z płaskimi dwuwarstwami zrekonstytuowanymi z t-SNARE, osadzonymi na szklanym podłożu15-17,21,22,24-27,29. Ogromną zaletą stosowania dwuwarstw osadzonych (SBL) jest możliwość wykorzystania mikroskopii TIRF do wykrywania zdarzeń dokowania i fuzji z doskonałym stosunkiem sygnału do szumu i bez zakłóceń ze strony wolnych v-SUV, choć zastosowanie mikroprzepływów pozwala również na rozdzielczość pojedynczych zdarzeń przy użyciu standardowej mikroskopii epifluorescencyjnej w polu dalekim24.
Głównym problemem jest to, czy i w jaki sposób oddziaływania między podłożem a dwuwarstwą wpływają na jakość dwuwarstwy wspieranej oraz na proces fuzji. We wczesnych pracach wykorzystywano planarne SBL, które były bezpośrednio wspierane na podłożu szklanym lub kwarcowym15-17. SBL te tworzono poprzez adsorpcję, pękanie, rozprzestrzenianie i fuzję membran t-SUV na podłożu. Wkrótce jednak zauważono, że pominięcie kluczowego komponentu t-SNARE, białka SNAP25, w SBL przygotowanych w ten sposób, prowadziło do kinetyki dokowania i fuzji v-SUV nieodróżnialnej od tej uzyskanej przy użyciu kompletnych białek t-SNARE17. Ponieważ SNAP25 jest absolutnie niezbędne do fuzji in vivo30,31, podważono fizjologiczną istotność tych wczesnych prób. Grupa Tamma pokonała to wyzwanie, stosując lepiej kontrolowany sposób formowania dwuwarstwy wspieranej21. Wykorzystano w nim nanoszenie metodą Langmuira-Blodgetta dla pierwszej, wolnej od białek warstwy SBL, a następnie fuzję tej monowarstwy z t-SUV21. Doprowadziło to do fuzji zależnej od SNAP25.
Aby uniknąć potencjalnych artefaktów związanych z dwuwarstwą bezpośrednio osadzoną na szklanym podłożu, bez konieczności stosowania metod Langmuira-Blodgetta, Karatekin et al. wprowadzili miękką, uwodnioną poduszkę z poli(glikolu etylenowego) (PEG) pomiędzy dwuwarstwę a podłoże24. Modyfikacja ta doprowadziła również do fuzji zależnej od SNAP2524. Znane jest, że dwuwarstwy osadzone na miękkiej warstwie polimerowej lepiej zachowują mobilność i funkcję białek transbłonowych32, co wykorzystywano w badaniach fuzji z wirusami33. Ponadto dwuwarstwy PEGylowane wydają się zachowywać pewną zdolność do samonaprawy i są bardzo stabilne34,35. Najpierw do membrany t-SUV włącza się frakcję dostępnych komercyjnie, sprzężonych z lipidami łańcuchów PEG. Gdy t-SUV pękają i tworzą płaską dwuwarstwę na szklanym podłożu, szczotka PEG pokrywa obie warstwy płaskiej dwuwarstwy. Ponieważ tworzenie płaskiej dwuwarstwy jest napędzane adhezją łańcuchów PEG otaczających t-SUV do hydrofilowej powierzchni szkła, pękanie liposomów i formowanie płaskiej dwuwarstwy są stosunkowo niewrażliwe na zastosowany skład lipidowy. Jednakże w przypadku włączenia dużych ilości cholesterolu, co zwiększa właściwości spójne SUV, mogą one nie pękać samoistnie. W takim przypadku w celu wspomagania formowania płaskiej dwuwarstwy można zastosować szok osmotyczny lub jony dwuwartościowe25.
Jak wspomniano powyżej, w tym podejściu szczoteczka z PEG pokrywa obie strony płaskiej, podpartej dwuwarstwy. Szczoteczka skierowana w stronę kanału przepływu mikrofluidycznego pomaga zapobiegać niespecyficznej adhezji nadchodzących v-SUV, które zazwyczaj są również pokryte warstwą PEG. Tworzenie kompleksów v- i t-SNARE rozpoczyna się od dystalnych względem błony końców N i postępuje etapami w kierunku domen proksymalnych względem błony36. Aby v-SUV mogły wejść w interakcję z t-SBL, końce N v- i t-SNARE muszą wystawać ponad szczoteczki z PEG, co wydaje się mieć miejsce w warunkach przeprowadzanego testu. Wysokość szczoteczki można dostosować do badania białek innych niż SNARE poprzez zmianę gęstości lipidów pegylowanych oraz długości łańcucha PEG37,38. Kolejną zaletą szczoteczek z PEG pokrywających proksymalne powierzchnie fuzujących dwuwarstw jest to, że naśladują one zatłoczone środowisko błon biologicznych, które są wypełnione 30 000–40 000 integralnych białek błonowych na mikrometr kwadratowy39. Podobnie jak łańcuchy PEG w tym teście, odpychająca warstwa białkowa pokrywająca błony biologiczne musi zostać odsunięta, aby umożliwić kontakt między dwiema fosfolipidowymi dwuwarstwami w celu zajścia fuzji.
W tym teście wykorzystuje się mikrofluidyczne kanały przepływowe, ponieważ oferują one wyjątkowe zalety. Po pierwsze, przepływ mikrofluidyczny umożliwia bardziej jednorodne osadzanie t-SUV, które rozprzestrzeniają się i fuzują, tworząc t-SBL. Po drugie, mała objętość kanału (&lt; 1 µl) minimalizuje zużycie próbki. Po trzecie, wymagane niewielkie objętości pozwalają na przeprowadzenie całego eksperymentu w warunkach stałego przepływu. Przepływ usuwa słabo, prawdopodobnie niespecyficznie, przyłączone v-SUV z SBL16. Utrzymuje on również stałą gęstość v-SUV nad t-SBL, co upraszcza analizę kinetyczną17. Wreszcie, pęcherzyki zadokowane są łatwo odróżnialne od pęcherzyków wolnych, niesionych przez przepływ25. Po czwarte, na tej samej lamelle można zastosować kilka kanałów mikrofluidycznych, z których każdy bada inny warunek. Pozwala to na porównanie warunków podczas jednego cyklu eksperymentalnego. Podobnego podejścia użyła grupa van Oijena do badania fuzji między wirusem grypy a amortyzowanymi SBL33.
W mikroskopii TIRF wykładniczy zanik pola ewanescentnego (ze stałą zaniku ~100 nm) ogranicza wzbudzenie fluorescencji do cząsteczek znajdujących się w bardzo bliskim sąsiedztwie granicy fazy szkło-bufor. Minimalizuje to wkład cząsteczek fluorescencyjnych znajdujących się dalej, zwiększa stosunek sygnału do szumu i pozwala na czułość na poziomie pojedynczych cząsteczek przy czasie naświetlania klatek wynoszącym 10-40 msec. Pole ewanescentne prowadzi również do wzrostu sygnału podczas fuzji: w miarę jak znakowane lipidy przenoszą się z SUV do SBL, znajdują się one średnio w silniejszym polu wzbudzenia. Ten wzrost fluorescencji jest bardziej wyraźny w przypadku większych liposomów.
Jeśli do wytworzenia pola ewanescentnego wykorzystuje się światło spolaryzowane, dodatkowe efekty wpływają na zmiany fluorescencji podczas przenoszenia znaczników z SUV do SBL. Niektóre barwniki lipidowe posiadają dipol przejścia zorientowany pod preferowanym średnim kątem względem dwuwarstwy, w której są osadzone. Tworzy to różnicę w ilości fluorescencji emitowanej przez fluorofory, gdy znajdują się one w SUV w stosunku do SBL, ponieważ spolaryzowana wiązka będzie wzbudzać barwniki w obu membranach w różny sposób. W pierwszym przypadku wiązka wzbudzająca będzie oddziaływać z dipolami przejścia zorientowanymi wokół sferycznego SUV, natomiast w drugim przypadku orientacje dipoli będą ograniczone przez płaską geometrię SBL. Na przykład, gdy stosowane jest padające światło spolaryzowane s (spolaryzowane prostopadle do płaszczyzny padania), wzbudzenie jest bardziej efektywne, gdy barwnik znajduje się w SBL niż w SUV w przypadku dipola przejścia barwnika lipidowego zorientowanego równolegle do membrany29,40 (takiego jak w przypadku DiI lub DiD41-43). SUV domieszkowany takim fluoroforem wydaje się ciemny podczas dokowania do SBL (Rycina 7, Reprezentatywne wyniki). W momencie otwarcia się poru fuzyjnego i połączenia membran SUV i SBL, sondy fluorescencyjne dyfundują do SBL i stają się bardziej podatne na wzbudzenie przez spolaryzowane s pole ewanescentne25,27,29. W konsekwencji sygnał fluorescencji zintegrowany wokół miejsca fuzji gwałtownie wzrasta podczas przenoszenia barwnika z SUV do SBL27 (Rycina 3 i Rycina 7). Dodatkowym czynnikiem wpływającym na zmiany sygnału towarzyszące fuzji jest zniesienie wygaszania (dequenching) znaczników fluorescencyjnych w miarę ich rozcieńczania podczas przenoszenia do SBL. Wkład zniesienia wygaszania jest zazwyczaj niewielki w porównaniu z zanikiem pola ewanescentnego i efektami polaryzacji w opisanym tutaj teście, ponieważ znakowana jest tylko niewielka frakcja (<img alt="Symbol przybliżenia i procent mniejszy niż 1% w notacji matematycznej." src="/files/ftp_upload/54349/54349eq1.jpg" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Równanie 1">) lipidów.
Wzrost sygnału podczas fuzji może zostać wykorzystany do wywnioskowania właściwości poru fuzyjnego poprzez porównanie czasu, <img alt="Równanie równowagi statycznej, ΣFx=0, symbol wzoru dla analizy równowagi sił w mechanice." src="/files/ftp_upload/54349/54349eq2.jpg" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Równanie 1">, wymaganego do wydostania się lipidu przez por swobodnie przepuszczalny dla lipidów, z rzeczywistym czasem uwalniania, <img alt="Symbol τ&lt;sub&gt;release&lt;/sub&gt;, koncepcja kinetyki, równanie, analiza reakcji chemicznej." src="/files/ftp_upload/54349/54349eq3.jpg" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Równanie 1">. Jeśli te dwie skale czasowe są porównywalne, można wywnioskować, że por stawia niewielki opór przepływowi lipidów. Jednakże, jeśli rzeczywisty czas uwalniania jest znacznie dłuższy niż czas uwalniania ograniczonego dyfuzją, wskazywałoby to na proces, taki jak migotanie poru (pore flickering), który opóźnia uwalnianie lipidów. Czas uwalniania ograniczonego dyfuzją, <img alt="Równanie równowagi statycznej, ΣFx=0, symbol wzoru dla analizy równowagi sił w mechanice." src="/files/ftp_upload/54349/54349eq2.jpg" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Równanie 1">, zależy od rozmiaru fundującego liposomu oraz dyfuzyjności lipidów; jego oszacowanie wymaga ilościowego określenia tych dwóch parametrów. Czułość testu na poziomie pojedynczych cząsteczek pozwala na pomiar dyfuzyjności lipidów poprzez śledzenie kilku pojedynczych fluoroforów lipidowych po ich uwolnieniu do SBL dla każdego zdarzenia fuzji26. Rozmiar każdego fundującego pęcherzyka można oszacować27, łącząc (i) intensywność pojedynczego barwnika lipidowego, (ii) zmianę całkowitej fluorescencji wokół miejsca dokowania po przeniesieniu wszystkich fluoroforów do SBL podczas fuzji, (iii) znaną gęstość znakowania lipidów SUV oraz (iv) powierzchnię przypadającą na jeden lipid. Dla wielu zdarzeń fuzji stwierdzono, że rzeczywiste czasy uwalniania lipidów były znacznie dłuższe niż oczekiwano w przypadku uwalniania kontrolowanego dyfuzyjnie27, co odnotowano wcześniej przy założeniu jednorodnego rozmiaru SUV44. Przyjmując, że opóźnienie uwalniania lipidów wynika z migotania poru, model ilościowy pozwala na oszacowanie „otwartości poru”, czyli ułamka czasu, w którym por pozostaje otwarty podczas fuzji27.
W miarę możliwości ważne jest testowanie mechanizmów fuzji przy użyciu zarówno markerów lipidowych, jak i markerów zawartości rozpuszczalnej. Na przykład uwalnianie lipidów mogłoby być opóźnione przez procesy inne niż migotanie porów, takie jak ograniczenie dyfuzji lipidów przez białka SNARE otaczające por. Gdyby tak było, uwalnianie zawartości poprzedzałoby uwalnianie markerów lipidowych, pod warunkiem, że por jest wystarczająco duży, aby umożliwić przejście sond rozpuszczalnych. Bardziej fundamentalna wada tego podejścia mogłaby wynikać z założenia, że przenoszenie znakowanych lipidów do SBL odbywa się poprzez wąski por fuzyjny łączący SBL z pęcherzykiem, który w dużej mierze zachował swój kształt sprzed fuzji. Przenoszenie lipidów do SBL mogłoby również wynikać z szybkiego rozszerzenia poru fuzyjnego z jednoczesnym, niezwykle szybkim zapadnięciem się SUV w membranę SBL, jak wcześniej sugerowano na podstawie samych danych dotyczących uwalniania lipidów29. Jednoczesne monitorowanie uwalniania lipidów i zawartości wykazało, że wiele porów zamknęło się po uwolnieniu wszystkich markerów lipidowych, ale zatrzymało część swojego rozpuszczalnego ładunku27. Wskazuje to, że co najmniej niektóre liposomy nie zapadają się w SBL po fuzji i że transfer barwnika lipidowego do SBL odbywa się przez por fuzyjny. Ponadto uwalnianie lipidów i zawartości następowało jednocześnie27, co sprawia, że mało prawdopodobne jest, aby opóźnienie uwalniania lipidów było spowodowane utrudnieniem dyfuzji lipidów przez białka SNARE otaczające por45.
Protokół fuzji SUV-SBL, w którym nie monitorowano uwalniania zawartości rozpuszczalnej, został wcześniej opublikowany przez Karatekina i Rothmana25W niniejszej pracy uwzględniono nowsze osiągnięcia, a mianowicie jednoczesny monitoring uwalniania lipidów i zawartości oraz szacowanie właściwości SUV, lipidów i porów fuzyjnych.27Protokół rozpoczyna się od instrukcji przygotowania komórek mikrofluidycznych, wykonanych poprzez połączenie bloku elastomeru poli(dimetylosiloksanu) (PDMS) zawierającego rowki z szkiełkiem podstawowym.25Następnie wyjaśniono sposób przygotowania v-SUV z markerami lipidowymi oraz markerami zawartości. W rozdziałach 4 i 5 zamieszczono instrukcje dotyczące montażu komórek mikrofluidycznych oraz tworzenia SBL. in situ oraz sprawdzanie pod kątem defektów i płynności, wprowadzanie v-SUV do cel przepływowych oraz detekcja zdarzeń fuzji. Sekcja 6 zawiera instrukcje dotyczące analizy danych.

<table><tr><tbody><td colspan="4">Reodczynniki</td></tr><tr><td>Milli-Q (MQ) woda</td><td>Milipory</td><td></td><td></td></tr><tr><td>KOH</td><td>J.T. Baker</td><td>3040-05</td><td></td></tr><tr><td>Etanol 190 Proof</td><td>Decon</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Isopropanol</td><td>Fisher Chemical</td><td>A416P4</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>AmericanBio</td><td>AB00892</td><td></td></tr><tr><td>Cholride sodu (KCl)</td><td>AmericanBio</td><td>AB01915</td><td></td></tr><tr><td>Dithiothreitol</td><td>AmericanBio</td><td>AB00490</td><td></td></tr><tr><td>N-[2-hydroksyetylo]piperazyno-N'-[kwas 2-etanosulfonowy] (HEPES)</td><td>AmericanBio</td><td>AB00892</td><td></td></tr><tr><td>EGTA</td><td>Acros Organics</td><td>409911000</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">Buffers</td></tr><tr><td>Bufor HEPES-KOH (pH 7,4)</td><td></td><td></td><td>25 mM HEPES-KOH, 140&nbsp; mM KCl, 100&nbsp; &mu; M EGTA, 1&nbsp; mM DTT</td></tr><tr><td colspan="4"><silny>Rozpuszczalniki</silny></td></tr><tr><td>Chloroform&nbsp;</td><td>J.T. Baker</td><td>9180-01</td><td>w szklanej butelce, UWAGA, nosić PPE</td></tr><tr><td>Metanol</td><td>J.T. Baker</td><td>9070-03</td><td>w szklanej butelce, UWAGA, nosić PPE</td></tr><tr><td colspan="4">Preparat liposomowy</td></tr><tr><td>Gazoszczelna strzykawka Hamilton</td><td></td><td>o różnych rozmiarach</td><td>używaj tylko szklanego pierścienia z solentami (Chlorophorm/ Methanon, 2:1, v/v)</td></tr><tr><td>Rurki szklane Pyrex Vista 11 ml, nakrętka 16x100 mm rurka hodowlana</td><td>Pyrex&nbsp;</td><td>70825-16</td><td>dokładnie oczyść, spłukać chloroformem</td></tr><tr><td>1-palmitoilo-2-oleoiloil-sn-glicero-3-fosfocholina, 16:0-18:1 PC (POPC)</td><td>Avanti Polar Lipids</td><td>850457</td><td>Lipidy są rozpuszczone w CHCl3 lub w postaci lifilizowanego proszku w szczelnie zamkniętych fiolkach. Aliquot po otwarciu. Przechowywać dodatkowe w postaci wysuszonych filmów lipidowych w atmosferze obojętnej w temperaturze -20 stopni Celsjusza. Przechowywać zapasy w CHCl3/MeOH (2:1, v/v) w temperaturze -20 & deg;C. pozwól przyjść do RT przed otwarciem</td></tr><tr><td>1,2-dioleoilo-sn-glicero-3-fosfo-L-seryna (sól sodowa), 18:1 PS (DOPS)</td><td>Avanti Polar Lipids</td><td>840035</td><td>Tak jak wyżej.</td></tr><tr><td>1-stearoilo-2-arachidonoilo-sn-glicero-3-fosfoetanoloamina, 18:0-20:4 PE (SAPE)</td><td>Lipidy polarne Avanti</td><td>850804</td><td>Jak wyżej.</td></tr><tr><td>L-&alfa;-fosfatydyloinozytolo-4,5-bisfosforan (mózg, świnia) (sól amonowa), Mózg PI(4,5)P2</td><td>Avanti Polar Lipids</td><td>840046</td><td>Jak wyżej.</td></tr><tr><td>1,2-dioleoilo-sn-glicero-3-fosfoetanoloamino-N-(7-nitro-2-1,3-benzoksadiazol-4-ylo) (sól amonowa), 18:1 NBD PE</td><td>Avanti Polar Lipids</td><td>810145</td><td>Jak wyżej.</td></tr><tr><td>1,2-dioleoiloilo-sn-glicero-3-fosfoetanoloamina-N-[metoksy(glikol polietylenowy)-2000] (sól amonowa), 18:1 PEG2000 PE</td><td>Avanti Polar Lipids</td><td>880130</td><td>Jak wyżej.</td></tr><tr><td>cholesterol (wełna owcza, >98%)</td><td>Avanti Polar Lipids</td><td>700000</td><td>Tak jak powyżej.</td></tr><tr><td>Olej DiD; Olej DiIC18(5) (nadchloran 1,1'-dioctadecyl-3,3,3',3'-tetrametylolindodikarbocyjaniny)</td><td>Sondy molekularne</td><td>D-307</td><td></td></tr><tr><td>Rotavapor R-210</td><td>Buchi</td><td>R-210</td><td>łaźnia cieplna powyżej Tm lipidów stosowanych</td></tr><tr><td>OG n-oktylo-&beta;-D-glukopiranozyd</td><td>Affymetrix</td><td>0311</td><td>przechowywać w temperaturze -20 &; C, pozwól przyjść do RT przed otwarciem</td></tr><tr><td>Shaker - Eppendorf Thermomixer R</td> Kasety dializacyjne <td>Eppendorf</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Slide-A-Lyze, 20k MWCO, 3&nbsp; ml</td><td>life technologies</td><td>66003</td><td></td></tr><tr><td>Bio-Beads SM-2 Adsorbenty</td><td>Bio-Rad</td><td>1523920</td><td></td></tr><tr><td>OptiPrep&nbsp; Gradient gęstości Medium</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D1556</td><td></td></tr><tr><td>Ultrawirówka Probówka, Cienkościenna, Ultra-Clear, 13.2&nbsp; ml, 14 x 89 mm</td><td>Beckman Coulter</td><td>41121703</td><td></td></tr><tr><td>Beckman SW41 Ti rotor</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>SuflorodamineB</td><td>Sondy molekularne</td><td>S-1307</td><td></td></tr><tr><td>Econo-Column&nbsp; Kolumny chromatograficzne, 2,5 i razy; 10 cm</td><td>Bio-Rad</td><td>7372512</td><td></td></tr><tr><td>Sepharose CL-4B</td><td>GE Healthcare</td><td>17-0150-01</td><td></td></tr><tr>SYPRO Pomarańczowe <td>sondy molekularne</td><td>w żelu białkowym</td><td>S-6650</td><td>5,000x Koncentrat w DMSO</td></tr><tr><td colspan="4">PDMS block</td></tr><tr><td>Sylgard 184 Zestaw elastomerów silikonowych, PDMS</td><td>Dow Corning</td><td>3097358-1004</td><td></td></tr><tr><td>Szalka Petriego ze szkła Pyrex, 150 x 20 mm, w komplecie z</td><td>pokrywą Corning</td><td>3160-152</td><td></td></tr><tr><td>Dziurkacz - Dziurkacz wielokrotnego użytku, 0,75&nbsp; mm</td><td>World Precision Instruments</td><td>504529</td><td></td></tr><tr><td>ręczna maszyna do dziurkowania&nbsp;</td><td>Wiertło SYNEO</td><td>MHPM-UNV</td><td></td></tr><tr><td>.035 x .026 x 1.5 304 SS TiN Okrągły dziurkacz</td><td>SYNEO</td><td>CR0350265N20R4</td><td>średnica wiertła: 0,9 mm, rozmiar otworu stempla: 0,74 mm</td></tr><tr><td>Rurka z mikrootworem Tygon, średnica wewnętrzna 0,25 mm, średnica zewnętrzna 0,76 mm</td><td>Cole-Parmer</td><td>06419-00</td><td>0,010" średnica wewnętrzna, 0,030" średnicy</td></tr><tr><td>zewnętrznej Rurka silikonowa (średnica zewnętrzna 0,51 mm, średnica zewnętrzna 2,1 mm</td><td>Cole-Parmer</td><td>95802-00</td><td>0,020 średnicy, średnica zewnętrzna</td></tr> <tr>0,083"<td colspan="4">Szkło nakrywkowe - czyste pomieszczenie posprzątane</td></tr><tr><td>Szkło nakrywkowe Schott Nexterion D</td><td></td> Odkurzacz plazmowy <td>Schott</td> 1472305 <td></td></tr><tr><td></td><td>Harrick</td><td>PDC-32G</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">pTIRF konfiguracja i akcesoria</td></tr><tr><td>IX81 korpus mikroskopu</td><td>Olympus</td><td>IX81</td><td></td></tr><tr><td>EM CCD</td><td>Andor</td><td>ixon-ultra-897</td><td></td></tr><tr><td>Thermo Plate, podgrzewany stolik mikroskopowy</td><td>Tokai Hit</td><td>MATS-U52RA26</td><td></td></tr><tr><td>1 ml szklane strzykawki Hamilton (4x)</td><td>Pompa</td> strzykawkowa Hamilton <td>81365</td><td></td></tr><tr><td></td><td>kd Scientific</td><td>KDS-230</td><td></td></tr></tbody></table>

fuzja pojedynczych proteoliposomów za pośrednictwem snare z dwuwarstwami na uwięzi w mikroprzepływowej komórce przepływowej monitorowanej za pomocą spolaryzowanej mikroskopii tirf

SNARE-mediated Fusion of Single Proteoliposomes with Tethered Supported Bilayers in a Microfluidic Flow Cell Monitored by Polarized TIRF Microscopy

W wszechobecnym procesie fuzji membranowej, otwarcie poru fuzyjnego ustanawia pierwsze połączenie między dwoma dawniej oddzielnymi komorami. Podczas uwalniania neuroprzekaźników lub hormonów przez egzocytozę, pory fuzyjne mogą przejściowo wielokrotnie otwierać się i zamykać, regulując kinetykę uwalniania ładunku. Dynamika porów określa również sposób recyklingu pęcherzyków; Nieodwracalne ponowne uszczelnienie powoduje przejściowe zlanie typu "kiss-and-run", podczas gdy dylatacja prowadzi do pełnej fuzji. Aby lepiej zrozumieć, jakie czynniki rządzą dynamiką porów, opracowaliśmy test do monitorowania fuzji błonowej przy użyciu mikroskopii spolaryzowanej całkowitej fluorescencji wewnętrznego odbicia (TIRF) z czułością pojedynczej cząsteczki i rozdzielczością czasową ~15 ms w biochemicznie dobrze zdefiniowanym systemie in vitro. Monitorowane jest połączenie znakowanych fluorescencyjnie małych pęcherzyków jednowarstwowych zawierających białka v-SNARE (v-SUVs) z płaską dwuwarstwą zawierającą t-SNARE, wspartą na miękkiej poduszce polimerowej (t-SBL, dwuwarstwa wspierana przez t). Test wykorzystuje mikroprzepływowe kanały przepływowe, które zapewniają minimalne zużycie próbki przy jednoczesnym dostarczaniu stałej gęstości SUV-ów. Wykorzystując szybkie wzmocnienie sygnału po przeniesieniu znaczników lipidowych z SUV do SBL podczas fuzji, monitorowana jest kinetyka transferu barwnika lipidowego. Czułość mikroskopii TIRF pozwala na śledzenie pojedynczych fluorescencyjnych znaczników lipidowych, z których można wywnioskować dyfuzyjność lipidów i rozmiar SUV dla każdego zdarzenia fuzji. Czas uwalniania barwnika lipidowego może być znacznie dłuższy niż oczekiwano, aby zapewnić niezakłócone przejście przez trwale otwarte pory. Korzystając z modelu, który zakłada, że opóźnienie uwalniania lipidów jest spowodowane migotaniem porów, można oszacować "otwartość" porów, czyli ułamek czasu, w którym pory pozostają otwarte podczas fuzji. Rozpuszczalny marker może być zamknięty w SUV-ach w celu jednoczesnego monitorowania uwalniania lipidów i rozpuszczalnego ładunku. Takie pomiary wskazują, że niektóre pory mogą się ponownie uszczelnić po utracie części rozpuszczalnego ładunku.

Jakość SBL
Przed eksperymentem fuzji kluczowe jest zweryfikowanie jakości i płynności SBL. Fluorescencja na dnie, od strony szklanej kanału mikroprzepływowego, powinna być jednolita, bez żadnych widocznych defektów. Jeśli przez kanał przejdzie pęcherzyk powietrza, zazwyczaj pozostawia on widoczne ślady na SBL. W przypadku wystąpienia takich rozległych blizn/defektów nie należy używać tego kanału. Czasami SUV mog...

Tutaj prezentujemy protokół do wykrywania pojedynczych, zapośredniczonych przez SNARE zdarzeń fuzji między liposomami a wspieranymi dwuwarstwami w kanałach mikroprzepływowych za pomocą spolaryzowanego TIRFM, z czułością pojedynczej cząsteczki i rozdzielczością czasową ~15 ms. Uwalnianie lipidów i rozpuszczalnego ładunku może być wykrywane jednocześnie. Mierzy się wielkość liposomów, dyfuzyjność lipidów i właściwości porów fuzyjnych.

Fuzja pojedynczych proteoliposomów za pośrednictwem SNARE z dwuwarstwami na uwięzi w mikroprzepływowej komórce przepływowej monitorowanej za pomocą spolaryzowanej mikroskopii TIRF

In the ubiquitous process of membrane fusion the opening of a fusion pore establishes the first connection between two formerly separate compartments. ...

Ogólnym celem niniejszego testu jest obserwacja pojedynczych zdarzeń fuzji błon napędzanych przez neuronalne i egzocytowe białka SNARE, aby zrozumieć podstawowe mechanizmy uwalniania neuroprzekaźników i hormonów. Metoda ta może pomóc w odpowiedzi na kluczowe pytania w dziedzinie fuzji błon, takie jak sposób uwalniania ładunku poprzez dynamiczny por fuzyjny oraz los poru po zakończeniu fuzji. Główną zaletą tej techniki jest możliwość obserwacji odrębnych etapów dokowania pęcherzyków, fuzji prowadzącej do otwarcia oraz kinetyki uwalniania ładunku dla pojedynczych zdarzeń w biochemicznie zdefiniowanych środowiskach.Choć metoda ta pozwala na zgłębienie procesu egzocytozy, może być ona również zastosowana do innych reakcji fuzji błon, takich jak fuzja wirusów otoczkowych z błonami komórek docelowych podczas infekcji. Zazwyczaj osoby rozpoczynające pracę z tą metodą napotykają trudności, ponieważ wymagane jest opanowanie wielu różnych etapów – od mikrowytrawiania, przez oczyszczanie białek, aż po obrazowanie. W pierwszej kolejności należy przygotować silikonową formę matrycową, wykorzystując standardowe techniki fotolitografii oraz przedstawiony tutaj szablon.Następnie do jednorazowego p

snare-mediated-fusion-single-proteoliposomes-with-tethered-supported

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Neuronauka

Wsparte płaskie dwuwarstwy są potężnymi narzędziami, które mogą być wykorzystywane do modelowania oddziaływań molekularnych w synapsie immunologicznej. W niniejszej pracy przedstawiamy metody zakotwiczenia białek adhezyjnych komórek, o których wiadomo, że modulują one tworzenie synaps, w górnej warstwie dwuwarstwy lipidowej oraz wizualizacji procesu tworzenia synapsy za pomocą mikroskopii TIRF.<br...

Wspierane dwuwarstwy płaskie do tworzenia i badania synaps immunologicznych oraz kinaps

Opracowaliśmy test fuzji komórek, który pozwala na ilościowe określenie zdarzeń fuzji błon zapośredniczonej przez białka SNARE poprzez aktywowaną ekspresję β-galaktozydazy.

Analiza fuzji błon zapośredniczonej przez białka SNARE z wykorzystaniem enzymatycznego testu fuzji komórek

Mikroskopia fluorescencyjna z pełnym wewnętrznym odbiciem (pTIRFM) oparta na polaryzacji umożliwia wykrywanie dynamiki błony komórkowej w czasie rzeczywistym. W artykule opisano implementację pTIRFM do badania przebudowy błony podczas regulowanej egzocytozy. Technikę tę można uogólnić na inne procesy w biologii komórki, które bezpośrednio lub pośrednio wiążą się ze zmianami kształtu błony.

Obrazowanie deformacji błony plazmatycznej za pomocą pTIRFM

Przygotowanie funkcjonalizowanych białkiem płaskich dwuwarstw lipidowych na podłożu szklanym, określenie ruchliwości białek w ich obrębie i pomiar gęstości białek jest pokazane tutaj. Nakreślono mapę drogową budowy mikroskopu całkowitego wewnętrznego odbicia z redukcją szumów, który umożliwia wizualizację pojedynczych dwuwarstwowych fluorochromów o wysokiej rozdzielczości czasoprzestrzennej.

Mikroskopia fluorescencyjna pojedynczych cząsteczek na dwuwarstwach podpartych planarnie

Ten protokół opisuje nową metodę pozwalającą na ilościową wizualizację złożonego tworzenia białek SNARE, opartą na transferze energii rezonansu Förstera i mikroskopii obrazowania życia fluorescencji.

Wizualizacja wewnątrzkomórkowego transportu SNARE za pomocą mikroskopii obrazowania czasu życia fluorescencji

Fuzja mitochondriów jest ważną reakcją homeostatyczną leżącą u podstaw dynamiki mitochondriów. Opisano tutaj system rekonstytucji in vitro do badania fuzji mitochondrialnej błony wewnętrznej, która może rozwiązać problem wiązania błony, dokowania, heminacji i otwierania porów. Omówiono wszechstronność tego podejścia w badaniu systemów błon komórkowych.

Modelowa platforma membranowa do odtwarzania dynamiki błon mitochondrialnych

Ten protokół opisuje tworzenie wspieranych dwuwarstw lipidowych oraz dodawanie włókien cytoszkieletu i białek motorycznych w celu zbadania dynamiki odtworzonych, połączonych błoną sieci cytoszkieletu za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej.

Rekonstytucja minimalnych kory aktynowych połączonych błoną na podpartych dwuwarstwach lipidowych

Tutaj przedstawiono protokół do wykonywania i analizy wiązania, mobilności i składania pojedynczych cząsteczek na sztucznych zatłoczonych błonach lipidowych za pomocą mikroskopii smTIRF (smTIRF) z wykorzystaniem pojedynczej cząsteczki całkowitego wewnętrznego odbicia.

Dyfuzja i montaż pojedynczych cząsteczek na błonach lipidowych stłoczonych w polimerach

Ten protokół opisuje, jak używać mikroskopii TIRF do śledzenia poszczególnych kanałów jonowych i określania ich aktywności w obsługiwanych błonach lipidowych, definiując w ten sposób wzajemne oddziaływanie między bocznym ruchem błony a funkcją kanału. Opisano w nim, jak przygotować membrany, rejestrować dane i analizować wyniki.

Obrazowanie jednocząsteczkowe ruchliwości bocznej i aktywności kanałów jonowych w dwuwarstwach lipidowych przy użyciu mikroskopii fluorescencji całkowitego wewnętrznego odbicia (TIRF)

Ten artykuł szczegółowo opisuje, jak tworzyć próbki do śledzenia pojedynczego białka w dwuwarstwach lipidowych wspieranych w stałych. Wyjaśnia to także prosty mikroskop fluorescencyjny o czułości na pojedynczą cząsteczkę i szybkim płynności. Na koniec przedstawiamy procedurę wyodrębniania trajektorii pojedynczych białek.

Śledzenie pojedynczych białek w dwuwarstwach lipidowych za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej

Poznaj metodę obserwacji pojedynczych zdarzeń fuzji błon mediowanych przez białka SNARE przy użyciu mikroskopii TIRF. Technika umożliwia badanie kinetyki egzocytozy i uwalniania ładunku.

Fuzja pojedynczych proteoliposomów za pośrednictwem SNARE z dwuwarstwami na uwięzi w mikroprzepływowej komórce przepływowej monitorowanej za pomocą spolaryzowanej mikroskopii TIRF (Wideo) | JoVE Journal

Fuzja pojedynczych proteoliposomów za pośrednictwem SNARE z dwuwarstwami na uwięzi w mikroprzepływowej komórce przepływowej monitorowanej za pomocą spolaryzowanej mikroskopii TIRF

Przeglądaj więcej filmów