Name: Protokół izolowania mysiego kręgu Willisa (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-10-22T14:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 30 s
Description: Poznaj protokół izolacji mysiego kręgu Willisa w celu badania dużych naczyń mózgowych. Ta metoda umożliwia szybkie i łatwe uzyskanie nienaruszonej struktury naczyń.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Ta praca była wspierana przez Uniwersytet Paris VI i grant Pierre Fabre Innovation.

Wszystkie procedury zostały przeprowadzone zgodnie ze standardami Wspólnoty Europejskiej dotyczącymi opieki i wykorzystania zwierząt laboratoryjnych, za zgodą lokalnej komisji etyki ds. eksperymentów na zwierzętach (Ile de France-Paris-Committee, zezwolenie 4270).
1. Znieczulenie
<ol>
	<li>Przed zabiegiem podać dorosłym myszom dootrzewnowo letalną dawkę pentobarbitalu (do 1 mg/10 g masy ciała), używając igły 27G i strzykawki 1 ml.</li>
</ol>
2. Perfuzja naczynia
UWAGA: Podczas perfuzji naczyń nie ma potrzeby nakładania maści weterynaryjnej na oczy. Procedura ta jest szybka (5-10 minut) i kończy się śmiercią zwierzęcia. Potwierdź brak reakcji, uciskając palec u stopy.
<ol>
	<li>Za pomocą nożyczek irydowych należy wykonać nacięcie ściany brzucha i otrzewnej o długości około 4 cm, tuż poniżej klatki piersiowej.</li>
	<li>Należy wykonać niewielkie nacięcie (o długości kilku milimetrów) w przeponie, a następnie kontynuować nacinanie przepony wzdłuż całej klatki piersiowej, aby odsłonić jamę opłucnową.</li>
	<li>Należy unieść mostek i zacisnąć jego końcówkę hemostatem; hemostat należy umieścić na szyi. Ostrożnie należy wyciąć tkankę tłuszczową łączącą mostek z sercem.</li>
	<li>Należy wprowadzić igłę perfuzyjną o rozmiarze 15G przez lewą komorę do szczytu serca.</li>
	<li>Na koniec należy użyć nożyczek, aby wyciąć jeden z płatów wątroby w celu utworzenia otworu odpływowego. 
	UWAGA: Alternatywny otwór odpływowy można utworzyć, wykonując nacięcie prawego przedsionka za pomocą nożyczek irydowych.</li>
	<li>Należy przeprowadzić perfuzję zwierzęcia 25 do 50 ml soli fizjologicznej w buforze fosforanowym (PBS) za pomocą pompy pracującej z prędkością 2,5 ml/min. Wątroba powinna pobleknąć w miarę zastępowania krwi przez PBS.</li>
	<li>Po około pięciu minutach, gdy płyn wypływający z wątroby będzie całkowicie przejrzysty, należy przerwać perfuzję.</li>
	<li>W przypadku planowania immunobarwienia lub standardowego barwienia, należy przeprowadzić perfuzję zwierzęcia 50 ml paraformaldehydu (PFA; 4% w PBS) przez 15 min. 
	UWAGA: Uwaga, opary PFA są toksyczne. Perfuzję zwierzęcia z użyciem PFA należy przeprowadzać w wentylowanej komorze z wyciągiem.</li>
</ol>
3. Izolacja mózgu i kręgu Willisa
<ol>
	<li>Izolacja mózgu
	<ol>
		<li>Odetnij głowę za pomocą nożyczek chirurgicznych.</li>
		<li>Wykonaj nacięcie w linii środkowej nożyczkami irydologicznymi, wzdłuż skóry od szyi do nosa.</li>
		<li>Odetnij skórę, aby odsłonić czaszkę, a następnie usuń pozostałe mięśnie i tkankę tłuszczową za pomocą nożyczek irydowych.</li>
		<li>Wprowadź ostrą końcówkę nożyczek irydologicznych do otworu wielkiego czaszki z jednej strony, a następnie ostrożnie przesuń je wzdłuż wewnętrznej powierzchni czaszki w kierunku zewnętrznego przylepcatka (znanego również jako kanał słuchowy).</li>
		<li>Powtórzyć nacięcie opisane w punkcie 3.1.4 po stronie przeciwległej i wykonać cięcie w linii środkowej wzdłuż wewnętrznej powierzchni kości ciemieniowej aż do początku szwu strzałkowego.</li>
		<li>Wprowadź nożyczki irydologiczne w kość czołową, dokładnie pomiędzy oczy, w szew strzałkowy, a następnie otwórz je, aby rozdzielić czaszkę na dwie części.</li>
		<li>Wyjmij mózg, chwyćce cebulki węchowe i użyj nożyczek irydowych, aby przeciąć połączenia nerwowe na jego powierzchni brzusznej.</li>
		<li>Wyjąć mózg i umieścić go w 60-mm szalce Petri z lodowatym PBS w celu izolacji CoW. Całkowicie zanurzyć mózg w PBS. Jeśli mózg został utrwalony w 4% PFA (do późniejszego krojenia i immunobarwienia lub barwienia rutynowego), należy go przechowywać w kąpieli z 4% PFA w 4 °C przez 24 h.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Izolacja kręgu Willisa 
	UWAGA: Do izolacji CoW wymagany jest mikroskop stereoskopowy. Mózg należy przechowywać w temperaturze 4 °C przez cały czas trwania procedury.
	<ol>
		<li>Umieść mózg odwrócony do góry nogami (t. j. (na jego powierzchni grzbietowej) w celu wizualizacji CoW.</li>
		<li>Użyj małej pęsety, aby chwycić tętnice mózgu przednie (ACA) u podstawy płatów węchowych (a, Rycina 1) i wywrzeć nacisk, aby oddzielić je od ciągłości naczynia. Tą samą procedurą należy przeciąć tętnice mózgu środkowego (MCA) w b (Rysunek 1).</li>
		<li>Za pomocą ostrych końców pęsety unieś i usuń główne tętnice tworzące CoW z kory.</li>
		<li>Unieś początkowy odcinek tętnic komunikujących tylnych (PCA), aby odłączyć je od mózgowia, chwytając pęsetą tętnice środkowe mózgu (MCA). Chwyć tętnice przednie (ACA i MCA) i delikatnie przesuń je nad skrzyżowaniem wzrokowym w kierunku przednio-grzbietowym. Aby zapobiec przerwaniu ciągłości kręgu Willisa (CoW), przerwij procedurę, aby zająć się pozostałymi tętnicami.</li>
		<li>Powtórz kroki 3.2.2 i 3.2.3 dla górnej tętnicy móżdżkowej (SCA) i tylnej tętnicy mózgu (PCA) (c, Rycina 1) oraz dla tętnicy podstawnej (BA) (d, Rycina 1), pociągając je w kierunku grzbietowo-przednim. Należy zatrzymać się na etapie zakończenia procedury opisanej w punkcie 3.2.4.</li>
		<li>Usunąć całą korę węchową (CoW), delikatnie pociągając ją pęsetą. Umieścić CoW w 60-milimetrowej płytce Petriego wypełnionej lodowatym PBS i usunąć wszelką pozostałą przytwierdzoną tkankę mózgową za pomocą dwóch pęset, unieruchamiając CoW małymi szpilkami.</li>
		<li>Przechowywać pobrane CoW w temperaturze -80 °C do dalszej obróbki w celu oczyszczania RNA (ekstrakcja RNA pozwala na uzyskanie dużych ilości RNA — około 500 ng) lub ekstrakcji białek. 
		Uwaga: CoW można utrzymać ex vivo przez 24 h, adaptując układ kąpieli organowej opracowany dla izolowanej tętnicy węchowej myszy. 7</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
<img alt="Schemat okluzji tętnicy mózgowej z opisanymi tętnicami: ACA, MCA, PCA, SCA; w pobliżu znajduje się narzędzie chirurgiczne." src="/files/ftp_upload/54352/54352fig1.jpg" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Rysunek 1"> 
Rysunek 1: Schematyczny rysunek mózgu myszy w widoku brzusznym z zaznaczonym kręgiem Willisa (CoW). CoW jest tworzony przez dwie tętnice szyjne wewnętrzne (MCA), które wywodzą się z dwóch tętnic przednich mózgu (ACA); tętnica podstawna (BA) rozgałęzia się na tętnice tylne (PCA) i górne (SCA) mózgu oraz dwie tętnice kręgowe (VA).

<ol><li>Beckmann, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Age-dependent+cerebrovascular+abnormalities+and+blood+flow+disturbances+in+APP23+mice+modeling+Alzheimer%27s+disease%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Age-dependent cerebrovascular abnormalities and blood flow disturbances in APP23 mice modeling Alzheimer's disease.</a> J Neurosci. 23 (24), 8453-8459 (2003).</li>
<li>Sadasivan, C., Fiorella, D. J., Woo, H. H., Lieber, B. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Physical+factors+effecting+cerebral+aneurysm+pathophysiology%5BTitle%5D)+AND+%22Ann+Biomed+Eng%22%5BJournal%5D)">Physical factors effecting cerebral aneurysm pathophysiology.</a> Ann Biomed Eng. 41 (7), 1347-1365 (2013).</li>
<li>Ritz, K., Denswil, N., Stam, O., van Lieshout, J., Daemen, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cause+and+mechanisms+of+intracranial+atherosclerosis%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation%22%5BJournal%5D)">Cause and mechanisms of intracranial atherosclerosis.</a> Circulation. 130 (16), 1407-1414 (2014).</li>
<li>Tulamo, R., Frösen, J., Hernesniemi, J., Niemelä, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inflammatory+changes+in+the+aneurysm+wall%3A+a+review%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurointerv+Surg%22%5BJournal%5D)">Inflammatory changes in the aneurysm wall: a review.</a> J Neurointerv Surg. 2 (2), 120-130 (2009).</li>
<li>Yamada, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cerebral+amyloid+angiopathy%3A+emerging+concepts%5BTitle%5D)+AND+%22J+Stroke%22%5BJournal%5D)">Cerebral amyloid angiopathy: emerging concepts.</a> J Stroke. 17 (1), 17-30 (2015).</li>
<li>Oy, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intracranial+atherosclerotic+stroke%3A+specific+focus+on+the+metabolic+syndrome+and+inflammation%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Atheroscler+Rep%22%5BJournal%5D)">Intracranial atherosclerotic stroke: specific focus on the metabolic syndrome and inflammation.</a> Curr Atheroscler Rep. 8 (4), 330-336 (2006).</li>
<li>Lee, H. J., Dietrich, H. H., Han, B. H., Zipfel, G. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+an+ex+vivo+model+for+the+study+of+cerebrovascular+function+utilizing+isolated+mouse+olfactory+artery%5BTitle%5D)+AND+%22J+Korean+Neurosurg+Soc%22%5BJournal%5D)">Development of an ex vivo model for the study of cerebrovascular function utilizing isolated mouse olfactory artery.</a> J Korean Neurosurg Soc. 57 (1), 1-5 (2015).</li>
<li>Hosaka, K., Downes, D. P., Nowicki, K. W., Hoh, B. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modified+murine+intracranial+aneurysm+model%3A+aneurysm+formation+and+rupture+by+elastase+and+hypertension%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurointerv+Surg%22%5BJournal%5D)">Modified murine intracranial aneurysm model: aneurysm formation and rupture by elastase and hypertension.</a> J Neurointerv Surg. 6 (6), 474-479 (2013).</li>
<li>Gauthier, S. A., Sahoo, S., Jung, S. S., Levy, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Murine+cerebrovascular+cells+as+a+cell+culture+model+for+cerebral+amyloid+angiopathy%3A+isolation+of+smooth+muscle+and+endothelial+cells+from+mouse+brain%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Murine cerebrovascular cells as a cell culture model for cerebral amyloid angiopathy: isolation of smooth muscle and endothelial cells from mouse brain.</a> Methods Mol Biol. 849, 261-274 (2012).</li>
<li>Choi, S., Kim, J., Kim, K., Suh, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+and+in+vitro+culture+of+vascular+endothelial+cells+from+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Korean+J+Physiol+Pharmacol%22%5BJournal%5D)">Isolation and in vitro culture of vascular endothelial cells from mice.</a> Korean J Physiol Pharmacol. 19 (1), 35-42 (2015).</li>
<li>Peters, D. G., Kassam, A. B., Yonas, H., O'Hare, E. H., Ferrell, R. E., Brufsky, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comprehensive+transcript+analysis+in+small+quantitiesof+mRNA+by+SAGE-Lite%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">Comprehensive transcript analysis in small quantitiesof mRNA by SAGE-Lite.</a> Nucleic Acids Res. 27 (24), (1999).</li>
<li>Badhwar, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stanimirovic%2C+Hamel%2C+%26+Haqqani+The+proteome+of+mouse+cerebral+arteries%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cereb+Blood+Flow+Metab%22%5BJournal%5D)">Stanimirovic, Hamel, & Haqqani The proteome of mouse cerebral arteries.</a> J Cereb Blood Flow Metab. 34 (6), 1033-1046 (2014).</li>
<li>Castro, L., Brito, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Striatal+neurones+have+a+specific+ability+to+respond+to+phasic+dopamine+release%5BTitle%5D)+AND+%22J+Physiol%22%5BJournal%5D)">Striatal neurones have a specific ability to respond to phasic dopamine release.</a> J Physiol. 591 (13), 3197-3214 (2013).</li>
<li>Hübscher, D., Nikolaev, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+transgenic+mice+expressing+FRET+biosensors%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Generation of transgenic mice expressing FRET biosensors.</a> Methods Mol Biol. 1294, 117-129 (2015).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Opisujemy tutaj powtarzalny protokół izolacji kręgu Willisa. Najczęstszymi zaburzeniami naczyniowo-mózgowymi z udziałem krowy są waskulopatie związane z CAA, miażdżyca tętnic wewnątrzczaszkowych i tętniak wewnątrzczaszkowy, z których wszystkie wpływają na ściany naczyń tętniczych. Czynniki ryzyka są dobrze znane, ale patogeneza molekularna tych zaburzeń mózgowych pozostaje słabo poznana i brakuje specyficznych markerów biologicznych do przewidywania ich wystąpienia. Istnieje duże zainteresowanie metodami izolowania krowy...

Mózgowy krąg tętniczy (circulus arteriosus cerebri), znany również jako okrąg Willisa (CoW), pętla wielokąta Willisora) został po raz pierwszy opisany przez Thomasa Willisa w 1664 roku. Jest to zespolenie krążeniowe zlokalizowane wokół skrzyżowania wzrokowego i podwzgórza, które można uznać za centralny węzeł dostarczający krew do mózgu i otaczających go struktur. Krew dostaje się do tej struktury przez tętnice szyjne wewnętrzne i kręgowe i wypływa z koła przez wewnętrzne tętnice środkowe i tylne tętnice mózgowe. Każda z tych tętnic ma lewą i prawą odnogę po obu stronach koła. Tętnice podstawne, po komunikacji i przednie tętnice komunikacyjne zamykają krąg (ryc. 1 i ryc. 2). Ryzyko upośledzenia przepływu krwi w którejkolwiek z tętnic odpływowych jest zminimalizowane przez zlewanie się krwi wchodzącej do kręgu z tętnic szyjnych i mózgowych, gwarantując w ten sposób dostarczenie wystarczającej ilości krwi do mózgu. Struktura ta służy również jako główna droga obocznego przepływu krwi w ciężkich chorobach okluzyjnych tętnicy szyjnej wewnętrznej.
Kilka rodzajów zaburzeń naczyniowo-mózgowych ma swoje źródło w krowie. Najczęstsze z nich to naczynia krwionośne związane z mózgową angiopatią amyloidową (CAA), miażdżyca tętnic wewnątrzczaszkowych i tętniaki wewnątrzczaszkowe. 1,2,3 Zaburzenia te mogą prowadzić do hipoperfuzji z powodu rozszerzenia naczyń krwionośnych oraz krwotoków śródmózgowych i/lub podpajęczynówkowych, co ostatecznie przekłada się na udary niedokrwienne lub krwotoczne lub, w najlepszym razie, przemijający atak niedokrwienny. Ostatnie postępy w procedurach diagnostycznych, w tym neuroobrazowaniu, prawdopodobnie w połączeniu z angiografią, umożliwiły kliniczne zdiagnozowanie tych głównych chorób naczyń mózgowych, bez konieczności biopsji mózgu. Niemniej jednak obecnie brakuje skutecznych i specyficznych metod leczenia (farmakologicznego lub wewnątrznaczyniowego) i w związku z tym istnieje potrzeba zdefiniowania nowych celów molekularnych.
Identyfikacja nowych celów leków do zapobiegania tym chorobom u ludzi będzie wymagała modeli zwierzęcych i sposobów izolowania naczyń mózgowych, w tym krowy. Takie modele powinny dostarczyć dowodów i wskazówek dotyczących konkretnych zmian, w tym zmian zapalnych, zachodzących w ścianach dużych naczyń w modelach zwierzęcych tętniaka tętnicy wewnątrzczaszkowej, CAA lub miażdżycy śródczaszkowej. 4,5,6
Ustaliliśmy metodę izolacji krowy myszy, aby ułatwić badania nad zapaleniem naczyń w chorobie Alzheimera (AD) i chorobach pokrewnych, takich jak CAA. Ta metoda izolowania myszy CoW została opracowana do oceny ekspresji genów zapalnych naczyń mózgowych podczas progresji choroby. Wraz z wykryciem odkładania się beta amyloidu w ścianach tętnic oponowo-rdzeniowych i pialnych, metoda ta może ułatwić określenie możliwego związku między ekspresją genów zapalnych w ścianie mózgowo-naczyniowej a akumulacją peptydu Aβ. Sieć naczyniowa mózgu, w tym opona mózgowo-rdzeniowa i opona mózgowo-rdzeniowa w przestrzeni podpajęczynówkowej, jest przedłużeniem dużych tętnic tworzących koło Willisa. Opisana tutaj metoda może być wykorzystana do wyizolowania krowy z dowolnej linii myszy i może być stosowana do wszystkich rodzajów badań przesiewowych (np. ekspresji genów, produkcji białek i potranslacyjnych modyfikacji białek) na dużych naczyniach mózgowo-naczyniowych myszy.

<table><tbody><tr><td>Dulbecco' s Sól fizjologiczna buforowana fosforanami</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D8537</td><td></td></tr><tr><td>Dumont #55 Kleszcze</td><td>Precyzyjne narzędzia naukowe</td><td>11295-51</td><td></td></tr><tr><td>Hartowane nożyczki do drobnej tęczówki&nbsp;</td><td>Nożyczki Fine Science Tools</td><td>14090-11</td><td></td></tr><tr><td>- proste / ostre / ostre&nbsp; &nbsp; Narzędzia naukowe 16,5 cm</td><td></td><td>14002-16</td><td></td></tr><tr><td>Kleszcze do #7b Dumont&nbsp;</td><td>Fine Science Tools</td><td>11270-20</td><td></td></tr><tr><td>Stereoskopowy mikroskop zmiennoogniskowy</td><td>Nikon</td><td>SMZ745T</td><td></td></tr><tr><td>CellBIND Powierzchnia 60 mm Naczynie</td> hodowlane <td>Corning</td><td>#3295</td><td></td></tr><tr><td>Pompa perystaltyczna - MINIPULS 3</td><td>Gilson</td><td>M312</td><td></td></tr><tr><td>Pentobarbital Sodique</td><td>Ceva Sant&eacute; Animale</td><td>FR/V/2770465 3/1992</td><td></td></tr></tbody></table>

protokół izolowania mysiego kręgu willisa

Protocol for Isolating the Mouse Circle of Willis

Mózgowy krąg tętniczy (circulus arteriosus cerebri) lub krąg Willisa (CoW) to zespolenie krążeniowe otaczające skrzyżowanie wzrokowe i podwzgórze, które dostarcza krew do mózgu i otaczających go struktur. Jest zaangażowany w kilka zaburzeń naczyniowo-mózgowych, w tym unaczynienie związane z mózgową angiopatią amyloidową (CAA), miażdżycę wewnątrzczaszkową i tętniaki wewnątrzczaszkowe. Badania mechanizmów molekularnych leżących u podstaw tych chorób w celu identyfikacji nowych celów leków w celu ich zapobiegania wymagają modeli zwierzęcych. Niektóre z tych modeli mogą być transgeniczne, podczas gdy inne będą obejmować izolację naczyń mózgowych, w tym CoW.Opisana tutaj metoda jest odpowiednia do izolacji CoW w każdej linii myszy i ma znaczny potencjał w badaniach przesiewowych (ekspresja genów, produkcja białek, potranslacyjne modyfikacje białek, analiza sekretomu itp.) na dużych naczyniach mózgowo-naczyniowych myszy. Może być również stosowany do badań ex vivo, poprzez adaptację systemu kąpieli narządowej opracowanego dla izolowanych tętnic węchowych myszy.

Myszy po perfuzji PBS uśmierca się, a CoW izoluje zgodnie z opisem w sekcji 3.2 protokołu. Przy prawidłowo wykonanej dyssekcji CoW powinna zostać wyjęta w jednym kawałku i powinna być lekko przezroczysta ze względu na brak resztek krwi w naczyniach krwionośnych.
<img alt="Wzrost naczyń krwionośnych mózgu: eksperyment w szalce Petriego, opisowy schemat tętnicy, analiza sieci naczyniowej." src="/files/ftp_upload/54352/54352fig2.jp...

Opisujemy tutaj powtarzalny protokół izolowania mysiego kręgu Willisa.

Protokół izolowania mysiego kręgu Willisa

The cerebral arterial circle (circulus arteriosus cerebri) or circle of Willis (CoW) is a circulatory anastomosis surrounding the optic chiasma and ...

Ogólnym celem tej procedury sekcyjnej jest wyizolowanie kręgu Willisa u myszy, aby ułatwić badanie dużych naczyń naczyniówki mózgowej myszy. Metoda ta może pomóc w odpowiedzi na kluczowe pytania w badaniach nad ekspresją genów naczyniowych w różnych chorobach dotykających naczynia mózgowe, takich jak choroba Alzheimera i amyloidowa angiopatia mózgowa. Główną zaletą tej techniki jest możliwość szybkiej i łatwej izolacji dużych naczyń bez zmiany ich struktury.Rozpocznij od użycia nożyczek typu Iris do wykonania nacięcia o długości czterech centymetrów w ścianie brzucha i otrzewnej letalnie zanestezjowanej myszy, tuż poniżej klatki piersiowej. Następnie wykonaj nacięcie o długości kilku milimetrów w przeponie, kontynuując nacięcie wzdłuż całej długości klatki piersiowej, aby odsłonić jamę opłucnową. Podnieś mostek i zaciśnij jego koniec hemostatem, opierając hemostat o szyję.Następnie ostrożnie wytnij tkankę tłuszczową łączącą mostek z sercem. Teraz wprowadź igłę perfuzyjną o rozmiarze 15 G przez lewą komorę do szczytu serca, a za pomocą nożyczek przetnij jeden z płatów wątroby, aby stworzyć ujście dla perfuzatu. Przeprowadź perfuzję zwierzęcia 25 do 50 mililitrami PBS przy prędkości pompowania 2,5 mililitra na minutę przez około dziesięć minut.Wątroba powinna wyblaknąć w miarę zastępowania krwi przez PBS. Gdy płyn wypływający z wątroby stanie się całkowicie przejrzysty, należy przerwać perfuzję. Aby wyizolować mózg, należy użyć nożyczek irydowych do wykonania nacięcia w linii środkowej wzdłuż skóry od szyi do nosa.Odciąć skórę za pomocą nożyczek Iris, aby odsłonić czaszkę i usunąć wszelkie pozostałości tkanek mięśniowych i tłuszczowych. Następnie włożyć końcówki nożyczek Iris do jednej strony otworu wielkiego (foramen magnum) i ostrożnie przesunąć je wzdłuż wewnętrznej powierzchni czaszki w stronę zewnętrznego przewodu słuchowego. Wykonać podobne nacięcie po drugiej stronie otworu wielkiego, a następnie nacięcie w linii środkowej wzdłuż wewnętrznej powierzchni kości międzyparietalnej aż do początku szwu strzałkowego.Wprowadzić zamknięte nożyczki Iris w obrębie kości czołowej pomiędzy oczami, w szwie strzałkowym, a następnie rozewrzeć ostrza, aby rozdzielić czaszkę na dwie części. Za pomocą pęsety uchwycić opuszki węchowe i użyć nożyczek Iris do przecięcia połączeń nerwowych na brzusznej powierzchni mózgu. Następnie zanurzyć mózg w 60 milimetrowej czaszce Petriego z lodowatym PBS.Aby wyizolować krąg Willisa, przenieś szalkę na wkład chłodzący pod mikroskop stereoskopowy i odwróć mózg na powierzchnię grzbietową, aby uwidocznić krąg Willisa. Użyj małej pęsety, aby chwycić tętnice mózgu przednie u podstawy płatów węchowych, a następnie wywrzyj nacisk, aby oddzielić tętnice od ciągłości naczyniowej. W ten sam sposób przetnij tętnice mózgu środkowe.Następnie za pomocą ostrych końcówek pęsety chwyć tętnice mózgowe środkowe i unieś początki tętnic łączących tylnych, oddzielając oba zestawy tętnic od mózgu. Następnie unieś tętnice przednie, delikatnie przesuwając je nad skrzyżowaniem wzrokowym w kierunku przednio-grzbietowym. W ten sam sposób usuń górne i tylne tętnice móżdżkowe, a następnie odsunie tętnicę podstawną.Na koniec, za pomocą pęsety delikatnie przenieś cały krąg Willisa do 60-milimetrowej szalki Petriego zawierającej lodowaty PBS i unieruchom naczynia małymi szpilkami, używając dwóch pęset do ostrożnego usunięcia pozostałych tkanek mózgu. Krąg Willisa powinien zostać wyjęty w jednym kawałku i powinien być lekko przezroczysty ze względu na brak pozostałej krwi w naczyniach. Oczyszczony krąg Willisa powinien specyficznie wykazywać ekspresję markerów komórek mięśni gładkich naczyń, takich jak Smooth Muscle Actin, Smooth Muscle-Myosin Heavy Chain oraz Smoothelin.Z kolei markery neuronalne, takie jak glikoproteina mieliny oligodendrocytów lub białko 2 związane z mikrotubulami, powinny być w kręgu Willisa ledwie wykrywalne. Ponadto ekspresja markera śródbłonka, E-selektyny, w tkance nerwowej poza kręgiem Willisa jest bardzo podobna do tej uzyskanej dla próbek z kręgu Willisa, co prawdopodobnie odzwierciedla istnienie sieci naczyń włosowatych mózgu. Po opanowaniu techniki, przy jej prawidłowym wykonaniu, procedura ta może zostać zrealizowana w ciągu dwóch godzin.Podczas wykonywania tej procedury należy pamiętać, że naczynia mózgowe myszy są bardzo cienkie i łatwo ulegają uszkodzeniu. W związku z tym preparatykę należy przeprowadzić bardzo starannie, bez pośpiechu, aby zapewnić pobranie całej struktury w jednym kawałku. Po opracowaniu technika ta utoruje drogę badaczom w dziedzinie zapalnych chorób neurologicznych do badania zaburzeń naczyniowych mózgu w modelu mysim choroby Alzheimera oraz schorzeń pokrewnych, takich jak amyloidowa angiopatia mózgowa.Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze rozumieć sposób izolacji kręgu Willisa u myszy.

protocol-for-isolating-the-mouse-circle-of-willis

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Neuronauka

Ten film demonstruje procedurę izolowania komórek odpornościowych od mysich splotów naczyniówkowych. Ta procedura jest stosowana w badaniach neuroimmunologicznych, aby zrozumieć, w jaki sposób komórki odpornościowe w splocie naczyniówkowym wpływają na zdrowie mózgu i różne choroby neurologiczne.

Izolowanie komórek odpornościowych z mysich splotów naczyniówkowych

Wprowadzamy metodę chirurgiczną do wywoływania eksperymentalnego uszkodzenia niedokrwienia/reperfuzji (I/R) symulującego zawał mięśnia sercowego (MI) w modelach mysich, co pozwala na większą przejrzystość w umiejscowieniu podwiązania na lewej tętnicy zstępującej przedniej (LAD) w celu zwiększenia powtarzalności eksperymentów MI u myszy.

Mysi model uszkodzenia niedokrwienno-reperfuzyjnego mięśnia sercowego poprzez podwiązanie lewej tętnicy zstępującej przedniej

Stan zapalny odgrywa kluczową rolę w patogenezie udaru niedokrwiennego. Coraz więcej dowodów sugeruje, że działa jak miecz obosieczny, który zaostrza wczesne uszkodzenie mózgu, ale także przyczynia się do późniejszej naprawy. Protokół ten opisuje izolację komórek odpornościowych z niedokrwionego mózgu i ich późniejsze fenotypowanie metodą cytometrii przepływowej.

Izolacja i analiza cytometrii przepływowej komórek odpornościowych z niedokrwionego mózgu myszy

Celem tego protokołu jest zademonstrowanie technik izolacji i hodowli mysich pierwotnych komórek mięśni gładkich naczyń krwionośnych (VSMC) z krążenia wieńcowego. Po wyizolowaniu VSMC można je stosować w wielu standardowych technikach hodowli.

Izolacja mysich komórek mięśni gładkich naczyń wieńcowych

Opisano procedurę przygotowania en face tętnicy szyjnej i aorty myszy. Takie preparaty, po immunofluorescencyjnym wybarwieniu specyficznymi przeciwciałami, umożliwiają badanie lokalizacji białek i identyfikację typów komórek w obrębie całej ściany naczyniowej za pomocą mikroskopii konfokalnej.

En Face Przygotowanie naczyń krwionośnych myszy

Tutaj prezentujemy protokół izolacji zdrowych i funkcjonalnych pierwotnych hepatocytów myszy. Opracowano instrukcje dotyczące wykrywania powstającej syntezy białek wątrobowych za pomocą nieradioaktywnego substratu znakującego, aby pomóc w zrozumieniu mechanizmów leżących u podstaw syntezy białek w kontekście homeostazy metabolizmu energetycznego w wątrobie.

Izolacja pierwotnych hepatocytów myszy do analizy powstającej syntezy białek metodą znakowania nieradioaktywnej L-azydohomoalaniny

Prezentowany tutaj jest protokół izolacji i amplifikacji tlenowych i fakultatywnych beztlenowych mysich bakterii komensalnych spojówek przy użyciu unikalnego wymazu z oka i etapu wzbogacania opartego na hodowli z późniejszą identyfikacją za pomocą metod mikrobiologicznych i spektrometrii mas MALDI-TOF.

Izolacja komensalna spojówek i identyfikacja u myszy

Złotym standardem w kardiologii dla komórkowych i molekularnych eksperymentów funkcjonalnych są kardiomiocyty. W artykule opisano adaptacje techniki innej niż Langendorff do izolowania kardiomiocytów myszy.

Prosta i skuteczna metoda konsekwentnego izolowania kardiomiocytów myszy

Tutaj przedstawiamy i demonstrujemy protokół izolacji pierwotnych komórek śródbłonka sinusoidalnego wątroby myszy (LSEC). Protokół opiera się na perfuzji kolagenazy wątrobowej, oczyszczaniu komórek niemiąższowych przez wirowanie z niską prędkością oraz selekcji kulek magnetycznych CD146. Zajmujemy się również fenotypowaniem i charakteryzacją tych izolowanych LSEC za pomocą cytometrii przepływowej i skaningowej mikroskopii elektronowej.

Izolacja i charakterystyka pierwotnych sinusoidalnych komórek śródbłonka wątroby myszy

Ten artykuł opisuje metodę izolacji mysich komórek śródbłonka z naczyń włosowatych limfatycznych skóry za pomocą kulek magnetycznych. Wyizolowane komórki śródbłonka limfatycznego można wykorzystać do dalszych eksperymentów in vitro i analizy ekspresji białek.

Mysia izolacja komórek śródbłonka limfatycznego skóry

Poznaj protokół izolacji mysiego kręgu Willisa w celu badania dużych naczyń mózgowych. Ta metoda umożliwia szybkie i łatwe uzyskanie nienaruszonej struktury naczyń.

Protokół izolowania mysiego kręgu Willisa

Przeglądaj więcej filmów