Protokół izolowania mysiego kręgu Willisa
22 października 2016
Opisujemy tutaj powtarzalny protokół izolowania mysiego kręgu Willisa.
Ogólnym celem tej procedury preparacji jest wyizolowanie mysiego kręgu Willisa, aby ułatwić badanie dużych naczyń mózgowo-naczyniowych myszy. Metoda ta może pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytania w badaniu ekspresji genów naczyniowo-mózgowych w różnych chorobach wpływających na naczynia mózgowe, takich jak choroba Alzheimera i angiopatia ameloidowa mózgu. Główną zaletą tej techniki jest to, że duże naczynia można szybko i łatwo odizolować bez zmiany struktury naczynia.
Zacznij od użycia nożyczek tęczówki, aby wykonać czterocentymetrowe nacięcie w ścianie brzucha i otrzewnej śmiertelnie znieczulonej myszy tuż pod klatką piersiową. Następnie wykonaj kilkumilimetrowe nacięcie w przeponie, kontynuując nacięcie na całej długości klatki piersiowej, aby odsłonić jamę opłucnej. Podnieś mostek i zaciśnij końcówkę hemostatem, opierając hemostat na szyi.
Następnie ostrożnie przyciąć tkankę tłuszczową łączącą mostek z sercem. Teraz przełóż igłę o rozmiarze 15 przez lewą komorę do wierzchołka serca i użyj nożyczek, aby przeciąć jeden z płatów wątroby, aby stworzyć ujście dla perfuzatu. Wykonaj fuzję zwierzęcia z 25 do 50 mililitrami PBS z szybkością pompowania 2,5 mililitra na minutę przez około dziesięć minut.
Wątroba powinna zblednąć, gdy krew zostanie zastąpiona PBS. Gdy płyn z wątroby jest całkowicie czysty, zatrzymaj perfuzję. Aby wyizolować mózg, użyj nożyczek tęczówki, aby wykonać nacięcie w linii środkowej wzdłuż skóry od szyi do nosa.
Przytnij skórę nożyczkami Iris, aby odsłonić czaszkę i usunąć resztki mięśni i tkanki tłuszczowej. Następnie umieść końcówki nożyczek tęczówki po jednej stronie otworu wielkiego i ostrożnie przesuń końcówki wzdłuż wewnętrznej powierzchni czaszki do zewnętrznego przewodu słuchowego. Wykonaj podobne nacięcie po drugiej stronie otworu wielkiego, a następnie linię środkową przeciętą wzdłuż wewnętrznej powierzchni kości międzyciemieniowej do początku szwu strzałkowego.
Umieść zamknięte nożyczki tęczówki w kości czołowej między oczami w szwie strzałkowym i otwórz ostrza, aby podzielić czaszkę na dwie części. Za pomocą kleszczy chwyć opuszki węchowe i użyj nożyczek tęczówki, aby odciąć połączenia nerwowe na brzusznej powierzchni mózgu. Następnie zanurz mózg w 60-milimetrowej szalce Petriego z lodowatym PBS.
Aby wyizolować krąg Willisa, przenieś naczynie na okład z lodu pod mikroskopem preparacyjnym i obróć mózg na jego grzbietową powierzchnię, aby uwidocznić krąg Willisa. Użyj małych kleszczy, aby chwycić przednie tętnice mózgowe u podstawy płatów węchowych i wywieraj nacisk, aby oddzielić tętnice od kontinuum naczynia. Przetnij środkowe tętnice mózgowe w ten sam sposób.
Następnie użyj ostrych końców kleszczy, aby chwycić środkowe tętnice mózgowe i podnieść początek tylnych tętnic łączących, odłączając oba zestawy tętnic od mózgu. Następnie podnieś tętnice przednie, delikatnie przeciągając je nad skrzyżowaniem wzrokowym w przednim kierunku grzbietowym. W ten sam sposób usuń tętnice móżdżkowe górne i tylne, a następnie przemieszczenie tętnicy podstawnej.
Na koniec użyj kleszczy, aby delikatnie przenieść cały krąg Willisa na 60-milimetrową szalkę Petriego zawierającą lodowaty PBS i przymocuj naczynia na miejscu za pomocą małych szpilek, używając dwóch kleszczy, aby ostrożnie usunąć pozostałą tkankę mózgową. Krąg Willisa powinien wyjść w jednym kawałku i powinien być lekko przezroczysty ze względu na brak resztkowej krwi w układzie naczyniowym. Czysty krąg Willisa powinien specyficznie wyrażać markery komórek mięśni gładkich naczyń krwionośnych, takie jak aktyna mięśni gładkich, ciężki łańcuch mięśni gładkich i miozyny oraz smoothelina.
Markery neuronalne, takie jak glikoproteina oligodendrocytów mieliny lub białko 2 związane z mikrotubulami, powinny być ledwo wykrywalne w kręgu Willisa. Co więcej, ekspresja markera śródbłonka, E-selektyny, w tkance nerwowej Willisa poza okręgiem jest bardzo podobna do tej uzyskanej dla kręgu próbek Willisa, co może odzwierciedlać istnienie sieci mózg-naczynia włosowate. Po opanowaniu tej techniki można ją wykonać w ciągu dwóch godzin, jeśli zostanie wykonana prawidłowo.
Próbując wykonać tę procedurę, należy pamiętać, że naczynia mózgowe myszy są bardzo cienkie i łatwo pękają. Dlatego sekcję należy przeprowadzić bardzo ostrożnie, bez pośpiechu, aby upewnić się, że cała konstrukcja zostanie zebrana w jednym kawałku. Po opracowaniu, technika ta toruje drogę naukowcom zajmującym się zapalnymi chorobami układu nerwowego do zbadania zaburzeń naczyniowych mózgu w mysim modelu choroby Alzheimera i chorób pokrewnych, takich jak angiopatia amyloidowa mózgu.
Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak odizolować krąg Willisa od myszy.
Wyświetl pełny transkrypt i uzyskaj dostęp do tysięcy filmów naukowych
Przegląd
Niniejszy artykuł przedstawia powtarzalny protokół izolacji kręgu Willisa u myszy, co jest kluczowe dla badania naczyń mózgowych. Metoda ta pozwala na szybką i łatwą izolację dużych naczyń bez zmiany ich struktury.
Kluczowe elementy badania
Dziedzina nauki
- Neuronauka
- Badania nad naczyniami mózgowymi
- Modele mysie
Wstęp
- Krąg Willisa jest kluczową strukturą w naczyniach mózgowych myszy.
- Zrozumienie ekspresji genów w naczyniach mózgowych jest niezbędne do badania chorób takich jak choroba Alzheimera.
- Izolowanie dużych naczyń może dostarczyć informacji na temat stanu naczyń mózgowych.
- Technika ta zwiększa możliwość badania wpływu różnych chorób na naczynia mózgowe.
Cel badania
- Opracowanie metody izolacji kręgu Willisa u myszy.
- Ułatwienie badań nad ekspresją genów w naczyniach mózgowych.
- Poprawa zrozumienia chorób dotykających naczynia mózgowe.
Zastosowane metody
- Disekcja ściany brzucha i otrzewnej za pomocą nożyczek irydowych.
- Nacięcie przepony w celu odsłonięcia jamy opłucnej.
- Zaciśnięcie mostka w celu uzyskania dostępu do kręgu Willisa.
- Zachowanie struktury naczyń podczas izolacji.
Główne wyniki
- Protokół umożliwia skuteczną izolację kręgu Willisa.
- Duże naczynia mogą być badane bez zmian strukturalnych.
- Metodę tę można zastosować w różnych badaniach naczyniowo-mózgowych.
- Ułatwia badania nad ekspresją genów związanych z chorobami naczyniowo-mózgowymi.
Wnioski
- Opisany protokół jest powtarzalny i wydajny.
- Stanowi on cenne narzędzie dla badaczy zajmujących się zdrowiem naczyniowo-mózgowym.
- W przyszłych badaniach można wykorzystać tę metodę do zgłębiania mechanizmów chorobowych.
Najczęściej zadawane pytania
Znaczenie dla przemysłu
Izolacja kręgu Willisa u myszy umożliwia bezpośrednią analizę ekspresji genów naczyniowych w modelach chorób, co wspiera walidację celów terapeutycznych w zaburzeniach neurodegeneracyjnych i naczyniowych. Ta metoda preparatyki zapewnia odtwarzalne źródło dużych naczyń do przesiewu molekularnego, ułatwiając wczesne odkrywanie biomarkerów oraz zrozumienie mechanizmów patogenetycznych. Dzięki zachowaniu struktury naczyniowej metoda ta zwiększa pewność prognostyczną w przedklinicznej ocenie ryzyka celów terapeutycznych dla choroby Alzheimera oraz mózgowej amyloidowej angiopatii.
Strategiczne zastosowania w badaniach i rozwoju biofarmaceutycznym
Wczesne etapy odkrywania i walidacja celu
- Wartość naukowa: Umożliwia badanie markerów mięśni gładkich naczyń i śródbłonka w istotnych dla choroby tkankach mózgowonaczyniowych.
- Wartość operacyjna: Zapewnia spójny system biologiczny do oceny stopnia zaangażowania celu oraz modulacji szlaków sygnałowych.
- Wartość prognostyczna: Wspiera testowanie hipotez dotyczących zmian w ekspresji genów związanych z modelami choroby Alzheimera i mózgowej amyloidowej angiopatii.
Przesiewanie i opracowanie testu
- Wartość naukowa: Umożliwia ilościową analizę ekspresji białek, modyfikacji potranslacyjnych oraz profili sekretomu z izolowanych naczyń.
- Wartość operacyjna: Pozwala na przygotowanie zestandaryzowanych preparatów tkankowych odpowiednich do analiz multipleksowych i przesiewania biomarkerów.
- Gotowość do analizy: Umożliwia skalowalne przygotowanie próbek naczyniowo-mózgowych do procesów wysokoprzepustowego przesiewania.
Badania translacyjne i przedkliniczne
- Ciągłość translacyjna: Łączy etap identyfikacji naczyniowych celów terapeutycznych z walidacją przedkliniczną w mysich modelach chorób.
- Ograniczanie ryzyka mechanistycznego: Wyjaśnia wpływ czynników naczyniowych mózgu na neurodegenerację, zmniejszając niejednoznaczność w wyborze celów terapeutycznych.
- Relewantność chorobowa: Bezpośrednio modeluje ludzkie patologie naczyniowe mózgu, w tym amyloidową angiopatię mózgu oraz miażdżycę.
Integracja potoku i przepływu pracy
Metoda ta wpisuje się w kontinuum procesu odkrywania leków, zapewniając izolowaną tkankę naczyniową mózgu do walidacji celu, opracowania testów oraz badań mechanistycznych przed etapem identyfikacji związku wiodącego.
- Biologia odkrywcza: Wspiera badanie ekspresji genów naczyniowo-mózgowych w modelach chorobowych w oparciu o postawione hipotezy.
- Przesiewanie: Dostarcza powtarzalnych preparatów naczyniowych do profilowania ekspresji biomarkerów i punktów uchwytu.
- Analityka: Umożliwia ilościowe pomiary, takie jak Western blot, immunofluorescencja i ELISA, dla specyficznych celów naczyniowych.
- Badania translacyjne: Łączy odkrycia molekularne w izolowanych naczyniach z procesami patofizjologicznymi w modelach przedklinicznych.
- Ponowne wykorzystanie w przedsiębiorstwie: Ustanawia powtarzalny protokół sekcji do walidacji celów naczyniowo-mózgowych w wielu projektach.
Wpływ operacyjny i przedsiębiorczy
- Wartość naukowa: Zwiększa pewność walidacji celu poprzez umożliwienie bezpośredniej analizy istotnych dla choroby tkanek naczyniowo-mózgowych.
- Wartość operacyjna: Zapewnia powtarzalność i standaryzację izolacji naczyń w różnych laboratoriach i badaniach.
- Wartość strategiczna: Poprawia proces podejmowania decyzji go/no-go poprzez redukcję niepewności biologicznej w wyborze celu naczyniowo-mózgowego.
- Wpływ na portfolio: Wspiera priorytetyzację celów z uwzględnieniem ryzyka w oparciu o ekspresję naczyniową i istotność szlaków sygnałowych.
Uwagi dotyczące wdrożenia
- Wymagana jest biegłość w sekcji myszy oraz w znajomości anatomii naczyń mózgowych pod mikroskopem.
- Procedura zależy od dostępności sprzętu do perfuzji, nożyczek Iris, pęset oraz zimnego PBS do zachowania tkanek naczyniowych.
- Konieczna jest standaryzacja czasu i techniki sekcji w celu zapewnienia integralności strukturalnej.
- Należy uwzględnić zmienność biologiczną w zakresie wielkości i rozgałęzień naczyń w zależności od szczepu i wieku myszy.
- Metoda jest ograniczona do końcowej analizy molekularnej; nie nadaje się do funkcjonalnych badań w czasie rzeczywistym ani do obrazowania żywych tkanek.
