Name: Zewnętrzne wzbudzenie neuronów za pomocą pól elektrycznych i magnetycznych w kulturach jedno- i dwuwymiarowych (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-05-07T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 32 s
Description: Poznaj metody zewnętrznej stymulacji elektrycznej i magnetycznej neuronów w kulturach jedno- i dwuwymiarowych. Techniki te umożliwiają pomiar parametrów pobudzenia nerwowego, takich jak chronaksja i reobaza, oraz pomagają w diagnozowaniu i leczeniu zaburzeń mózgu.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Autorzy dziękują Oferowi Feinermanowi, Fredowi Wolfowi, Menahemowi Segalowi, Andreasowi Neefowi i Eitanowi Reuveny'emu za bardzo pomocne dyskusje. Autorzy dziękują Ilanowi Breskinowi i Jordiemu Soriano za opracowanie wczesnych wersji technologii. Autorzy dziękują Cwi Tlusty'emu i Jean-Pierre'owi Eckmannowi za pomoc w opracowaniu koncepcji teoretycznych. Badania te były wspierane przez Fundację Minerva, Ministerstwo Nauki i Technologii Izraela oraz przez grant 1320/09 Izraelskiej Fundacji Nauki i grant Bi-National Science Foundation 2008331.

<ol><li>Nagarajan, S. S., Durand, D. M., Warman, E. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+induced+electric+fields+on+finite+neuronal+structures%3A+a+simulation+study%5BTitle%5D)+AND+%22IEEE+Trans+Biomed+Eng%22%5BJournal%5D)">Effects of induced electric fields on finite neuronal structures: a simulation study.</a> IEEE Trans Biomed Eng. 40 (11), 1175-1188 (1993).</li>
<li>Nowak, L. G., Bullier, J. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/9504844">Axons but not cell bodies, are activated by electrical stimulation in cortical gray matter. II. Evidence from selective inactivation of cell bodies and axon initial segments.</a> Exp Brain Res. 118 (4), 489-500 (1998).</li>
<li>Ranck, J. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Which+elements+are+excited+in+electrical+stimulation+of+mammalian+central+nervous+system%3A+a+review%5BTitle%5D)+AND+%22Brain+Res%22%5BJournal%5D)">Which elements are excited in electrical stimulation of mammalian central nervous system: a review.</a> Brain Res. 98 (3), 417-440 (1975).</li>
<li>Rattay, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+basic+mechanism+for+the+electrical+stimulation+of+the+nervous+system%5BTitle%5D)+AND+%22Neuroscience%22%5BJournal%5D)">The basic mechanism for the electrical stimulation of the nervous system.</a> Neuroscience. 89 (2), 335-346 (1999).</li>
<li>Stern, S., Agudelo-Toro, A., Rotem, A., Moses, E., Neef, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chronaxie+Measurements+in+Patterned+Neuronal+Cultures+from+Rat+Hippocampus%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Chronaxie Measurements in Patterned Neuronal Cultures from Rat Hippocampus.</a> PLoS One. 10 (7), e0132577(2015).</li>
<li>Brunelin, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Examining+transcranial+direct-current+stimulation+%28tDCS%29+as+a+treatment+for+hallucinations+in+schizophrenia%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Psychiatry%22%5BJournal%5D)">Examining transcranial direct-current stimulation (tDCS) as a treatment for hallucinations in schizophrenia.</a> Am J Psychiatry. 169 (7), 719-724 (2012).</li>
<li>Cruccu, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((EFNS+guidelines+on+neurostimulation+therapy+for+neuropathic+pain%5BTitle%5D)+AND+%22Eur+J+Neurol%22%5BJournal%5D)">EFNS guidelines on neurostimulation therapy for neuropathic pain.</a> Eur J Neurol. 14 (9), 952-970 (2007).</li>
<li>Kennedy, S. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Canadian+Network+for+Mood+and+Anxiety+Treatments+%28CANMAT%29+Clinical+guidelines+for+the+management+of+major+depressive+disorder+in+adults.+IV.+Neurostimulation+therapies%5BTitle%5D)+AND+%22J+Affect+Disord%22%5BJournal%5D)">Canadian Network for Mood and Anxiety Treatments (CANMAT) Clinical guidelines for the management of major depressive disorder in adults. IV. Neurostimulation therapies.</a> J Affect Disord. 117, Suppl 1. S44-S53 (2009).</li>
<li>Minzenberg, M. J., Carter, C. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Developing+treatments+for+impaired+cognition+in+schizophrenia%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Cogn+Sci%22%5BJournal%5D)">Developing treatments for impaired cognition in schizophrenia.</a> Trends Cogn Sci. 16 (1), 35-42 (2012).</li>
<li>Vaidya, N. A., Mahableshwarkar, A. R., Shahid, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Continuation+and+maintenance+ECT+in+treatment-resistant+bipolar+disorder%5BTitle%5D)+AND+%22J+ECT%22%5BJournal%5D)">Continuation and maintenance ECT in treatment-resistant bipolar disorder.</a> J ECT. 19 (1), 10-16 (2003).</li>
<li>Bartlett, W. P., Banker, G. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+electron+microscopic+study+of+the+development+of+axons+and+dendrites+by+hippocampal+neurons+in+culture.+II.+Synaptic+relationships%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">An electron microscopic study of the development of axons and dendrites by hippocampal neurons in culture. II. Synaptic relationships.</a> J Neurosci. 4 (8), 1954-1965 (1984).</li>
<li>Bartlett, W. P., Banker, G. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+electron+microscopic+study+of+the+development+of+axons+and+dendrites+by+hippocampal+neurons+in+culture.+I.+Cells+which+develop+without+intercellular+contacts%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">An electron microscopic study of the development of axons and dendrites by hippocampal neurons in culture. I. Cells which develop without intercellular contacts.</a> J Neurosci. 4 (8), 1944-1953 (1984).</li>
<li>Beggs, J. M., Plenz, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neuronal+avalanches+in+neocortical+circuits%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Neuronal avalanches in neocortical circuits.</a> J Neurosci. 23 (35), 11167-11177 (2003).</li>
<li>Breskin, I., Soriano, J., Moses, E., Tlusty, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Percolation+in+living+neural+networks%5BTitle%5D)+AND+%22Phys+Rev+Lett%22%5BJournal%5D)">Percolation in living neural networks.</a> Phys Rev Lett. 97 (18), (2006).</li>
<li>Feinerman, O., Moses, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transport+of+information+along+unidimensional+layered+networks+of+dissociated+hippocampal+neurons+and+implications+for+rate+coding%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Transport of information along unidimensional layered networks of dissociated hippocampal neurons and implications for rate coding.</a> J Neurosci. 26 (17), 4526-4534 (2006).</li>
<li>Soriano, J., Rodriguez Martinez,, Tlusty, M., T,, Moses, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+input+connections+in+neural+cultures%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Development of input connections in neural cultures.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 105 (37), 13758-13763 (2008).</li>
<li>Deisseroth, K. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/21191368">Optogenetics.</a> Nat Methods. 8 (1), 26-29 (2011).</li>
<li>Fenno, L., Yizhar, O., Deisseroth, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+development+and+application+of+optogenetics%5BTitle%5D)+AND+%22Annu+Rev+Neurosci%22%5BJournal%5D)">The development and application of optogenetics.</a> Annu Rev Neurosci. 34, 389-412 (2011).</li>
<li>Williams, S. C., Deisseroth, K. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/24106299">Optogenetics.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 110 (41), 16287(2013).</li>
<li>Rotem, A., Moses, E. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/16532767">Magnetic stimulation of curved nerves.</a> IEEE Trans Biomed Eng. 53 (3), 414-420 (2006).</li>
<li>Rotem, A., Moses, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Magnetic+stimulation+of+one-dimensional+neuronal+cultures%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys+J%22%5BJournal%5D)">Magnetic stimulation of one-dimensional neuronal cultures.</a> Biophys J. 94 (12), 5065-5078 (2008).</li>
<li>Feinerman, O., Moses, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+picoliter+%27fountain-pen%27+using+co-axial+dual+pipettes%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci+Methods%22%5BJournal%5D)">A picoliter 'fountain-pen' using co-axial dual pipettes.</a> J Neurosci Methods. 127 (1), 75-84 (2003).</li>
<li>Feinerman, O., Segal, M., Moses, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Signal+propagation+along+unidimensional+neuronal+networks%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurophysiol%22%5BJournal%5D)">Signal propagation along unidimensional neuronal networks.</a> J Neurophysiol. 94 (5), 3406-3416 (2005).</li>
<li>Papa, M., Bundman, M. C., Greenberger, V., Segal, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Morphological+analysis+of+dendritic+spine+development+in+primary+cultures+of+hippocampal+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Morphological analysis of dendritic spine development in primary cultures of hippocampal neurons.</a> J Neurosci. 15 (1 Pt 1), 1-11 (1995).</li>
<li>Bikson, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+uniform+extracellular+DC+electric+fields+on+excitability+in+rat+hippocampal+slices+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22J+Physiol%22%5BJournal%5D)">Effects of uniform extracellular DC electric fields on excitability in rat hippocampal slices in vitro.</a> J Physiol. 557 (1), 175-190 (2004).</li>
<li>Rahman, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cellular+effects+of+acute+direct+current+stimulation%3A+somatic+and+synaptic+terminal+effects%5BTitle%5D)+AND+%22J+Physiol%22%5BJournal%5D)">Cellular effects of acute direct current stimulation: somatic and synaptic terminal effects.</a> J Physiol. 591 (10), 2563-2578 (2013).</li>
<li>Stern, S., Segal, M., Moses, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Involvement+of+Potassium+and+Cation+Channels+in+Hippocampal+Abnormalities+of+Embryonic+Ts65Dn+and+Tc1+Trisomic+Mice%5BTitle%5D)+AND+%22EBioMedicine%22%5BJournal%5D)">Involvement of Potassium and Cation Channels in Hippocampal Abnormalities of Embryonic Ts65Dn and Tc1 Trisomic Mice.</a> EBioMedicine. 2 (9), 1048-1062 (2015).</li>
<li>Rotem, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Solving+the+orientation+specific+constraints+in+transcranial+magnetic+stimulation+by+rotating+fields%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Solving the orientation specific constraints in transcranial magnetic stimulation by rotating fields.</a> PLoS One. 9 (2), e86794(2014).</li>
<li>Feinerman, O., Rotem, A., Moses, E. <a target="_blank" href="http://www.nature.com/nphys/journal/v4/n12/abs/nphys1099.html">Reliable neuronal logic devices from patterned hippocampal cultures.</a> Nat Phys. 4 (12), 967-973 (2008).</li>
<li>Kleinfeld, D., Kahler, K. H., Hockberger, P. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Controlled+outgrowth+of+dissociated+neurons+on+patterned+substrates%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Controlled outgrowth of dissociated neurons on patterned substrates.</a> J Neurosci. 8 (11), 4098-4120 (1988).</li>
<li>Bugnicourt, G., Brocard, J., Nicolas, A., Villard, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nanoscale+surface+topography+reshapes+neuronal+growth+in+culture%5BTitle%5D)+AND+%22Langmuir%22%5BJournal%5D)">Nanoscale surface topography reshapes neuronal growth in culture.</a> Langmuir. 30 (15), 4441-4449 (2014).</li>
<li>Roth, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neuronal+architectures+with+axo-dendritic+polarity+above+silicon+nanowires%5BTitle%5D)+AND+%22Small%22%5BJournal%5D)">Neuronal architectures with axo-dendritic polarity above silicon nanowires.</a> Small. 8 (5), 671-675 (2012).</li>
<li>Peyrin, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Axon+diodes+for+the+reconstruction+of+oriented+neuronal+networks+in+microfluidic+chambers%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+Chip%22%5BJournal%5D)">Axon diodes for the reconstruction of oriented neuronal networks in microfluidic chambers.</a> Lab Chip. 11 (21), 3663-3673 (2011).</li>
<li>Renault, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Combining+microfluidics%2C+optogenetics+and+calcium+imaging+to+study+neuronal+communication+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Combining microfluidics, optogenetics and calcium imaging to study neuronal communication in vitro.</a> PLoS One. 10 (4), e0120680(2015).</li>
<li>Roth, B. J., Basser, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+model+of+the+stimulation+of+a+nerve+fiber+by+electromagnetic+induction%5BTitle%5D)+AND+%22IEEE+Trans+Biomed+Eng%22%5BJournal%5D)">A model of the stimulation of a nerve fiber by electromagnetic induction.</a> IEEE Trans Biomed Eng. 37 (6), 588-597 (1990).</li>
</ol>

Autorzy oświadczają, że nie mają konkurencyjnych interesów finansowych.

Tworzenie wzorów 1D jest ważnym narzędziem, które można wykorzystać do różnych zastosowań. Na przykład użyliśmy wzorców 1D do tworzenia bramek logicznych z kultur neuronalnych 29 , a ostatnio do pomiaru Chronaxie i Rheobase neuronów hipokampa szczura 5 oraz spowolnienia prędkości propagacji sygnału aktywności wypalania w neuronach hipokampa zespołu Downa w porównaniu z neuronami hipokampa typu dzikiego (WT) 27. Sugerowany protokół tworzenia wzorów 1D...

Interakcja między neuronami a zewnętrznymi polami elektrycznymi ma zarówno fundamentalne, jak i praktyczne implikacje. Chociaż od czasów Volty wiadomo, że zewnętrznie przyłożone pole elektryczne może pobudzać tkankę, mechanizmy odpowiedzialne za wytwarzanie wynikowego potencjału czynnościowego w neuronach dopiero niedawno zaczynają być odkrywane 1,2,3,4. Obejmuje to znalezienie odpowiedzi na pytania dotyczące mechanizmu powodującego depolaryzację potencjału błonowego, roli właściwości błony i kanałów jonowych, a nawet regionu neuronu, który reaguje na pole elektryczne 2,5. Neurostymulacja terapeutyczna 6,7,8,9,10 metodologie są szczególnie zależne od tych informacji, które mogą być kluczowe dla ukierunkowania na dotknięte obszary i zrozumienia wyniku terapii. Takie zrozumienie może również pomóc w opracowaniu protokołów leczenia i nowych podejść do stymulacji różnych obszarów mózgu.
Pomiar interakcji w mózgu in vivo dodaje ważny element do tego zrozumienia, ale jest utrudniony przez nieprecyzyjność i niską kontrolowalność pomiarów wewnątrz czaszki. W przeciwieństwie do tego, pomiary w kulturach mogą być łatwo wykonywane w dużych ilościach z dużą precyzją, doskonałą wydajnością sygnału do szumu oraz wysokim stopniem odtwarzalności i kontroli. Korzystając z kultur, można wyjaśnić wiele różnych właściwości neuronalnych zachowania sieci zbiorowej 11,12,13,14,15,16. Podobnie, oczekuje się, że ten dobrze kontrolowany system będzie bardzo skuteczny w wyjaśnianiu mechanizmu, za pomocą którego działają inne metody stymulacji, na przykład, w jaki sposób otwieranie kanałów podczas stymulacji optycznej w optogenetycznie aktywnych neuronach 17,18,19 jest odpowiedzialne za tworzenie potencjału czynnościowego.
Tutaj nacisk kładziony jest na opisanie rozwoju i zrozumienia narzędzi, które mogą skutecznie pobudzać neuron za pomocą zewnętrznego pola elektrycznego. W artykule opisano przygotowanie dwuwymiarowych i jednowymiarowych wzorcowych kultur hipokampa, stymulację przy użyciu różnych konfiguracji i orientacji bezpośrednio przyłożonego pola elektrycznego przez elektrody do kąpieli, a na koniec stymulację dwuwymiarowych i wzorzystych kultur jednowymiarowych przez zmienne w czasie pole magnetyczne, które indukuje pole elektryczne 5,20,21.

<table><tbody><tr><td>APV</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A8054</td><td>Odłącz sieć. Wymienione w sekcji 2.4.2</td></tr><tr><td>B27 supp</td><td>Gibco</td><td>17504-044</td><td>Podłoże galwaniczne. Wspomniano w Sekcja 1.1.1</td></tr><tr><td>bicuculline</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>14343</td><td>Odłącz sieć. Wymieniony w sekcji 2.4.2</td></tr><tr><td>Boraks (dekahydrat tetraboranu sodu)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S9640</td><td>Bufor boranowy. Wymieniony w sekcji 1.1.2</td></tr><tr><td>Kwas borowy</td><td>Frutarom LTD</td><td>5550710</td><td>Bufor boranowy. Wymienione w sekcji 1.1.2</td></tr><tr><td>CaCl2 , 1 M</td><td>Fluka&nbsp;</td><td>21098</td><td>Rozwiązanie do nagrywania zewnątrzkomórkowego. Wspomniano w sekcji 1.5.2</td></tr><tr><td>CNQX</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C239</td><td>Odłącz sieć. Wspomniano w Sekcja 2.4.2</td></tr><tr><td>COMSOL</td><td>COMSOL Inc</td><td>Multiphysics 3.5</td><td>Symulacja numeryczna. Wymienione w sekcji 3.5.2</td></tr><tr><td>D-(+)-glukoza, 1 M</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>65146</td><td>Pożywka galwaniczna, Zewnątrzkomórkowy roztwór zapisu. Wymienione w sekcjach 1.1.1 i 1.5.2 Hodowle</td></tr><tr>komórkowe<td>D-PBS</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D8537</td><td>. Wymienione w sekcjach 1.2.4 i 1.2.6</td></tr><tr><td>FCS (FBS)</td> <td>Gibco</td><td>12657-029</td><td>Podłoże galwaniczne. Wspomniany w sekcji 1.1.1</td></tr><tr><td>Fibronectin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F1141</td><td>Bio Coating. Wspomniano w sekcji 1.2.6</td></tr><tr><td>Fluo4AM</td><td>Life technologies</td><td>F14201</td><td>Obrazowanie spontanicznej lub wywołanej aktywności. Wymienione w sekcjach 1.5.1, 1.5.3 i 1.5.5</td></tr><tr><td>FUDR</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F0503</td><td>Zmienianie podłoża. Wspomniano w sekcji 1.4.1</td></tr><tr><td>Gentamycyna</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G1272</td><td>Pożywka galwaniczna, Pożywka zmieniająca, Pożywka końcowa. Wymienione w sekcji 1.1.1</td></tr><tr><td>GlutaMAX 100x</td><td>Gibco</td><td>35050-038</td><td>Podłoże galwaniczne, Podłoże do wymiany, Podłoże końcowe. Wspomniany w sekcji 1.1.1</td></tr><tr><td>Hepes, 1 M</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H0887</td><td>Zewnątrzkomórkowy roztwór zapisu. Wspomniano w sekcji 1.5.2</td></tr><tr><td>HI HS</td><td>BI</td><td>04-124-1A</td><td>Podłoże galwaniczne, Medium zmieniające, Medium końcowe. Wymieniony w sekcjach 1.1.1, 1.4.1 i 1.4.2</td></tr><tr><td>KCl,&nbsp; 3 M</td><td>Merck</td><td>1049361000</td><td>Zewnątrzkomórkowe rozwiązanie do nagrywania. Wymienione w sekcji 1.5.2</td></tr><tr><td>Laminin&nbsp;</td><td>Powłoka biologiczna Sigma-Aldrich</td><td>L2020</td><td>. Wymienione w sekcji 1.2.6</td></tr><tr><td>MEM x 1</td><td>Gibco</td><td>21090-022</td><td>Podłoże galwaniczne, Podłoże zmieniające, Pożywka końcowa. Wymienione w sekcji 1.4.1&nbsp; &nbsp; &nbsp; 1.4.2</td></tr><tr><td>MgCl2 , 1 M</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M1028</td><td>Zewnątrzkomórkowy roztwór zapisu. Wymieniony w sekcji 1.5.2</td></tr><tr><td>NaCl, 4 M</td><td>Bio-Lab</td><td>19030591</td><td>Zewnątrzkomórkowy roztwór do zapisu. Wymienione w sekcji 1.5.2</td></tr><tr><td>Octadecanethiol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>01858</td><td>Czyszczenie szkiełek nakrywkowych pokrytych Cr-Au (kultury 1D). Wymienione w sekcji 1.2.3</td></tr><tr><td>Pluracare F108 NF Prill</td><td>BASF Corparation&nbsp;</td><td>50475278</td><td>Powłoka bio-odrzucająca, powłoka biologiczna. Wymienione w sekcjach 1.2.4 i 1.2.6</td></tr><tr><td>0,01% roztwór poli-L-lizyny&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>&nbsp; P47075</td><td>Promuj podział komórek. Wymieniony w sekcji 1.1.4</td></tr><tr><td>Sacharoza, 1 M</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S1888</td><td>Zewnątrzkomórkowy roztwór do nagrywania. Wymienione w sekcji 1.5.2</td></tr><tr><td>Tiol&nbsp;</td><td>Powłoka bio-odrzucająca Sigma-Aldrich</td><td>1858</td><td>. Wymienione w sekcji 1.2.3</td></tr><tr><td>URIDINE</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>U3750</td><td>Zmienianie podłoża. Wymienione w sekcji 1.4.1</td></tr><tr><td>Napylarka</td><td>AJA International, Inc</td><td>ATC Orion-5Series&nbsp;</td><td>powlekanie szkła cienkimi warstwami metalu. Wymienione w sekcji 1.2.2</td></tr><tr><td>Ploter pisakowy&nbsp;</td><td>Hewlett Packard&nbsp;</td><td>HP 7475A</td><td>Wytrawianie wzoru na powlekanym szkiełku nakrywkowym. Wymienione w sekcji 1.2.5</td></tr><tr><td>Przewody elektrod&nbsp;</td><td>A-M Systems, Carlsborg WA</td><td>767000</td><td>Elektryczna stymulacja kultur neuronalnych. Wymienione w sekcjach 2.1, 2.2, 2.3 i 2.4.5</td></tr><tr><td>Generator sygnału</td><td>BKPrecision</td><td>4079</td><td>Kształtowanie sygnału elektrycznego. Wspomniany w Rozdziale 2.3</td></tr><tr><td>Wzmacniacz</td><td>domowej roboty</td><td></td><td>Wzmocnienie napięcia sygnału z generatora sygnału do elektrod. Wymienione w rozdziale 2.3</td></tr><tr><td></td><td>Matryca zasilania&nbsp;</td><td>MPS-3005 LK-3&nbsp;</td><td>Zasilanie maszyny do napylania. Wspomniano w sekcji 1.2.2.3</td></tr><tr><td>Przezczaszkowa stymulacja magnetyczna</td><td>Magstim, Spring Gardens, UK</td><td>Rapid 2</td><td>Magnetyczna stymulacja hodowli neuronalnej. Wymienione w sekcjach 3.1, 3.3 i 3.4</td></tr><tr><td>Żywica epoksydowa</td><td>Cognis</td><td>Versamid 140</td><td>Odlewanie cewek domowej roboty. Wymienione w sekcji 3.4</td></tr><tr><td>Powłoka epoksydowa</td><td></td><td>EPON 815&nbsp;</td><td>Odlewanie cewek domowej roboty. Wymienione w sekcji 3.4</td></tr><tr><td>Druty platynowe o grubości 0,005 ''; Systemy AM,&nbsp;</td><td>&nbsp; Carlsborg WA</td><td>&nbsp; 767000</td><td>Elektryczna stymulacja kultur neuronalnych. Wspomniano w sekcji 2.1</td></tr><tr><td>Okrągła cewka magnetyczna</td><td>Domowa</td><td></td><td>stymulacja magnetyczna kultur neuronalnych. Wymienione w sekcji 3.3</td></tr><tr><td>WaveXpress SW</td><td>B& K Precyzja&nbsp;</td><td></td><td>Oprogramowanie do edycji przebiegów. Wspomniana w sekcji 2.1.32</td></tr><tr><td>Kamera Xion Ultra 897</td><td>Andor</td><td></td><td>Sensitive EMCCD. Wymienione w sekcji 2.4.4</td></tr></tbody></table>

zewnętrzne wzbudzenie neuronów za pomocą pól elektrycznych i magnetycznych w kulturach jedno- i dwuwymiarowych

External Excitation of Neurons Using Electric and Magnetic Fields in One- and Two-dimensional Cultures

Neuron uruchomi potencjał czynnościowy, gdy jego potencjał błonowy przekroczy pewien próg. W typowej aktywności mózgu dzieje się to w wyniku chemicznych danych wejściowych do jego synaps. Jednak neurony mogą być również pobudzane przez narzucone pole elektryczne. W szczególności ostatnie zastosowania kliniczne aktywują neurony poprzez zewnętrzne wytwarzanie pola elektrycznego. Dlatego interesujące jest zbadanie, w jaki sposób neuron reaguje na pole zewnętrzne i co powoduje potencjał czynnościowy. Na szczęście precyzyjne i kontrolowane zastosowanie zewnętrznego pola elektrycznego jest możliwe w przypadku embrionalnych komórek neuronalnych, które są wycinane, dysocjowane i hodowane w kulturach. Pozwala to na badanie tych pytań w wysoce powtarzalnym systemie.
W tym artykule omówiono niektóre techniki stosowane do kontrolowanego stosowania zewnętrznego pola elektrycznego na hodowlach neuronów. Sieci mogą być albo jednowymiarowe, czyli wzorzyste w formy linearne, albo mogą rosnąć na całej płaszczyźnie podłoża, a więc dwuwymiarowe. Ponadto wzbudzenie może być wytworzone przez bezpośrednie przyłożenie pola elektrycznego za pomocą elektrod zanurzonych w płynie (elektrody kąpielowe) lub przez indukcję pola elektrycznego za pomocą zdalnego wytwarzania impulsów magnetycznych.

Przedstawiony protokół umożliwia łatwe tworzenie wzorów w kulturach neuronalnych. W połączeniu z opracowanymi przez nas metodami stymulacji pozwala on na pomiar niektórych wewnętrznych właściwości neuronów, takich jak chronaksja i reobaza5, porównanie właściwości neuronów zdrowych i chorych27, znalezienie optymalnych sposobów stymulacji kultur w zależności od ich struktury oraz zastosowanie wielu innych nowatorskich podejść. Niektóre przykła...

Kultury neuronów są dobrym modelem do badania nowych technik stymulacji mózgu poprzez ich wpływ na pojedyncze neurony lub populację neuronów. Przedstawiono różne metody stymulacji wzorcowych kultur neuronalnych za pomocą pola elektrycznego wytwarzanego bezpośrednio przez elektrody kąpielowe lub indukowanego przez zmienne w czasie pole magnetyczne.

Zewnętrzne wzbudzenie neuronów za pomocą pól elektrycznych i magnetycznych w kulturach jedno- i dwuwymiarowych

A neuron will fire an action potential when its membrane potential exceeds a certain threshold. In typical activity of the brain, this occurs as a result ...

Ogólnym celem tego protokołu do elektrycznej i magnetycznej stymulacji kultur jednowymiarowych i dwuwymiarowych jest efektywne wykorzystanie kultur neuronalnych jako zredukowanego modelu stymulacji mózgu, z którego możemy wydobyć wgląd i ważne parametry. Korzystanie z naszego protokołu stymulacji elektrycznej z jednowymiarowymi kulturami pozwala nam mierzyć określone parametry związane z pobudzeniem neuronalnym, na przykład chronaksję i reozasadę w różnych przedziałach neuronu. Technika stymulacji magnetycznej pozwala nam porównać wpływ pól magnetycznych i elektrycznych na kultury neuronów.Model ten pozwala nam również lepiej diagnozować i leczyć zaburzenia mózgu. Proponujemy skuteczną i łatwą metodę hodowli wzorcowych sieci neuronowych w dowolnym wzorcu projektowym, nawet sieciach jednowymiarowych. Następnie możemy zorientować elektryczne i zmienne w czasie pola magnetyczne w odniesieniu do tych sieci, aby oddzielić i obserwować wkłady z różnych przedziałów neuronu.Główną zaletą tej techniki jest to, że nie wymaga ona udziału ludzi ani modeli zwierzęcych, co umożliwia obszerne i wyczerpujące poszukiwanie odpowiednich parametrów stymulacji neuronalnej. Procedurę zademonstrują Jurij Burniszew, technik z mojego laboratorium i Ami Eisen, doktorantka w laboratorium. Na początek przygotuj wzorzyste kultury neuronalne, umieszczając komórki nerwowe na szklanych szkiełkach nakrywkowych, częściowo wstępnie pokrytych warstwą bioodrzucającą.Aby to zrobić, wyczyść 25 milimetrów szkiełka nakrywkowe. I za pomocą maszyny do rozpylania pokryj szkiełko nakrywkowe warstwą bioodrzucającą. Dostosuj parametry do procesu osadzania, aby utworzyć warstwę składającą się z cienkiej warstwy chromu o długości od sześciu do 10 angstremów, która zapewnia stabilność powłoki, oraz warstwy złota o grubości 30 angstremów, zapewniającej powłoce reaktywność tiolu.Po zakończeniu procesu należy usunąć szkiełko nakrywkowe z maszyny do napylania i zbadać uzyskaną powłokę. Następnie zmontuj zmodyfikowany system plotera pisakowego, zastępując końcówkę atramentu pisaka pisaka ostrą metalową igłą do wytrawiania. Umieść arkusz gumy przyklejony do sztywnej płyty w ploterze, aby zapewnić solidną i cierną powierzchnię podczas trawienia.Następnie wyreguluj położenie arkusza, naciskając przyciski znajdujące się na ploterze. Po umieszczeniu gumowego arkusza na jego powierzchni odpipetuj niewielką kroplę wody i umieść na niej wstępnie powlekane szkiełko nakrywkowe. Następnie, za pomocą plotera, wytrawiaj warstwy metalu poprzez powtarzalne drapanie, generując linie o grubości 200 mikrometrów, aby stworzyć pożądane wzory.Przed elektrostymulacją umieść nasienne szkiełko nakrywkowe w komorze obrazowania. Aby stymulować komórki polem elektrycznym o stałym kierunku, należy użyć dwóch równoległych elektrod oddalonych od siebie o 11 milimetrów i umieszczonych po przeciwnych stronach kultury posianych na 13-milimetrowych szkiełkach nakrywkowych. Następnie zmontuj komorę do obrazowania hodowli i pasujący uchwyt elektrody tak, aby druty elektrodowe były zanurzone w pożywce zewnątrzkomórkowej i umieszczone jeden milimetr nad hodowlą.Następnie podłącz pojedynczą parę elektrod do wzmacniacza operacyjnego, który wzmacnia sygnał z generatora. Zastosuj pojedynczy impuls bipolarnej fali prostokątnej o 50% cyklu pracy i amplitudzie 22 woltów. Użyj fali bipolarnej bez składowej stałej, aby uniknąć elektrolizy, która może wystąpić na elektrodach.Zastosuj impuls trwający od 10 mikrosekund do czterech milisekund, aby zapewnić skuteczną stymulację, ale zapobiec uszkodzeniu komórek. Aby stymulować ogniwa polami elektrycznymi o zmieniającym się kierunku, użyj dwóch prostopadłych par elektrod. Upewnij się, że dwie pary elektrod, a także ich zaciski zasilania i monitorowania są całkowicie odizolowane elektrycznie od siebie i unoszą się nad ziemią.Aby zmienić orientację pola elektrycznego, zmień amplitudę napięcia przyłożonego do dwóch par elektrod. Następnie określ intensywność i kierunek wynikowego pola poprzez dodawanie wektorów. Aby wygenerować pole wirujące o stałej amplitudzie, należy przyłożyć falę sinusoidalną do jednej pary elektrod, jednocześnie zasilając drugą parę falą cosinusoidalną.Aby rozpocząć stymulację magnetyczną, umieść pod mikroskopem kulturę neuronalną, wyhodowaną w kształcie koła. Stymuluj kulturę za pomocą standardowej okrągłej cewki do stymulacji magnetycznej i stymulatora wspomagającego, które są dostępne na rynku. Aby stymulować kultury o niestandardowym natężeniu pola magnetycznego, podłącz specjalnie wykonaną cewkę stymulacji magnetycznej do specjalnie zbudowanego stymulatora.Następnie za pomocą wskaźnika laserowego wyrównaj środek kultury ze środkiem cewki, aby zapewnić skuteczną stymulację. Dostosuj pozycje cewki tak, aby pozostawała około pięciu milimetrów nad środkiem kultury. Po prawidłowym ustawieniu cewki stymulacyjnej, załaduj stymulator do potencjału do pięciu kilowoltów.Następnie, za pomocą przełącznika wysokoprądowego i wysokonapięciowego, rozładuj prąd wysokiego napięcia przez cewkę stymulacyjną, aby wygenerować impuls magnetyczny, który stymuluje aktywność hodowanych neuronów. Na koniec zamontuj cewkę odbiorczą w tej samej pozycji, co kultura neuronalna i zmierz intensywność generowanego pola magnetycznego. Schemat ten pokazuje, że poprzez przyłożenie różnych amplitud impulsów napięciowych do dwóch par elektrod, pola elektryczne mogą być zorientowane pod każdym kątem bez konieczności ręcznego obracania kultury.Oto przykładowe nagrania stanów przejściowych wapnia ze stymulacją elektryczną przy różnych przyłożonych napięciach. Przy zastosowaniu stałego czasu trwania pola elektrycznego, liczba neuronów, które wystrzeliwują i reagują na pole elektryczne, pokazuje skumulowany rozkład Gaussa w funkcji amplitudy napięcia. A to jest przykład krzywej siły-czasu trwania uzyskanej przy użyciu tego protokołu.W przypadku kultur pierścieniowych reagujących na pole magnetyczne wskaźnik powodzenia stymulacji rośnie wraz z promieniem hodowli. Ten wykres przedstawia zależność między rozmiarem pierścienia a natężeniem pola magnetycznego. Najbardziej udane wzbudzenia kultur polegają na nakładaniu się na siebie przestrzeni fazy dostępnej doświadczalnie i obszaru o wysokim prawdopodobieństwie.Po opanowaniu przygotowanie jednowymiarowych kultur można przeprowadzić w ciągu trzech do czterech godzin. Podczas wykonywania stymulacji elektrycznej i magnetycznej należy pamiętać, aby umożliwić pełne odzyskanie kultury z etapu stymulacji i upewnić się, że cały sprzęt unosi się w stosunku do podłoża elektrycznego. Postępując zgodnie z tą procedurą, można odpowiedzieć na inne pytania, takie jak hodowla neuronów z różnych obszarów mózgu, pomiar statystyk, na przykład neuronów korowych.Inną możliwością jest pomiar parametrów dowolnego neuronu modelowego choroby. Po opracowaniu, technika ta może utorować drogę do optymalizacji siły i czasu trwania potrzebnych do skutecznej i bezpiecznej stymulacji mózgu. Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak stworzyć dowolny pożądany wzór kultur neuronalnych i być w stanie stymulować je elektrycznie lub magnetycznie w celu badania interakcji neuronów z polami elektromagnetycznymi.

external-excitation-neurons-using-electric-magnetic-fields-one-two

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Neuronauka

Niniejszy protokół demonstruje metody wykorzystywane do tworzenia środowisk 2D i 3D w specjalnie zaprojektowanych komorach elektrotaktycznych, które umożliwiają śledzenie komórek in vivo/ex vivo przy użyciu rejestracji time-lapse na poziomie pojedynczych komórek, w celu zbadania galwanotaksji/elektrotaksji oraz innych odpowiedzi komórkowych na elektryczne pola (EFs) prądu stałego (DC).

Sterowana polem elektrycznym migracja kierunkowa komórek progenitorowych neuronów w środowiskach 2D i 3D

W tym protokole pokazujemy, jak konstruować niestandardowe komory, które pozwalają na zastosowanie pola elektrycznego prądu stałego, aby umożliwić obrazowanie poklatkowe translokacji komórek prekursorowych pochodzenia nerwowego w dorosłym mózgu podczas galwanotaksji.

Test galwanotaksji do analizy kinetyki migracji neuronalnych komórek prekursorowych w zewnętrznie przyłożonym polu elektrycznym prądu stałego

Ten film pokazuje rozwój hodowli neuronów 3D połączonej z planarnym układem mikroelektrod z neuronami hipokampa. Izolowane neurony tworzą sieć 2D w obszarze aktywnym układu mikroelektrod i przylegają do szklanych mikrokulek w wielodołkowej płytce z wkładką membranową. Po przeniesieniu tych pokrytych neuronami mikrokulek do elektrody, organizują się one w połączoną sieć neuronową 3D.

Budowa trójwymiarowych sieci neuronowych sprzężonych z układami mikroelektrod

Ten film demonstruje technikę stymulowania kultur neuronalnych o liniowym wzorze za pomocą jednolitego, jednokierunkowego pola elektrycznego.

Zewnętrzne wzbudzenie jednowymiarowych wzorcowych kultur neuronalnych

Ten film demonstruje metodę stymulowania kultur neuronalnych hodowanych w wzorzystym okrągłym pierścieniu na szkiełku nakrywkowym, przy użyciu zmiennego w czasie pola magnetycznego.

Stymulacja wzorzystych kultur neuronalnych za pomocą pola magnetycznego

Film demonstruje zapis elektrofizjologiczny w celu oceny połączeń neuronalnych między neuronami pochodzącymi z iPSC a neuronami korowymi szczura, potwierdzając kontakty synaptyczne w kokulturze poprzez aktywację światłoczułych kanałów jonowych i wykrywanie prądów postsynaptycznych.

Ocena tworzenia połączeń nerwowych w kokulturze za pomocą zapisów elektrofizjologicznych

Przedstawiamy protokół hodowli pierwotnych eksplantatów neuronów spiralnych myszy na matrycach wieloelektrodowych w celu zbadania profili odpowiedzi neuronalnej i optymalizacji parametrów stymulacji. Takie badania mają na celu poprawę interfejsu neuron-elektroda implantów ślimakowych z korzyścią dla słuchu pacjentów, a także zużycia energii przez urządzenie.

Hodowla eksplantatów neuronów zwojów spiralnych i elektrofizjologia na układach wieloelektrodowych

Komórki neuronalne myszy hodowane na układach wieloelektrodowych wykazują zwiększoną reakcję po stymulacji elektrycznej. Protokół ten pokazuje, jak hodować neurony, jak rejestrować aktywność i jak ustanowić protokół trenowania sieci w celu reagowania na wzorce stymulacji.

Zależny od czasu wzrost odpowiedzi sieci na stymulację kultur komórek neuronalnych na układach mikroelektrod

Ten protokół opisuje użycie nanoprzewodów krzemowych do wewnątrzkomórkowej optycznej biomodulacji komórki w prosty i łatwy do wykonania sposób. Technika ta jest wysoce elastyczna i może być stosowana zarówno do zastosowań in vitro, jak i in vivo.

Nanodruty krzemowe i stymulacja optyczna do badań wewnątrz- i międzykomórkowego sprzężenia elektrycznego

W tym badaniu prezentujemy protokół różnicowania nerwowych komórek macierzystych i progenitorowych (NPC) indukowanych wyłącznie przez stymulację impulsami prądu stałego (DC) w systemie mikroprzepływowym.

Różnicowanie neuronalnych komórek prekursorowych pod wpływem pola elektrycznego w urządzeniach mikroprzepływowych

Ten protokół opisuje krok po kroku proces budowy zarówno elektrycznych, jak i magnetycznych stymulatorów używanych do stymulacji tkanek biologicznych. Protokół zawiera wytyczne dotyczące obliczeniowej symulacji pól elektrycznych i magnetycznych oraz produkcji urządzeń stymulujących.

Urządzenia do stymulacji tkanek biologicznych i pola magnetycznego

Poznaj metody zewnętrznej stymulacji elektrycznej i magnetycznej neuronów w kulturach jedno- i dwuwymiarowych. Techniki te umożliwiają pomiar parametrów pobudzenia nerwowego, takich jak chronaksja i reobaza, oraz pomagają w diagnozowaniu i leczeniu zaburzeń mózgu.

Zewnętrzne wzbudzenie neuronów za pomocą pól elektrycznych i magnetycznych w kulturach jedno- i dwuwymiarowych

Przeglądaj więcej filmów