Zewnętrzne wzbudzenie neuronów za pomocą pól elektrycznych i magnetycznych w kulturach jedno- i dwuwymiarowych

Ogólnym celem tego protokołu do elektrycznej i magnetycznej stymulacji kultur jednowymiarowych i dwuwymiarowych jest efektywne wykorzystanie kultur neuronalnych jako zredukowanego modelu stymulacji mózgu, z którego możemy wydobyć wgląd i ważne parametry. Korzystanie z naszego protokołu stymulacji elektrycznej z jednowymiarowymi kulturami pozwala nam mierzyć określone parametry związane z pobudzeniem neuronalnym, na przykład chronaksję i reozasadę w różnych przedziałach neuronu. Technika stymulacji magnetycznej pozwala nam porównać wpływ pól magnetycznych i elektrycznych na kultury neuronów.

Model ten pozwala nam również lepiej diagnozować i leczyć zaburzenia mózgu. Proponujemy skuteczną i łatwą metodę hodowli wzorcowych sieci neuronowych w dowolnym wzorcu projektowym, nawet sieciach jednowymiarowych. Następnie możemy zorientować elektryczne i zmienne w czasie pola magnetyczne w odniesieniu do tych sieci, aby oddzielić i obserwować wkłady z różnych przedziałów neuronu.

Główną zaletą tej techniki jest to, że nie wymaga ona udziału ludzi ani modeli zwierzęcych, co umożliwia obszerne i wyczerpujące poszukiwanie odpowiednich parametrów stymulacji neuronalnej. Procedurę zademonstrują Jurij Burniszew, technik z mojego laboratorium i Ami Eisen, doktorantka w laboratorium. Na początek przygotuj wzorzyste kultury neuronalne, umieszczając komórki nerwowe na szklanych szkiełkach nakrywkowych, częściowo wstępnie pokrytych warstwą bioodrzucającą.

Aby to zrobić, wyczyść 25 milimetrów szkiełka nakrywkowe. I za pomocą maszyny do rozpylania pokryj szkiełko nakrywkowe warstwą bioodrzucającą. Dostosuj parametry do procesu osadzania, aby utworzyć warstwę składającą się z cienkiej warstwy chromu o długości od sześciu do 10 angstremów, która zapewnia stabilność powłoki, oraz warstwy złota o grubości 30 angstremów, zapewniającej powłoce reaktywność tiolu.

Po zakończeniu procesu należy usunąć szkiełko nakrywkowe z maszyny do napylania i zbadać uzyskaną powłokę. Następnie zmontuj zmodyfikowany system plotera pisakowego, zastępując końcówkę atramentu pisaka pisaka ostrą metalową igłą do wytrawiania. Umieść arkusz gumy przyklejony do sztywnej płyty w ploterze, aby zapewnić solidną i cierną powierzchnię podczas trawienia.

Następnie wyreguluj położenie arkusza, naciskając przyciski znajdujące się na ploterze. Po umieszczeniu gumowego arkusza na jego powierzchni odpipetuj niewielką kroplę wody i umieść na niej wstępnie powlekane szkiełko nakrywkowe. Następnie, za pomocą plotera, wytrawiaj warstwy metalu poprzez powtarzalne drapanie, generując linie o grubości 200 mikrometrów, aby stworzyć pożądane wzory.

Przed elektrostymulacją umieść nasienne szkiełko nakrywkowe w komorze obrazowania. Aby stymulować komórki polem elektrycznym o stałym kierunku, należy użyć dwóch równoległych elektrod oddalonych od siebie o 11 milimetrów i umieszczonych po przeciwnych stronach kultury posianych na 13-milimetrowych szkiełkach nakrywkowych. Następnie zmontuj komorę do obrazowania hodowli i pasujący uchwyt elektrody tak, aby druty elektrodowe były zanurzone w pożywce zewnątrzkomórkowej i umieszczone jeden milimetr nad hodowlą.

Następnie podłącz pojedynczą parę elektrod do wzmacniacza operacyjnego, który wzmacnia sygnał z generatora. Zastosuj pojedynczy impuls bipolarnej fali prostokątnej o 50% cyklu pracy i amplitudzie 22 woltów. Użyj fali bipolarnej bez składowej stałej, aby uniknąć elektrolizy, która może wystąpić na elektrodach.

Zastosuj impuls trwający od 10 mikrosekund do czterech milisekund, aby zapewnić skuteczną stymulację, ale zapobiec uszkodzeniu komórek. Aby stymulować ogniwa polami elektrycznymi o zmieniającym się kierunku, użyj dwóch prostopadłych par elektrod. Upewnij się, że dwie pary elektrod, a także ich zaciski zasilania i monitorowania są całkowicie odizolowane elektrycznie od siebie i unoszą się nad ziemią.

Aby zmienić orientację pola elektrycznego, zmień amplitudę napięcia przyłożonego do dwóch par elektrod. Następnie określ intensywność i kierunek wynikowego pola poprzez dodawanie wektorów. Aby wygenerować pole wirujące o stałej amplitudzie, należy przyłożyć falę sinusoidalną do jednej pary elektrod, jednocześnie zasilając drugą parę falą cosinusoidalną.

Aby rozpocząć stymulację magnetyczną, umieść pod mikroskopem kulturę neuronalną, wyhodowaną w kształcie koła. Stymuluj kulturę za pomocą standardowej okrągłej cewki do stymulacji magnetycznej i stymulatora wspomagającego, które są dostępne na rynku. Aby stymulować kultury o niestandardowym natężeniu pola magnetycznego, podłącz specjalnie wykonaną cewkę stymulacji magnetycznej do specjalnie zbudowanego stymulatora.

Następnie za pomocą wskaźnika laserowego wyrównaj środek kultury ze środkiem cewki, aby zapewnić skuteczną stymulację. Dostosuj pozycje cewki tak, aby pozostawała około pięciu milimetrów nad środkiem kultury. Po prawidłowym ustawieniu cewki stymulacyjnej, załaduj stymulator do potencjału do pięciu kilowoltów.

Następnie, za pomocą przełącznika wysokoprądowego i wysokonapięciowego, rozładuj prąd wysokiego napięcia przez cewkę stymulacyjną, aby wygenerować impuls magnetyczny, który stymuluje aktywność hodowanych neuronów. Na koniec zamontuj cewkę odbiorczą w tej samej pozycji, co kultura neuronalna i zmierz intensywność generowanego pola magnetycznego. Schemat ten pokazuje, że poprzez przyłożenie różnych amplitud impulsów napięciowych do dwóch par elektrod, pola elektryczne mogą być zorientowane pod każdym kątem bez konieczności ręcznego obracania kultury.

Oto przykładowe nagrania stanów przejściowych wapnia ze stymulacją elektryczną przy różnych przyłożonych napięciach. Przy zastosowaniu stałego czasu trwania pola elektrycznego, liczba neuronów, które wystrzeliwują i reagują na pole elektryczne, pokazuje skumulowany rozkład Gaussa w funkcji amplitudy napięcia. A to jest przykład krzywej siły-czasu trwania uzyskanej przy użyciu tego protokołu.

W przypadku kultur pierścieniowych reagujących na pole magnetyczne wskaźnik powodzenia stymulacji rośnie wraz z promieniem hodowli. Ten wykres przedstawia zależność między rozmiarem pierścienia a natężeniem pola magnetycznego. Najbardziej udane wzbudzenia kultur polegają na nakładaniu się na siebie przestrzeni fazy dostępnej doświadczalnie i obszaru o wysokim prawdopodobieństwie.

Po opanowaniu przygotowanie jednowymiarowych kultur można przeprowadzić w ciągu trzech do czterech godzin. Podczas wykonywania stymulacji elektrycznej i magnetycznej należy pamiętać, aby umożliwić pełne odzyskanie kultury z etapu stymulacji i upewnić się, że cały sprzęt unosi się w stosunku do podłoża elektrycznego. Postępując zgodnie z tą procedurą, można odpowiedzieć na inne pytania, takie jak hodowla neuronów z różnych obszarów mózgu, pomiar statystyk, na przykład neuronów korowych.

Inną możliwością jest pomiar parametrów dowolnego neuronu modelowego choroby. Po opracowaniu, technika ta może utorować drogę do optymalizacji siły i czasu trwania potrzebnych do skutecznej i bezpiecznej stymulacji mózgu. Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak stworzyć dowolny pożądany wzór kultur neuronalnych i być w stanie stymulować je elektrycznie lub magnetycznie w celu badania interakcji neuronów z polami elektromagnetycznymi.