Sortowanie komórek aktywowane fluorescencją (FACS) i analiza ekspresji genów neuronów eksprymujących fos ze świeżej i mrożonej tkanki mózgowej szczura

Ogólnym celem tej procedury jest dysocjacja neuronów wykazujących ekspresję fos od świeżej lub zamrożonej tkanki mózgowej dorosłego szczura w celu późniejszego sortowania komórek aktywowanych fluorescencją lub FACS. Metoda ta może być wykorzystana do wyizolowania komórek neuronalnych będących przedmiotem zainteresowania w celu zidentyfikowania unikalnej neuroadaptacji molekularnej neuronów aktywowanych behawioralnie. Główną zaletą tej techniki jest to, że pozwala na wykorzystanie zamrożonej tkanki, ułatwiając izolację komórek z wielu obszarów mózgu w różnych dniach.

Aby przetworzyć tę świeżą tkankę mózgową, włóż dwie lub więcej wstępnie schłodzonych żyletek do szczelin lodowatej matrycy do krojenia mózgu, aby wyciąć od jednego do dwóch milimetrowych plasterków koronalnych zawierających interesujące obszary mózgu, umieszczając skrawki na schłodzonej szklanej płytce podczas ich krojenia. Najpierw przeprowadź sekcję obszaru mózgu będącego przedmiotem zainteresowania, odrzuć inne obszary i usuń istotę białą. Aby zamrozić tkankę, przenieś próbki do mikroprobówki i zanurz probówkę w izopentanie o temperaturze ujemnej 40 stopni Celsjusza na 20 sekund w celu przechowywania w temperaturze minus 80 stopni Celsjusza do czasu dalszego przetwarzania.

Aby zmielić tkankę, należy pozostawić próbki do rozmrożenia na zimnej szklanej płytce nie dłużej niż jedną minutę przed pokryciem próbek w jednej lub dwóch kroplach roztworu buforu A. Następnie, trzymając żyletkę całkowicie pionowo do płytki, zmiel tkankę 100 razy w każdym prostopadłym kierunku. Aby dokładnie zmielić tkankę, bardzo ważne jest, aby utrzymywać tkankę mokrą za pomocą buforu A i postępować zgodnie z określonymi czasami i kierunkiem mielenia.

Bardzo ważne jest, aby usunąć większość istoty białej podczas sekcji tkanek i utrzymać tkankę pokrytą buforem A, aby poprawić wydajność mielenia i utrzymać zdrowie komórek. Gdy tkanka zostanie dokładnie przetworzona, użyj żyletki, aby przenieść kawałki do probówki mikrowirówki zawierającej jeden mililitr zimnego buforu A i odwróć probówkę trzy do pięciu razy, aby zanurzyć całą zmieloną tkankę w roztworze. Aby zdysocjować fragmenty tkanki w zawiesinę jednokomórkową, próbki należy osadzać przez odwirowanie.

Odrzucić supernatant. Następnie powoli dodaj jeden mililitr zimnego, świeżo rozmrożonego roztworu enzymatycznego w dół wewnętrznej ścianki mikroprobówki. I użyj pipety o dużej średnicy końcówki, aby natychmiast zassać i dozować całość każdej granulki cztery razy, aby rozproszyć zmielone kawałki tkanki.

Następnie szybko odwróć mikroprobówkę, aby zapobiec przywieraniu granulek do dna probówki, i inkubuj próbkę z mieszaniem od końca do końca przez 30 minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Pod koniec trawienia ponownie odwirować probówkę i dodać 0,6 mililitra zimnego buforu A do komórek. Używając tej samej końcówki pipety, natychmiast zassać i dozować granulki pięć razy.

Następnie wybierz szklaną pipetę o średnicy 1,3 milimetra i użyj jej do delikatnego roztarcia próbek 10 razy. Umieścić próbkę na lodzie na dwie minuty, aby umożliwić szczątkom i niezdysocjowanym komórkom osiądnięcie na dnie probówki. Następnie przenieś supernatant do nowej 15-mililitrowej probówki.

Następnie dodaj 600 mikrolitrów roztworu buforu A do pozostałego osadu i użyj pipety o średnicy 0,8 milimetra, aby rozcierać próbkę dodatkowo 10 razy. Po pozostawieniu tkanek do ustabilizowania się, jak właśnie pokazano, połącz supernatant z pierwszą zawiesiną komórkową i dodaj kolejne 600 mikrolitrów buforu do osadu. Następnie użyj pipety o średnicy 0,4 milimetra, aby rozcierać próbkę i umieść probówkę na lodzie na dwie minuty, aby tkanki mogły się uspokoić.

Przestrzeganie etapów mechanicznego rozcierania w protokole jest ważne dla pomyślnego sortowania. Następnie połącz supernatant ze zdysocjowanymi komórkami. Następnie dodaj 600 mikrolitrów buforu A do próbki i powtórz trzykrotnie tarcie pipetą o średnicy 0,4 milimetra.

Umieść probówki na lodzie na dwie minuty, aby komórki mogły się uspokoić. A następnie zbierz supernatant w drugiej 15-mililitrowej probówce. Powtórz proces rozcierania jeszcze trzy razy, używając najmniejszej szklanej pipety, co znacznie zwiększa wydajność komórek do późniejszego sortowania.

Po zebraniu wszystkich supernatantów dodaj 800 mikrolitrów 100% etanolu o ujemnej temperaturze 20 stopni Celsjusza do czterech miroprobówek na lodzie. Następnie przenieś 800 mikrolitrów komórek z pierwszej probówki zebranego supernatantu do każdej z pierwszych dwóch probówek etanolu i 800 mikrolitrów komórek z drugiej probówki supernatantu do każdej z dwóch ostatnich probówek etanolu. Odwróć probówki, aby wymieszać próbki.

Następnie umieszcza się próbki na lodzie na 15 minut, mieszając przez odwrócenie co pięć minut. Pod koniec inkubacji odwirować komórki. Następnie, dotykając tylko ścianki mikroprobówki, użyj mikropipety, aby powoli usunąć wszystkie oprócz ostatnich 50 mikrolitrów każdego supernatantu.

Przefiltrować każdą z dwóch zawiesin komórek oddzielnie za pomocą dwóch różnych par filtrów siatkowych. Komórki są następnie gotowe do znakowania przeciwciałami przeciwko markerom komórkowym będącym przedmiotem zainteresowania i sortowania za pomocą cytometrii przepływowej. Analiza świeżych i mrożonych próbek tkanki mózgowej ujawnia obecność małych, jednorodnych populacji komórek nerwowych o podobnej wielkości i ziarnistości.

Małe jednorodne populacje mogą być bramkowane, aby wykluczyć wszelkie agregaty komórkowe, a neurony można zidentyfikować na podstawie ich dodatniej wartości NeuN i DAPI. Zarówno w świeżych, jak i mrożonych próbkach tkanek poziomy mRNA NeuN są również znacznie wyższe w populacjach NeuN-dodatnich niż w populacjach NeuN-ujemnych. Natomiast poziomy mRNA markerów komórek glejowych i olidogodendrocytów są wyższe w populacji NeuN-ujemnej niż w populacji NeuN-dodatniej.

Podobny trend wyższych poziomów mRNA markerów komórek mikrogijalnych obserwuje się w populacji NeuN-ujemnej, chociaż nie było to istotne statystycznie. Co więcej, poziomy mRNA Fos są wyższe w neuronach Fos-dodatnich niż w neuronach Fos-ujemnych, z trzykrotnym wzrostem mRNA Fos w neuronach Fos-dodatnich ze świeżej tkanki i jedenastokrotnym wzrostem mRNA Fos w neuronach Fos-dodatnich z zamrożonej tkanki, co potwierdza ważność metody identyfikacji określonych genów będących przedmiotem zainteresowania z komórek sortowanych przepływowo zarówno w warunkach świeżych, jak i zamrożonych tkanek. Próbując wykonać tę procedurę, należy pamiętać o przestrzeganiu krytycznych kroków zapobiegających rozpadowi komórek.

Po tej procedurze można przeprowadzić inne metody, takie jak sortowanie komórek aktywowane fluorescencją, w celu wyizolowania interesujących podzbiorów komórek do dalszej analizy molekularnej. Użycie zamrożonej tkanki pozwala na sortowanie próbek w oddzielnych dniach, co ma kluczowe znaczenie w przypadku eksperymentów, które obejmują długie i skomplikowane procedury pobierania i przygotowania tkanek. Technika ta może być również wykorzystana do przygotowania pośmiertnie zamrożonych próbek ludzkiego mózgu przechowywanych przez kilka miesięcy lub lat w celu sortowania za pomocą cytometrii przepływowej.

Technika ta utorowała drogę naukowcom z dziedziny neurobiologii do zbadania mechanizmów molekularnych leżących u podstaw zachowania neuronów wykazujących ekspresję fos lub innych komórek typu dzikiego znakowanych immunologicznie. Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak oddzielić komórki od świeżej lub zamrożonej tkanki mózgowej szczura w celu aktywowanego fluorescencją sortowania komórek neuronów lub typów komórek będących przedmiotem zainteresowania.