Name: Sortowanie komórek aktywowane fluorescencją (FACS) i analiza ekspresji genów neuronów eksprymujących fos ze świeżej i mrożonej tkanki mózgowej szczura (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-08-27T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 37 s
Description: Poznaj metodę FACS do analizy ekspresji genów neuronów Fos z mrożonej tkanki mózgowej szczura. Technika ta umożliwia izolację komórek nerwowych w wielu sesjach badawczych.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Ta praca była wspierana przez NIDA Intramural Research Program (Bruce T. Hope, Yavin Shaham). F.J.R. był wspierany przez nominację do Programu Uczestnictwa w Badaniach NIDA sponsorowanego przez National Institutes of Health i administrowanego przez Oak Ridge Institute for Science and Education, a także otrzymał dodatkowe wsparcie finansowe ze stypendium Becas-Chile zarządzanego przez CONICYT i Universidad de los Andes, Santiago, Chile. Placówka Johns Hopkins FACS Core była wspierana przez Award P30AR053503 z Narodowego Instytutu Zapalenia Stawów oraz Chorób Układu Mięśniowo-Szkieletowego i Skóry Narodowego Instytutu Zdrowia.

Wszystkie eksperymenty zostały przeprowadzone zgodnie z Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) of the National Institutes of Health Guide for the Care and Use of Laboratory animals 16.
Uwaga: Wszystkie poniższe kroki używają probówek wirówkowych o niskim stopniu wiązania, które były trzymane na lodzie, chyba że określono inaczej.
1. Przygotowanie przed pobraniem tkanek
<ol>
	<li>Ustaw wirówkę na 4 oC.</li>
	<li>Wypoleruj ogniowo zestaw trzech szklanych pipet Pasteura o zmniejszających się średnicach około 1,3, 0,8 i 0,4 mm dla każdej próbki.</li>
	<li>Przygotować oznakowane probówki o pojemności 1,7 ml zawierające 1 ml zimnego buforu A i przechowywać probówki na lodzie.</li>
	<li>Przygotuj tackę na lód zawierającą matrycę do krojenia mózgu, szpatułki i szklane talerze (lub odwróconą szklaną szalkę Petriego), na której przeprowadzisz sekcję. Wstępnie schłodź dwie lub więcej żyletek na szklanych płytkach i użyj bibułki do wysuszenia wszystkich narzędzi, które dotykają chusteczki.</li>
	<li>Rozmrażać roztwór enzymu w temperaturze pokojowej (RT) przez 30 minut przed pobraniem tkanki.</li>
</ol>
2. Pobieranie i sekcja tkanek
<ol>
	<li>Rozpocznij leczenie behawioralne lub farmakologiczne 90 minut przed pobraniem tkanki. 
	UWAGA: W przypadku przedstawionych tutaj wyników wykonano ostre wstrzyknięcia dootrzewnowe metamfetaminy w dawce 5 mg/kg metamfetaminy szczurom w nowym środowisku (warunek testowy) i naiwnym szczurom trzymanym w klatkach domowych (warunki kontrolne).</li>
	<li>Znieczulij szczura, umieszczając go w szklanym słoiku z eksykatorem z nasyconym izofluranem i odetnij głowę szczurowi 30 - 60 sekund później za pomocą gilotyny. 
	Użyj nożyczek, aby usunąć skórę i mięśnie z głowy i odsłonić czaszkę. Użyj rongeurs, aby przeciąć czaszkę i otworzyć otwór wielki i usunąć tylną część czaszki. Użyj rongeurs, aby przeciąć wzdłuż górnych krawędzi czaszki, aby odsłonić mózg. Uważaj, aby nie uszkodzić mózgu. Użyj małej szpatułki, aby delikatnie zgarnąć i podnieść mózg. Podnieś mózg i przetnij nerwy, aż mózg będzie wolny 17.</li>
	<li>Wypreparuj tkankę za pomocą żyletek. 
	UWAGA: Próbki tkanek należy pobrać przy użyciu jednej z następujących metod: (2.3.1) świeżo wypreparowana tkanka; (2.3.2) zamrożona tkanka po sekcji; lub (2.3.3) zamrożoną tkankę wypreparowaną z zamrożonego całego mózgu. Utrzymuj matrycę do krojenia mózgu, żyletki i szklaną płytkę suchą podczas procesów sekcji i mielenia, ponieważ skondensowana woda może prowadzić do hipotonicznej lizy komórek. Użyj szkieł powiększających, aby zapewnić dokładne rozwarstwienie.
	<ol>
		<li>W przypadku świeżo wypreparowanej tkanki umieść świeżo wyekstrahowany mózg w matrycy do krojenia mózgu (metalowa forma w kształcie mózgu szczura ze szczelinami na żyletki w odstępach 1 mm), która została schłodzona na lodzie. Włóż dwie lub więcej wstępnie schłodzonych żyletek do szczelin, aby wyciąć plastry koronalne, które zawierają interesujący obszar (obszary) mózgu. Ułóż pokrojony plasterek na schłodzonym szklanym talerzu. 
		Uwaga: Przeanalizuj interesujące Cię obszary mózgu na schłodzonej szklanej płytce.</li>
		<li>W przypadku zamrożonej tkanki po rozbiorze, należy wypreparować obszar (obszary) mózgu będący przedmiotem zainteresowania z wycinków świeżo wyekstrahowanego mózgu, podobnie jak opisano to powyżej w ppkt 2.3.1. Wypreparowaną tkankę umieścić w mikroprobówce i szybko zamrozić tkankę, zanurzając mikroprobówkę w izopentanie o temperaturze -40 ºC na 20 sekund. Wypreparowaną tkankę należy przechowywać przez cały czas zamrożoną w zamrażarce w temperaturze -80 ºC do czasu dalszej obróbki.</li>
		<li>W przypadku zamrożonej tkanki świeżo wyekstrahowany mózg należy natychmiast zamrozić w izopentanie o temperaturze -40 ºC i przechowywać w szczelnie zamkniętej torbie w temperaturze -80 ºC przez okres do 6 miesięcy.
		<ol>
			<li>W dniu sekcji umieść zamrożony mózg w kriostacie ustawionym na około -20 ºC (nie cieplejszym niż -18 ºC) na około 2 godziny w celu zrównoważenia temperatury. 
			UWAGA: Mózg można łatwo przeciąć w tej temperaturze, podczas gdy znacznie niższe temperatury sprawiają, że mózg jest zbyt kruchy, aby można go było bezpiecznie przeciąć.</li>
			<li>Użyj żyletek, aby pokroić 1-2 mm plastry koronalne zamrożonych mózgów w kriostacie. Użyj igły o rozmiarze od 12 do 16, aby uzyskać stemple tkankowe z tych plastrów w warunkach zamrażania. Wypreparowaną tkankę należy przechowywać w pozycji zamrożonej przez cały czas do czasu dalszego przetwarzania.</li>
		</ol>
		</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Dodaj 1-2 krople buforu A, aby przykryć wypreparowaną tkankę przed mieleniem. Usuń większość istoty białej z tkanki za pomocą dwóch żyletek, aby zapobiec utracie neuronów podczas pozostałej części procesu tarcia. Jeśli zaczynasz od zamrożonej tkanki, pozwól chusteczce rozmrozić się na zimnej szklanej płytce nie dłużej niż 1 minutę przed zastosowaniem roztworu buforu A.</li>
	<li>Zmiel tkankę 100 razy w każdym prostopadłym kierunku za pomocą żyletki na schłodzonej szklanej płytce. Podczas mielenia trzymaj żyletkę pionowo do szklanej płytki. 
	UWAGA: Dokładne mielenie ma kluczowe znaczenie dla wszystkich etapów protokołu.</li>
	<li>Za pomocą żyletek przenieś zmieloną tkankę do probówek mikrowirówek zawierających 1 ml zimnego buforu A. Odwróć probówkę 3 - 5 razy, aby cała zmielona tkanka pozostała w roztworze.</li>
</ol>
3. Dysocjacja komórek
UWAGA: Używaj delikatnego mieszania koniec po końcu dla wszystkich poniższych kroków. Nie używaj mieszalnika wirowego i unikaj pęcherzyków powietrza, które powodują uszkodzenie komórek.
<ol>
	<li>Odwirować probówki z próbkami o stężeniu 110 x g przez 2 minuty w temperaturze 4 °C. Odrzucić supernatant. Powoli dodaj 1 ml zimnego, świeżo rozmrożonego roztworu enzymatycznego (zawierającego mieszaninę enzymów proteolitycznych) w dół wewnętrznej ścianki mikroprobówki. Natychmiast zassać cały granulat i delikatnie pipetować w górę i w dół tylko 4 razy pipetą o umiarkowanie dużej średnicy końcówki, aby rozproszyć zmielone granulki tkankowe.</li>
	<li>Natychmiast odwrócić mikroprobówki, aby zapobiec przywieraniu osadu do dna i inkubować próbki, mieszając koniec po końcu przez 30 minut w temperaturze 4 oC.</li>
	<li>Po enzymatycznym trawieniu tkanek odwirować probówki o sile 960 x g przez 2 minuty w temperaturze 4 °C. Usunąć supernatant i dodać 0,6 ml zimnego buforu A. Natychmiast po dodaniu buforu A należy użyć tej samej końcówki pipety do rozproszenia osadu poprzez zassanie całej osadki i delikatnie pipetować w górę i w dół 5 razy.</li>
	<li>Mechanicznie rozcierać strawioną tkankę i zbierać do probówek o pojemności 15 ml, wykonując następujące czynności. Do każdej próbki należy użyć oddzielnego zestawu 3 pipet Pasteura z polerowanego szkła o malejących średnicach około 1,3, 0,8 i 0,4 mm przymocowanych do bańek lateksowych.
	<ol>
		<li>Delikatnie rozetrzeć każdą próbkę 10 razy za pomocą szklanej pipety o średnicy 1,3 mm. Pozostaw próbkę na lodzie na 2 minuty (szczątki i niezdysocjowane komórki osiądą na dnie). Zebrać sklarowany osad (~ 0,6 ml) i przenieść do stożkowej probówki o pojemności 15 ml (probówka #1).</li>
		<li>Dodać 0,6 ml roztworu buforu A do pozostałego osadu. Próbkę należy rozcierać 10 razy za pomocą szklanej pipety o średnicy 0,8 mm. Pozostaw próbkę na lodzie na 2 minuty. Zebrać supernatant (~ 0,6 ml) i przenieść do tej samej 15 ml stożkowej probówki #1.</li>
		<li>Dodać 0,6 ml roztworu buforu A do pozostałego osadu. Próbkę należy rozcierać 10 razy za pomocą szklanej pipety o średnicy 0,4 mm. Pozostaw próbkę na lodzie na 2 minuty. Zebrać supernatant (~ 0,6 ml; bez dotykania osadu z niezdysocjowanymi komórkami) i przenieść do tej samej 15 ml probówki stożkowej #1, 
		UWAGA: Pipetę o średnicy 0.4 mm należy przechowywać w probówce #1 w celu wykonania następujących czynności związanych z rozcieraniem.</li>
		<li>Powtórzyć krok 3.4.3 jeszcze trzy razy, używając najmniejszej szklanej pipety (o średnicy ~ 0,4 mm) i zebrać supernatant do oddzielnej stożkowej probówki o pojemności 15 ml (probówka #2).</li>
		<li>Zebrane zawiesiny komórek należy rozcierać w probówkach #1 i #2 jeszcze 10 razy za pomocą szklanej pipety o średnicy 0,4 mm i przechowywać na lodzie.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
4. Utrwalanie i przenikanie komórek
<ol>
	<li>Przygotuj 4 mikroprobówki na próbkę (dwie mikroprobówki dla komórek z probówki #1 i dwie dla komórek z probówki #2), dodając 800 μl 100% zimnego etanolu (przechowywanego w temperaturze -20 oC przed użyciem) do każdej probówki i trzymaj je na lodzie. Uwaga: Końcowe stężenie etanolu wyniesie 50%.</li>
	<li>Odpipetować ~ 800 μl zawiesin komórek (z probówki #1 i probówki#2) do każdej z 4 probówek zawierających zimny etanol i odwrócić probówki w celu wymieszania próbek.</li>
	<li>Inkubuj probówki na lodzie przez 15 minut, odwracając probówki co 5 minut.</li>
	<li>Po utrwaleniu/przepuszczalności odwirować probówki o stężeniu 1 700 x g przez 4 minuty w temperaturze 4 °C i odrzucić supernatant. Pozostaw 50 μl roztworu, aby zapobiec utracie komórek. 
	UWAGA: Granulki na tym etapie są białe i mniej przylegają do ścianki rurek niż przed przepuszczalnością. Dlatego należy ostrożnie usunąć supernatant, dotykając ścianki mikroprobówki, w której nie ma osadu, i powoli pobrać supernatant za pomocą mikropipety.</li>
</ol>
5. Filtracja komórkowa
<ol>
	<li>Ponownie zawiesić granulki z kroku 4.4 za pomocą zimnego PBS w następujący sposób:
	<ol>
		<li>Dodaj 550 μl zimnego PBS do jednej z dwóch mikroprobówek pochodzących z probówki #1 i użyj końcówki pipety o umiarkowanie dużej średnicy, aby delikatnie odpipetować zawiesinę komórek w górę iw dół 5 razy. Powtórz to samo dla jednej mikroprobówki pochodzącej z probówki #2.</li>
		<li>W przypadku komórek z probówki #1, używając tej samej pipety, przenieś pierwszą zawiesinę komórek do drugiej granulki. Zawiesić drugą osadkę, delikatnie pipetując zawiesinę połączonych komórek 5 razy w górę i w dół.</li>
		<li>W przypadku ogniw z probówki #2 ponownie zawiesić i połączyć granulki (tj. trzecią i czwartą mikroprobówkę) zgodnie z opisem w ppkt 5.1.2.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Przefiltrować oddzielnie dwie zawiesiny komórek z etapów 5.1.2 i 5.1.3, używając dwóch różnych par filtrów siatkowych (o wielkości porów 100 μm i 40 μm) w następujący sposób:
	<ol>
		<li>Wstępnie zwilż sitko do każdej komórki, dodając PBS do wnętrza sitka. Użyj pipety, aby usunąć nadmiar PBS z zewnętrznej strony sitka.</li>
		<li>Równomiernie odpipetować zawiesinę komórek z kroku 5.1.2 na pierwsze sitko do komórek o wielkości porów 100 μm. Zebrać przepływ do probówki o pojemności 50 ml na lodzie. Użyj pipety, aby zebrać przepływ, który jest przymocowany do zewnętrznej strony spodu sitka do komórek.</li>
		<li>Za pomocą tej samej pipety przenieś przepływ z sitka o pojemności 100 μm do sitka o średnicy 40 μm. Zebrać ten przepływ do innej probówki o pojemności 50 ml na lodzie. W przypadku przenoszenia przepływu z sitka o średnicy 40 μm należy wymienić końcówki do pipet na nowe, aby uniknąć zanieczyszczenia sitkiem o średnicy 100 μm.</li>
		<li>Powtórz te kroki dla zawiesiny komórek z kroku 5.1.3, używając nowego zestawu filtrów.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Połączyć oba przepływy z każdej próbki, aby uzyskać końcową objętość około 1 ml na próbkę.</li>
</ol>
6. Inkubacja z przeciwciałami
UWAGA: Użyj małych porcji zawiesin komórek mózgowych, aby przygotować wiele próbek kontrolnych do ustawienia odpowiednich ustawień cytometru przepływowego przed uruchomieniem głównej próbki. Dla każdego znakowania przeciwciał należy przygotować próbki kontrolne, które nie zawierają przeciwciał, a jedynie przeciwciało drugorzędowe (lub inny znacznik fluorescencyjny), a następnie zarówno przeciwciała pierwszorzędowe, jak i drugorzędowe (lub inne znaczniki fluorescencyjne). Użyj tych elementów sterujących, aby ustawić bramki, które oddzielają specyficzne i niespecyficzne etykietowanie w cytometrze przepływowym. Jeśli to możliwe, używaj fluorochromów, które nie wymagają kompensacji. Zwiększyć końcową objętość kontrolnych próbek z bramkowaniem do końcowej objętości 700 μl, dodając PBS przed dodaniem przeciwciał pierwszorzędowych.
<ol>
	<li>Przygotować próbkę rozpraszającą światło i kontrolną DAPI, przenosząc 100 μl próbki przefiltrowanych komórek do mikroprobówki o pojemności 1,7 ml. Dodać 600 μl zimnego PBS z 1 μg/ml DAPI do barwienia jąder. Inkubować przez 10 minut z mieszaniem od końca do końca i przemyć (jak wskazano w krokach 6.4.2-6.4.5) przed przepuszczeniem przez cytometr przepływowy. 
	UWAGA: Ta próbka jest używana tylko do ustawienia bramki komórki/jąder przed sortowaniem pozostałych komórek w maszynie FACS.</li>
	<li>Przygotować pojedyncze próbki kontrolne znakowane immunologicznie, przenosząc 100 μl przefiltrowanych komórek do mikroprobówki o pojemności 1,7 ml. Dodać 600 μl zimnego PBS z jednym przeciwciałem (np. przeciwciałem NeuN). Dodać 600 μl zimnego PBS do mikroprobówki z innym przeciwciałem (np. przeciwciałem Fos). Dodaj odpowiednie przeciwciało drugorzędowe, jeśli nie jest to przeciwciało pierwszorzędowe sprzężone bezpośrednio. 
	UWAGA: Próbki te służą do określenia odpowiedniego napięcia lampy fotopowielacza (PMT) oraz do oceny nakładania się dwóch sygnałów fluorescencyjnych, jeśli to konieczne. Stężenia przeciwciał należy miareczkować, aby osiągnąć najlepszy stosunek sygnału do szumu we wszystkich kanałach. Nakładające się sygnały fluorescencyjne można również skompensować poprzez wewnętrzną kalibrację różnych kanałów fluorescencyjnych w cytometrze przepływowym.</li>
	<li>Przygotować podwójnie znakowaną fluorescencyjnie ujemną próbkę kontrolną, przenosząc 100 μl przefiltrowanych komórek do mikroprobówki o pojemności 1,7 ml. Dodać 600 μl zimnego PBS z samymi przeciwciałami drugorzędowymi lub bezpośrednio sprzężonymi przeciwciałami pierwszorzędowymi IgG. 
	UWAGA: Ta próbka kontrolna może być używana za każdym razem przed sortowaniem w celu określenia fluorescencji tła dla każdego fluoroforu.</li>
	<li>Przygotować główną próbkę do sortowania.
	<ol>
		<li>Przenieść 700 μl przefiltrowanych komórek do mikroprobówki o pojemności 1,7 ml. Dodać 7 μl (1:100) pierwszorzędowego przeciwciała Fos sprzężonego bezpośrednio z Alexa Fluor 647 (anty-Fos-AF647) i 1,4 μl (1:500) pierwszorzędowego przeciwciała NeuN sprzężonego bezpośrednio z fikoerytryną (anty-NeuN-PE). Inkubować probówki przez 30 minut w temperaturze 4 °C z mieszaniem od końca do końca.</li>
		<li>Pod koniec inkubacji dodać 800 μl zimnego PBS do każdej mikroprobówki, w tym próbki głównej i próbek kontrolnych, i wymieszać przez inwersję.</li>
		<li>Odwirować mikroprobówki o masie 1 300 x g przez 3 minuty w temperaturze 4 °C. Odrzucić supernatant, pozostawiając 50 μl supernatantu, aby zapobiec utracie komórek.</li>
		<li>Dodać 1 ml zimnego PBS do osadu i ponownie zawiesić komórki za pomocą pipety o umiarkowanie dużej średnicy końcówki.</li>
		<li>Wirować przy 1 300 x g przez 3 minuty w temperaturze 4 °C. Odrzucić supernatant.</li>
		<li>Ponownie zawiesić granulat w 500 μl zimnego PBS (dostosować końcową objętość w zależności od wielkości granulki).</li>
		<li>Przenieść i przefiltrować zawiesinę do okrągłodennej probówki na próbkę FACS z nasadką z sitkiem do komórek (40 μm). Trzymaj komórki znakowane immunologicznie na lodzie i natychmiast wykonaj FACS. Uwaga: W celu przefiltrowania dotknij końcówki pipety pionowo na nasadce sitka i przepchnij przez nią zawiesinę komórek.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Ustawić bramki cytometru przepływowego za pomocą próbek kontrolnych.
	<ol>
		<li>Użyj próbki rozpraszającej światło i kontrolnej DAPI, aby zidentyfikować populację komórek neuronalnych na podstawie całkowitych zdarzeń i szczątków komórkowych. 
		UWAGA: Ciała komórkowe w tym preparacie stanowią tylko 1 - 2% wszystkich zdarzeń (reszta to szczątki i przerwane procesy komórkowe). Na podstawie sygnału fluorescencyjnego DAPI (wskazującego jądra) i rozproszenia do przodu (wielkość komórki) możliwe jest zlokalizowanie ciał komórek i bramki wstecznej w oparciu o właściwości rozpraszania światła do przodu i z boku komórek (jak pokazano na rysunku 1 A, B).</li>
		<li>Użyj pojedynczych próbek kontrolnych znakowanych immunologicznie, aby określić ustawienia napięcia PMT i przeanalizować rozlanie się emisji z jednego określonego fluorochromu do innego filtra/kanału (np. Alexa Fluor 488/FITC lub fikoerytryna). Jeśli sygnały fluorescencyjne nakładają się na siebie, skoryguj nakładanie się, ręcznie dostosowując poziomy kompensacji.</li>
		<li>Użyj podwójnie znakowanej fluorescencyjnie kontroli ujemnej, aby ustawić próg dla populacji dodatniej. 
		UWAGA: Uważa się, że sygnał pochodzący z tej próbki jest spowodowany autofluorescencją, a komórki głównej próbki znajdujące się powyżej tego progu można uznać za dodatnie. Zazwyczaj parametry progowe sortowania są bardziej rygorystyczne i w rzeczywistości sortowane są około 2/3 górnych oznaczonych komórek powyżej kontroli ujemnej.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Posortuj neurony z głównej próbki za pomocą FACS do mikroprobówek o pojemności 1,7 ml. Zebrać komórki do 50 μl buforu do ekstrakcji RNA. Po sortowaniu należy odwirować i odwirować probówkę i wymieszać zawiesinę, pipetując 10 razy w górę i w dół, aby odzyskać wszystkie posortowane komórki ze ścianek probówki.</li>
	<li>Inkubować posortowaną zawiesinę komórkową w temperaturze 42 °C przez 30 minut, aby upewnić się, że wszystkie komórki są poddawane lizie przed ekstrakcją RNA, a następnie odwirować przy 2 800 x g przez 2 minuty w temperaturze 4 °C.</li>
	<li>Przenieść supernatant do probówki wolnej od RNaz w celu długotrwałego przechowywania w temperaturze -80 ºC lub natychmiast przetworzyć próbkę do izolacji RNA, syntezy cDNA, wstępnej amplifikacji genu docelowego i qPCR, jak opisano wcześniej 13-15.</li>
</ol>

<ol><li>Bossert, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ventral+medial+prefrontal+cortex+neuronal+ensembles+mediate+context-induced+relapse+to+heroin%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Ventral medial prefrontal cortex neuronal ensembles mediate context-induced relapse to heroin.</a> Nat Neurosci. 14, 420-422 (2011).</li>
<li>Cruz, F. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Role+of+nucleus+accumbens+shell+neuronal+ensembles+in+context-induced+reinstatement+of+cocaine-seeking%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Role of nucleus accumbens shell neuronal ensembles in context-induced reinstatement of cocaine-seeking.</a> J Neurosci. 34, 7437-7446 (2014).</li>
<li>Fanous, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Role+of+orbitofrontal+cortex+neuronal+ensembles+in+the+expression+of+incubation+of+heroin+craving%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Role of orbitofrontal cortex neuronal ensembles in the expression of incubation of heroin craving.</a> J Neurosci. 32, 11600-11609 (2012).</li>
<li>Koya, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeted+disruption+of+cocaine-activated+nucleus+accumbens+neurons+prevents+context-specific+sensitization%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Targeted disruption of cocaine-activated nucleus accumbens neurons prevents context-specific sensitization.</a> Nat Neurosci. 12, 1069-1073 (2009).</li>
<li>Cruz, F. C., Rubio, F. J., Hope, B. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Using+c-fos+to+study+neuronal+ensembles+in+corticostriatal+circuitry+of+addiction%5BTitle%5D)+AND+%22Brain+Research%22%5BJournal%5D)">Using c-fos to study neuronal ensembles in corticostriatal circuitry of addiction.</a> Brain Research. 1628, 157-173 (2015).</li>
<li>Kamentsky, L. A., Melamed, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spectrophotometric+cell+sorter%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Spectrophotometric cell sorter.</a> Science. 156, 1364-1365 (1967).</li>
<li>Kamentsky, L. A., Melamed, M. R., Derman, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spectrophotometer%3A+new+instrument+for+ultrarapid+cell+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Spectrophotometer: new instrument for ultrarapid cell analysis.</a> Science. 150, 630-631 (1965).</li>
<li>Lobo, M. K., Karsten, S. L., Gray, M., Geschwind, D. H., Yang, X. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((FACS-array+profiling+of+striatal+projection+neuron+subtypes+in+juvenile+and+adult+mouse+brains%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Neurosci%22%5BJournal%5D)">FACS-array profiling of striatal projection neuron subtypes in juvenile and adult mouse brains.</a> Nat Neurosci. 9, 443-452 (2006).</li>
<li>Lobo, M. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+profiling+of+striatonigral+and+striatopallidal+medium+spiny+neurons+past%2C+present%2C+and+future%5BTitle%5D)+AND+%22Int+Rev+Neurobiol%22%5BJournal%5D)">Molecular profiling of striatonigral and striatopallidal medium spiny neurons past, present, and future.</a> Int Rev Neurobiol. 89, 1-35 (2009).</li>
<li>Guez-Barber, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((FACS+purification+of+immunolabeled+cell+types+from+adult+rat+brain%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci+Methods%22%5BJournal%5D)">FACS purification of immunolabeled cell types from adult rat brain.</a> J Neurosci Methods. 203, 10-18 (2012).</li>
<li>Guez-Barber, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((FACS+identifies+unique+cocaine-induced+gene+regulation+in+selectively+activated+adult+striatal+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">FACS identifies unique cocaine-induced gene regulation in selectively activated adult striatal neurons.</a> J Neurosci. 31, 4251-4259 (2011).</li>
<li>Fanous, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Unique+gene+alterations+are+induced+in+FACS-purified+Fos-positive+neurons+activated+during+cue-induced+relapse+to+heroin+seeking%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurochem%22%5BJournal%5D)">Unique gene alterations are induced in FACS-purified Fos-positive neurons activated during cue-induced relapse to heroin seeking.</a> J Neurochem. 124, 100-108 (2013).</li>
<li>Liu, Q. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Detection+of+molecular+alterations+in+methamphetamine-activated+Fos-expressing+neurons+from+a+single+rat+dorsal+striatum+using+fluorescence-activated+cell+sorting+%28FACS%29%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurochem%22%5BJournal%5D)">Detection of molecular alterations in methamphetamine-activated Fos-expressing neurons from a single rat dorsal striatum using fluorescence-activated cell sorting (FACS).</a> J Neurochem. 128, 173-185 (2014).</li>
<li>Rubio, F. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Context-induced+reinstatement+of+methamphetamine+seeking+is+associated+with+unique+molecular+alterations+in+Fos-expressing+dorsolateral+striatum+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Context-induced reinstatement of methamphetamine seeking is associated with unique molecular alterations in Fos-expressing dorsolateral striatum neurons.</a> J Neurosci. 35, 5625-5639 (2015).</li>
<li>Li, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Incubation+of+methamphetamine+craving+is+associated+with+selective+increases+in+expression+of+Bdnf+and+trkb%2C+glutamate+receptors%2C+and+epigenetic+enzymes+in+cue-activated+fos-expressing+dorsal+striatal+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Incubation of methamphetamine craving is associated with selective increases in expression of Bdnf and trkb, glutamate receptors, and epigenetic enzymes in cue-activated fos-expressing dorsal striatal neurons.</a> J Neurosci. 35, 8232-8244 (2015).</li>
<li>US National Research Council. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%22Guide+for+the+care+and+use+of+laboratory+animals%22">Guide for the care and use of laboratory animals</a>. , (2011).</li>
<li>Koya, E., Margetts-Smith, G., Hope, B. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Daun02+inactivation+of+behaviourally-activated+Fos-expressing+neuronal+ensembles%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Protocols%22%5BJournal%5D)">Daun02 inactivation of behaviourally-activated Fos-expressing neuronal ensembles.</a> Current Protocols. , (2016).</li>
<li>Cruz, F. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((New+technologies+for+examining+the+role+of+neuronal+ensembles+in+drug+addiction+and+fear%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Neurosci%22%5BJournal%5D)">New technologies for examining the role of neuronal ensembles in drug addiction and fear.</a> Nat Rev Neurosci. 14, 743-754 (2013).</li>
<li>Mardones, G., Gonzalez, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Selective+plasma+membrane+permeabilization+by+freeze-thawing+and+immunofluorescence+epitope+access+to+determine+the+topology+of+intracellular+membrane+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol+Methods%22%5BJournal%5D)">Selective plasma membrane permeabilization by freeze-thawing and immunofluorescence epitope access to determine the topology of intracellular membrane proteins.</a> J Immunol Methods. 275, 169-177 (2003).</li>
<li>Molyneaux, B. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DeCoN%3A+genome-wide+analysis+of+in+vivo+transcriptional+dynamics+during+pyramidal+neuron+fate+selection+in+neocortex%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">DeCoN: genome-wide analysis of in vivo transcriptional dynamics during pyramidal neuron fate selection in neocortex.</a> Neuron. 85, 275-288 (2015).</li>
<li>Schwarz, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Using+fluorescence+activated+cell+sorting+to+examine+cell-type-specific+gene+expression+in+rat+brain+tissue%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Using fluorescence activated cell sorting to examine cell-type-specific gene expression in rat brain tissue.</a> J Vis Exp. , e52537(2015).</li>
</ol>

Autorzy oświadczają, że nie mają konkurencyjnych interesów finansowych.

FACS może być używany do sortowania neuronów i innych typów komórek ze świeżej lub zamrożonej dorosłej tkanki mózgowej. Jak wspomniano we wstępie, możliwość wykorzystania zamrożonej tkanki pozwala na optymalne wykorzystanie próbek pochodzących od zwierząt, które przeszły złożone i długotrwałe procedury behawioralne, takie jak samodzielne podawanie i badania nawrotów w badaniach nad uzależnieniami. Te procedury behawioralne trwają zwykle 1-2 godziny lub dłużej i wymagają, aby wszystkie zwierzęta (w sumie 10-20) zostały pr...

Podczas nauki, zwierzęta tworzą skojarzenia między złożonymi zestawami bardzo specyficznych bodźców. Uważa się, że te informacje o wysokiej rozdzielczości są kodowane przez zmiany w określonych wzorcach rzadko rozmieszczonych neuronów zwanych zespołami neuronalnymi. Zespoły neuronalne zostały niedawno zidentyfikowane poprzez indukcję natychmiast wczesnych genów (IEG), takich jak Fos, Arc i Zif268 oraz ich produktów białkowych w neuronach, które były silnie aktywowane podczas zachowania lub ekspozycji na sygnały. W szczególności wykazano, że neurony wyrażające fos odgrywają rolę przyczynową w wyuczonych zachowaniach specyficznych dla kontekstu i wskazówek 1-4. Tak więc unikalne neuroadaptacje molekularne w tych aktywowanych neuronach eksprymujących Fos są głównymi kandydatami na mechanizmy neuronalne, które kodują wyuczone skojarzenia powstałe podczas normalnego uczenia się i nieprawidłowych zaburzeń uczenia się, takich jak uzależnienie i zespół stresu pourazowego (PTSD) 5.
Sortowanie komórek aktywowane fluorescencją (FACS) umożliwiło ostatnio analizę unikalnych neuroadaptacji molekularnych w neuronach wykazujących ekspresję fos. Cytometria przepływowa i sortowanie komórek zostały opracowane w latach sześćdziesiątych XX wieku 6,7 w celu scharakteryzowania i izolowania komórek zgodnie z ich charakterystyką rozpraszania światła i immunofluorescencji i od dawna są stosowane w immunologii i badaniach nad rakiem. Jednak cytometria przepływowa i FACS wymagają zdysocjowanych pojedynczych komórek, które są trudne do uzyskania z dorosłej tkanki mózgowej. FACS został po raz pierwszy użyty do wyizolowania i analizy neuronów prążkowia eksprymujących zielone białko fluorescencyjne (GFP) od myszy transgenicznych, które nie wymagały znakowania przeciwciałami 8,9. Opracowaliśmy metodę FACS opartą na przeciwciałach 10 w celu wyizolowania i oceny zmian molekularnych w neuronach wykazujących ekspresję Fos aktywowanych przez lek i / lub sygnały u zwierząt typu dzikiego 11-15. W tej metodzie neurony są znakowane przeciwciałem przeciwko ogólnemu markerowi neuronalnemu NeuN, podczas gdy silnie aktywowane neurony są znakowane przeciwciałem przeciwko Fos. Chociaż nasza początkowa metoda wymagała zebrania do 10 szczurów na próbkę w celu uzyskania świeżej tkanki, późniejsze modyfikacje protokołu pozwoliły na izolację FACS neuronów eksprymujących fos i ilościową analizę reakcji łańcuchowej polimerazy (qPCR) dyskretnych obszarów mózgu od pojedynczego szczura w wieku 13-15 lat. Ogólnie rzecz biorąc, unikalne zmiany molekularne stwierdzono w neuronach eksprymujących fos aktywowanych podczas różnych zachowań aktywowanych kontekstem i wskazówkami w badaniach nad uzależnieniami 12,14,15.
Głównym problemem logistycznym związanym z wykonywaniem FACS na świeżej tkance jest to, że potrzeba jednego całego dnia, aby oddzielić tkankę i przeprowadzić ją za pomocą FACS. Ponadto dziennie można przetwarzać tylko około czterech próbek. Zwykle oznacza to, że tylko jeden obszar mózgu może być oceniany z każdego mózgu, a pozostałe obszary mózgu muszą zostać odrzucone. Jest to poważny problem w przypadku procedur behawioralnych o niskiej przepustowości, takich jak samodzielne podawanie i trening wygaszania, który wymaga operacji i wielu tygodni intensywnego treningu. Co więcej, długie i skomplikowane procedury behawioralne w dniu testu utrudniają wykonanie FACS tego samego dnia. Byłaby to znacząca zaleta, gdyby można było zamrozić mózgi zwierząt natychmiast po testach behawioralnych, a następnie wyizolować neurony wyrażające fos z jednego lub więcej obszarów mózgu w różnych momentach wybranych przez badaczy.
Tutaj pokazujemy, że nasz protokół FACS może być używany do izolowania neuronów eksprymujących Fos (i innych typów komórek) zarówno ze świeżej, jak i zamrożonej tkanki mózgowej. Na przykład wyizolowaliśmy neurony wykazujące ekspresję fos z prążkowia szczura po ostrym wstrzyknięciu metamfetaminy oraz od naiwnych szczurów bez zastrzyków (warunek kontrolny). Jednak ten protokół FACS może być stosowany po każdym leczeniu behawioralnym lub farmakologicznym. Późniejsza analiza qPCR naszych próbek wykazała, że ekspresję genów z tych typów komórek można ocenić z podobną skutecznością zarówno ze świeżej, jak i mrożonej tkanki.

<table><tbody><tr><td>Macierz mózgu</td><td>CellPoint Scientific</td><td>69-2160-1</td><td>do otrzymywania koronalnych wycinków mózgu</td></tr><tr><td>Hibernate A o niskiej fluorescencji</td><td>Brain Bits</td><td>HA-lf</td><td>Bufor A w protokole służy do przetwarzania tkanek i komórek od etapów dysocjacji do utrwalenia</td></tr><tr><td>Accutase</td><td>Millipore</td><td>SCR005</td><td>Roztwór enzymatyczny w protokole służy do enzymatycznego trawienia tkanki przed rozcieraniem</td></tr><tr><td>Białkowa tubka LoBind 1,5 ml, PCR clean</td><td>Eppendorf</td><td>22431081</td><td>zapobiegająca utracie komórek podczas protokołu</td></tr><tr><td>Sitko do komórek, 40 &mikro; m</td><td>BD Falcon</td><td>352340</td><td>do filtrowania zawiesiny komórek</td></tr><tr><td>Sitko do komórek, 100 i mikro; m</td><td>BD Falcon</td><td>352360</td><td>do filtrowania zawiesiny komórek</td></tr><tr><td>Falcon 5 ml probówka z polistyrenu okrągłodennego z zatrzaskową nasadką sitową</td><td>BD Bioscience</td><td>352235</td><td>do filtrowania zawiesiny komórek przed przejściem przez cytometr przepływowy</td></tr><tr><td>Pipet Pasteura, szkło</td><td>Dostawa NIH</td><td>6640-00-782-6008</td><td>do rozcierania tkanek</td></tr><tr><td>Milli-Mark Anti-NeuN-PE, przeciwciało klonowe A60 (mysie przeciwciało monoklonalne)</td><td>EMD Przeciwciało Millipore</td><td>FCMAB317PE</td><td>do wykrywania neuronów</td></tr><tr><td>Phospho-c-Fos (Ser32) (D82C12) XP Rabbit (koniugat Alexa Fluor 647)&nbsp;</td><td>Technologia sygnalizacji komórkowej&nbsp;</td><td>Przeciwciało 8677</td><td>do wykrywania komórek wykazujących ekspresję fos</td></tr><tr><td>DAPI</td><td>Sigma</td><td>D8417</td><td>do znakowania jąder</td></tr><tr><td>PicoPure RNA Isolation Kit</td><td>Applied Biosystems.</td><td>KIT0204</td><td>Zestaw zawiera bufor do ekstrakcji RNA dla kroku 6.14. Służy do zbierania posortowanych komórek,</td></tr><tr><td>indeksu górnego III, systemu syntezy pierwszej nici cDNA</td>, <td>Invitrogen</td><td>18080-051</td><td>, do syntezy cDNA z RNA</td></tr><tr><td>, TaqMan, PreAmp, Master, Mix</td>, <td>Applied Biosystems.</td><td>4391128</td><td>wykonać celowaną preamplifikację z cDNA</td></tr><tr><td>TaqMan Advance Fast Master&nbsp;</td><td>Biosystemy stosowane.</td><td>4444963</td><td>wykonać PCR za pomocą sond TaqMan Sonda</td></tr><tr><td>Fos TaqMan Applied</td><td>Biosystems.</td><td>Rn00487426_g1</td><td>Sonda/startery TaqMan</td></tr><tr><td>NeuN Sonda TaqMan</td><td>Applied Biosystems.</td><td>Sekwencja nukleotydowa CACTCCAACAGCGTGAC</td><td>dla markera genu neuronalnego</td></tr><tr><td>NeuN Forward primer</td><td>Applied Biosystems.</td><td>GGCCCCTGGCAGAAAGTAG</td><td>sekwencja nukleotydowa dla markera genu neuronalnego</td></tr> <tr><td>NeuN Odwrotny starter</td><td>Applied Biosystems.</td><td>Sekwencja nukleotydowa TTCCCCCTGGTCCTTCTGA</td><td>dla markera genu neuronalnego</td></tr><tr><td>Gfap Sonda TaqMan</td><td>Applied Biosystems.</td><td>Rn00566603_m1</td><td>Sonda/startery TaqMan do markera genu astrocityc</td></tr><tr><td>iba-1 Sonda TaqMan</td><td>Applied Biosystems.</td><td>Rn00574125_g1</td><td>Sonda/startery TaqMan do markera genu mikroglya</td></tr><tr><td>Gapdh Sonda TaqMan</td><td>Applied Biosystems.</td><td>Sekwencja nukleotydowa CTCATGACCACAGTCCA</td><td>dla genu referencyjnego/porządkowego</td></tr><tr><td>Gapdh Forward primer</td><td>Applied Biosystems.</td><td>Sekwencja nukleotydowa GACAACTTTGGCATCGTGGAA</td><td>dla genów referencyjnych/porządkowych</td></tr><tr><td>Gapdh Odwrotny starter</td><td>Applied Biosystems.</td>Sekwencja nukleotydowa <td>CACAGTCTCTGAGTGGCAGTGA</td><td>dla genu referencyjnego/porządkowego</td></tr><tr><td>Oligo2 Sonda TaqMan</td><td>Applied Biosystems.</td><td>Rn01767116_m1&nbsp;</td><td>Sonda/startery TaqMan do markera genów oligodendrocytarnych</td></tr><tr><td>Pipetor P1000</td><td>Rainin</td><td>17014382</td><td>Jest określany jako pipeta o dużej średnicy końcówki w krokach 3.1 i 3.3 do łagodnego rozcierania tkanek oraz kroku 6.7 do ponownego zawieszenia komórek</td></tr><tr><td>7500 Szybki system PCR w czasie rzeczywistym</td><td>firmy Applied Biosystems.</td><td>446985</td><td>do ilościowego sortowania komórek PCR</td></tr><tr><td>FACSAria I,</td><td>BD Biosciences</td><td></td><td>do sortowania FACS</td></tr></tbody></table>

sortowanie komórek aktywowane fluorescencją (facs) i analiza ekspresji genów neuronów eksprymujących fos ze świeżej i mrożonej tkanki mózgowej szczura

Fluorescence Activated Cell Sorting (FACS) and Gene Expression Analysis of Fos-expressing Neurons from Fresh and Frozen Rat Brain Tissue

Badanie neuroplastyczności i molekularnych zmian w wyuczonych zachowaniach przechodzi z badania całych regionów mózgu na badanie specyficznych zestawów rzadko rozmieszczonych aktywowanych neuronów zwanych zespołami neuronalnymi, które pośredniczą w wyuczonych skojarzeniach. Sortowanie komórek aktywowane fluorescencją (FACS) zostało niedawno zoptymalizowane dla tkanki mózgowej dorosłego szczura i umożliwiło izolację aktywowanych neuronów za pomocą przeciwciał przeciwko markerowi neuronalnemu NeuN i białku Fos, markerowi silnie aktywowanych neuronów. Do tej pory neurony wykazujące ekspresję fos i inne typy komórek izolowano ze świeżych tkanek, co wiązało się z długimi dniami przetwarzania i pozwalało na ocenę bardzo ograniczonej liczby próbek mózgu po długich i złożonych procedurach behawioralnych. Tutaj stwierdziliśmy, że wydajność neuronów eksprymujących Fos i mRNA Fos z prążkowia grzbietowego była podobna między świeżo wypreparowaną tkanką a tkanką zamrożoną w temperaturze -80 ºC przez 3 - 21 dni. Ponadto potwierdziliśmy fenotyp posortowanych komórek NeuN-dodatnich i NeuN-ujemnych, oceniając ekspresję genów markerów neuronalnych (NeuN), astrocytarnych (GFAP), oligodendrocytarnych (Oligo2) i mikrogialnych (Iba1), co wskazuje, że zamrożona tkanka może być również stosowana do izolacji FACS typów komórek glejowych. Ogólnie rzecz biorąc, możliwe jest pobranie, wypreparowanie i zamrożenie tkanki mózgowej podczas wielu sesji FACS. Maksymalizuje to ilość danych uzyskanych od cennych zwierząt, które często przeszły długie i złożone procedury behawioralne.

Sortowanie neuronów Fos-dodatnich i Fos-ujemnych ze świeżej i zamrożonej tkanki prążkowia grzbietowego pojedynczych szczurów po ostrych wstrzyknięciach metamfetaminy.
Opisany powyżej protokół został wykorzystany do sortowania neuronów Fos-dodatnich i Fos-ujemnych z pojedynczego prążkowia grzbietowego szczura 90 min po dostryperitonealnym wstrzyknięciu metamfetaminy (5 mg/kg). Jako kontrole wykorzystano naiwne szczury przebywając...

Tutaj prezentujemy protokół Fluorescencji Aktywowanego Sortowania Komórek (FACS) do badania molekularnych zmian w zespołach neuronalnych wyrażających Fos zarówno ze świeżej, jak i mrożonej tkanki mózgowej. Zastosowanie zamrożonej tkanki pozwala na izolację FACS wielu obszarów mózgu podczas wielu sesji, aby zmaksymalizować wykorzystanie cennych zwierząt osobistych.

Sortowanie komórek aktywowane fluorescencją (FACS) i analiza ekspresji genów neuronów eksprymujących fos ze świeżej i mrożonej tkanki mózgowej szczura

The study of neuroplasticity and molecular alterations in learned behaviors is switching from the study of whole brain regions to the study of specific ...

Ogólnym celem niniejszej procedury jest dysocjacja neuronów wykazujących ekspresję Fos z utrwalonego przez zamrażanie lub świeżego tkankowego materiału mózgu dorosłego szczura w celu późniejszego sortowania komórek metodą fluorescencyjnej aktywowanej segregacji komórek, czyli FACS. Metoda ta może być wykorzystana do izolacji wybranych komórek neuronalnych w celu zidentyfikowania unikalnej molekularnej neuroadaptacji neuronów aktywowanych behawioralnie. Główną zaletą tej techniki jest możliwość zastosowania mrożonej tkanki, co ułatwia izolację komórek z wielu obszarów mózgu w różne dni.Aby przetworzyć tę świeżą tkankę mózgu, należy włożyć dwa lub więcej schłodzonych wcześniej żyletek do szczelin lodowatej matrycy do krojenia mózgu, aby wyciąć koronalne plastry o grubości od jednego do dwóch milimetrów, zawierające interesujące obszary mózgu, przekładając wycinki na schłodzoną szklaną płytkę w miarę ich wycinania. Najpierw należy wypreparować interesujący obszar mózgu, odrzucić pozostałe części i usunąć białą substancję. W celu zamrożenia tkanki, należy przenieść próbki do mikroprobówki i zanurzyć probówkę w izopentanie o temperaturze -40 °C na 20 sekund, a następnie przechowywać w temperaturze -80 °C do czasu dalszego przetwarzania.Aby rozdrobnić tkankę, należy pozostawić próbki do rozmrożenia na zimnej szklanej płytce na nie więcej niż jedną minutę, a następnie pokryć je jedną lub dwiema kroplami roztworu Buforu A. Następnie, trzymając ostrze żyletki całkowicie pionowo do płytki, należy rozdrobnić tkankę, wykonując 100 cięć w każdym z prostopadłych kierunków. Aby dokładnie rozdrobnić tkankę, kluczowe jest utrzymywanie jej w stanie wilgotnym za pomocą Buforu A oraz przestrzeganie określonego czasu i kierunków rozdrabniania.Kluczowe jest usunięcie większości istoty białej podczas sekcji tkanki oraz utrzymywanie tkanki w Buforze A, aby zwiększyć efektywność rozdrabniania i zachować żywotność komórek. Po dokładnym przetworzeniu tkanki, za pomocą żyletki przenieść fragmenty do probówki do mikrocentryfugi zawierającej 1 mL zimnego Buforu A, a następnie odwrócić probówkę od trzech do pięciu razy, aby zanurzyć całą rozdrobnioną tkankę w roztworze. W celu dysocjacji fragmentów tkanki do zawiesiny jednokomórkowej, należy zgranulować próbki poprzez wirowanie.Odlej supernatant. Następnie powoli dodaj jeden mililitr zimnego, świeżo rozmrożonego roztworu enzymu po wewnętrznej ściance mikroprowetki. Użyj pipety z końcówką o dużym średnicy, aby natychmiast czterokrotnie wciągnąć i wydalić całość każdego osadu w celu rozproszenia posiekanych fragmentów tkanki.Następnie szybko odwróć mikroprobówkę, aby zapobiec przywieraniu osadów do dna probówki, i inkubuj próbkę przez 30 minut w temperaturze 4 °C, mieszając metodą obrotową (end-over-end). Po zakończeniu trawienia ponownie odwiruj probówkę i dodaj do komórek 0,6 ml zimnego Buforu A. Używając tej samej końcówki pipety, natychmiast aspiruj i wydmuchuj osad pięciokrotnie.Następnie wybrać szklaną pipetę o średnicy 1,3 mm i za jej pomocą delikatnie utrzeć próbki 10 razy. Umieścić próbkę na lodzie przez dwie minuty, aby pozostałości i niezdysocjowane komórki opadły na dno probówki. Następnie przenieść nadsącz do nowej probówki o objętości 15 ml.Następnie do pozostałego osadu dodaj 600 µL roztworu Buforu A i za pomocą pipety o średnicy 0,8 mm wykonaj dodatkowo 10 cykli trituracji próbki. Po odczekaniu do opadnięcia tkanek, zgodnie z wcześniejszą demonstracją, połącz nadsącz z pierwszą zawiesiną komórkową i dodaj kolejne 600 µL buforu do osadu. Następnie użyj pipety o średnicy 0,4 mm, aby przeprowadzić triturację próbki, a następnie umieść probówkę w lodzie na dwie minuty, aby umożliwić opadnięcie tkanek.Przestrzeganie kroków mechanicznego utraciaowania opisanych w protokole jest istotne dla pomyślnego sortowania. Następnie połącz supernatant z rozdzielonymi komórkami. Po tym dodaj do próbki 600 µl Buforu A i powtórz utraciawanie pipetą 0,4 mm jeszcze trzy razy.Umieść probówki na lodzie na dwie minuty, aby komórki mogły ososiąść. Następnie połącz nadsącz w drugiej probówce o pojemności 15 ml. Powtórzenie procesu tryturacji jeszcze trzy razy przy użyciu najmniejszej pipety szklanej znacząco zwiększa wydajność uzyskiwania komórek do późniejszego sortowania.Po zebraniu wszystkich supernatantów, do czterech probówek mikrocentryfugowych na lodzie należy dodać po 800 µL 100% etanolu schłodzonego do -20 °C. Następnie przenosi się 800 µL komórek z pierwszej probówki zebranego supernatantu do każdej z dwóch pierwszych probówek z etanolem oraz 800 µL komórek z drugiej probówki supernatantu do każdej z dwóch ostatnich probówek z etanolem. Probówki należy odwrócić, aby wymieszać próbki.Następnie umieść próbki na lodzie na 15 minut, mieszając je przez odwracanie co pięć minut. Po zakończeniu inkubacji odwiruj komórki. Następnie, dotykając jedynie ścianki mikroprobówki, użyj mikropipety, aby powoli usunąć cały supernatant z każdej próbki, pozostawiając jedynie ostatnie 50 µL.Każdą z dwóch zawiesin komórkowych przefiltruj osobno, używając dwóch różnych par sitek do komórek. Komórki są następnie gotowe do znakowania przeciwciałami przeciwko interesującym markerom komórkowym i sortowania metodą cytometrii przepływowej. Analiza świeżych i mrożonych próbek tkanki mózgowej wykazuje obecność małych, jednorodnych populacji komórek neuronalnych o podobnym rozmiarze i ziarnistości.Małe, jednorodne populacje można wyodrębnić za pomocą bramkowania, aby wykluczyć agregaty komórek, a neurony można zidentyfikować na podstawie pozytywności względem NeuN i DAPI. Zarówno w świeżych, jak i mrożonych próbkach tkanek poziomy mRNA NeuN są również znacznie wyższe w populacjach NeuN-dodatnich niż w populacjach NeuN-ujemnych. Z kolei poziomy mRNA markerów komórek glejowych i oligodendrocytów są wyższe w populacji NeuN-ujemnej niż w populacji NeuN-dodatniej.Podobny trend wyższych poziomów mRNA markerów komórek mikroglejalnych obserwuje się w populacji NeuN-ujemnej, choć nie było to statystycznie istotne. Ponadto poziomy mRNA Fos są wyższe w neuronach Fos-dodatnich niż w neuronach Fos-ujemnych, z trzykrotnym wzrostem mRNA Fos w neuronach Fos-dodatnich z tkanki świeżej oraz jedenastokrotnym wzrostem mRNA Fos w neuronach Fos-dodatnich z tkanki mrożonej, co potwierdza poprawność metody identyfikacji specyficznych genów zainteresowania z komórek sortowanych przepływowo w warunkach tkanki świeżej i mrożonej. Podczas wykonywania tej procedury ważne jest pamiętanie o przestrzeganiu krytycznych kroków zapobiegających lizie komórek.Po zastosowaniu tej procedury można przeprowadzić inne metody, takie jak fluorescencyjny sort lazykometryczny (FACS), aby wyizolować interesujące podgruby komórek do dalszych analiz molekularnych. Wykorzystanie zamrożonej tkanki umożliwia sortowanie próbek w różne dni, co jest kluczowe w przypadku eksperymentów obejmujących długotrwałe i skomplikowane procedury pobierania i przygotowania tkanek. Technika ta może być również stosowana do przygotowania pośmiertnych zamrożonych próbek ludzkiego mózgu, przechowywanych przez kilka miesięcy lub lat, w celu ich sortowania za pomocą cytometrii przepływowej.Technika ta utorowała drogę badaczom z dziedziny neuronauki do eksploracji mechanizmów molekularnych leżących u podstaw zachowania neuronów wykazujących ekspresję białka Fos lub innych immunoznakowanych komórek typu dzikiego o określonym znaczeniu. Po obejrzeniu tego filmu powinieneś posiadać dobrą wiedzę na temat tego, jak dysocjować komórki ze świeżej lub zamrożonej tkanki mózgu szczura w celu przeprowadzenia fluorescencyjnego sortowania komórek (FACS) neuronów lub wybranych typów komórek.

fluorescence-activated-cell-sorting-facs-gene-expression-analysis-fos

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Neuronauka

Niniejszy protokół opisuje niepromienną procedurę hybrydyzacji in-situ, która umożliwia jednoczesną identyfikację dwóch gatunków transkryptów z rozdzielczością pojedynczych komórek w cienkich przekrojach mózgu kręgowców.

Podwójna fluorescencyjna hybrydyzacja in situ w świeżych przekrojach mózgu

W niniejszej pracy opisujemy szybką i prostą metodę obrazowania fluorescencyjnie znakowanych komórek w półgrubych skrawkach mózgu. Poprzez utrwalenie, pocięcie i optyczne klarowanie tkanki mózgowej opisujemy, w jaki sposób standardowe obrazowanie epifluorescencyjne lub konfokalne może być wykorzystane do wizualizacji poszczególnych komórek i sieci neuronalnych w obrębie nienaruszonej tkanki nerwowej.

Szybka metoda obrazowania fluorescencyjnego o wysokiej rozdzielczości w półgrubych przekrojach mózgu

Opisano zoptymalizowaną procedurę oczyszczania neuronalnych progenitorów pochodzących z grzebienia neuronalnego z tkanek zarodkowych myszy. Metoda ta wykorzystuje ekspresję fluorescencyjnych alleli reporterowych do izolowania odrębnych populacji za pomocą fluorescencyjnego sortowania komórek (FACS). Technikę tę można zastosować do izolowania neuronalnych subpopulacji na różnych etapach rozwoju lub z tkanek dorosłych.

Zoptymalizowana procedura izolacji autonomicznych progenitorów neuronalnych z narządów trzewnych płodów myszy przy użyciu sortowania komórek aktywowanego fluorescencją (FACS)

Ten film demonstruje protokół izolowania komórek z hipokampów szczurów, w tym neuronów, astrocytów i mikrogleju.

Uzyskiwanie różnych populacji komórek nerwowych z hipokampa szczura

Ten film pokazuje dysocjację zamrożonej tkanki mózgowej szczura na zawiesinę jednokomórkową przy użyciu trawienia enzymatycznego i mechanicznego rozcierania. Przygotowane komórki są utrwalane i przepuszczane etanolem do dalszych zastosowań, takich jak cytometria przepływowa lub analiza ekspresji genów.

Uzyskiwanie zawiesiny jednokomórkowej z zamrożonej tkanki mózgowej szczura

Celem tego protokołu jest użycie techniki sortowania komórek aktywowanych fluorescencją (FACS) do sortowania określonych typów komórek nerwowych w celu późniejszej analizy ekspresji genów specyficznych dla typu komórki, markerów epigenetycznych i/lub ekspresji białek.

Wykorzystanie sortowania komórek aktywowanego fluorescencją do zbadania ekspresji genów specyficznych dla typu komórki w tkance mózgowej szczura

Celem tego badania jest zidentyfikowanie rozproszonych sieci mózgowych związanych z nagrodą poprzez nakreślenie niezawodnej techniki immunohistologicznej wykorzystującej komórkową aktywację c-fos do pomiaru jednoczesnych zmian w szlakach dopaminy i miejscach końcowych po nowym spożyciu tłuszczu i cukru u szczurów.

Jednoczesne wykrywanie aktywacji c-FOS z mezolimbicznych i mezokortykalnych miejsc nagrody dopaminy po naiwnym spożyciu cukru i tłuszczu u szczurów

Ten protokół opisuje procedurę ręcznego sortowania w celu izolacji pojedynczych, znakowanych fluorescencyjnie neuronów, a następnie amplifikacji mRNA opartej na transkrypcji in vitro w celu sekwencjonowania RNA pojedynczej komórki o dużej głębokości.

Sekwencjonowanie RNA pojedynczej komórki znakowanych fluorescencyjnie neuronów myszy przy użyciu ręcznego sortowania i podwójnej transkrypcji in vitro z sekwencjonowaniem bezwzględnym (DIVA-Seq)

Tutaj prezentujemy protokół, który wykorzystuje barwniki bliskiej podczerwieni w połączeniu z immunohistochemią i skanowaniem w wysokiej rozdzielczości do oznaczania białek w obszarach mózgu.

Wykorzystanie fluorescencji w bliskiej podczerwieni i skanowania w wysokiej rozdzielczości do pomiaru ekspresji białek w mózgu gryzoni

Ten protokół opisuje metodę łączenia fluorescencyjnej hybrydyzacji in situ (FISH) i immunohistochemii fluorescencji (IHC) zarówno w świeżo mrożonych, jak i stałych sekcjach mózgu myszy, w celu uzyskania wieloznakowego sygnału FISH i fluorescencji IHC. IHC celował w białka cytoplazmatyczne i przyłączone do błony.

Połączenie hybrydyzacji fluorescencji in situ multipleksowej z immunohistochemią fluorescencyjną na świeżo zamrożonych lub utrwalonych wycinkach mózgu myszy

Fluorescence-Activated Cell Sorting-Radioligand Treated Tissue (FACS-RTT) to potężne narzędzie do badania roli białka translokatora 18 kDa lub ekspresji receptora serotoniny5HT 2A w chorobie Alzheimera w skali komórkowej. Protokół ten opisuje zastosowanie ex-vivo FACS-RTT w modelu szczura TgF344-AD.

Tkanka traktowana radioligandem aktywowanym fluorescencją (FACS-RTT) w celu określenia komórkowego pochodzenia sygnału radioaktywnego

Poznaj metodę FACS do analizy ekspresji genów neuronów Fos z mrożonej tkanki mózgowej szczura. Technika ta umożliwia izolację komórek nerwowych w wielu sesjach badawczych.

Sortowanie komórek aktywowane fluorescencją (FACS) i analiza ekspresji genów neuronów eksprymujących fos ze świeżej i mrożonej tkanki mózgowej szczura (Wideo) | JoVE Journal

Sortowanie komórek aktywowane fluorescencją (FACS) i analiza ekspresji genów neuronów eksprymujących fos ze świeżej i mrożonej tkanki mózgowej szczura

Przeglądaj więcej filmów