Name: Inżynieria genetyczna niekonwencjonalnych drożdży do produkcji biopaliw odnawialnych i biochemicznych (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-09-20T08:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 10 s
Description: Poznaj protokół transformacji genetycznej i usuwania genu KU70 w drożdżach Yarrowia lipolytica Po1g. Metoda zwiększa rekombinację homologiczną do 71%, umożliwiając precyzyjną inżynierię szczepów.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dziękujemy za wsparcie finansowe ze strony Narodowej Agencji Środowiska Singapuru (ETRP 1201102), Konkurencyjnego Programu Badawczego Narodowej Fundacji Badawczej Singapuru (NRF-CRP5-2009-03), Agencji ds. Nauki, Technologii i Badań Singapuru (1324004108), Globalnego Programu Projektów R&D, Ministerstwa Gospodarki Opartej na Wiedzy, Republiki Korei (N0000677), Agencji Redukcji Zagrożeń Obronnych (DTRA, HDTRA1-13-1-0037) oraz Inicjatywa Biologii Syntetycznej Narodowego Uniwersytetu Singapuru (DPRT/943/09/14).

1. Generacja szczepu delecji Y. lipolytica KU70
<ol>
	<li>Budowa kasety zakłócającej 
	Uwaga: W Tabeli 1 przedstawiono wszystkie startery stosowane w amplifikacjach reakcji łańcuchowej polimerazy (PCR).
	<ol>
		<li>Zaprojektuj startery od 20 do PCR, amplifikuj kasetę ekspresji LEU2 (patrz Tabela 1) z wektora ekspresji Y. lipolytica i wprowadzaj miejsca LoxP do końców 5' i 3' kasety LEU2 za pomocą startera o długim przodzie (# 1; Tabela 1) i długi odwrócony starter (# 2; Tabela 1). Aby wprowadzić dodatkowe miejsce z ograniczeniami dla kolejnych kroków procesu klonowania, dodaj witrynę ograniczeń BamHI w primerze #1.</li>
		<li>Przeprowadzić PCR przy użyciu polimerazy DNA o wysokiej wierności, jak opisano w Tabeli 2.</li>
		<li>Oczyść kasetę produktu PCR LoxP-promotor-LEU2-terminator-LoxP za pomocą zestawu do oczyszczania PCR zgodnie z instrukcjami producenta. Dodać zwisy 3'-A do oczyszczonego produktu PCR zgodnie z instrukcjami producenta 21. Użyj ligazy DNA T4 do ligacji produktu A-tailed PCR do wektora klonowania TA w celu uzyskania plazmidu T-LEU2 zgodnie z tabelą 3.</li>
		<li>PCR amplifikuje sekwencję 1 kb 5' w górę genu KU70 przy użyciu starterów # 3/# 4 z genomowego DNA Y. lipolytica Po1g 22 zgodnie z tabelą 2. Oczyść produkt PCR za pomocą zestawu do oczyszczania PCR zgodnie z instrukcjami producenta.
		<ol>
			<li>Podwójne trawienie zarówno oczyszczonego produktu PCR, jak i plazmidu T-LEU2 za pomocą enzymów SacII i BamHI zgodnie z tabelą 4. Oczyść mieszaninę wytrawiającą za pomocą zestawu do oczyszczania PCR zgodnie z instrukcjami producenta. Użyj ligazy DNA T4 do ligacji oczyszczonego i strawionego produktu PCR do miejsc SacII/BamHI T-LEU2 w celu uzyskania plazmidu T-LEU2-5E, zgodnie z tabelą 3.</li>
		</ol>
		</li>
		<li>PCR amplifikuje sekwencję 1 kb 3' w dół genu KU70 przy użyciu starterów # 5/# 6 z genomowego DNA Y. lipolytica Po1g 22 zgodnie z tabelą 2. Oczyść produkt PCR za pomocą zestawu do oczyszczania PCR zgodnie z instrukcjami producenta. Podwójne trawienie zarówno oczyszczonego produktu PCR, jak i plazmidu T-LEU2-5E z enzymami NotI i NdeI, zgodnie z tabelą 4.
		<ol>
			<li>Oczyść mieszaninę wytrawiającą za pomocą zestawu do oczyszczania PCR zgodnie z instrukcjami producenta. Następnie podwiązać oczyszczony i strawiony produkt PCR do miejsc NotI/NdeI T-LEU2-5E, aby uzyskać plazmid T-KO przy użyciu ligazy DNA T4, zgodnie z tabelą 3.</li>
		</ol>
		</li>
		<li>Roztrawić plazmid T-KO enzymami SacII i NdeI, zgodnie z tabelą 4, aby wytworzyć kasetę rozrywającą (ryc. 1). Oczyść strawione fragmenty DNA za pomocą zestawu do oczyszczania PCR zgodnie z instrukcjami producenta.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Właściwe przygotowanie komórek i transformacja szczepu Y. lipolytica Po1g
	<ol>
		<li>Właściwe przygotowanie komórek
		<ol>
			<li>Zaszczepić kolonię szczepu Y. lipolytica Po1g ze świeżej płytki z ekstraktem drożdżowym-peptonem-dekstrozą (YPD) w 10 ml pożywki YPD (1% ekstraktu drożdżowego, 2% peptonu, 2% dekstrozy i 50 mM buforu cytrynianowego o pH 4,0) w kolbie o pojemności 100 ml. Inkubować w inkubatorze z wytrząsaniem w temperaturze 30 °C przy prędkości obrotowej 225 obr./min przez 20 godzin, aż do nasycenia (OD600 około 15, mierzone za pomocą spektrofotometru).</li>
			<li>Granulować komórki, wirując przez 5 minut przy 5 000 x g w temperaturze pokojowej. Przemyć komórki 20 ml buforu Tris-EDTA (TE) (10 mM Tris, 1 mM EDTA, pH 7,5) i zawiesić komórki zgodnie z opisem w kroku 1.2.1.2. Zawiesić komórki w 1 ml 0,1 M octanu litu (pH 6,0, dostosowany kwasem octowym) i inkubować przez 10 minut w temperaturze pokojowej.</li>
			<li>Podzielić właściwe komórki (100 μl) do sterylnych probówek o pojemności 1,5 ml. Natychmiast należy przejść do poniższych etapów przemiany lub dodać glicerol do końcowego stężenia 25% (v/v) i przechowywać w temperaturze -80 °C do długotrwałego przechowywania.</li>
		</ol>
		</li>
		<li>przekształcenie
		<ol>
			<li>Delikatnie wymieszać 10 μl zdenaturowanego DNA plemników łososia (10 mg/ml) i 1-5 μg oczyszczonej kasety rozrywającej ze 100 μl kompetentnych komórek i inkubować w temperaturze 30 °C przez 15 min.</li>
			<li>Dodać 700 μl 40% glikolu polietylenowego (PEG)-4000 (rozpuszczonego w 0,1 M octanu litu o pH 6,0), dobrze wymieszać i inkubować w inkubatorze z wytrząsaniem o temperaturze 30 °C przy 225 obr./min przez 60 min. 
			Uwaga: Ważne jest, aby używać PEG o średniej masie cząsteczkowej 4000, zamiast PEG-3350 (zwykle stosowanego w przemianach konwencjonalnych drożdży).</li>
			<li>Mieszaninę przemian należy poddać szokowi cieplnemu, umieszczając probówkę w łaźni wodnej o temperaturze 39 °C na 60 minut.</li>
			<li>Dodać 1 ml pożywki YPD i odmowywać przez 2 godziny w temperaturze 30 °C i 225 obr./min. Wirować przy 9 000 x g przez 1 minutę w temperaturze pokojowej, usunąć supernatant i ponownie zawiesić osad w 1 ml buforu TE.</li>
			<li>Ponownie zagnieździć komórki przez odwirowanie przy 9 000 x g przez 1 minutę w temperaturze pokojowej i wyrzucić supernatant. Zawiesić osad w 100 μl buforu TE i płytce na selektywnych płytkach (np. płytkach z niedoborem leucyny) i inkubować w temperaturze 30 °C przez 2-3 dni.</li>
			<li>Wybrać od 4 do 10 pojedynczych kolonii i zaszczepić oddzielnie w 2 ml pożywki YPD. Inkubować przez noc w inkubatorze z wytrząsaniem o temperaturze 30 °C przy prędkości 225 obr./min. Zidentyfikuj dodatnie kolonie za pomocą analizy PCR genomowego DNA z transformantów 22 zgodnie z tabelą 5 przy użyciu dwóch zestawów starterów # 55/# 56 i # 56/# 57, odpowiednio. 
			Uwaga: Niezlinearyzowany wektor pYLEX1 jest przekształcany w komórki kompetentne Y. lipolytica Po1g w celu określenia wydajności transformacji poprzez zliczenie liczby jednostek tworzących kolonie (cfu) na μg użytego plazmidowego DNA 23.</li>
		</ol>
		</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. Na ratunek znacznikowi
<ol>
	<li>Budowa plazmidu ekspresji Cre
	<ol>
		<li>Budowa pomp pYLEX1-CRE i pYLEX1-HPH
		<ol>
			<li>Zaprojektuj startery 20 do PCR wzmacniają otwarte ramki odczytu cre i hph. Dodaj dodatkowy nukleotyd adeninowy przed kodonami start w starterach do przodu # 82 i # 84 i wstaw miejsca restrykcyjne KpnI poniżej kodonów stop w starterach odwrotnych # 83 i # 85. PCR wzmacnia otwarte ramki odczytu cre i hph z pSH69 (numer dostępu HQ412578) 24 zgodnie z tabelą 2.</li>
			<li>Oczyść zarówno fragmenty cre, jak i hph za pomocą zestawu do oczyszczania PCR zgodnie z instrukcjami producenta. Trawić zarówno oczyszczone fragmenty cre, jak i hph enzymem KpnI zgodnie z tabelą 4. Podwójnie trawić plazmid pYLEX1 enzymami PmlI i KpnI, zgodnie z tabelą 4. Oczyść mieszaninę wytrawiającą za pomocą zestawu do oczyszczania PCR zgodnie z instrukcjami producenta.</li>
			<li>Użyj ligazy DNA T4 zgodnie z tabelą 3 do ligacji oczyszczonych i strawionych fragmentów cre i hph do miejsc PmlI/KpnI wektora ekspresyjnego Y. lipolytica, dając odpowiednio pYLEX1-CRE i pYLEX1-HPH.</li>
		</ol>
		</li>
		<li>Budowa pSL16-CRE-HPH
		<ol>
			<li>PCR amplifikuje kasetę promotor-terminator genu cre z pYLEX1-CRE przy użyciu starterów # 86/# 87 otaczających miejsca restrykcyjne SalI/PstI, zgodnie z tabelą 2. Oczyść produkt PCR za pomocą zestawu do oczyszczania PCR zgodnie z instrukcjami producenta.
			<ol>
				<li>Podwójnie trawić zarówno oczyszczony produkt PCR, jak i plazmid 25 pSL16-CEN1-1 (227) z enzymami SalI i PstI, zgodnie z tabelą 4. Oczyść mieszaninę wytrawiającą za pomocą zestawu do oczyszczania PCR zgodnie z instrukcjami producenta. Następnie podwiązać oczyszczony i strawiony produkt PCR do pSL16-CEN1-1 (227) w odpowiednich miejscach, aby wytworzyć pSL16-CRE przy użyciu ligazy DNA T4, jak podano w tabeli 3.</li>
			</ol>
			</li>
			<li>PCR amplifikuje kasetę terminatora genu promotora hph z pYLEX1-HPH za pomocą starterów # 88/# 89 flankujących miejsca restrykcyjne XhoI/BglII, zgodnie z tabelą 2. Oczyść produkt PCR za pomocą zestawu do oczyszczania PCR zgodnie z instrukcjami producenta.
			<ol>
				<li>Podwójnie trawić zarówno oczyszczony produkt PCR, jak i plazmid pSL16-CRE enzymami XhoI i BglII zgodnie z tabelą 4. Oczyść mieszaninę wytrawiającą za pomocą zestawu do oczyszczania PCR zgodnie z instrukcjami producenta. Następnie podwiązać oczyszczony i strawiony produkt PCR do pSL16-CRE w odpowiednich miejscach, aby wytworzyć pSL16-CRE-HPH przy użyciu ligazy DNA T4, zgodnie z tabelą 3. 
				Uwaga: Otrzymany plazmid ekspresji Cre, pSL16-CRE-HPH, zawiera wybieralny marker higromycyny B i jest wektorem centromerowym i episomalnym replikującym (Figura 2).</li>
			</ol>
			</li>
			<li>Sprawdzić wszystkie konstrukty przez trawienie z odpowiednimi enzymami restrykcyjnymi (np. SalI/PstI, w celu wycięcia insertu z wektora) zgodnie z tabelą 4.</li>
		</ol>
		</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Ratowanie markerów za pośrednictwem rekombinazy Cre
	<ol>
		<li>Przekształć pSL16-CRE-HPH w kompetentne komórki szczepu nokautującego KU70 zgodnie z protokołem transformacji opisanym w sekcji 1.2 powyżej. Komórki przekształcić na płytce YPD plus higromycyna B (YPDH) (zawierające 400 μg/ml higromycyny B) i inkubować w temperaturze 30 °C przez 2-3 dni.</li>
		<li>Przeprowadzić PCR kolonii zgodnie z tabelą 5 przy użyciu starterów # 84/# 85 w celu zidentyfikowania dodatnich kolonii zawierających plazmid pSL16-CRE-HPH po transformacji. 
		Uwaga: Starter do przodu # 84 i starter do tyłu # 85 znajdują się wewnątrz regionu kodującego genu hph (Tabela 1). Tylko dodatnie klony generują specyficzny produkt PCR w reakcji PCR.</li>
		<li>Wybrać dodatni klon i zaszczepić w 2 ml pożywki YPDH, a następnie inkubować w inkubatorze z wytrząsaniem w temperaturze 30 °C przy 225 obr./min przez noc do nasycenia. Zmierz średnicę zewnętrznej komórki600 za pomocą spektrofotometru. Zbierz komórki przy OD600 ~15. Wirować przy 5 000 x g przez 5 minut w temperaturze pokojowej i przemyć raz 2 ml sterylnej wody.</li>
		<li>Ponownie zaszczepić komórki w 2 ml pożywki YPD o początkowym OD600 wynoszącym 0,1 i pozwolić komórkom rosnąć w inkubatorze z wytrząsaniem w temperaturze 30 °C przy 225 obr./min przez noc. Umieść nocną hodowlę komórkową na płytkach YPD, aby wyizolować pojedyncze kolonie 23. Repliki kolonii płytek na płytkach YPD, YPDH i z niedoborem leucyny 23, 
		Uwaga: Kolonie, które utraciły zarówno marker LEU2, jak i plazmid pSL16-CRE-HPH, mogą rosnąć tylko na płytkach YPD (ryc. 3).</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
3. Usunięcie genów dehydrogenazy alkoholowej i oksydazy alkoholowej
<ol>
	<li>Przeszukaj bazę danych genomu Y. lipolytica za pomocą narzędzia Basic Local Alignment Search Tool (BLAST), aby zidentyfikować kandydatów na geny do delecji 26. Wprowadź sekwencję białka dehydrogenazy alkoholowej I S. cerevisiae do wyszukiwarki BLAST (http://www.genome.jp/tools-bin/search_sequence?prog=blast&db=yli&seqid=aa). 
	Uwaga: Narzędzie wyszukiwania BLAST zwraca najbardziej podobne sekwencje białek w bazie danych genomu Y. lipolytica.</li>
	<li>Skonstruować kasety delecyjne metodą PCR ze starterami od # 7 do # 56 (Tabela 1) i przeprowadzić reakcje trawienia i ligacji enzymów restrykcyjnych przy użyciu tych samych metod, jak opisano w sekcji 1.1 powyżej.</li>
	<li>Przygotować kompetentne komórki szczepu nokautującego KU70, przeprowadzić transformacje i przeprowadzić PCR w celu identyfikacji dodatnich kolonii ze starterami # 55, # 58 do # 81 (Tabela 1), postępując zgodnie z protokołem opisanym w sekcji 1.2 powyżej. 
	Uwaga: Jako przykład, procedura delecji genu YALI0E17787g jest opisana na rysunkach 4 i 5. Opisano wpływ regionu homologicznego o długości 1 kb i 2 kb na szybkość rekombinacji homologicznej.</li>
</ol>

<ol><li>Jiménez-Bremont, J. F., Rodrìguez-Hernández, A. A., Rodrìguez-Kessler, M. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aJim%C3%A9nez-Bremont%2C+JF+%22Development+and+dimorphism+of+the+yeast+Yarrowia+lipolytica.+Dimorphic+fungi%3A+Their+importance+as+models+for+differentiation+and+fungal+pathogenesis%22">Development and dimorphism of the yeast Yarrowia lipolytica. Dimorphic fungi: Their importance as models for differentiation and fungal pathogenesis</a>. J, R. uiz-H. errera , 58-66 (2012).</li>
<li>Coelho, M., Amaral, P., Belo, I. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aCoelho%2C+M+%22Yarrowia+lipolytica%3A+an+industrial+workhorse.+Current+research%2C+technology+and+education+topics+in+applied+microbiology+and+microbial+biotechnology%22">Yarrowia lipolytica: an industrial workhorse. Current research, technology and education topics in applied microbiology and microbial biotechnology</a>. Méndez-Vilas, A. , 930-940 (2010).</li>
<li>Martinez-Vazquez, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+the+transcription+factor+Znc1p%2C+which+regulates+the+yeast-to-hypha+transition+in+the+dimorphic+yeast+Yarrowia+lipolytica%5BTitle%5D)+AND+%22Plos+One%22%5BJournal%5D)">Identification of the transcription factor Znc1p, which regulates the yeast-to-hypha transition in the dimorphic yeast Yarrowia lipolytica.</a> Plos One. 8 (6), e66790(2013).</li>
<li>Richard, M., Quijano, R. R., Bezzate, S., Bordon-Pallier, F., Gaillardin, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tagging+morphogenetic+genes+by+insertional+mutagenesis+in+the+yeast+Yarrowia+lipolytica%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Bacteriol%22%5BJournal%5D)">Tagging morphogenetic genes by insertional mutagenesis in the yeast Yarrowia lipolytica.</a> J. Bacteriol. 183 (10), 3098-3107 (2001).</li>
<li>Flores, C. L., Martìnez-Costa, O. H., Sánchez, V., Gancedo, C., Aragòn, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+dimorphic+yeast+Yarrowia+lipolytica+possesses+an+atypical+phosphofructokinase%3A+characterization+of+the+enzyme+and+its+encoding+gene%5BTitle%5D)+AND+%22Microbiology%22%5BJournal%5D)">The dimorphic yeast Yarrowia lipolytica possesses an atypical phosphofructokinase: characterization of the enzyme and its encoding gene.</a> Microbiology. 151 (5), 1465-1474 (2005).</li>
<li>Domìnguez, Á, et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Non-conventional+yeasts+as+hosts+for+heterologous+protein+production%5BTitle%5D)+AND+%22Int.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Non-conventional yeasts as hosts for heterologous protein production.</a> Int. Microbiol. 1 (2), 131-142 (1998).</li>
<li>Zinjarde, S. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Food-related+applications+of+Yarrowia+lipolytica%5BTitle%5D)+AND+%22Food+Chem%22%5BJournal%5D)">Food-related applications of Yarrowia lipolytica.</a> Food Chem. 152, 1-10 (2014).</li>
<li>Finogenova, T., Morgunov, I., Kamzolova, S., Chernyavskaya, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Organic+acid+production+by+the+yeast+Yarrowia+lipolytica%3A+a+review+of+prospects%5BTitle%5D)+AND+%22Appl.+Biochem.+Micro%2B%22%5BJournal%5D)">Organic acid production by the yeast Yarrowia lipolytica: a review of prospects.</a> Appl. Biochem. Micro+. 41 (5), 418-425 (2005).</li>
<li>Groguenin, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetic+engineering+of+the+%CE%B2-oxidation+pathway+in+the+yeast+Yarrowia+lipolytica+to+increase+the+production+of+aroma+compounds%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Mol.+Catal.+B-Enzym%22%5BJournal%5D)">Genetic engineering of the β-oxidation pathway in the yeast Yarrowia lipolytica to increase the production of aroma compounds.</a> J. Mol. Catal. B-Enzym. 28 (2), 75-79 (2004).</li>
<li>Meng, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biodiesel+production+from+oleaginous+microorganisms%5BTitle%5D)+AND+%22Renew.+Energ%22%5BJournal%5D)">Biodiesel production from oleaginous microorganisms.</a> Renew. Energ. 34 (1), 1-5 (2009).</li>
<li>Papanikolaou, S., Aggelis, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lipid+production+by+Yarrowia+lipolytica+growing+on+industrial+glycerol+in+a+single-stage+continuous+culture%5BTitle%5D)+AND+%22Bioresource+Technol%22%5BJournal%5D)">Lipid production by Yarrowia lipolytica growing on industrial glycerol in a single-stage continuous culture.</a> Bioresource Technol. 82 (1), 43-49 (2002).</li>
<li>Tai, M., Stephanopoulos, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Engineering+the+push+and+pull+of+lipid+biosynthesis+in+oleaginous+yeast+Yarrowia+lipolytica+for+biofuel+production%5BTitle%5D)+AND+%22Metab.+Eng%22%5BJournal%5D)">Engineering the push and pull of lipid biosynthesis in oleaginous yeast Yarrowia lipolytica for biofuel production.</a> Metab. Eng. 15, 1-9 (2013).</li>
<li>Liu, H. H., Ji, X. J., Huang, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biotechnological+applications+of+Yarrowia+lipolytica%3A+Past%2C+present+and+future%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechnol.+Adv%22%5BJournal%5D)">Biotechnological applications of Yarrowia lipolytica: Past, present and future.</a> Biotechnol. Adv. 33 (8), 1522-1546 (2015).</li>
<li>Liu, L., Alper, H. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Draft+genome+sequence+of+the+oleaginous+yeast+Yarrowia+lipolytica+PO1f%2C+a+commonly+used+metabolic+engineering+host%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Announc%22%5BJournal%5D)">Draft genome sequence of the oleaginous yeast Yarrowia lipolytica PO1f, a commonly used metabolic engineering host.</a> Genome Announc. 2 (4), e00652-e00614 (2014).</li>
<li>Dujon, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genome+evolution+in+yeasts%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Genome evolution in yeasts.</a> Nature. 430 (6995), 35-44 (2004).</li>
<li>Chen, D. C., Beckerich, J. M., Gaillardin, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((One-step+transformation+of+the+dimorphic+yeast+Yarrowia+lipolytica%5BTitle%5D)+AND+%22Appl.+Microbial.+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">One-step transformation of the dimorphic yeast Yarrowia lipolytica.</a> Appl. Microbial. Biotechnol. 48 (2), 232-235 (1997).</li>
<li>Wang, J. H., Hung, W., Tsai, S. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High+efficiency+transformation+by+electroporation+of+Yarrowia+lipolytica%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">High efficiency transformation by electroporation of Yarrowia lipolytica.</a> J. Microbiol. 49 (3), 469-472 (2011).</li>
<li>Matsuoka, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+regions+essential+for+the+function+of+chromosomal+replicator+sequences+from+Yarrowia+lipolytica%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Gen.+Genet%22%5BJournal%5D)">Analysis of regions essential for the function of chromosomal replicator sequences from Yarrowia lipolytica.</a> Mol. Gen. Genet. 237 (3), 327-333 (1993).</li>
<li>Kretzschmar, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Increased+homologous+integration+frequency+in+Yarrowia+lipolytica+strains+defective+in+non-homologous+end-joining%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Genet%22%5BJournal%5D)">Increased homologous integration frequency in Yarrowia lipolytica strains defective in non-homologous end-joining.</a> Curr. Genet. 59 (1-2), 63-72 (2013).</li>
<li>Lorenz, T. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Polymerase+Chain+Reaction%3A+Basic+Protocol+Plus+Troubleshooting+and+Optimization+Strategies%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Polymerase Chain Reaction: Basic Protocol Plus Troubleshooting and Optimization Strategies.</a> J. Vis. Exp. (63), e3998(2012).</li>
<li>Kobs, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cloning+blunt-end+DNA+fragments+into+the+pGEM-T+Vector+Systems%5BTitle%5D)+AND+%22Promega+Notes%22%5BJournal%5D)">Cloning blunt-end DNA fragments into the pGEM-T Vector Systems.</a> Promega Notes. 62, 15-18 (1997).</li>
<li>JoVE Science Education Database. Isolating Nucleic Acids from Yeast. Essentials of Biology 1: yeast, Drosophila and C. elegans. , JoVE. Cambridge, MA. Available from:
 <a target="_blank" href="http://www.jove.com/science-education/5096/isolating-nucleic-acids-from-yeast">http://www.jove.com/science-education/5096/isolating-nucleic-acids-from-yeast</a> (2016).</li>
<li>Sanders, E. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Aseptic+laboratory+techniques%3A+plating+methods%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Aseptic laboratory techniques: plating methods.</a> J. Vis. Exp. (63), e3064(2012).</li>
<li>Hegemann, J. H., Heick, S. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Delete+and+repeat%3A+a+comprehensive+toolkit+for+sequential+gene+knockout+in+the+budding+yeast+Saccharomyces+cerevisiae%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">Delete and repeat: a comprehensive toolkit for sequential gene knockout in the budding yeast Saccharomyces cerevisiae.</a> Methods Mol. Biol. 765, 189-206 (2011).</li>
<li>Yamane, T., Sakai, H., Nagahama, K., Ogawa, T., Matsuoka, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dissection+of+centromeric+DNA+from+yeast+Yarrowia+lipolytica+and+identification+of+protein-binding+site+required+for+plasmid+transmission%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biosci.+Bioeng%22%5BJournal%5D)">Dissection of centromeric DNA from yeast Yarrowia lipolytica and identification of protein-binding site required for plasmid transmission.</a> J. Biosci. Bioeng. 105 (6), 571-578 (2008).</li>
<li>McGinnis, S., Madden, T. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((BLAST%3A+at+the+core+of+a+powerful+and+diverse+set+of+sequence+analysis+tools%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">BLAST: at the core of a powerful and diverse set of sequence analysis tools.</a> Nucleic Acids Res. 32 ((Web Server issue)), W20-W25 (2004).</li>
<li>Madzak, C., Tréton, B., Blanchin-Roland, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Strong+hybrid+promoters+and+integrative+expression%2Fsecretion+vectors+for+quasi-constitutive+expression+of+heterologous+proteins+in+the+yeast+Yarrowia+lipolytica%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Mol.+Microbiol.+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Strong hybrid promoters and integrative expression/secretion vectors for quasi-constitutive expression of heterologous proteins in the yeast Yarrowia lipolytica.</a> J. Mol. Microbiol. Biotechnol. 2 (2), 207-216 (2000).</li>
<li>Nicaud, J. M., Le Clainche, A., Le Dall, M. T., Wang, H., Gaillardin, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Yarrowia+lipolytica%2C+a+yeast+model+for+the+genetic+studies+of+hydroxy+fatty+acids+biotransformation+into+lactones%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Mol.+Catal.+B-Enzym%22%5BJournal%5D)">Yarrowia lipolytica, a yeast model for the genetic studies of hydroxy fatty acids biotransformation into lactones.</a> J. Mol. Catal. B-Enzym. 5 (1), 175-181 (1998).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Naszym celem w tym badaniu jest umożliwienie szybkiego i wydajnego generowania celowanych nokautów genów w szczepie Y. lipolytica Po1g. Aby to osiągnąć, należy wziąć pod uwagę kilka kwestii. Po pierwsze, wymagana jest wysoka wydajność transformacji. W związku z tym w pracy opisano skuteczny i wygodny protokół przemiany chemicznej dla szczepu Y. lipolytica Po1g. Zastosowanie PEG-4000 jest kluczowym czynnikiem dla udanej transformacji tego szczepu. Nie uzyskano transformantów do transformacji pla...

W przeciwieństwie do Saccharomyces cerevisiae, Yarrowia lipolytica, niekonwencjonalne drożdże, mogą rosnąć w postaci drożdży lub grzybni w odpowiedzi na zmiany warunków środowiskowych 1,2. Tak więc te drożdże dymorficzne mogą być wykorzystane jako dobry model do badania różnicowania, morfogenezy i taksonomii grzybów 3,4,5. Jest ogólnie uważany za bezpieczny (GRAS) gatunek drożdży, który jest szeroko stosowany do produkcji różnych dodatków do żywności, takich jak kwasy organiczne, polialkohole, związki aromatyczne, emulgatory i środki powierzchniowo czynne 6,7,8,9. Jest to obowiązkowy tlenowce i dobrze znane drożdże oleiste zdolne do naturalnej akumulacji lipidów w dużych ilościach, tj. do 70% suchej masy komórek 10. Może również wykorzystywać szerokie spektrum źródeł węgla do wzrostu, w tym różnego rodzaju pozostałości w zasobach odpadowych jako składniki odżywcze 11,12,13. Wszystkie te unikalne cechy sprawiają, że Y. lipolytica jest bardzo atrakcyjna do różnych zastosowań biotechnologicznych.
Chociaż cała sekwencja genomu Y. lipolytica została opublikowana 14,15, manipulacja genetyczna tych niekonwencjonalnych drożdży jest bardziej złożona niż w przypadku innych gatunków drożdży. Po pierwsze, transformacja tego gatunku drożdży jest znacznie mniej wydajna ze względu na brak stabilnego i wydajnego systemu transformacji genetycznej 16,17. Po drugie, pracochłonna integracja genomowa kaset ekspresji liniowej jest powszechnie stosowana do ekspresji genów będących przedmiotem zainteresowania, ponieważ w tych drożdżach nie znaleziono naturalnego systemu plazmidów episomalnych 18. Po trzecie, generowanie genetycznych nokautów i knock-inów jest ograniczone, ponieważ skuteczność celowania genu poprzez dokładną rekombinację homologiczną w tych drożdżach jest niska, a większość zdarzeń integracji zachodzi poprzez niehomologiczne łączenie końców (NHEJ) 19.
W tym badaniu opisujemy zoptymalizowany protokół transformacji dla szczepu Y. lipolytica Po1g, który jest łatwy, szybki, wydajny i powtarzalny. Aby zwiększyć częstotliwość precyzyjnej rekombinacji homologicznej, usunęliśmy gen KU70, który koduje kluczowy enzym w szlaku NHEJ. Korzystając ze zoptymalizowanego protokołu transformacji i przekształcając liniową kasetę nokautującą zawierającą flankujące regiony homologii o wielkości 1 kb, gen KU70 Y. lipolytica Po1g został pomyślnie usunięty. Solidność tej metodologii delecji genów została następnie wykazana poprzez celowanie w geny dehydrogenazy alkoholowej i oksydazy alkoholowej w szczepie Po1g KU70Δ. Zaobserwowano, że szczep delecji KU70 wykazywał znacznie wyższą skuteczność celowania genów za pośrednictwem rekombinacji homologicznej niż szczep Po1g typu dzikiego. Ponadto skonstruowano replikacyjny plazmid ekspresji Cre przenoszący marker oporności higromycyny B w celu ratowania markera. Uratowanie markera ułatwia wiele rund celowania w geny w uzyskanych mutantach delecji genów. Oprócz delecji genów, nasz protokół transformacji genetycznej i delecji genów opisany tutaj może być stosowany do wstawiania genów do określonych loci oraz do wprowadzania mutacji specyficznych dla miejsca do genomu Y. lipolytica.

<table><tbody><tr><td>Odczynnik/Materiał</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Startery oligonukleotydowe</td><td>Zintegrowane technologie</td><td></td> DNA <td>25 nmole DNA oligos</td></tr><tr><td>Y. lipolytica szczep Po1g</td><td>Yeastern Biotech</td><td></td><td>auksotroficzny pochodna leucyny typu dzikiego szczepu W29 (ATCC 20460)</td></tr><tr><td>Wektor pYLEX1</td><td>Yeast Biotech</td><td>FYY203-5MG</td><td>Y. lipolytica wektor ekspresyjny</td></tr><tr><td>E. coli TOP10</td><td>Invitrogen</td><td></td><td>Do klonowania i rozmnażania plazmidów</td></tr><tr><td>wektor pGEM-T&nbsp;</td><td>Wektor klonowania</td> <td>Promega</td><td>A3600</td> TA</tr><tr><td>QIAprep Spin Miniprep Kit</td><td>Qiagen</td><td>27106</td><td>Do izolacji plazmidu</td></tr><tr><td>Wizard SV Gel i PCR Clean-Up System</td><td>Promega</td><td>A9282</td><td>Ekstrahuj fragmenty DNA z żeli agarozowych i oczyszczaj produkty PCR z reakcji amplifikacji</td></tr><tr><td>Polimeraza DNA iProof o wysokiej wierności </td><td>Bio-Rad</td><td>172-5302</td><td>Polimeraza DNA o wysokiej wierności</td></tr><tr><td>BamHI&nbsp;</td><td>New England Biolabs</td><td>R0136S</td><td>Enzym restrykcyjny</td></tr><tr><td>BglII&nbsp;</td><td>New England Biolabs</td><td>R0144L</td><td>Enzym restrykcyjny</td></tr><tr><td>KpnI</td><td>New England Biolabs</td><td>R0142S</td><td>Enzym restrykcyjny</td></tr><tr><td>NdeI&nbsp;</td><td>New England Biolabs</td><td>R0111S</td><td>Enzym restrykcyjny</td></tr><tr><td>NotI</td><td>New England Biolabs</td><td>R0189L</td><td>Enzym restrykcyjny</td></tr><tr><td>PmlI</td><td>New England Biolabs</td><td>R0532S</td><td>Enzym restrykcyjny</td></tr><tr><td>PstI&nbsp;</td><td>New England Biolabs</td><td>R0140S</td><td>Enzym restrykcyjny</td></tr><tr><td>SacII</td><td>New England Biolabs</td><td>R0157S</td><td>Enzym restrykcyjny</td></tr><tr><td>SalI</td><td>New England Biolabs</td><td>R0138S</td><td>Enzym restrykcyjny</td></tr><tr><td>XhoI</td><td>New England Biolabs</td><td>R0146L</td><td>Enzym restrykcyjny</td></tr><tr><td>Ligaza DNA T4</td><td>New England Biolabs</td><td>M0202L</td><td></td></tr><tr><td>Taq DNA polimeraza i nbsp;</td><td>Bio-Rad</td><td>M0267L</td><td></td></tr><tr><td>Ampicylina</td><td>Gibco-Life Technologies</td><td>11593-027</td><td>Antybiotyki</td></tr><tr><td>Higromycyna B</td><td>PAA</td><td>P21-014</td><td>Antybiotyki</td></tr><tr><td>GeneRuler 1 kb Drabinka DNA</td><td>Thermo Scientific</td><td>SM0312</td><td>1 kb Drabinka DNA</td></tr><tr><td>PEG4000</td><td>Sigma</td><td>95904-F</td><td></td></tr><tr><td>Tris</td><td>Promega</td><td>H5135</td><td></td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Bio-Rad</td><td>161-0729</td><td></td></tr><tr><td>DNA plemników łososia</td><td>Invitrogen</td><td>15-632-011</td><td></td></tr><tr><td>Octan litu</td><td>Sigma</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Kwas octowy</td><td>Koraliki szklane Sigma</td><td></td><td></td></tr><tr><td>(425-600 &mikro; m)</td> <td>Sigma</td><td>G8772</td><td></td></tr><tr><td>RNAza A</td><td>Thermo Scientific</td><td>EN0531</td><td></td></tr><tr><td>Barwnik ładujący DNA</td><td>Thermo Scientific</td><td>R0611</td><td></td></tr><tr><td>Ekstrakt z drożdży baktonowych</td><td>BD</td><td>212750</td><td></td></tr><tr><td>Bacto Peptone</td><td>BD</td><td>211677</td><td></td></tr><tr><td>D-Glucose</td><td>1st Base</td><td>BIO-1101</td><td></td></tr><tr><td>YNB bez aminokwasów</td><td>Sigma</td><td>Y0626</td><td></td></tr><tr><td>DO Suplement-Leu</td><td>Clontech</td><td>630414</td><td></td></tr><tr><td>Glycerol</td><td>Sigma</td><td>G5516</td><td></td></tr><tr><td>Difco LB Bulion</td><td>BD</td><td>244620</td><td></td></tr><tr><td>Difco LB Agar</td><td>BD</td><td>244520</td><td></td></tr><tr><td>Bacto Agar</td><td>BD</td><td>214010</td><td></td></tr><tr><td><silny>Sprzęt</mocny></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Maszyna do PCR</td><td>Biorad</td><td>T100 Termocykler</td><td></td></tr><tr><td>Łaźnia wodna</td><td>Memmert</td><td>WNB 14</td><td></td></tr><tr><td>Inkubator stacjonarny/wytrząsający</td><td>Yihder</td><td>LM-570RD</td><td></td></tr><tr><td>Wytrząsarka</td><td>termiczna Allsheng</td><td>MS-100</td><td></td></tr><tr><td>Mikrowirówka</td><td>Eppendorf</td><td>5424R</td><td></td></tr><tr><td>Wirówka</td><td>Eppendorf</td><td>5810R</td><td></td></tr><tr><td>Spektrofotometr</td><td>Eppendorf&nbsp;</td><td>BioPhotometer plus</td><td></td></tr><tr><td>Żelowy imager</td><td>GE</td><td>Amersham Imager 600</td><td></td></tr></tbody></table>

inżynieria genetyczna niekonwencjonalnych drożdży do produkcji biopaliw odnawialnych i biochemicznych

Genetic Engineering of an Unconventional Yeast for Renewable Biofuel and Biochemical Production

Yarrowia lipolytica to niepatogenny, dymorficzny i ściśle tlenowy gatunek drożdży. Ze względu na swoje charakterystyczne cechy fizjologiczne i metaboliczne, te niekonwencjonalne drożdże są nie tylko dobrym modelem do badania fundamentalnej natury różnicowania grzybów, ale są również obiecującą platformą mikrobiologiczną do produkcji biochemicznej i różnych zastosowań biotechnologicznych, które wymagają rozległych manipulacji genetycznych. Jednak manipulacje genetyczne Y. lipolytica były ograniczone ze względu na brak wydajnego i stabilnego systemu transformacji genetycznej, a także bardzo wysokie wskaźniki rekombinacji niehomologicznej, które można przypisać głównie genowi KU70. W tym miejscu przedstawiamy łatwy i szybki protokół skutecznej transformacji genetycznej i delecji genu w Y. lipolytica Po1g. W pierwszej kolejności ustalono protokół efektywnej transformacji egzogennego DNA w Y. lipolytica Po1g. Po drugie, aby osiągnąć zwiększoną szybkość podwójnej krzyżowej rekombinacji homologicznej w celu dalszej delecji genów docelowych, gen KU70 został usunięty przez przekształcenie kasety rozrywającej zawierającej ramiona homologii 1 kb. Po trzecie, aby zademonstrować zwiększoną skuteczność delecji genu po delecji genu KU70, indywidualnie usunęliśmy 11 docelowych genów kodujących dehydrogenazę alkoholową i oksydazę alkoholową, stosując te same procedury na szczepie platformy nokautującej KU70. Zaobserwowano, że szybkość precyzyjnej rekombinacji homologicznej znacznie wzrosła z mniej niż 0,5% dla delecji genu KU70 w Po1g do 33%-71% dla pojedynczej delecji genu 11 genów docelowych w Po1g KU70Δ. Skonstruowano replikacyjny plazmid przenoszący marker oporności higromycyny B i system Cre / LoxP, a gen markera selekcyjnego w szczepach nokautujących drożdży został ostatecznie usunięty przez ekspresję rekombinazy Cre, aby ułatwić wiele rund ukierunkowanych manipulacji genetycznych. Powstałe w ten sposób mutanty delecji pojedynczego genu mają potencjalne zastosowanie w produkcji biopaliw i biochemii.

Zlinearyzowany wektor ekspresyjny Y. lipolytica został wprowadzony do platformy dokującej pBR w genomie szczepu Y. lipolytica Po1g poprzez przeprowadzenie pojedynczej rekombinacji krzyżowej 27. Dzięki zastosowaniu szybkiej procedury transformacji chemicznej opracowanej w niniejszym badaniu, zlinearyzowany wektor ekspresyjny Y. lipolytica został pomyślnie przekształcony do szczepu dzikiego Po1g z wydajnością transformacji &gt;100 cfu/µg DNA. Kaseta kno...

Niniejszym opisujemy metody molekularnej manipulacji genetycznej szczepu Yarrowia lipolytica Po1g w celu poprawy efektywności delecji genów. Powstałe w ten sposób zmodyfikowane szczepy Y. lipolytica mają potencjalne zastosowania w produkcji biopaliw i biochemii.

Inżynieria genetyczna niekonwencjonalnych drożdży do produkcji biopaliw odnawialnych i biochemicznych

Yarrowia lipolytica is a non-pathogenic, dimorphic and strictly aerobic yeast species. Owing to its distinctive physiological features and metabolic ...

Ogólnym celem niniejszej procedury jest opracowanie skutecznych metod inżynierii genetycznej dla niekonwencjonalnego gatunku drożdży, obejmujących konstrukcję transformującego DNA, transformację DNA, selekcję transformantów oraz ukierunkowaną delecję genów poprzez rekombinację homologiczną. Opracowaliśmy wysoce wydajną technikę delecji genów w szczepie Yarrowia lipolytica PO1G, która znajduje potencjalne zastosowanie w produkcji biopaliw i biochemikaliów. Główną zaletą tej techniki w porównaniu z istniejącymi metodami, takimi jak przerwanie genu za pomocą PCR, jest dostępność dużych ilości fragmentów do delecji genów oraz szerokiego zakresu markerów selekcyjnych.W niniejszym badaniu przedstawiamy protokół transformacji genetycznej szczepu yarrowia lipolytica PO1G, który jest efektywny, prosty, uznany i powtarzalny. Konstruowany w tym badaniu szczep yarrowia lipolytica PO1G z delecją KU70 wykazuje bardzo wysoką częstotliwość rekombinacji homologicznej, co umożliwia szybsze i łatwiejsze przesiewy celowanych delecji genów. Pierwszym krokiem w tej procedurze jest amplifikacja metodą PCR kasety ekspresyjnej LEU2 z wektora ekspresyjnego Y.lipolytica oraz wprowadzenie miejsc LoxP na końcach 5' i 3' kasety LEU2.W pierwszym starterze wprowadzono również miejsce restrykcyjne BamHI na potrzeby późniejszych etapów procesu klonowania. Po oczyszczeniu kasety LoxP promotor LEU2 terminator LoxP, do oczyszczonego produktu PCR dodano trzy nawisy A. Produkt PCR z końcówkami A został następnie poddany ligacji z wektorem klonującym TA w celu uzyskania plazmidu T-LEU2.Drugim etapem PCR jest amplifikacja sekwencji o długości jednej kilobazy położonej powyżej strony 5' genu KU70 przy użyciu starterów trzy i cztery z genomicznego DNA Y.lipolytica PO1G. Następnie należy przeprowadzić podwójne trawienie zarówno oczyszczonego produktu PCR, jak i plazmidu T-LEU2 enzymami SacII i BamHI, a następnie podwiązać oczyszczony i strawiony produkt PCR do miejsc SacII i BamHI w T-LEU2, aby uzyskać plazmid T-LEU2-5E. Trzecim etapem PCR jest amplifikacja sekwencji o długości jednej kilobazy położonej poniżej strony 3' genu KU70 przy użyciu starterów pięć i sześć z genomicznego DNA Y.lipolytica PO1G.Następnie przeprowadź podwójną trawień zarówno oczyszczonego produktu PCR, jak i plazmidu T-LEU2-53 enzymami NotI i NdeI, a następnie liguj oczyszczony i strawiony produkt PCR do miejsc NotI i NdeI w T-LEU2-5E, aby uzyskać plazmid T-KO. Na koniec straw plazmid T-KO enzymami SacII i NdeI, aby wytworzyć kasetę dysrupcyjną. Rozpocznij tę procedurę od przygotowania kompetentnych komórek Y.lipolytica PO1G.Zaszczep kolonię szczepu Y.lipolytica PO1G z świeżej płytki z agarem YPD (ekstrakt drożdżowy, pepton, glukoza) do 10 mililitrów pożywki YPD w kolbie o pojemności 100 mililitrów. Inkubuj w inkubatorze wytrząsowym w temperaturze 30 °C przy 225 RPM przez 20 godzin aż do osiągnięcia stanu nasycenia. Następnego dnia odwirowuj komórki przez pięć minut przy 5000 ×g w temperaturze pokojowej w celu uzyskania osadu.Przemyj komórki 20 mililitrami buforu TE i ponownie odwiruj komórki. Po usunięciu supernatantu resuspenderuj komórki w jednym mililitrze 0,1 molarnego octanu litu i inkubuj przez 10 minut w temperaturze pokojowej. Podziel kompetentne komórki na alikwoty po 100 mikrolitrów w sterylnych probówkach o pojemności 1,5 mililitra.Należy niezwłocznie przejść do procedury transformacji, delikatnie mieszając 10 µL zdenaturowanego DNA z plemni łososia oraz od jednej do pięciu µg oczyszczonej kasety dysrupcyjnej z 100 µL kompetentnych komórek. Inkubować w temperaturze 30 °C przez 15 minut. Dodać 700 µL 40% glikolu polietylenowego 1000.Wymieszać dokładnie i inkubować w inkubatorze z wytrząsaniem w temperaturze 30 °C przy 225 RPM przez 60 minut. Następnie poddać mieszaninę transformacyjną szokowi termicznemu, umieszczając probówkę w kąpieli wodnej o temperaturze 39 °C na 60 minut. Po 60 minutach dodać do probówki jeden mililitr pożywki YPD i pozwolić komórkom na regenerację przez dwie godziny w temperaturze 30 °C przy 225 RPM.Wiruj przy 9000 ×g przez jedną minutę w temperaturze pokojowej. Odlej supernatant i resuspender osad w jednym mililitrze buforu TE. Ponownie odwiruj komórki i odrzuć supernatant.Osad zawiesić w 100 µL buforu TE i wysiać na płytkę z podłożem pozbawionym leucyny. Płytkę inkubować w temperaturze 30 °C przez dwa do trzech dni. Przed przeprowadzeniem ratowania markera za pomocą rekombinazy CRE, należy skonstruować plazmid ekspresyjny CRE zgodnie z opisem w protokole tekstowym.Niektóre z cech tego plazmidu replikującego się episomalnie obejmują gen rekombinazy CRE, marker oporności na hygromycynę B oraz gen oporności na ampicylinę. Aby rozpocząć tę procedurę, należy wprowadzić plazmid ekspresyjny CRE do kompetentnych komórek szczepu z nokautem KU70, zgodnie z protokołem transformacji zaprezentowanym wcześniej. Przenieść transformowane komórki na płytki YPD z dodatkiem hygromycyny B i inkubować w temperaturze 30 °C przez dwa do trzech dni.Po przeprowadzeniu kolonialnej PCR, opisanej w protokole tekstowym w celu identyfikacji kolonii pozytywnych, należy wybrać pozytywny klon do zaszczepienia w 2 ml pożywki YPDH i inkubować w inkubatorze z wytrząsaniem w temperaturze 30 °C przy 225 RPM przez noc do osiągnięcia stanu nasycenia. Następnego dnia należy zmierzyć OD 600 hodowli za pomocą spektrofotometru. Gdy komórki osiągną OD 600 wynoszące około 15, należy je zebrać poprzez wirowanie przy 5000 ×g przez pięć minut w temperaturze pokojowej.Usunąć supernatant, dodać dwa mililitry sterylnej wody i ponownie wirować. Usunąć supernatant i resuspender komórki w pożywce YPD. Ponownie zaszczepić komórki w dwóch mililitrach pożywki YPD z początkową wartością OD 600 wynoszącą 0,1. Pozostawić komórki do wzrostu w inkubatorze w temperaturze 30 °C przy 225 RPM przez noc.Następnego dnia wykonaj posiew przez kreskowanie nocnej hodowli komórek na płytki YPD w celu wyizolowania pojedynczych kolonii. Inkubuj w temperaturze 30 Celsius do momentu pojawienia się kolonii. Wykonaj posiew replikacyjny kolonii na płytki YPD, YPDH oraz płytki z niedoborem leucyny.Inkubować płytki w temperaturze 30 °C przez dwa dni. Przedstawiono schemat plazmidu do nokautu KU70. Trawienie plazmidu enzymami SacII i NdeI prowadzi do otrzymania kasety dysrupcyjnej.Elektroforeza w żelu potwierdza obecność prążka o wielkości 4,3 kb, co odpowiada oczekiwanemu rozmiarowi kasety disruptyjnej. Delecja genu KU70 w szczepie Y.lipolytica PO1G została potwierdzona za pomocą PCR. Ścieżki od 1 do 10 zawierają produkty PCR amplifikowane z genomowego DNA transformantów, a ścieżka 11 zawiera produkty PCR ze szczepu dzikiego.Ścieżka siódma przedstawia pozytywny knockout, natomiast ścieżka pierwsza pokazuje wynik fałszywie dodatni. Gen markerowy selekcji w szczepie z knockoutem KU70 został ostatecznie usunięty poprzez ekspresję rekombinazy CRE. Pozytywne transformanty pozbawione markera zweryfikowano na podstawie ich wzrostu wyłącznie na płytce YPD.Aby zweryfikować wzrost szybkości delecji genów, po usunięciu genu KU70, w szczepie z knockoutem KU70 indywidualnie usunięto 11 genów docelowych, stosując tę samą procedurę. Każda dysrupcja genu została potwierdzona za pomocą PCR, a reprezentatywny wynik przedstawiono tutaj, gdzie ścieżki pierwsza, druga i czwarta zostały zidentyfikowane jako pozytywne knockouty. Szczep platynowy Yarrowia lipolytica PO1G z delecją KU70 zapewnia bardziej wydajny system i jest lepszym wyborem dla aplikacji w inżynierii szlaków metabolicznych oraz optymalizacji szczepów podczas konstruowania innych mutantów z delecjami chromosomalnymi.Po obejrzeniu tego filmu powinni Państwo posiąść wszechstronną wiedzę na temat strategii ukierunkowanej delecji pojedynczego genu poprzez rekombinację homologiczną w komórkach *Yarrowia lipolytica* PO1G.

genetic-engineering-an-unconventional-yeast-for-renewable-biofuel

Research

JoVE Journal

Genetics

Genetyka

Metoda Green Monster umożliwia szybkie tworzenie wielokrotnych delecji oznakowanych genem reporterowym kodującym zielone białko fluorescencyjne. Metoda ta opiera się na przeprowadzaniu szczepów drożdży przez powtarzalne cykle seksualnego sortowania delecji oraz wzbogacania komórek posiadających więcej delekcji na podstawie fluorescencji.

Proces Green Monster w celu generowania szczepów drożdży z wielokrotnymi delecjami genów

Prezentowany tutaj jest ujednolicony opis technik, które mogą być użyte do rozwoju, transformacji, podawania i testowania ekspresji heterologicznego białka probiotycznych drożdży Saccharomyces boulardii.

Przemiana drożdży probiotycznych i ich odzyskiwanie z tkanek odpornościowych przewodu pokarmowego po zgłębniku doustnym u myszy

Przedstawiamy szczegółowy protokół do konstruowania i sprawdzania bibliotek mutantów dla kampanii ukierunkowanej ewolucji u Saccharomyces cerevisiae.

Metoda ukierunkowanej ewolucji u Saccharomyces cerevisiae: tworzenie i badanie przesiewowe biblioteki mutantów

Techniki adaptacyjnej ewolucji i izolacji są opisane i zademonstrowane, aby uzyskać pochodne szczepu Scheffersomyces stipitis NRRL Y-7124, które są w stanie szybko zużywać mieszaninę cukrów heksozowych i pentozowych w enzymatycznych scukrzanych niedetoksykowanych hydrolizatach i gromadzić ponad 40 g/L etanolu.

Techniki ewolucji wytrzymałych drożdży fermentujących pentozy do biokonwersji lignocelulozy do etanolu

Wąskim gardłem w cyklu "zaprojektuj-zbuduj-testuj" inżynierii mikrobiologicznej jest szybkość, z jaką możemy przeprowadzać funkcjonalne badania przesiewowe szczepów. Opisujemy wysokoprzepustową metodę badań przesiewowych szczepów stosowaną do setek do tysięcy komórek drożdży na eksperyment, która wykorzystuje sekwencjonowanie RNA oparte na kropelkach.

Wysokowydajne fenotypowanie szczepów drożdży z sekwencjonowaniem RNA na bazie kropelek

Optogenetyczna kontrola metabolizmu mikrobiologicznego oferuje elastyczną dynamiczną kontrolę nad procesami fermentacji. Niniejszy protokół pokazuje, jak skonfigurować fermentację regulowaną niebieskim światłem do produkcji chemicznej i białkowej w różnych skalach objętościowych.

Fermentacja kontrolowana światłem do produkcji mikrobiologicznej, chemicznej i białkowej

Ten protokół wykorzystuje bioluminescencyjny reporter, który umożliwia pomiary aktywności transkrypcyjnej u Saccharomyces eubayanus w celu monitorowania przejścia z glukozy do maltozy, umożliwiając analizę adaptacji metabolicznych w czasie rzeczywistym i wspierając optymalizację szczepu do fermentacji przemysłowej w różnych warunkach.

In vivo (in vivo) Monitorowanie aktywności transkrypcyjnej podczas przemiany metabolicznej za pomocą bioluminescencyjnego reportera w drożdżach

Opisana jest wysokoprzepustowa, zautomatyzowana metodologia produkcji i przetwarzania protoplastów tytoniu. Zrobotyzowany system umożliwia masowo równoległą ekspresję i odkrywanie genów w modelowym systemie BY-2, które powinno być możliwe do przełożenia na uprawy niemodelowe.

Zrobotyzowana platforma do wysokowydajnej izolacji i transformacji protoplastów

Metody generowania dużych bibliotek gRNA powinny być proste, wydajne i opłacalne. Opisujemy protokół produkcji bibliotek gRNA oparty na enzymatycznym trawieniu docelowego DNA. Metoda CORALINA (comprehensive gRNA library generation through controlled nuclease activity) stanowi alternatywę dla kosztownej, niestandardowej syntezy oligonukleotydów.

Uniwersalny protokół do produkcji bibliotek gRNA na dużą skalę z dowolnego źródła DNA

W tym protokole, bakulowirus jest wytwarzany przez przejściową transfekcję plazmidu bakulowirusa do komórek Sf9 i amplifikowany w kulturze zawiesinowej bez surowicy. Supernatant jest oczyszczany przez chromatografię powinowactwa heparyny i dalej zagęszczany przez ultrawirowanie. Protokół ten jest przydatny do produkcji i oczyszczania bakulowirusa do zastosowania w terapii genowej.

Produkcja i oczyszczanie bakulowirusa do zastosowania w terapii genowej

Poznaj protokół transformacji genetycznej i usuwania genu KU70 w drożdżach Yarrowia lipolytica Po1g. Metoda zwiększa rekombinację homologiczną do 71%, umożliwiając precyzyjną inżynierię szczepów.

Inżynieria genetyczna niekonwencjonalnych drożdży do produkcji biopaliw odnawialnych i biochemicznych

Przeglądaj więcej filmów