Name: Warstwowe konstrukty alginianowe: platforma do wspólnej hodowli heterogenicznych populacji komórek (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-08-07T15:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 57 s
Description: Poznaj metodę tworzenia dwuwarstwowych dysków alginianowych do wspólnej hodowli 3D różnych populacji komórek. Technika umożliwia badanie interakji komórkowych w inżynierii tkanek.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Ta praca została sfinansowana przez National Science Foundation (CBET 0845754, AHH).

1. Przygotowanie do tworzenia krążków alginianowych
<ol>
	<li>Przygotować 4% (w/v) roztwór alginianu w 1x sól fizjologiczną buforowaną fosforanem Dulbecco bez dodatku chlorku wapnia lub chlorku magnezu i umieścić w łaźni wodnej o temperaturze 37 °C. Stężenia roztworu alginianu mogą się różnić, ale zalecane są 1 - 4% (w/v) roztwory alginianu.</li>
	<li>Wymieszać roztwór alginianu w stosunku 1:1 z ciepłym podłożem do hodowli komórkowych (np. Zmodyfikowanym Eagle Medium firmy Dulbecco) dla żądanego typu komórek. Stężenie alginianów wynosi obecnie połowę pierwotnego stężenia, tj. 2% (w/v). Sterylizuj roztwór alginianu/pożywki za pomocą sterylnych nylonowych filtrów strzykawkowych 0,2 μm.</li>
	<li>Przygotować kąpiel ze sterylnego 102 mM dwuwodnego chlorku wapnia w sterylnej wodzie z roztworem wystarczającym do zanurzenia pleśni (~ 200 - 300 ml).</li>
	<li>Zebrać sterylną "formę do tworzenia żelu" (cylindryczne studzienki o średnicy 6 mm x wysokości 3 mm w płycie aluminiowej o wymiarach 3 cale x 3 cale, patrz rysunek 1) i płytki końcowe (na dole: jedna płyta aluminiowa o wymiarach 3 cale x 3 cale, na górze: jedna o wymiarach 1,5 cala x 3 cale) i przygotować formy w następujący sposób:
	<ol>
		<li>Przyciąć grubą bibułę filtracyjną (bibułę filtracyjną) i membranę mikrosita komórkowego (wielkość porów 10 μm) do rozmiarów górnej i dolnej płytki końcowej i umieścić je w kąpieli chlorku wapnia do momentu nasycenia, około 1 min. W razie potrzeby wysterylizuj grubą bibułę filtracyjną i membranę mikrosita w autoklawie lub świetle ultrafioletowym przez 30 minut przed użyciem.</li>
		<li>Ustaw jedną połowę (dolną połowę) konstrukcji formy.
		<ol>
			<li>Ułóż następujące elementy jeden na drugim w następującej kolejności i wygładź za pomocą sterylnej szpatułki: duża płytka końcowa (3 cale x 3 cale), gruba bibuła filtracyjna, a następnie membrana mikrositowa.</li>
			<li>Odwróć i dociśnij formę do stosu ręczników papierowych, aby zapewnić utratę nadmiaru roztworu chlorku wapnia.</li>
			<li>Umieść "formę do tworzenia żelu" z cylindrycznymi dołkami na górze membrany mikrosita komórkowego i delikatnie przymocuj formę z dwóch stron za pomocą klipsów do segregatorów po lewej i prawej stronie. Upewnij się, że zostawiłeś wystarczająco dużo miejsca na górną płytę końcową (1.5 cala x 3 cale), aby całkowicie zakryć dołki później.</li>
		</ol>
		</li>
		<li>Ustaw drugą połowę (górną połowę) konstrukcji formy.
		<ol>
			<li>Ułóż następujące elementy jeden na drugim w następującej kolejności i wygładź go: małą płytkę końcową, grubą bibułę filtracyjną, membranę mikrositową.</li>
			<li>Odwróć i dociśnij tę połowę formy do stosu ręczników papierowych, aby zapewnić utratę nadmiaru roztworu chlorku wapnia. Nie mocuj w tym momencie tej połowy formy za pomocą spinaczy do segregatorów.</li>
		</ol>
		</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Komórki hodowlane zgodnie z zaleceniami producenta. Zbierz pożądane komórki, aby osadzić je w warstwowych hydrożelach alginianowych. Zalecana gęstość komórek to 1 - 2 x 106 komórek/ml, ale może się ona zmieniać w zależności od pożądanych eksperymentów. 
	Uwaga: Korzystając z tej metody do tworzenia warstw z różnymi typami komórek, upewnij się, że hodujesz dwa typy komórek równolegle w celu nakładania warstw. Mezenchymalne komórki macierzyste (MSC) wysiane w gęstości komórek 1 x 106 komórek/ml zostaną użyte jako przykład dla poniższego protokołu. Numer komórki i numer dysku można skalować na potrzeby eksperymentów w razie potrzeby.
	<ol>
		<li>Na jeden do dwóch tygodni przed osadzeniem należy wysiać mezenchymalne komórki macierzyste o gęstości komórek 3,000 - 5,000 komórek/cm2 w 10 ml podstawowej pożywki wzrostowej (Dulbecco's Modified Eagle Medium, 10% płodowej surowicy bydlęcej, 2% L-glutaminy, 1% aminokwasów endogennych, 1% penicyliny/streptomycyny) w kolbach T-75.</li>
		<li>Usuwaj zużytą pożywkę co 2-3 dni i zastąp 10 ml podstawowej pożywki wzrostowej, aż komórki będą zlewać się w 80-90%.</li>
		<li>Aby zebrać komórki, usuń zużyte podłoże i odpipetuj 3 ml 1x soli fizjologicznej buforowanej fosforanem Dulbecco bez dodatku chlorku wapnia lub chlorku magnezu w celu wypłukania komórek. Usunąć ten roztwór, odpipetować 3 ml 0,25% trypsyny-EDTA na komórki rosnące w kolbach T-75 i inkubować przez 5 minut w temperaturze 37 °C. Po oderwaniu komórek od przylegającej powierzchni dodać 6 - 9 ml podstawowej pożywki wzrostowej.</li>
		<li>Odwirować MSCs przy 600 x g przez 5 minut w temperaturze pokojowej, odessać supernatant i ponownie zawiesić w 1 - 5 ml podstawowej pożywki wzrostowej. Policz komórki za pomocą hemocytometru, korzystając z instrukcji urządzenia.</li>
		<li>Usunąć 1 x 106 komórek z całkowitego zawieszenia komórek, odwirować w tych samych warunkach i odessać supernatant.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. Tworzenie krążków alginianowych z nasionami komórek
<ol>
	<li>Ponownie zawiesić osad komórkowy za pomocą 1 ml sterylnego roztworu alginianu/pożywki, aby uzyskać gęstość komórek 1 x 106 komórek/ml. Mieszanina komórkowo-alginianowa będzie miała jednorodny mętny wygląd, gdy komórki zostaną odpowiednio wymieszane.</li>
	<li>Odpipetować 130 μl mieszaniny komórek i alginianów do sześciu studzienek o średnicy 6 mm x wysokości 3 mm w dolnej połowie formy, kroplami, tak aby nie tworzyć pęcherzyków. Nad krawędzią każdej studzienki powinna być widoczna lekko wypukła łąkotka.</li>
	<li>Ostrożnie wygładź górną połowę konstrukcji formy za pomocą sterylnej szpatułki i odwróć ją tak, aby membrana mikrosita komórkowego znalazła się na górze studzienek. Umieść konstrukcję formy na wierzchu studzienek, upewniając się, że studzienki zawierające komórkę i mieszaninę alginianów są całkowicie zakryte.</li>
	<li>Podnieś załadowaną konstrukcję formy i, mocno dociskając środek, przypnij pozostałe dwie strony (górną i dolną), aby przymocować górną i dolną połowę konstrukcji formy. W tym czasie roztwory alginianu komórkowego powinny być bezpiecznie osadzone w studzienkach.</li>
	<li>Zanurz mocowaną konstrukcję formy w kąpieli chlorku wapnia o pojemności 102 mM, upewniając się, że cała konstrukcja jest zanurzona. Inkubować w okapie do hodowli komórkowej w temperaturze pokojowej przez 90 minut.</li>
	<li>Pod koniec 90 minut wyjąć konstrukcję formy z kąpieli chlorku wapnia o pojemności 102 mM i umieścić na stosie ręczników papierowych w kapturze do hodowli komórkowych. Usuń wszystkie cztery spinki do segregatora i oddziel dwie połówki konstrukcji formy. Hydrożele powstające w studniach nie powinny mieć żadnych pęcherzyków i powinny całkowicie wypełnić studzienki.</li>
	<li>Za pomocą szpatułki ostrożnie obrysuj krawędź studzienek zawierających hydrożele, aby ostrożnie poluzować i wyciąć hydrożele. Po usunięciu hydrożeli z konstrukcji formy, wrzuć hydrożele bezpośrednio do kąpieli 1x soli fizjologicznej buforowanej fosforanem Dulbecco z chlorkiem wapnia i chlorkiem magnezu. Całkowicie przykryj żele, aby zmyć nadmiar roztworu chlorku wapnia przez 1 - 5 minut.</li>
	<li>Przenieś hydrożele do podstawowego roztworu pożywki wzrostowej w żądanym naczyniu (np. 6-dołkowych płytkach), które całkowicie zakrywa hydrożele. Inkubować przez co najmniej 1 godzinę w inkubatorze do hodowli komórkowych w temperaturze 37 °C i 5% CO2 przed przejściem do etapu warstwowania. 
	Uwaga: Hydrożele zawierające komórki mogą być w tym czasie przechowywane w inkubatorze do hodowli komórkowych przez czas nieokreślony, dopóki nie będzie pożądane nałożenie warstw żeli na inną populację komórek, pod warunkiem, że zmiany pożywki są wykonywane co 2-3 dni.</li>
</ol>
3. Nakładanie warstw krążków alginianowych
<ol>
	<li>W ciągu ostatnich pół godziny 1-godzinnej inkubacji zebrać i przygotować sterylne formy i roztwór do wyżarzania żeli.
	<ol>
		<li>Przygotuj "formę do cięcia", mocując formę, która ma dołki o wysokości połowy wysokości "formy do tworzenia żelu" (dołki o średnicy 6 mm x 1,5 mm w płycie aluminiowej o wymiarach 3 cale x 3 cale) do płyty końcowej (3 cale x 3 cale) za pomocą klipsów do segregatora po lewej i prawej stronie.</li>
		<li>Przygotuj "formę do wyżarzania", mocując formę o średnicy o 3 mm większą niż "forma do formowania żelu" (dołki o średnicy 9 mm x 3 mm w płycie aluminiowej o wymiarach 3 cale x 3 cale) do płyty końcowej (3 cale x 3 cale) za pomocą klipsów do segregatorów po lewej i prawej stronie.</li>
		<li>Przygotować roztwór 100 mM cytrynianu sodu/30 mM EDTA (dwuwodny cytrynian sodu, dwuwodna sól tetrasodowa kwasu etylenodiaminotetraoctowego) w sterylnej wodzie.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Usuń żele z pożądanymi populacjami komórek (w tym przykładzie dwa krążki z hMSC) z pożywki w naczyniu i umieść w dołkach "formy do cięcia". Każdy żel powinien ściśle przylegać do studzienek, tak aby połowa żelu wystawała ponad formę.</li>
	<li>Za pomocą skalpela pokrój żel wzdłuż powierzchni formy (spowoduje to przecięcie hydrożelu na pół). Odwróć górną połowę żelu i umieść go w otwartej formie. Połowa żelu powinna również dobrze przylegać do formy, ale teraz obie połówki żeli powinny mieć wysokość formy z widoczną wyciętą powierzchnią wewnętrzną. Powtórzyć z drugim żelem. 
	Uwaga: Ostrzeżenie: Tylko wewnętrzne powierzchnie cięcia będą tworzyć warstwowe tarcze. Użycie zewnętrznych powierzchni spowoduje rozdzielenie połówek. Podejrzewa się, że tekstura z membrany mikrosita przeniesiona na powierzchnię żelu uniemożliwia powodzenie procesu wyżarzania.</li>
	<li>Umieść kawałek suchej membrany mikrositowej na wierzchu studzienek, upewniając się, że membrana mikrosita styka się ze wszystkimi połówkami żelu do wyżarzania i całkowicie je przykryj. Umieść grubą bibułę filtracyjną na membranie mikrosita, upewniając się, że żele są całkowicie pokryte.</li>
	<li>Odpipetować roztwór 100 mM cytrynianu sodu/30 mM EDTA (dwuwodny cytrynian sodu, dwuwodna sól tetrasodowa kwasu etylenodiaminotetraoctowego) na grubą bibułę filtracyjną aż do jej nasycenia. Około 750 μl wystarcza na cztery dołki.</li>
	<li>Inkubować żele przez 1 minutę w temperaturze pokojowej. Następnie usuń membranę mikrosita komórkowego i grubą bibułę filtracyjną i wyrzuć je. Wyjmij spinki do segregatora i otwórz formę.</li>
	<li>Dla każdego wyżarzonego żelu przenieś jedną połowę hydrożelu poddanego działaniu cytrynianu sodu/EDTA do przygotowanej "formy do wyżarzania" z powierzchnią cięcia skierowaną do góry. Będzie to połowa wyżarzonej konstrukcji.</li>
	<li>Za pomocą szpatułki podnieś i umieść drugi półżel poddany działaniu cytrynianu sodu/EDTA (może zawierać inny typ komórek) na żelu już w "formie do wyżarzania", odwracając tę drugą półżel tak, aby powierzchnia cięcia stykała się z powierzchnią cięcia żelu już w "formie do wyżarzania".</li>
	<li>Delikatnie dociśnij dwa żele za pomocą szpatułki, aby usunąć wszelkie pęcherzyki między dwoma żelami. W razie potrzeby zmień położenie żeli, aby upewnić się, że znajdują się bezpośrednio jeden na drugim.</li>
	<li>Delikatnie podnieś "formę do wyżarzania" i zanurz ją w kąpieli chlorkowo-wapniowej o pojemności 102 mM na 30 minut. Nie zakrywaj studzienek płytą końcową.</li>
	<li>Po 30 minutach inkubacji usuń "formę do wyżarzania" i umieść ją na ręcznikach papierowych. Usuń spinki do segregatora i oddziel formę od płyty końcowej.</li>
	<li>Za pomocą szpatułki zbierz wyżarzone żele i umieść je w 1x Dulbecco's Phosphate Buffered Sol z chlorkiem wapnia i chlorkiem magnezu w kąpieli w celu umycia żeli. Następnie przenieś wyżarzone hydrożele na pożywkę do hodowli komórkowych w żądanym naczyniu (np. Płytce 6-dołkowej) w celu hodowli.</li>
</ol>

<ol><li>Sophia Fox, A. J., Bedi, A., Rodeo, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Basic+Science+of+Articular+Cartilage%5BTitle%5D)+AND+%22Sports+Health%22%5BJournal%5D)">The Basic Science of Articular Cartilage.</a> Sports Health. 1 (6), 461-468 (2009).</li>
<li>Neidlinger-Wilke, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanical+loading+of+the+intervertebral+disc%3A+from+the+macroscopic+to+the+cellular+level%5BTitle%5D)+AND+%22Eur.+Spine+J%22%5BJournal%5D)">Mechanical loading of the intervertebral disc: from the macroscopic to the cellular level.</a> Eur. Spine J. 23 (3), 333-343 (2013).</li>
<li>Klein, T. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tissue+engineering+of+stratified+articular+cartilage+from+chondrocyte+subpopulations%5BTitle%5D)+AND+%22Osteoarth.+Cartilage%22%5BJournal%5D)">Tissue engineering of stratified articular cartilage from chondrocyte subpopulations.</a> Osteoarth. Cartilage. 11 (8), 595-602 (2003).</li>
<li>Han, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Scaffold-free+Grafts+for+Articular+Cartilage+Defects%5BTitle%5D)+AND+%22Clin.+Orthop.+Relat.+R%22%5BJournal%5D)">Scaffold-free Grafts for Articular Cartilage Defects.</a> Clin. Orthop. Relat. R. 466 (8), 1912-1920 (2008).</li>
<li>Ng, K. W., Ateshian, G. A., Hung, C. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Zonal+chondrocytes+seeded+in+a+layered+agarose+hydrogel+create+engineered+cartilage+with+depth-dependent+cellular+and+mechanical+inhomogeneity%5BTitle%5D)+AND+%22Tissue+Eng.+A%22%5BJournal%5D)">Zonal chondrocytes seeded in a layered agarose hydrogel create engineered cartilage with depth-dependent cellular and mechanical inhomogeneity.</a> Tissue Eng. A. 15 (9), 2315-2324 (2009).</li>
<li>Ng, K. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+layered+agarose+approach+to+fabricate+depth-dependent+inhomogeneity+in+chondrocyte-seeded+constructs%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Orthop.+Res%22%5BJournal%5D)">A layered agarose approach to fabricate depth-dependent inhomogeneity in chondrocyte-seeded constructs.</a> J. Orthop. Res. 23 (1), 134-141 (2005).</li>
<li>Nguyen, L. H., Kudva, A. K., Saxena, N. S., Roy, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Engineering+articular+cartilage+with+spatially-varying+matrix+composition+and+mechanical+properties+from+a+single+stem+cell+population+using+a+multi-layered+hydrogel%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">Engineering articular cartilage with spatially-varying matrix composition and mechanical properties from a single stem cell population using a multi-layered hydrogel.</a> Biomaterials. 32 (29), 6946-6952 (2011).</li>
<li>Leone, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Continuous+multilayered+composite+hydrogel+as+osteochondral+substitute%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biomed.+Mater.+Res.+A%22%5BJournal%5D)">Continuous multilayered composite hydrogel as osteochondral substitute.</a> J. Biomed. Mater. Res. A. 103 (8), 2521-2530 (2015).</li>
<li>Lai, J. H., Kajiyama, G., Smith, R. L., Maloney, W., Yang, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stem+cells+catalyze+cartilage+formation+by+neonatal+articular+chondrocytes+in+3D+biomimetic+hydrogels%5BTitle%5D)+AND+%22Sci.+Rep%22%5BJournal%5D)">Stem cells catalyze cartilage formation by neonatal articular chondrocytes in 3D biomimetic hydrogels.</a> Sci. Rep. 3, (2013).</li>
<li>Vigfúsdòttir, ÁT., Pasrija, C., Thakore, P. I., Schmidt, R. B., Hsieh, A. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Role+of+Pericellular+Matrix+in+Mesenchymal+Stem+Cell+Deformation+during+Chondrogenic+Differentiation%5BTitle%5D)+AND+%22Cell.+Mol.+Bioeng%22%5BJournal%5D)">Role of Pericellular Matrix in Mesenchymal Stem Cell Deformation during Chondrogenic Differentiation.</a> Cell. Mol. Bioeng. 3 (4), 387-397 (2010).</li>
<li>Lee, C. S. D., Gleghorn, J. P., Won Choi, N., Cabodi, M., Stroock, A. D., Bonassar, L. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Integration+of+layered+chondrocyte-seeded+alginate+hydrogel+scaffolds%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">Integration of layered chondrocyte-seeded alginate hydrogel scaffolds.</a> Biomaterials. 28 (19), 2987-2993 (2007).</li>
<li>Gleghorn, J. P., Lee, C. S. D., Cabodi, M., Stroock, A. D., Bonassar, L. J. Adhesive properties of laminated alginate gels for tissue engineering of layered structures. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aGleghorn%2C+JP+%22J.+Biomed.+Mater.+Res.+A%22">J. Biomed. Mater. Res. A</a>. 85 (3), 611-618 (2008).</li>
<li>Gharravi, A. M., Orazizadeh, M., Ansari-Asl, K., Banoni, S., Izadi, S., Hashemitabar, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Design+and+Fabrication+of+Anatomical+Bioreactor+Systems+Containing+Alginate+Scaffolds+for+Cartilage+Tissue+Engineering%5BTitle%5D)+AND+%22Avicenna+J.+Med.+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Design and Fabrication of Anatomical Bioreactor Systems Containing Alginate Scaffolds for Cartilage Tissue Engineering.</a> Avicenna J. Med. Biotechnol. 4 (2), 65-74 (2012).</li>
<li>Xu, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chondrogenic+Differentiation+of+Human+Mesenchymal+Stem+Cells+in+Three-Dimensional+Alginate+Gels%5BTitle%5D)+AND+%22Tissue+Eng.+A%22%5BJournal%5D)">Chondrogenic Differentiation of Human Mesenchymal Stem Cells in Three-Dimensional Alginate Gels.</a> Tissue Eng. A. 14 (5), 667-680 (2008).</li>
<li>Yeatts, A. B., Gordon, C. N., Fisher, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Formation+of+an+aggregated+alginate+construct+in+a+tubular+perfusion+system%5BTitle%5D)+AND+%22Tissue+Eng.+C%2C+Methods%22%5BJournal%5D)">Formation of an aggregated alginate construct in a tubular perfusion system.</a> Tissue Eng. C, Methods. 17 (12), 1171-1178 (2011).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

W tym miejscu opisujemy protokół tworzenia warstwowych krążków hydrożelu alginianowego do badania kokultur wielu populacji komórek, takich jak te w fizjologicznie warstwowych tkankach, np . chrząstce. Struktury warstwowe, takie jak opisana platforma hodowlana, mogą być wykorzystywane do badania wzajemnych oddziaływań między dwiema odrębnymi populacjami komórek poddanymi temu samemu środowisku hodowlanemu lub pod obciążeniem.
Alginian jest anionowym liniowym polisacharydem, który okaza...

Kompresyjne tkanki nośne, takie jak chrząstka stawowa lub krążki międzykręgowe, składają się z niejednorodnych obszarów tkanki, które są kluczowe zarówno dla funkcji biomechanicznej, jak i odpowiedniej mechano-transdukcji w tkance. Nie tylko organizacja i funkcja komórkowa jest odrębna w różnych regionach, ale matryce zewnątrzkomórkowe (ECM) są również zróżnicowane pod względem składu i organizacji. Na przykład chrząstka stawowa składa się z trzech podstawowych stref o różnej morfologii komórek, funkcji mechanicznych i ECM. Różnice w ich ECM prowadzą do różnicowej odpowiedzialności za nośność; Warstwa powierzchowna bierze przede wszystkim udział w reakcji na rozciąganie na obciążenie, podczas gdy strefy środkowa i głęboka są głównie odpowiedzialne za reakcję na ściskanie 1. Podobnie w krążku międzykręgowym żelowe jądro miażdżyste jest otoczone blaszkowatym zwłóknieniem pierścienia, a komórki w tych dwóch odrębnych obszarach doświadczają różnych rodzajów bodźców biofizycznych 2. W tego typu tkankach komórki i macierze zewnątrzkomórkowe w warstwach tkanek oddziałują ze sobą, gdy tkanka ulega siłom mechanicznym i reaguje na nie.
Rekapitulacja takich heterogenicznych struktur tkankowych pozostaje wyzwaniem w inżynierii tkankowej i medycynie regeneracyjnej, a nasze zrozumienie ich biologicznego znaczenia jest ograniczone. Istnieje zapotrzebowanie na platformy hodowlane do analizy tkanek warstwowych, a także kokultur różnych populacji komórek w ramach jednego konstruktu. W inżynierii tkankowej chrząstki stawowej skonstruowano bezrusztkowe konstrukty warstwowe poprzez wykorzystanie zdolności strefowych chondrocytów do odkładania różnych ECM w celu naśladowania różnych warstw tej tkanki 3,4. Jednak warstwowe konstrukty hydrożelowe dają możliwość zbadania interakcji różnych typów populacji komórek, które nie są w stanie samodzielnie utworzyć solidnej tkanki. Na przykład różne populacje mezenchymalnych komórek macierzystych mogą być hodowane wspólnie w ramach warstwowych konstruktów. Takie warstwowe rusztowania były używane zarówno z chondrocytami, jak i różnicującymi mezenchymalnymi komórkami macierzystymi w celu poprawy inżynierii tkankowej 5. Nie tylko różne populacje komórek mogą być hodowane w podobnych warstwach hydrożelu, ale pojedynczy typ komórek może być również hodowany w warstwach, które zostały zmodyfikowane tak, aby miały różną sztywność lub zawartość biochemiczną, aby wywołać różne reakcje z komórek 6,7.
Wiele różnych hydrożeli biomateriałowych zostało użytych do warstwowania populacji komórek do inżynierii tkanki chrzęstnej, takich jak te wykorzystujące glikol polietylenowy lub bazie alkoholu poliwinylowego 7-9. Jednak hydrożele alginianowe są jednym z najprostszych biomateriałów, z których można tworzyć warstwowe rusztowania do badania heterogenicznych populacji komórek w kokulturze. Podczas gdy hydrożele agarozowe są również łatwo tworzone, hydrożele alginianowe mają dodatkową zaletę, umożliwiając łatwą izolację komórek z konstruktu 3D w celu analizy pojedynczych komórek, jak opisano wcześniej 10. W poprzednich badaniach dwuwarstwowe hydrożele alginianowe zostały uformowane w cienkich arkuszach, a z tych arkuszy wycięto skrawki (np. za pomocą stempla do biopsji) do określonych zastosowań, takich jak analiza zawartości biochemicznej lub właściwości ścinania międzyfazowego 11,12. Opisano inną metodę formowania cienkich arkuszy alginianowych z możliwością rozwarstwienia na wiele warstw, ale nadal wymagałaby zmiany w hydrożelu do stosowania w testach mechanicznych 13.
Tutaj prezentujemy metodę powtarzalnego tworzenia dwuwarstwowych krążków hydrożelowych alginianowych do wykorzystania we wspólnej hodowli różnych populacji komórek. Ta platforma z dyskiem alginianowym ma kilka zalet. Przede wszystkim powtarzalny kształt i mały rozmiar sprzyjają mechanicznej stymulacji osadzonych komórek bez konieczności wykonywania biopsji lub innych fizycznych zmian w hydrożelu w wielu zastosowaniach. Dodatkowo, żywotność komórek pozostaje wysoka podczas procesu nakładania warstw, a po utworzeniu żelu widoczne jest wyraźne oddzielenie dwóch populacji komórek w żelu bez początkowego nakładania się obszaru.

<table><tbody><tr><td>Sól sodowa kwasu alginowego</td><td>Sigma Aldrich</td><td>A1112</td><td>Roztwór wykonany w % wagowym przy użyciu DPBS (-/-)</td></tr><tr><td>1x Sól fizjologiczna buforowana fosforanem Dulbecco (-/-)</td><td>Gibco Life Technologies&nbsp;</td><td>14190</td><td></td></tr><tr><td>1x sól fizjologiczna buforowana fosforanem Dulbecco (+/+)</td><td>Gibco Life Technologies&nbsp;</td><td>14190</td><td></td></tr><tr><td>Zmodyfikowany Eagle Medium firmy Dulbecco Technologie</td><td>życia Gibco&nbsp;</td>Przykład <td>z 11965</td><td>roku. Użyj żądanych</td></tr><tr><td>filtrów strzykawkowych typu medium (0.02 i #956; m Nylon)</td><td>FisherBrand</td><td>0979C</td><td></td></tr><tr><td>Chlorek wapnia Dihydrat</td><td>Bioreagents</td><td>Fisher BP510</td><td>Przygotuj roztwór w sterylnej wodzie</td></tr><tr><td>Criterion Blotter Filter Paper</td><td>Biorad</td><td>1704085</td><td>Przytnij na wymiar płyty końcowe do tworzenia pleśni</td></tr><tr><td>Membrana mikrositowa komórkowa (10 &#956; m rozmiar porów)</td><td>Biodesign Inc z Nowego Jorku</td><td>N10R</td><td>Przycięte na wymiar płyt końcowych do tworzenia pleśni</td></tr><tr><td>Cytrynian sodu dwuwodny</td><td>FisherScience</td><td>S93364</td><td></td></tr><tr><td>Kwas etylenodiaminotetraoctowy sól tetrasodowa dwuwodna (EDTA)</td><td>FisherBioreagent</td><td>BP121</td><td></td></tr><tr><td>Surowica bydlęca płodu&nbsp;</td><td>Technologie Gibco Life&nbsp;</td><td>26140</td><td>Użyty w przykładzie mezenchymalnej pożywki dla podstawowych komórek macierzystych</td></tr><tr><td>Penicilina/Streptomycyna (10 000 U/ml)</td><td>Gibco Life Technologies&nbsp;</td><td>15140</td><td>Używany w przykładzie mezenchymalnej pożywki do podstawowego wzrostu komórek macierzystych</td></tr><tr><td>L-Glutamina (200 mM)</td><td>Gibco Life Technologies&nbsp;</td><td>25030081</td><td>Wykorzystany w przykładzie mezenchymalne podłoże do podstawowego wzrostu komórek macierzystych</td></tr><tr><td>Aminokwasy endogenne (100x)</td><td>Gibco Life Technologies&nbsp;</td><td>11140050</td><td>Stosowany w przykładzie pożywki dla podstawowych komórek macierzystych</td></tr></tbody></table>

warstwowe konstrukty alginianowe: platforma do wspólnej hodowli heterogenicznych populacji komórek

Layered Alginate Constructs: A Platform for Co-culture of Heterogeneous Cell Populations

Wiele tkanek nośnych posiada strukturalnie i funkcjonalnie odrębne regiony, zazwyczaj towarzyszą im różne fenotypy komórek o zróżnicowanych cechach mechanosensorycznych. Inżynieria i analiza tych typów tkanek pozostają wyzwaniem. Warstwowe konstrukty hydrożelowe dają możliwość badania interakcji między wieloma populacjami komórek w obrębie pojedynczych konstruktów. Hydrożele alginianowe są zarówno biokompatybilne, jak i pozwalają na łatwą izolację komórek po eksperymentach. W tym miejscu opisujemy metodę opracowywania dwuwarstwowych krążków hydrożelowych z alginianu o małych rozmiarach. Proces ten utrzymuje wysoką żywotność ludzkich mezenchymalnych komórek macierzystych podczas procesu tworzenia, a te warstwowe dyski mogą wytrzymać nieograniczoną cykliczną kompresję, powszechnie stosowaną do stymulacji hMSC przechodzących chondrogenezę. Te warstwowe konstrukty mogą być potencjalnie skalowane w górę, aby zawierały dodatkowe poziomy, a także mogą być używane do segregacji populacji komórek początkowo po nałożeniu warstw. Ta dwuwarstwowa platforma do hodowli hydrożelu alginianowego może być wykorzystywana do wielu różnych zastosowań, w tym do inżynierii i analizy komórek tkanek nośnych i kokultur innych typów komórek.

Rysunek 1 przedstawia proces tworzenia i warstwowania hydrożeli alginianowych. Gotowe żele dwuwarstwowe wykazują całkowitą początkową separację populacji komórek, co pokazano na Rysunku 2. Żywotność ludzkich mezenchymalnych komórek macierzystych osadzonych w tych hydrożelach i ułożonych warstwowo pozostaje wysoka i porównywalna z żywotnością w hydrożelach jednolitych, co przedstawiono na Rysunku 3. Żywotność oceniano po wygrzewaniu, przec...

Inżynieria i analiza tkanek nośnych z heterogenicznymi populacjami komórek nadal stanowią wyzwanie. W tym miejscu opisujemy metodę tworzenia dwuwarstwowych krążków hydrożelu alginianowego jako platformy do wspólnej hodowli różnych populacji komórek w ramach jednego konstruktu.

Warstwowe konstrukty alginianowe: platforma do wspólnej hodowli heterogenicznych populacji komórek

Many load bearing tissues possess structurally and functionally distinct regions, typically accompanied by different cell phenotypes with differential ...

Ogólnym celem niniejszej procedury jest powtarzalne tworzenie dwuwarstwowych dysków hydrożelu alginianowego do badania relacji między różnymi populacjami komórek podczas 3D ko-kultury. Metoda ta ułatwia badanie interakcji między wieloma populacjami komórek w przestrzennie heterogenicznych kulturach 3D, co może pomóc w odpowiedzi na kluczowe pytania w inżynierii tkankowej i fizjologii tkanek obciążonych mechanicznie. Główną zaletą tej techniki jest to, że oferuje ona prosty, ekonomiczny i powtarzalny sposób konstruowania zasianych komórkami, wielowarstwowych hydrożeli alginianowych, których struktura sprzyja stymulacji mechanicznej.Procedurę tę zaprezentuje Poonam Sharma, doktorantka z mojego laboratorium. Aby uformować dyski alginianowe, należy najpierw nałożyć kawałek grubego papieru filtracyjnego na płytkę końcową o wymiarach trzech na trzy cale, a następnie nałożyć membranę mikrosita do komórek. Użyć sterylnej szpatułki, aby wyrównać membranę i papier filtracyjny.Następnie odwróć stos na stos ręczników papierowych i dociśnij materiały, aby usunąć nadmiar roztworu chlorku wapnia. Dalej, umieść formę do tworzenia żelu z cylindrycznymi wgłębieniami na górze membrany mikrositowej i użyj klipsów sprężynowych, aby delikatnie przymocować formę do płyty końcowej po lewej i prawej stronie. Teraz ułóż kawałek grubego papieru filtracyjnego na małej płycie końcowej, a następnie kawałek membrany mikrositowej i odwróć stos, aby usunąć nadmiar chlorku wapnia, tak jak właśnie zaprezentowano.Gdy obie połowy formy będą gotowe, w zawiesinie z jałowego medium alginianowego należy zawiesić 1*10⁶ komórek badanych na mililitr. Mieszanina będzie wyglądać na jednorodnie mętną, gdy komórki zostaną odpowiednio rozproszone. Następnie, kroplami przenieś 130 µL komórek do poszczególnych otworów o średnicy 6 mm i wysokości 3 mm w dolnej połowie konstrukcji formy.Nad krawędzią każdego dołka powinien być widoczny lekko wypukły menisk. Po wysianiu wszystkich komórek należy użyć sterylnej szpatułki, aby ostrożnie wygładzić górną połowę konstrukcji formy. Następnie należy odwrócić formę tak, aby membrana mikrosita znalazła się nad dołkami, i umieścić formę na górze, dbając o to, by całkowicie przykryć dołki zawierające mieszaniny komórek i alginianu.Po umieszczeniu formy, podnieś załadowaną konstrukcję formy i, mocno naciskając na środek, załóż żabki biurowe na pozostałe dwie strony konstrukcji, aby połączyć górną i dolną połowę formy. Roztwory alginianu z komórkami powinny być stabilnie osadzone w wgłębieniach. Następnie zanurz całą konstrukcję formy w kąpieli z 102 mM chlorku wapnia w komorze do hodowli komórek w temperaturze pokojowej na 90 minut.Po zakończeniu inkubacji przenieś konstrukt na stos ręczników papierowych i zdejmij dwa żabki spinające górną płytę końcową z formą. Rozdziel dwie połowy konstruktu. Hydrożele uformowane w zagłębieniach nie powinny zawierać pęcherzyków powietrza i powinny całkowicie wypełniać zagłębienia.Usuń pozostałe dwa żabki zaciskowe i oddziel formę zawierającą hydrożel od pozostałej płyty końcowej. Używając szpatułki, ostrożnie prowadź wzdłuż krawędzi dołków zawierających hydrożele, aby delikatnie poluzować żele. Następnie przenieś hydrożele bezpośrednio do kąpieli z DPBS z chlorkiem wapnia i chlorkiem magnezu.Po upływie od jednej do pięciu minut przenieś hydrożele do poszczególnych dołków płytki sześciodołkowej zawierającej wystarczającą ilość pożywki do wzrostu bazylii, aby całkowicie zanurzyć żele na co najmniej jedną godzinę w temperaturze 37 °C i przy 5% CO2. W ciągu ostatnich 30 minut inkubacji użyj żabek biurowych, aby przymocować formę z dołkami o wysokości połowy formy do tworzenia żelu do aluminiowych płytek końcowych o wymiarach 3x3 cale lub 3x1,5 cala po lewej i prawej stronie, w celu stworzenia formy do wycinania. Następnie stwórz tryb wyżarzania, przypinając żabkami formę z dołkami o średnicy większej o 3 mm niż w formie do tworzenia żelu do aluminiowych płytek końcowych o wymiarach 3x3 cale po lewej i prawej stronie.Następnie przenieś hydrożele do wgłębień formy do wycinania. Każdy żel powinien ściśle przylegać do wgłębienia, tak aby połowa żelu wystawała ponad formę. Użyj skalpela, aby przeciąć hydrożel wzdłuż powierzchni formy, dzieląc go na pół.Odwróć górną połowę żelu i umieść ją w otwartym zagłębieniu formy. Fragment żelu powinien ściśle pasować do zagłębienia, tak aby obie połowy miały teraz wysokość formy, z widoczną przeciętą powierzchnią wewnętrzną. Następnie nałóż na zagłębienia kawałek suchej membrany mikrositowej do komórek, upewniając się, że membrana styka się ze wszystkimi połowami żelu przeznaczonymi do wyżarzania, i przykryj membranę kawałkiem grubej papierowej filtra.Gdy żele zostaną całkowicie przykryte, należy nasączyć papier filtracyjny cytrynianem sodu z dodatkiem EDTA i inkubować żele w temperaturze pokojowej. Po jednej minucie należy usunąć membranę mikrosita komórkowego oraz gruby papier filtracyjny, a następnie zdjąć zaciski biurowe. Następnie należy otworzyć formę i przenieść połowę żelu do przygotowanej formy do wyżarzania, tak aby cięta powierzchnia była skierowana ku górze.Za pomocą szpatułki przenieś drugą połowę przetraktowanego żelu na pierwszy żel w taki sposób, aby przecięta powierzchnia stykała się z przeciętą powierzchnią pierwszego żelu. Po umieszczeniu wszystkich żeli, użyj szpatułki, aby delikatnie docisnąć żele w celu usunięcia pęcherzyków powietrza, a następnie ostrożnie zanurz formę do wyżarzania w kąpieli z chlorkiem wapnia. Po 30 minutach przenieś formę do wyżarzania na stos ręczników papierowych i zdejmij zaciski mocujące.Następnie oddziel formę od płyty końcowej i przenieś żele na krótko do kąpieli z DPBS, a następnie zanurz je w odpowiedniej pożywce do hodowli komórkowych. Gotowe żele dwuwarstwowe wykazują całkowitą początkową separację populacji komórek, co widać na tym obrazie komórek 293 FT oznakowanych zielonym lub czerwonym barwnikiem do śledzenia komórek. Żywotność ludzkich mezenchymalnych komórek macierzystych osadzonych po wyżarzaniu jest wysoka w hydrożelach warstwowych, podobnie jak żywotność komórek obserwowana w hydrożelach jednolitych.Po wyizolowaniu szczytowego naprężenia z każdego cyklu podczas czterogodzinnego nieskrępowanego cyklicznego ściskania, warstwowe hydrożele bezkomórkowe wykazują odpowiedź naprężeniową na ściskanie cykliczne o znacznie mniejszej wartości w porównaniu z niewarstwowymi hydrożelami bezkomórkowymi, mimo że oba typy hydrożeli pozostają nienaruszone po siedmiu dniach hodowli. Po opanowaniu techniki, wliczając przygotowanie wszystkich materiałów, procedura ta może zostać ukończona w czasie krótszym niż cztery i pół godziny, jeśli jest wykonywana prawidłowo. Podczas przeprowadzania tej procedury ważne jest, aby pracować uważnie i powoli, aby zapobiec błędom oraz łatwiej monitorować poszczególne próbki.Po przeprowadzeniu tej procedury można zastosować inne metody, takie jak stymulacja mechaniczna i immunobarwienie, aby odpowiedzieć na dodatkowe pytania dotyczące oddziaływań między różnymi populacjami komórek w macierzach pozakomórkowych, które mogą powstać. Technika ta pozwoli badaczom z dziedziny mechanobiologii i inżynierii tkankowej na łatwiejsze badanie zależności między różnymi populacjami komórek, takimi jak mezenchymalne komórki macierzyste, chondrocyty i komórki nucleus pulposus. Należy pamiętać, że praca z przedmiotami ostrymi, materiałami biologicznymi, a w szczególności z ludzkimi komórkami, może być niezwykle niebezpieczna i podczas wykonywania tej procedury należy zawsze przestrzegać środków ostrożności, takich jak stosowanie odpowiednich środków ochrony osobistej.

layered-alginate-constructs-platform-for-co-culture-heterogeneous

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Bioinżynieria

W niniejszym protokole prezentujemy proces wytwarzania macierzy mikroaktuatorów z pionowo przesuniętymi słupkami, na której opiera się ta technologia, oraz sposób, w jaki technologia bazowa ta może zostać zmodyfikowana w celu prowadzenia wysokoprzepustowych dynamicznych mechanicznie hodweli komórkowych w dwu- i trójwymiarowych paradygmatach hodowli.

Mikrofabrykowane platformy do mechanicznie dynamicznej hodowli komórek

Hodowla prawidłowych komórek w kontekście trójwymiarowym stanowi alternatywną metodę badania wczesnych zdarzeń niezbędnych do transformacji komórkowej i tumorigenezji. Metoda ta jest wykorzystywana do hodowli prawidłowych komórek jajnika i jajowodów w celu zbadania wczesnych etapów powstawania raka jajnika.

Hydrożele alginianowe do trójwymiarowej hodowli organów jajników i jajowodów

W następnych sekcjach przedstawiamy procedury przygotowania mikrosfer alginianowych do zastosowań biomedycznych. W szczególności ilustrujemy technikę tworzenia wielowarstwowych mikrosfer alginianowych w celu jednoczesnej enkapsulacji komórek i białek jako potencjalnej metody leczenia cukrzycy typu 1.

Wytwarzanie mikrosfer alginianowych do zastosowań biomedycznych

Wodne systemy dwufazowe były używane do jednoczesnego modelowania wielu populacji komórek. Ta szybka i łatwa metoda modelowania komórek wykorzystuje separację faz wodnych roztworów dekstranu i glikolu polietylenowego oraz napięcie międzyfazowe, które istnieje między tymi dwoma roztworami polimerów.

Modelowanie kohodowli komórkowych przy użyciu wodnych systemów dwufazowych

Ustaliliśmy metodę kapsułkowania pluripotencjalnych komórek macierzystych (komórek PS) w kapsułkach hydrożelowych alginianowych za pomocą dyszy współosiowej.  Zapobiega to nadmiernej agregacji komórek i ogranicza naprężenia ścinające doświadczane przez komórki w hodowli zawiesinowej.  Technika ta ma zastosowanie do masowej produkcji komórek PS, a także do badań nad niszą komórek macierzystych.

Enkapsulacja alginianowa pluripotencjalnych komórek macierzystych za pomocą dyszy współosiowej

Poniższy protokół opisuje procedurę składania kultur podobnych do kanapek, które mają być używane jako etap pośredni między dwuwymiarowymi (2D) i trójwymiarowymi (3D) środowiskami komórkowymi. Opracowane systemy mogą znaleźć zastosowanie w badaniach mikroskopii, biomechaniki, biochemii i biologii komórki.

Mikrośrodowiska przypominające kanapki w celu wykorzystania interakcji między komórkami a materiałami

Opisujemy wytwarzanie arkuszy hydrożelowych z mikrowzorzystymi elementami za pomocą prostego procesu, który może być składany i manipulowany w formie wolnostojącej. Korzystając z tych modułowych arkuszy hydrożelowych, można wygenerować prosty system hodowli komórkowych 3D w skali makro z kontrolowanym mikrośrodowiskiem komórkowym.

Budowa modułowych arkuszy hydrożelowych dla mikrowzorzystej architektury komórkowej 3D w skali makro

Trójwymiarowa hodowla w kulkach alginianowych, ze względu na swoją prostotę i powtarzalność, została wybrana do utrzymania komórek gruczolaka przysadki. Procedury obejmowały wstępne trawienie enzymatyczne i mechaniczną dysocjację tkanki nowotworowej, a następnie zawiesinę komórek zamknięto w kulkach alginianowych.

Trójwymiarowa hodowla kulek alginianowych ludzkich komórek gruczolaka przysadki

Obecne modele hodowli dwuwarstwowych nie pozwalają na funkcjonalne badania in vitro, które naśladują mikrośrodowiska in vivo. Wykorzystując glikol polietylenowy i metodę szablonowania tlenku, protokół ten opisuje rozwój ultracienkiej biomimetycznej błony podstawnej o regulowanej sztywności, porowatości i składzie biochemicznym, która ściśle naśladuje matryce zewnątrzkomórkowe in vivo.

Ultracienkie porowane elastyczne hydrożele jako biomimetyczna błona podstawna do hodowli dwukomórkowej

Praca ta opisuje protokół dla swobodnego osadzonego druku 3D komórek macierzystych nerwowych wewnątrz samonaprawiającego, wyżarniającego się układu cząstek i matrycy zewnątrzkomórkowej. Protokół umożliwia programowalne wzorcowanie połączonych konstrukcjonów tkanek nerwowych ludzkich z wysoką dokładnością.

Wsparcie dla mikrożel-macierzy zewnętrznej dla wbudowanego drukowania 3D ludzkich konstrukcji nerwowych

Protokół pokazuje nowatorski model eksperymentalny in vitro, który może podsumować biologię dwóch rodzajów przylegających linii komórkowych za pomocą trójwymiarowego (3D) wydrukowanego rusztowania. Opisano budowę tego modelu i procedury operacyjne, od przygotowania komórek i hodowli komórek po analizę i ocenę.

Model kohodowli z wykorzystaniem dwóch typów przylegających linii komórkowych

Poznaj metodę tworzenia dwuwarstwowych dysków alginianowych do wspólnej hodowli 3D różnych populacji komórek. Technika umożliwia badanie interakji komórkowych w inżynierii tkanek.

Warstwowe konstrukty alginianowe: platforma do wspólnej hodowli heterogenicznych populacji komórek

Przeglądaj więcej filmów