Warstwowe konstrukty alginianowe: platforma do wspólnej hodowli heterogenicznych populacji komórek
7 sierpnia 2016
Inżynieria i analiza tkanek nośnych z heterogenicznymi populacjami komórek nadal stanowią wyzwanie. W tym miejscu opisujemy metodę tworzenia dwuwarstwowych krążków hydrożelu alginianowego jako platformy do wspólnej hodowli różnych populacji komórek w ramach jednego konstruktu.
Ogólnym celem tej procedury jest powtarzalne tworzenie dwuwarstwowych krążków hydrożelowych z alginianu w celu zbadania relacji między różnymi populacjami komórek podczas kohodowli 3D. Metoda ta ułatwia badanie interakcji między wieloma populacjami komórek w przestrzennie heterogenicznych kulturach 3D, co może pomóc w uzyskaniu odpowiedzi na kluczowe pytania z zakresu inżynierii tkankowej i fizjologii tkanek nośnych. Główną zaletą tej techniki jest to, że oferuje ona prosty, ekonomiczny i powtarzalny sposób konstruowania wielowarstwowych hydrożeli alginianowych wysiewanych przez komórki, które strukturalnie sprzyjają stymulacji mechanicznej.
Tę procedurę zademonstruje Poonam Sharma, doktorant z mojego laboratorium. Aby uformować krążki alginianowe, najpierw ułóż kawałek grubej bibuły filtracyjnej na płycie końcowej o wymiarach trzy na trzy cale, a następnie na membranie mikrosita komórkowego. Użyj sterylnej szpatułki, aby spłaszczyć membranę i bibułę filtracyjną.
Następnie odwróć stos na stos ręczników papierowych i ściśnij materiały, aby usunąć nadmiar roztworu chlorku wapnia. Następnie umieść formę do tworzenia żelu z cylindrycznymi dołkami na membranie mikrosita i użyj spinaczy do segregatorów, aby delikatnie przymocować formę do płyty końcowej po lewej i prawej stronie. Teraz ułóż kawałek grubej bibuły filtracyjnej na małej płycie końcowej, a następnie kawałek membrany mikrositowej i odwróć stos, aby usunąć nadmiar chlorku wapnia, jak właśnie pokazano.
Gdy obie połówki formy są gotowe, ponownie zawieś jedną razy od 10 do szóstej komórki zainteresowania na mililitr sterylnego podłoża alginianowego. Mieszanina będzie wydawała się jednorodnie mętna, gdy komórki będą odpowiednio rozproszone. Następnie przenieś 130 mikrolitrów komórek kroplami do pojedynczych studzienek o średnicy sześciu milimetrów i wysokości trzech milimetrów w dolnej połowie konstrukcji formy.
Nad krawędzią każdej studzienki powinna być widoczna lekko wypukła łąkotka. Kiedy wszystkie komórki zostaną wysiane, użyj sterylnej szpatułki, aby ostrożnie wygładzić górną połowę konstrukcji formy. Następnie odwróć formę tak, aby membrana mikrosita znalazła się na górze studzienek i umieść formę na wierzchu studzienek, uważając, aby całkowicie przykryć studzienki zawierające mieszaniny komórek i alginianów.
Gdy forma jest na miejscu, podnieś załadowaną konstrukcję formy i mocno dociśnij środek, umieść klipsy do segregatora po pozostałych dwóch stronach konstrukcji, aby przymocować górną i dolną połowę formy. Roztwory alginianu komórkowego powinny być bezpiecznie osadzone w studzienkach. Następnie zanurz całą konstrukcję formy w 102-milimolowej kąpieli chlorku wapnia w okapie do hodowli komórkowych w temperaturze pokojowej na 90 minut.
Pod koniec inkubacji przenieś konstrukt na stos ręczników papierowych i usuń dwa spinacze do segregatora mocujące górną płytkę końcową do formy. Oddziel dwie połówki konstrukcji. Hydrożele powstałe w studniach nie powinny mieć żadnych pęcherzyków i powinny całkowicie wypełnić studzienki.
Usuń pozostałe dwa spinki do segregatora i oddziel formę zawierającą hydrożel od pozostałej płyty końcowej. Za pomocą szpatułki ostrożnie prześledź krawędź studzienek zawierających hydrożele, aby ostrożnie poluzować żele. Następnie przenieś hydrożele bezpośrednio do kąpieli DPBS z chlorkiem wapnia i chlorkiem magnezu.
Po jednej do pięciu minut przenieś hydrożele do pojedynczych studzienek na sześciodołkowej płytce zawierającej wystarczającą ilość roztworu pożywki do wzrostu bazylii, aby całkowicie zanurzyć żele na co najmniej godzinę w temperaturze 37 stopni Celsjusza i pięciu procentach CO2. W ciągu ostatnich 30 minut inkubacji użyj spinaczy do spoiwa, aby przymocować formę z dołkami o połowie wysokości formy do tworzenia żelu do aluminiowej płyty końcowej o wymiarach trzy na trzy cale lub trzy na 1,5 cala po lewej i prawej stronie, aby utworzyć formę do cięcia. Następnie utwórz tryb wyżarzania, przycinając formę z dołkami o średnicy o średnicy trzech milimetrów większych niż forma do formowania żelu do płyt końcowych z aluminiowej płyty o wymiarach trzy na trzy cale po lewej i prawej stronie.
Teraz przenieś hydrożele do studzienek formy tnącej. Każdy żel powinien ściśle przylegać do studzienki, tak aby połowa żelu wystawała ponad formę. I użyj skalpela, aby pokroić wzdłuż powierzchni formy, aby przeciąć hydrożel na pół.
Odwróć górną połowę żelu i umieść go w otwartej formie. Kawałek żelu powinien ściśle przylegać do studzienki, ale teraz obie połówki powinny mieć wysokość formy, z widoczną wyciętą powierzchnią wewnętrzną. Następnie umieść kawałek suchej membrany mikrositowej nad studzienkami, upewniając się, że membrana styka się ze wszystkimi połówkami żelu, które mają być wyżarzane, i przykryj membranę kawałkiem grubej bibuły filtracyjnej.
Gdy żele są całkowicie pokryte, nasącz bibułę filtracyjną cytrynianem sodu uzupełnionym EDTA i inkubuj żele w temperaturze pokojowej. Po minucie wyrzuć membranę mikrosita komórkowego i grubą bibułę filtracyjną oraz usuń spinki do segregatora. Następnie otwórz formę i przenieś połówkę żelu do przygotowanej formy do wyżarzania z powierzchnią cięcia skierowaną do góry.
Za pomocą szpatułki przenieś drugą potraktowaną połówkę żelu na pierwszy żel, tak aby powierzchnia cięcia stykała się z powierzchnią cięcia pierwszego żelu. Po umieszczeniu wszystkich żeli za pomocą szpatułki delikatnie dociśnij żele, aby usunąć wszelkie pęcherzyki, i ostrożnie zanurz formę do wyżarzania w kąpieli chlorku wapnia. Po 30 minutach przenieś formę do wyżarzania na stos ręczników papierowych i usuń klipsy do wiązania.
Następnie oddziel formę od płytki końcowej i przenieś żele na krótko do kąpieli DPBS, a następnie zanurz je w odpowiednim pożywce do hodowli komórkowych. Ukończone dwuwarstwowe żele wykazują całkowitą początkową separację populacji komórek, jak zaobserwowano na tym obrazie 293 komórek FT oznaczonych zielonymi lub czerwonymi barwnikami śledzącymi komórki. Żywotność ludzkich mezenchymalnych komórek macierzystych osadzonych po wyżarzaniu jest wysoka w warstwowych hydrożelach, podobnie jak żywotność komórek obserwowana w hydrożelach luzem.
Po wyizolowaniu naprężenia szczytowego z każdego cyklu w ciągu czterech godzin nieograniczonego cyklicznego kompresji, bezkomórkowe hydrożele warstwowe wykazują reakcję na stres na cykliczną kompresję, która jest znacznie mniejsza w porównaniu z masowymi niewarstwowymi hydrożelami bezkomórkowymi, mimo że oba rodzaje hydrożelu pozostają nienaruszone po siedmiu dniach w hodowli. Po opanowaniu tej techniki, w tym przygotowania wszystkich materiałów, można ukończyć w mniej niż cztery i pół godziny, jeśli zostanie wykonana prawidłowo. Podczas próby wykonania tej procedury ważne jest, aby pracować celowo i powoli, aby zapobiec wszelkim błędom i łatwiej śledzić różne próbki.
Po tej procedurze można wykonać inne metody, takie jak stymulacja mechaniczna i barwienie immunologiczne, aby odpowiedzieć na dodatkowe pytania dotyczące interakcji między różnymi populacjami komórek w matrycach zewnątrzkomórkowych, które mogą się tworzyć. Technika ta pozwoli naukowcom zajmującym się mechanobiologią i inżynierią tkankową na łatwiejsze badanie relacji między różnymi populacjami komórek, takimi jak mezenchymalne komórki macierzyste, chondrocyty i komórki jądra miażdżystego. Nie zapominaj, że praca z ostrymi narzędziami, materiałami biologicznymi, a zwłaszcza komórkami ludzkimi, może być niezwykle niebezpieczna i że podczas wykonywania tej procedury należy zawsze podejmować środki ostrożności, takie jak noszenie odpowiedniej odzieży ochronnej.
Wyświetl pełny transkrypt i uzyskaj dostęp do tysięcy filmów naukowych
Przegląd
W niniejszym artykule przedstawiono metodę tworzenia dwuwarstwowych dysków hydrożelu alginianowego w celu badania oddziaływań między zróżnicowanymi populacjami komórek w trójwymiarowej ko-kulturze. Technika ta została opracowana, aby ułatwić badania w zakresie inżynierii tkankowej oraz fizjologii tkanek obciążonych mechanicznie.
Kluczowe elementy badania
Dziedzina nauki
- Inżynieria tkankowa
- Hodowla komórkowa
- Technologia hydrożeli
Wstęp
- Tkanki nośne są złożone i wymagają innowacyjnych podejść inżynieryjnych.
- Systemy kokultury mogą dostarczyć wiedzy na temat oddziaływań międzykomórkowych.
- Kultury 3D lepiej naśladują warunki fizjologiczne niż kultury 2D.
- Hydrożele alginianowe są biokompatybilne i wszechstronne w badaniach nad komórkami.
Cel badania
- Opracowanie powtarzalnej metody tworzenia dwuwarstwowych hydrożeli alginianowych.
- Zbadanie zależności pomiędzy różnymi populacjami komórek.
- Pogłębienie wiedzy na temat zastosowań w inżynierii tkankowej.
Zastosowane metody
- Układanie papieru filtrującego i membrany mikrosita komórkowego na płycie końcowej.
- Wygładzanie membrany i papieru filtrującego za pomocą sterylnej szpatułki.
- Tworzenie wielowarstwowych hydrożeli alginianowych do wysiewu komórek.
- Umożliwienie stymulacji mechanicznej konstruktów.
Główne wyniki
- Metoda ta pozwala na tworzenie hydrożeli o sprzyjającej strukturze.
- Umożliwia ona badanie przestrzennie niejednorodnych oddziaływań międzykomórkowych.
- Technika ta jest ekonomiczna i prosta w implementacji.
- Procedura została zaprezentowana przez studenta studiów magisterskich, co podkreśla jej wartość edukacyjną.
Wnioski
- Ta metoda stanowi cenne narzędzie w badaniach nad inżynierią tkankową.
- Umożliwia ona lepsze zrozumienie dynamiki populacji komórek w hodowlach 3D.
- Przyszłe badania mogą wykorzystać tę technikę w różnych zastosowaniach.
Najczęściej zadawane pytania
Znaczenie dla przemysłu
Wielowarstwowe konstrukty z hydrożelu alginianowego umożliwiają precyzyjną przestrzenną ko-kulturę heterogenicznych populacji komórek, wspierając badania mechanistyczne nad oddziaływaniami międzykomórkowymi w modelach tkanek obciążonych mechanicznie. Platforma ta rozwiązuje problem inżynierii strukturalnie odmiennych regionów tkankowych i zapewnia wiarygodność prognostyczną w badaniach i rozwoju (B+R) we wczesnych fazach inżynierii tkankowej oraz medycyny regeneracyjnej. Powtarzalność i skalowalność tej metody czynią ją przydatnym narzędziem w procesach odkrywczych i przedklinicznych ukierunkowanych na złożone systemy tkankowe.
Strategiczne zastosowania w badaniach i rozwoju biofarmaceutycznym
Wczesne odkrywanie i walidacja celu
- Umożliwia badanie oddziaływań komórka-komórka oraz komórka-macierz w fizjologicznie istotnych środowiskach 3D.
- Wspiera ograniczanie ryzyka biologicznego poprzez modelowanie heterogeniczności przestrzennej występującej w tkankach natywnych.
- Ułatwia funkcjonalną walidację potencjalnych typów komórek do zastosowań w inżynierii tkankowej.
Przesiewy i opracowywanie testów
- Zapewnia zestandaryzowaną platformę do powtarzalnych testów kokultury z wynikami ilościowymi.
- Umożliwia przygotowanie zwalidowanych konstruktów do późniejszej stymulacji mechanicznej i przesiewu fenotypowego.
- Wspiera skalowalność analiz oraz ponowne wykorzystanie platformy dla wielu typów komórek i warunków doświadczalnych.
Badania translacyjne i przedkliniczne
- Jest zgodne z modelami tkanek istotnymi dla danej choroby w celu odkrywania biomarkerów translacyjnych.
- Zapewnia ciągłość od etapu odkrycia po walidację przedkliniczną, umożliwiając badania mechanistyczne przy obciążeniach mechanicznych istotnych fizjologicznie.
- Zmniejsza ryzyko translacyjne poprzez wspieranie predykcyjnego modelowania reakcji tkanek.
Integracja potoku i przepływu pracy
Ta metoda warstwowego hydrożelu wpisuje się w kontinuum od etapu odkryć do badań przedklinicznych, umożliwiając prowadzenie badań opartych na hipotezach, opracowywanie testów oraz modelowanie translacyjne systemów tkankowych.
- Biologia odkrywcza: Wspiera testowanie hipotez dotyczących interakcji populacji komórkowych i mechanosensingu w tkankach inżynieryjnych.
- Przesiewy: Dostarcza powtarzalnych, ilościowych wyników służących do oceny żywotności komórek i odpowiedzi mechanicznej.
- Analityka: Zapewnia mierzalne wyniki, takie jak odpowiedź na stres podczas ściskania cyklicznego, do analizy porównawczej.
- Badania translacyjne: Łączy etap odkryć z walidacją przedkliniczną poprzez modelowanie środowisk tkanek obciążonych mechanicznie.
- Zastosowanie w skali przedsiębiorstwa: Oferuje modułową, skalowalną platformę możliwą do adaptacji w różnych badaniach nad inżynierią tkankową i kokulturami.
Wpływ operacyjny i przedsiębiorczy
- Wartość naukowa: Zwiększa pewność prognostyczną hipotez w inżynierii tkankowej i zmniejsza niejednoznaczność mechanistyczną.
- Wartość operacyjna: Standaryzuje przepływy pracy w kokulturach i zwiększa powtarzalność w zespołach badawczo-rozwojowych (R&D).
- Wartość strategiczna: Poprawia proces podejmowania decyzji go/no-go oraz efektywność kapitałową poprzez umożliwienie wczesnej redukcji ryzyka w modelach tkankowych.
- Wpływ na portfolio: Wspiera priorytetyzację programów inżynierii tkankowej i medycyny regeneracyjnej z uwzględnieniem analizy ryzyka.
Rozważania dotyczące wdrożenia
- Wymaga doświadczenia w zakresie trójwymiarowych (3D) hodowli komórkowych oraz pracy z hydrożelami.
- Wymaga dostępu do zaplecza hodowli komórkowych, sprzętu do stymulacji mechanicznej oraz narzędzi obrazowania.
- Wymaga standaryzacji międzyzespołowej w zakresie przygotowania i analizy konstruktów.
- Możliwość adaptacji do różnych typów komórek i modeli tkankowych poprzez optymalizację protokołu.
- Staranna obsługa i przemyślana realizacja procesu są kluczowe dla powtarzalności i integralności próbek.
