Warstwowe konstrukty alginianowe: platforma do wspólnej hodowli heterogenicznych populacji komórek
7 sierpnia 2016
Inżynieria i analiza tkanek nośnych z heterogenicznymi populacjami komórek nadal stanowią wyzwanie. W tym miejscu opisujemy metodę tworzenia dwuwarstwowych krążków hydrożelu alginianowego jako platformy do wspólnej hodowli różnych populacji komórek w ramach jednego konstruktu.
Ogólnym celem niniejszej procedury jest powtarzalne tworzenie dwuwarstwowych dysków hydrożelu alginianowego do badania relacji między różnymi populacjami komórek podczas 3D ko-kultury. Metoda ta ułatwia badanie interakcji między wieloma populacjami komórek w przestrzennie heterogenicznych kulturach 3D, co może pomóc w odpowiedzi na kluczowe pytania w inżynierii tkankowej i fizjologii tkanek obciążonych mechanicznie. Główną zaletą tej techniki jest to, że oferuje ona prosty, ekonomiczny i powtarzalny sposób konstruowania zasianych komórkami, wielowarstwowych hydrożeli alginianowych, których struktura sprzyja stymulacji mechanicznej.
Procedurę tę zaprezentuje Poonam Sharma, doktorantka z mojego laboratorium. Aby uformować dyski alginianowe, należy najpierw nałożyć kawałek grubego papieru filtracyjnego na płytkę końcową o wymiarach trzech na trzy cale, a następnie nałożyć membranę mikrosita do komórek. Użyć sterylnej szpatułki, aby wyrównać membranę i papier filtracyjny.
Następnie odwróć stos na stos ręczników papierowych i dociśnij materiały, aby usunąć nadmiar roztworu chlorku wapnia. Dalej, umieść formę do tworzenia żelu z cylindrycznymi wgłębieniami na górze membrany mikrositowej i użyj klipsów sprężynowych, aby delikatnie przymocować formę do płyty końcowej po lewej i prawej stronie. Teraz ułóż kawałek grubego papieru filtracyjnego na małej płycie końcowej, a następnie kawałek membrany mikrositowej i odwróć stos, aby usunąć nadmiar chlorku wapnia, tak jak właśnie zaprezentowano.
Gdy obie połowy formy będą gotowe, w zawiesinie z jałowego medium alginianowego należy zawiesić 1*10⁶ komórek badanych na mililitr. Mieszanina będzie wyglądać na jednorodnie mętną, gdy komórki zostaną odpowiednio rozproszone. Następnie, kroplami przenieś 130 µL komórek do poszczególnych otworów o średnicy 6 mm i wysokości 3 mm w dolnej połowie konstrukcji formy.
Nad krawędzią każdego dołka powinien być widoczny lekko wypukły menisk. Po wysianiu wszystkich komórek należy użyć sterylnej szpatułki, aby ostrożnie wygładzić górną połowę konstrukcji formy. Następnie należy odwrócić formę tak, aby membrana mikrosita znalazła się nad dołkami, i umieścić formę na górze, dbając o to, by całkowicie przykryć dołki zawierające mieszaniny komórek i alginianu.
Po umieszczeniu formy, podnieś załadowaną konstrukcję formy i, mocno naciskając na środek, załóż żabki biurowe na pozostałe dwie strony konstrukcji, aby połączyć górną i dolną połowę formy. Roztwory alginianu z komórkami powinny być stabilnie osadzone w wgłębieniach. Następnie zanurz całą konstrukcję formy w kąpieli z 102 mM chlorku wapnia w komorze do hodowli komórek w temperaturze pokojowej na 90 minut.
Po zakończeniu inkubacji przenieś konstrukt na stos ręczników papierowych i zdejmij dwa żabki spinające górną płytę końcową z formą. Rozdziel dwie połowy konstruktu. Hydrożele uformowane w zagłębieniach nie powinny zawierać pęcherzyków powietrza i powinny całkowicie wypełniać zagłębienia.
Usuń pozostałe dwa żabki zaciskowe i oddziel formę zawierającą hydrożel od pozostałej płyty końcowej. Używając szpatułki, ostrożnie prowadź wzdłuż krawędzi dołków zawierających hydrożele, aby delikatnie poluzować żele. Następnie przenieś hydrożele bezpośrednio do kąpieli z DPBS z chlorkiem wapnia i chlorkiem magnezu.
Po upływie od jednej do pięciu minut przenieś hydrożele do poszczególnych dołków płytki sześciodołkowej zawierającej wystarczającą ilość pożywki do wzrostu bazylii, aby całkowicie zanurzyć żele na co najmniej jedną godzinę w temperaturze 37 °C i przy 5% CO2. W ciągu ostatnich 30 minut inkubacji użyj żabek biurowych, aby przymocować formę z dołkami o wysokości połowy formy do tworzenia żelu do aluminiowych płytek końcowych o wymiarach 3x3 cale lub 3x1,5 cala po lewej i prawej stronie, w celu stworzenia formy do wycinania. Następnie stwórz tryb wyżarzania, przypinając żabkami formę z dołkami o średnicy większej o 3 mm niż w formie do tworzenia żelu do aluminiowych płytek końcowych o wymiarach 3x3 cale po lewej i prawej stronie.
Następnie przenieś hydrożele do wgłębień formy do wycinania. Każdy żel powinien ściśle przylegać do wgłębienia, tak aby połowa żelu wystawała ponad formę. Użyj skalpela, aby przeciąć hydrożel wzdłuż powierzchni formy, dzieląc go na pół.
Odwróć górną połowę żelu i umieść ją w otwartym zagłębieniu formy. Fragment żelu powinien ściśle pasować do zagłębienia, tak aby obie połowy miały teraz wysokość formy, z widoczną przeciętą powierzchnią wewnętrzną. Następnie nałóż na zagłębienia kawałek suchej membrany mikrositowej do komórek, upewniając się, że membrana styka się ze wszystkimi połowami żelu przeznaczonymi do wyżarzania, i przykryj membranę kawałkiem grubej papierowej filtra.
Gdy żele zostaną całkowicie przykryte, należy nasączyć papier filtracyjny cytrynianem sodu z dodatkiem EDTA i inkubować żele w temperaturze pokojowej. Po jednej minucie należy usunąć membranę mikrosita komórkowego oraz gruby papier filtracyjny, a następnie zdjąć zaciski biurowe. Następnie należy otworzyć formę i przenieść połowę żelu do przygotowanej formy do wyżarzania, tak aby cięta powierzchnia była skierowana ku górze.
Za pomocą szpatułki przenieś drugą połowę przetraktowanego żelu na pierwszy żel w taki sposób, aby przecięta powierzchnia stykała się z przeciętą powierzchnią pierwszego żelu. Po umieszczeniu wszystkich żeli, użyj szpatułki, aby delikatnie docisnąć żele w celu usunięcia pęcherzyków powietrza, a następnie ostrożnie zanurz formę do wyżarzania w kąpieli z chlorkiem wapnia. Po 30 minutach przenieś formę do wyżarzania na stos ręczników papierowych i zdejmij zaciski mocujące.
Następnie oddziel formę od płyty końcowej i przenieś żele na krótko do kąpieli z DPBS, a następnie zanurz je w odpowiedniej pożywce do hodowli komórkowych. Gotowe żele dwuwarstwowe wykazują całkowitą początkową separację populacji komórek, co widać na tym obrazie komórek 293 FT oznakowanych zielonym lub czerwonym barwnikiem do śledzenia komórek. Żywotność ludzkich mezenchymalnych komórek macierzystych osadzonych po wyżarzaniu jest wysoka w hydrożelach warstwowych, podobnie jak żywotność komórek obserwowana w hydrożelach jednolitych.
Po wyizolowaniu szczytowego naprężenia z każdego cyklu podczas czterogodzinnego nieskrępowanego cyklicznego ściskania, warstwowe hydrożele bezkomórkowe wykazują odpowiedź naprężeniową na ściskanie cykliczne o znacznie mniejszej wartości w porównaniu z niewarstwowymi hydrożelami bezkomórkowymi, mimo że oba typy hydrożeli pozostają nienaruszone po siedmiu dniach hodowli. Po opanowaniu techniki, wliczając przygotowanie wszystkich materiałów, procedura ta może zostać ukończona w czasie krótszym niż cztery i pół godziny, jeśli jest wykonywana prawidłowo. Podczas przeprowadzania tej procedury ważne jest, aby pracować uważnie i powoli, aby zapobiec błędom oraz łatwiej monitorować poszczególne próbki.
Po przeprowadzeniu tej procedury można zastosować inne metody, takie jak stymulacja mechaniczna i immunobarwienie, aby odpowiedzieć na dodatkowe pytania dotyczące oddziaływań między różnymi populacjami komórek w macierzach pozakomórkowych, które mogą powstać. Technika ta pozwoli badaczom z dziedziny mechanobiologii i inżynierii tkankowej na łatwiejsze badanie zależności między różnymi populacjami komórek, takimi jak mezenchymalne komórki macierzyste, chondrocyty i komórki nucleus pulposus. Należy pamiętać, że praca z przedmiotami ostrymi, materiałami biologicznymi, a w szczególności z ludzkimi komórkami, może być niezwykle niebezpieczna i podczas wykonywania tej procedury należy zawsze przestrzegać środków ostrożności, takich jak stosowanie odpowiednich środków ochrony osobistej.
Wyświetl pełny transkrypt i uzyskaj dostęp do tysięcy filmów naukowych
Przegląd
W niniejszym artykule przedstawiono metodę tworzenia dwuwarstwowych dysków hydrożelu alginianowego w celu badania oddziaływań między zróżnicowanymi populacjami komórek w trójwymiarowej ko-kulturze. Technika ta została opracowana, aby ułatwić badania w zakresie inżynierii tkankowej oraz fizjologii tkanek obciążonych mechanicznie.
Kluczowe elementy badania
Dziedzina nauki
- Inżynieria tkankowa
- Hodowla komórkowa
- Technologia hydrożeli
Wstęp
- Tkanki nośne są złożone i wymagają innowacyjnych podejść inżynieryjnych.
- Systemy kokultury mogą dostarczyć wiedzy na temat oddziaływań międzykomórkowych.
- Kultury 3D lepiej naśladują warunki fizjologiczne niż kultury 2D.
- Hydrożele alginianowe są biokompatybilne i wszechstronne w badaniach nad komórkami.
Cel badania
- Opracowanie powtarzalnej metody tworzenia dwuwarstwowych hydrożeli alginianowych.
- Zbadanie zależności pomiędzy różnymi populacjami komórek.
- Pogłębienie wiedzy na temat zastosowań w inżynierii tkankowej.
Zastosowane metody
- Układanie papieru filtrującego i membrany mikrosita komórkowego na płycie końcowej.
- Wygładzanie membrany i papieru filtrującego za pomocą sterylnej szpatułki.
- Tworzenie wielowarstwowych hydrożeli alginianowych do wysiewu komórek.
- Umożliwienie stymulacji mechanicznej konstruktów.
Główne wyniki
- Metoda ta pozwala na tworzenie hydrożeli o sprzyjającej strukturze.
- Umożliwia ona badanie przestrzennie niejednorodnych oddziaływań międzykomórkowych.
- Technika ta jest ekonomiczna i prosta w implementacji.
- Procedura została zaprezentowana przez studenta studiów magisterskich, co podkreśla jej wartość edukacyjną.
Wnioski
- Ta metoda stanowi cenne narzędzie w badaniach nad inżynierią tkankową.
- Umożliwia ona lepsze zrozumienie dynamiki populacji komórek w hodowlach 3D.
- Przyszłe badania mogą wykorzystać tę technikę w różnych zastosowaniach.
Najczęściej zadawane pytania
Znaczenie dla przemysłu
Wielowarstwowe konstrukty z hydrożelu alginianowego umożliwiają precyzyjną przestrzenną ko-kulturę heterogenicznych populacji komórek, wspierając badania mechanistyczne nad oddziaływaniami międzykomórkowymi w modelach tkanek obciążonych mechanicznie. Platforma ta rozwiązuje problem inżynierii strukturalnie odmiennych regionów tkankowych i zapewnia wiarygodność prognostyczną w badaniach i rozwoju (B+R) we wczesnych fazach inżynierii tkankowej oraz medycyny regeneracyjnej. Powtarzalność i skalowalność tej metody czynią ją przydatnym narzędziem w procesach odkrywczych i przedklinicznych ukierunkowanych na złożone systemy tkankowe.
Strategiczne zastosowania w badaniach i rozwoju biofarmaceutycznym
Wczesne odkrywanie i walidacja celu
- Umożliwia badanie oddziaływań komórka-komórka oraz komórka-macierz w fizjologicznie istotnych środowiskach 3D.
- Wspiera ograniczanie ryzyka biologicznego poprzez modelowanie heterogeniczności przestrzennej występującej w tkankach natywnych.
- Ułatwia funkcjonalną walidację potencjalnych typów komórek do zastosowań w inżynierii tkankowej.
Przesiewy i opracowywanie testów
- Zapewnia zestandaryzowaną platformę do powtarzalnych testów kokultury z wynikami ilościowymi.
- Umożliwia przygotowanie zwalidowanych konstruktów do późniejszej stymulacji mechanicznej i przesiewu fenotypowego.
- Wspiera skalowalność analiz oraz ponowne wykorzystanie platformy dla wielu typów komórek i warunków doświadczalnych.
Badania translacyjne i przedkliniczne
- Jest zgodne z modelami tkanek istotnymi dla danej choroby w celu odkrywania biomarkerów translacyjnych.
- Zapewnia ciągłość od etapu odkrycia po walidację przedkliniczną, umożliwiając badania mechanistyczne przy obciążeniach mechanicznych istotnych fizjologicznie.
- Zmniejsza ryzyko translacyjne poprzez wspieranie predykcyjnego modelowania reakcji tkanek.
Integracja potoku i przepływu pracy
Ta metoda warstwowego hydrożelu wpisuje się w kontinuum od etapu odkryć do badań przedklinicznych, umożliwiając prowadzenie badań opartych na hipotezach, opracowywanie testów oraz modelowanie translacyjne systemów tkankowych.
- Biologia odkrywcza: Wspiera testowanie hipotez dotyczących interakcji populacji komórkowych i mechanosensingu w tkankach inżynieryjnych.
- Przesiewy: Dostarcza powtarzalnych, ilościowych wyników służących do oceny żywotności komórek i odpowiedzi mechanicznej.
- Analityka: Zapewnia mierzalne wyniki, takie jak odpowiedź na stres podczas ściskania cyklicznego, do analizy porównawczej.
- Badania translacyjne: Łączy etap odkryć z walidacją przedkliniczną poprzez modelowanie środowisk tkanek obciążonych mechanicznie.
- Zastosowanie w skali przedsiębiorstwa: Oferuje modułową, skalowalną platformę możliwą do adaptacji w różnych badaniach nad inżynierią tkankową i kokulturami.
Wpływ operacyjny i przedsiębiorczy
- Wartość naukowa: Zwiększa pewność prognostyczną hipotez w inżynierii tkankowej i zmniejsza niejednoznaczność mechanistyczną.
- Wartość operacyjna: Standaryzuje przepływy pracy w kokulturach i zwiększa powtarzalność w zespołach badawczo-rozwojowych (R&D).
- Wartość strategiczna: Poprawia proces podejmowania decyzji go/no-go oraz efektywność kapitałową poprzez umożliwienie wczesnej redukcji ryzyka w modelach tkankowych.
- Wpływ na portfolio: Wspiera priorytetyzację programów inżynierii tkankowej i medycyny regeneracyjnej z uwzględnieniem analizy ryzyka.
Rozważania dotyczące wdrożenia
- Wymaga doświadczenia w zakresie trójwymiarowych (3D) hodowli komórkowych oraz pracy z hydrożelami.
- Wymaga dostępu do zaplecza hodowli komórkowych, sprzętu do stymulacji mechanicznej oraz narzędzi obrazowania.
- Wymaga standaryzacji międzyzespołowej w zakresie przygotowania i analizy konstruktów.
- Możliwość adaptacji do różnych typów komórek i modeli tkankowych poprzez optymalizację protokołu.
- Staranna obsługa i przemyślana realizacja procesu są kluczowe dla powtarzalności i integralności próbek.
