Wysokowydajna identyfikacja polimerów odstraszających bakterie do wyrobów medycznych

Ogólnym celem tej techniki polimerowej mikromacierzy jest zidentyfikowanie syntetycznych polimerów zdolnych do modulowania przylegania bakterii do powierzchni abiotycznych. Metoda ta może pomóc w przyspieszeniu postępów w odkrywaniu prostych, kosztowo efektywnych biomateriałów, które hamują przyleganie bakterii do wyrobów medycznych. Główną zaletą tej techniki w porównaniu z konwencjonalnymi badaniami nad biomateriałami, polegającymi na testowaniu jednego materiału naraz, jest możliwość jednoczesnego przesiewania setek polimerów w ramach jednego zasobu.

Na początek, zgodnie z protokołem tekstowym, należy przygotować roztwory polimerów i dodać je do dołków płytki 384-dołkowej. Utwórz rutynę do nanoszenia polimerów w czterech powtórzeniach, składającą się z 1536 punktów, rozmieszczonych w 48 rzędach i 32 kolumnach, nanosząc jednocześnie 32 roztwory polimerów, tak aby drukarkę można było zatrzymać po naniesieniu każdej sekcji w celu oczyszczenia pinów. Następnie umieść szkiełka pokryte agarozą na platformie i upewnij się, że uszczelnienie próżniowe jest prawidłowe, aby utrzymać szkiełka w pozycji.

Aby wyregulować głowicę drukującą tak, aby wszystkie piny znajdowały się na tej samej wysokości, należy ręcznie opuścić głowicę na szkiełko przedmiotowe i potwierdzić, że piny unoszą się jednocześnie. Umieść płytkę wielodołkową w uchwycie dla płytek, tak aby dołek A1 znajdował się w prawym górnym rogu uchwytu, i upewnij się, że płytka jest stabilnie zamocowana. Po wyświetleniu komunikatu potwierdź, że szkiełko i płytka wielodołkowa są na swoich miejscach.

Drukuj po jednej sekcji na raz, umożliwiając oczyszczenie pinów pomiędzy sekcjami. Następnie użyj ręcznika papierowego nasączonego acetonem, aby dokładnie wyczyścić piny. Na koniec użyj suchej chusteczki higienicznej, aby upewnić się, że piny są całkowicie suche.

Po całkowitym wydrukowaniu mikromacierzy należy umieścić je w uchwycie do szkiełek i przenieść do pieca próżniowego ustawionego na 40 °C w celu wysuszenia i usunięcia N&P z plamek polimeru. Następnie należy sterylizować płytki światłem UV przez 30 minut. Przed zaszczepieniem bakterii na szkiełkach należy zmierzyć fluorescencję tła zgodnie z protokołem tekstowym.

Po wyhodowaniu i przygotowaniu inokulum do mikromacierzy, zgodnie z protokołem tekstowym, umieść wysterylizowane promieniami UV polimerowe mikromacierze w prostokątnych płytkach czterodołkowych i dodaj 6 mL mieszanych kultur bakteryjnych. Inkubuj płytki w temperaturze 37 °C przy łagodnym mieszaniu przez pięć dni. Po inkubacji delikatnie przepłucz mikromacierze dwukrotnie przy użyciu PBS.

Następnie dodać 1 µg/mL DAPI w PBS i inkubować przez 30 minut. Dalej, przenieść macierze mikroarray do nowej płytki czterodołkowej, przykryć macierze PBS, a następnie delikatnie zamieszać ruchem wirowym. Po czym wymienić PBS i powtórzyć płukanie.

Po płukaniu wysuszyć macierze mikroarray pod strumieniem powietrza, a następnie nałożyć folię uszczelniającą i przytwierdzić szkiełka nakrywkowe do slajdów z mikroarray. Po wyschnięciu kleju zdezynfekować powierzchnię zewnętrzną 70% etanolem. Przy użyciu mikroskopu fluorescencyjnego wyposażonego w obiektyw 20x, zarejestrować pojedyncze obrazy dla każdej plamki polimerowej w polu jasnym oraz w kanałach strappy.

Aby pokryć szkiełka nakrywkowe polimerami, należy przygotować roztwory polimerów HIT w tetrahydrofuranie lub innym odpowiednim rozpuszczalniku. Przy użyciu powlekarki rotacyjnej należy nanieść roztwory polimerów na okrągłe szklane szkiełka nakrywkowe o odpowiednim rozmiarze, wirując z prędkością 2000 RPM przez dziesięć sekund. Pokryte szkiełka należy suszyć w piecu konwekcyjnym w temperaturze 40 degrees celsius przez noc.

Przed inokulacją bakteriami należy wysterylizować szkiełka nakrywkowe światłem UV przez 30 minut. Wysterylizowane w ten sposób szkiełka nakrywkowe umieść w standardowej płytce 12 lub 24-dołkowej i inkubuj z bakteriami, zgodnie z procedurą pokazaną wcześniej w tym filmie. Po inkubacji przemyj powlekone szkiełka nakrywkowe dwukrotnie 0,1 M buforem kakodylanowym, a następnie utrwal próbki przez dwie godziny, stosując 2,5% (masy/objętości) glutaraldehyd oraz 0,1 M bufor kakodylanowy.

Utrwal popsutki 1% czterotlenkiem osmu przez jedną godzinę w temperaturze pokojowej. Następnie odwodnij je w serii stężeń etanolu, pozostawiając próbki przez 30 minut w każdym z nich. Próbki napyl nowe za pomocą napylacza, używając mieszaniny stopu złota i platyny w proporcji 60:40, przy natężeniu prądu 30 mA i próżni wynoszącej 0,75 torr.

Po wykonaniu zdjęć za pomocą SEM należy wizualnie porównać obrazy niepowlekanych szkiełek podstawkowych z obrazami szkiełek powleczonych agarozą lub polimerami HIT, aby potwierdzić zdolność polimerów do wiązania lub odpychania bakterii. W celu oceny kompatybilności różnych rozpuszczalników z końcową częścią cewnika, a także ich zdolności do rozpuszczania polimeru HIT, należy zanurzyć fragmenty cewnika w rozpuszczalnikach i inkubować przez 12 godzin, a następnie wizualnie ocenić integralność cewnika oraz przejrzystość rozpuszczalnika. Aby przeanalizować przyleganie bakterii do cewników za pomocą SEM, należy przygotować 10% roztwór polimeru w acetonie.

Wciśnij końcówkę mikropipety 200 µL w środkową część odciętego fragmentu cewnika, aby go utrzymać, a następnie zanurz fragment w roztworze polimeru na około 30 sekund. Susz powleczony fragment w warunkach otoczenia przez 30 minut, a następnie nałóż drugą warstwę, ponownie zanurzając fragment cewnika w roztworze polimeru i susząc go przez noc w warunkach otoczenia. Po inkubacji powleczonych i niepowleczonych fragmentów cewnika w zaszczepionym podłożu LB, zgodnie z protokołem tekstowym, użyj 1 mL PBS do przemycia cewników.

Następnie należy zastosować 10% paraformaldehyd w PBS, aby utrwalić bakterie przez 30 minut. Po przemyciu w PBS należy użyć DAPI do barwienia bakterii na fragmentach cewnika przez 20 minut. Następnie należy przemyć próbki jednym mililitrem PBS.

Obserwuj rozmieszczenie próbek w komorze. Korzystając z poniższych ustawień, wykonaj obrazy konfokalne fragmentów cewnika. Zakończ obrazowanie konfokalne, wykonując stos obrazów z (z-stack) składający się z 50 obrazów na odcinku 100 micrometer długości cewnika.

Po potraktowaniu promieniami UV i inkubacji z bakteriami, użyj 1 mL PBS, aby dwukrotnie przemyć fragmenty, a następnie przenieś je do płytek 48-dołkowych zawierających 10% formaldehyd w PBS na 30 minut. Po utrwaleniu próbek przeprowadź kolejne przemywanie w PBS i pozostaw do wyschnięcia przez noc w temperaturze pokojowej. Następnie zamocuj je na stubach z przewodzącymi krążkami węglowymi i wykorzystaj napylacz do napylenia złota.

Przed obrazowaniem z wykorzystaniem skaningowego mikroskopu elektronowego. Rysunek ten przedstawia przyleganie bakterii do szeregu polimerów, określone za pomocą analizy mikroarray. Plamki naniesione bez polimeru służą jako kontrola negatywna, ponieważ agaroza wykazuje silną odporność na wiązanie bakterii, w związku z czym fluorescencja jest bardzo niska.

Przedstawione polimery wykazują wiązanie ze stopem, choć w większości przypadków właściwości odpychające polimeru znacząco różnią się w zależności od badanych gatunków bakterii. Odzwierciedla to duże różnice w mechanizmach przyłączania występujące u różnych gatunków. Polimery o niskim stopniu wiązania można łatwo zidentyfikować poprzez porównanie z agarozą.

Polimery o wysokim powinowactwie zostaną prawdopodobnie zidentyfikowane w matrycy i mogą służyć jako kontrole dodatnie w kolejnych eksperymentach. W przypadku polimerów, które nie wykazują autofluorescencji w kanale DAPI, porównanie jakościowe obrazów plamek można przeprowadzić wizualnie. W celu potwierdzenia właściwości odpychających bakterie 22 zidentyfikowanych odpowiednich polimerów przeprowadzono eksperymenty w większej skali, aby przetestować powlekanie większych powierzchni.

Przedstawiono tutaj najlepiej rokujące próbki wykorzystane do powlekania szkiełek podstawkowych, przeanalizowane za pomocą SEM. Rysunki te ukazują przekroje cewnika analizowane metodą mikroskopii konfokalnej oraz SEM. Obie metody mikroskopowe mają tę zaletę, że umożliwiają bezpośrednie przeliczenie komórek na powierzchni, co dostarcza jednoznacznych danych, ponieważ zmniejszenie przylegania komórek jest łatwo widoczne.

Po zastosowaniu tej procedury można przetestować składniki surowicy lub krwi, aby określić ich wpływ na wiązanie bakterii. W celu oceny potencjału powłok polimerowych do zastosowań klinicznych można wykorzystać model zwierzęcy. Należy pamiętać, że praca z odczynnikami chemicznymi i organizmami patogennymi może być niebezpieczna.

Podczas obchodzenia się z materiałami i ich utylizacji należy zastosować niezbędne środki kontrolne w celu zminimalizowania ryzyka dla personelu i środowiska.