Wysokowydajna identyfikacja polimerów odstraszających bakterie do wyrobów medycznych

Ogólnym celem tej techniki mikromacierzy polimerowej jest zidentyfikowanie syntetycznych polimerów zdolnych do modulowania przyczepiania się bakterii do powierzchni abiotycznych. Metoda ta może pomóc przyspieszyć postęp w odkrywaniu prostych, opłacalnych biomateriałów, które hamują przyczepianie się bakterii do wyrobów medycznych. Główną zaletą tej techniki w porównaniu z konwencjonalnymi badaniami biomateriałów, polegającymi na testowaniu jednego materiału na raz, jest jej zdolność do jednoczesnego przesiewania setek polimerów w jednym zasobie.

Na początek przygotuj roztwory polimerów i dodaj je do dołków płytki 384-dołkowej, zgodnie z protokołem tekstowym. Stwórz rutynę drukowania polimerów w poczwórnym duplikacie, składającą się z 1536 plamek, ułożonych w 48 wierszy i 32 kolumny, drukujących 32 roztwory polimerów na raz, tak aby drukarka mogła zostać zatrzymana po wydrukowaniu każdej sekcji, aby umożliwić oczyszczenie pinów. Teraz umieść szkiełka pokryte agarozą na platformie i upewnij się, że jest dobrze uszczelnione próżniowo, aby utrzymać prowadnice na miejscu.

Aby wyregulować głowicę drukującą tak, aby wszystkie kołki znajdowały się na tej samej wysokości, ręcznie opuść głowicę na szklany szkiełko i upewnij się, że kołki przesuwają się w górę w tym samym czasie. Umieść płytkę studzienkową na uchwycie płytki z dołkiem A1 w prawym górnym rogu uchwytu i upewnij się, że płytka studzienki jest mocno zamocowana. Upewnij się, że szkiełko i płytka studzienki są na swoim miejscu, gdy zostaniesz o to poproszony.

Drukuj jedną sekcję na raz, co pozwala na czyszczenie pinów między sekcjami. Następnie użyj ręcznika papierowego zamoczonego w acetonie, aby dokładnie wyczyścić szpilki. Następnie wysusz bibułkę, aby upewnić się, że szpilki są całkowicie suche.

Gdy mikromacierze są całkowicie wydrukowane, umieść je w uchwycie na szkiełka i przenieś do pieca próżniowego, ustawionego na 40 stopni Celsjusza do wyschnięcia, aby usunąć N&P z plam polimerowych. Następnie użyj światła UV, aby sterylizować płytki przez 30 minut. Przed zaszczepieniem szkiełek bakteriami należy wykonać pomiar fluorescencji tła zgodnie z protokołem tekstowym.

Po wyhodowaniu i przygotowaniu inokulantów do mikromacierzy, zgodnie z protokołem tekstowym, umieść wysterylizowane promieniami UV mikromatryce polimerowe na prostokątnych płytkach czterodołkowych i dodaj sześć mililitrów mieszanych kultur bakteryjnych. Inkubować płytki w temperaturze 37 stopni Celsjusza z delikatnym mieszaniem przez pięć dni. Po inkubacji użyj PBS, aby delikatnie przepłukać mikromacierze dwukrotnie.

Następnie dodaj jeden mikrogram na mililitr DAPI w PBS i inkubuj przez 30 minut. Następnie przenieś mikromacierze na świeżą płytkę czterodołkową, przykryj mikromacierze PBS, a następnie delikatnie zawiruj. Następnie wymień PBS raz i powtórz pranie.

Po wypłukaniu wysuszyć mikromacierze pod strumieniem powietrza, a następnie nałożyć folię uszczelniającą i przymocować szkiełka szklane do szkiełek do szkiełek do mikromacierzy. Gdy klej wyschnie, użyj 70% etanolu do sterylizacji zewnętrznej powierzchni. Za pomocą mikroskopu fluorescencyjnego, wyposażonego w 20-krotny obiektyw, uchwyć pojedyncze obrazy dla każdej plamki polimerowej w jasnym polu i kanałach paskowych.

W celu pokrycia szkiełek nakrywkowych polimerami należy przygotować roztwory polimerów HIT w tetrahydrofuranie lub innym odpowiednim rozpuszczalniku. Za pomocą powlekarki wirowej powlekaj okrągłe szkiełka szklane o odpowiedniej wielkości roztworami polimerowymi z prędkością 2000 obr./min przez dziesięć sekund. Pokryte szkiełka nakrywkowe wysuszyć w piecu konwekcyjnym w temperaturze 40 stopni Celsjusza przez noc.

I użyj światła UV, aby wysterylizować szkiełka nakrywkowe przez 30 minut przed zaszczepieniem bakteriami. Umieść szkiełka nakrywkowe wysterylizowane promieniami UV na standardowej płytce 12- lub 24-dołkowej i inkubuj z bakteriami, jak pokazano wcześniej w tym filmie. Po inkubacji użyć 0,1 molowego buforu kakodylowego, aby dwukrotnie przepłukać powlekane szkiełka nakrywkowe, a następnie za pomocą 2,5% wagowych aldehydu glutarowego i 0,1 molowego buforu kakodylanu utrwalić próbki na dwie godziny.

Po utrwaleniu szkiełek nakrywkowych 1% tetratlenkiem osmu przez godzinę w temperaturze pokojowej. Przed odwodnieniem w serii etanolowej przez 30 minut przy każdym stężeniu. Następnie za pomocą napylarki i mieszaniny 60 do 40% stopu złota i platyny pokryj próbki za pomocą prądu o natężeniu 30 miliamperów i próżni 0,75 tora.

Po wykonaniu zdjęć za pomocą SEM należy wizualnie porównać obrazy niepowlekanych szkiełek nakrywkowych z tymi pokrytymi agarozą lub polimerami HIT, aby potwierdzić zdolność polimerów do wiązania lub odpychania bakterii. Aby ocenić różne rozpuszczalniki pod kątem kompatybilności z końcową częścią studzienkową cewnika, a także ich zdolności do rozpuszczania polimeru HIT, zanurz fragmenty cewnika w rozpuszczalnikach i inkubuj przez 12 godzin przed wizualną oceną integralności cewnika i czystości rozpuszczalnika. Aby przeanalizować przyczepienie bakterii do cewników za pomocą SEM, przygotuj 10% roztwór polimeru w acetonie.

Wciśnij końcówkę mikropipety o pojemności 200 mikrolitrów w środkową część wyciętego kawałka cewnika, aby go przytrzymać i wsuń kawałek w roztworze polimeru na około 30 sekund. Wysuszyć powlekany element w warunkach otoczenia przez 30 minut, a następnie nałożyć drugą powłokę, ponownie zanurzając element cewnika w roztworze polimeru i wysuszyć przez noc w warunkach otoczenia. Po inkubacji powlekanych i niepowlekanych fragmentów cewnika w zaszczepionym LB, zgodnie z protokołem tekstowym, należy użyć jednego mililitra PBS do umycia cewników.

Następnie użyj 10% paraformaldehydu w PBS, aby utrwalić bakterie przez 30 minut. Po umyciu PBS użyj DAPI, aby zabarwić bakterie na elementach cewnika przez 20 minut. Przed umyciem jednym mililitrem PBS.

Przestrzegać ułożenia próbek w komorze. Korzystając z następujących ustawień, wykonaj obrazy konfokalne fragmentów cewnika. Uzupełnij obrazowanie konfokalne, umieszczając 50 obrazów w stosie na cewniku o długości 100 mikrometrów.

Po poddaniu działaniu promieniowania UV i inkubacji z bakteriami, użyj jednego mililitra PBS do dwukrotnego umycia kawałków i przenieś je na 48-dołkowe płytki zawierające 10% formaldehydu w PBS przez 30 minut. Po utrwaleniu próbek należy przeprowadzić kolejne płukanie PBS i wysuszyć przez noc w temperaturze pokojowej. Następnie zamontuj na króćcach z przewodzącymi dyskami węglowymi i użyj napylarki do powlekania złotem.

Przed obrazowaniem za pomocą skaningowego mikroskopu elektronowego. Rysunek ten przedstawia przyłączenie bakterii do wielu polimerów, jak określono za pomocą analizy mikromacierzy. Plamy drukowane bez polimeru działają jak kontrola ujemna, ponieważ agaroza jest silnie odporna na wiązanie bakteryjne, a zatem fluorescencja jest bardzo niska.

Prezentowane polimery wiążą stopy, chociaż w większości przypadków właściwości odstraszające polimeru różnią się znacznie między badanymi gatunkami bakterii. Odzwierciedla to duże różnice między mechanizmami przywiązania u różnych gatunków. Polimery o niskim poziomie wiązania można łatwo zidentyfikować w porównaniu z agarozą.

Polimery o wysokim stopniu wiązania mogą zostać zidentyfikowane w macierzy i mogą być wykorzystane jako kontrole pozytywne w kolejnych eksperymentach. W przypadku polimerów, które nie wykazują autofluorescencji w kanale DAPI, można dokonać jakościowego porównania obrazów punktowych wizualnie. Przeprowadzono eksperymenty na większą skalę w celu przetestowania powlekania większych powierzchni, aby potwierdzić właściwości odstraszające bakterie 22 zidentyfikowanych odpowiednich polimerów.

Pokazane tutaj są najlepiej działające próbki używane do powlekania szklanych szkiełek nakrywkowych, analizowane przez SEM. Rysunki te przedstawiają wycinki cewnika analizowane za pomocą mikroskopii konfokalnej i SEM. Obie metody mikroskopowe mają tę zaletę, że umożliwiają bezpośrednie zliczanie komórek na powierzchni, dostarczając jednoznacznych danych, ponieważ zmniejszenie przyczepu komórek jest łatwo widoczne.

Po tej procedurze można przetestować składniki surowicy lub krwi w celu określenia ich wpływu na wiązanie bakterii. Model zwierzęcy może zostać wykorzystany w celu oceny potencjału powłok polimerowych do zastosowań klinicznych. Nie zapominaj, że praca z chemikaliami i organizmami chorobotwórczymi może być niebezpieczna.

Podczas obchodzenia się z produktem i usuwania należy wprowadzić niezbędne środki kontroli, aby ograniczyć ryzyko osobiste i środowiskowe.