Name: Wysokowydajna identyfikacja polimerów odstraszających bakterie do wyrobów medycznych (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-11-05T13:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 43 s
Description: Poznaj metodę mikromacierzy do identyfikacji polimerów odstraszających bakterie z powierzchni wyrobów medycznych. Technika umożliwia jednoczesne badanie setek polimerów, przyspieszając odkrywanie nowych biomateriałów.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Autorzy dziękują EASTBIO (East of Scotland BioScience Doctoral Training Partnership finansowanemu przez BBSRC) (S. V.) oraz Medical Research Council (P.J.G) za finansowanie.

1. Przygotowanie preparatów pokrytych agarozą
UWAGA: Przed wytworzeniem mikromacierzy polimerowych, szkiełka szkiełkowe pokryte aminoalkilosilanem są powlekane agarozą I-B, aby zminimalizować niespecyficzne wiązanie tła i umożliwić ocenę polimerów, które wiążą lub odstraszają bakterie6. Powłoka silanowa ułatwia wiązanie agarozy ze szkiełkami.
<ol>
	<li>Uzupełnić 2% (m/v) roztwór agarozy I-B w wodzie destylowanej w butelce o pojemności 250 ml.</li>
	<li>Po luźnym zamknięciu butelki zawiesinę podgrzewać w kuchence mikrofalowej przez 30 sekund, aż do rozpuszczenia. Upewnij się, że nasadka nie jest szczelnie zamknięta, aby uniknąć potencjalnego wzrostu ciśnienia. Regularnie wyjmuj butelkę i delikatnie obracaj.</li>
	<li>Upewnij się, że ciało stałe się rozpuściło, a roztwór jest klarowny. Wlać ten roztwór agarozy do zlewki o pojemności 100 ml i umieścić w łaźni wodnej o temperaturze 65 °C, aby uzyskać płynny roztwór.</li>
	<li>Zanurz szkiełka pokryte silanem w roztworze agarozy, zapewniając równomierne pokrycie, i przetrzyj tylną część szkiełka bibułką.</li>
	<li>Szkiełka należy suszyć powlekaną stroną do góry w środowisku wolnym od kurzu (np. w szafce lub dygestorium) przez co najmniej 24 godziny.</li>
	<li>Potwierdzić jednolitą powłokę przez oględziny. Powłokę można łatwo ocenić, wdychając ją na szkiełko — na niepowlekanych obszarach utworzy się kondensacja. Do drukowania mikromacierzy należy używać wyłącznie szkiełek pokrytych całkowicie i równomiernie.</li>
</ol>
2. Przygotowanie roztworów polimerowych do druku
<ol>
	<li>Przygotować roztwory (1% w/v) wybranych wstępnie uformowanych polimerów składających się z poliakrylanów, poliakryloamidów i poliuretanów w N-metylopirolidonie (NMP) w szklanych fiolkach. (przygotować 1 ml każdego polimeru). Wirować, aż polimer całkowicie się rozpuści. Synteza polimerów jest opisana w innym miejscu6.</li>
	<li>Za pomocą mikropipety napełnij każdą studzienkę płytki mikrodołkowej 384 roztworem polimeru o objętości 25 μl, upewniając się, że nie ma zanieczyszczenia krzyżowego, a każda studzienka zawiera unikalny polimer. Użyj NMP jako kontroli negatywnej w co najmniej 2 studzienkach. Zapisz tożsamość roztworu polimeru w każdym dołku na szablonie płytki studzienki lub pliku arkusza kalkulacyjnego.</li>
</ol>
3. Drukowanie mikromacierzy polimerowych za pomocą drukarki kontaktowej
UWAGA: Drukowanie mikromacierzy odbywało się za pomocą drukarki stykowej. Szczegółowe instrukcje dotyczące drukowania mikromacierzy polimerowych znajdują się poniżej. Aby uzyskać ogólne wskazówki dotyczące korzystania z drukarki i zalecenia dotyczące bezpieczeństwa, postępuj zgodnie z instrukcją obsługi producenta. Chociaż korzystamy z drukarki kontaktowej, można również użyć odpowiedniego ręcznego urządzenia do stemplowania.
<ol>
	<li>Zgodnie z zaleceniami zawartymi w instrukcji obsługi drukarki utwórz procedurę (patrz krok 3.3), która umożliwia drukowanie 384 cieczy (roztworów polimerów lub NMP) w poczwórnych odstępach, przy użyciu 32-pinowej głowicy mikromacierzującej (ułożonej jako 8 rzędów i 4 kolumny).</li>
	<li>Wydrukuj 1 536 miejsc podzielonych na 48 wierszy i 32 kolumny. Zaprogramuj procedurę tak, aby drukowała w 12 sekcjach, tj. 32 roztworach na raz, tak aby drukarka mogła zostać zatrzymana po wydrukowaniu każdej sekcji, aby umożliwić oczyszczenie pinów.</li>
	<li>Aby utworzyć procedurę drukowania:
	<ol>
		<li>Otwórz oprogramowanie i z dostępnych opcji wybierz "Utwórz nową rutynę". Wybierz kartę "Opis", aby wprowadzić szczegółowe informacje o eksperymencie. Wybierz zakładkę "Głowica" i wybierz "32-pinowa głowica mikromacierzy".</li>
		<li>Wybierz zakładkę 'Źródło' i wybierz uchwyt płyty (uchwyt płyty źródłowej (1x5)), typ płyty (płyta 384 x 6 000), łączne tabliczki (1) i kolejność źródeł (według kolumn).</li>
		<li>W zakładce 'Projekt slajdu' wybierz 'Slajd 3x1'' i wybierz ustawienie według 'Numer pola'. Następnie wybierz 'Wzorzec szyku'. Wprowadź "Widok punktowy" jako "układ" i "Wymiary wzoru" jako "Liczba wierszy" (6), "Liczba kolumn" (8), "Rozstaw wierszy" (750) i "Rozstaw kolumn" (560). Wybierz jedną sekcję do wydrukowania jako pierwszą.</li>
		<li>W zakładce "Układ slajdów" wprowadź liczbę slajdów używanych do drukowania. Wybierz zakładkę 'Drukuj', aby wprowadzić parametry drukowania (liczba stempli na farbę: 1, liczba stempli na punkt: 5, czas stemplowania: 200 ms, czas tuszowania: 100 ms). 
		UWAGA: Stworzono teraz procedurę drukowania 384 cieczy (roztworów polimerów lub NMP) w poczwórnych odstępach, przy użyciu 32-pinowej głowicy mikromacierzującej (ułożonej jako 8 rzędów i 4 kolumny). W sumie program powinien wydrukować 1 536 punktów ułożonych w 48 rzędów i 32 kolumny o rozstawie rzędów 750 μm i rozstawie kolumn 560 μm.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Umieść prowadnice pokryte agarozą na platformie i upewnij się, że jest dobrze uszczelnione próżniowo, aby utrzymać prowadnice na miejscu.</li>
	<li>Wyreguluj głowicę drukującą tak, aby wszystkie kołki znajdowały się na tej samej wysokości. Sprawdź to, ręcznie opuszczając głowicę na szklaną szkiełko i upewniając się, że kołki przesuwają się w tym samym czasie. Jeśli występują jakiekolwiek rozbieżności z wysokością, wyreguluj za pomocą tulei na sworzniu w górę lub w dół.</li>
	<li>Umieść płytkę studzienkową na uchwycie talerza we właściwej orientacji, tj. studzienka A1 znajduje się w prawym górnym rogu uchwytu i upewnij się, że płytka studzienki jest mocno zamocowana.</li>
	<li>Za pomocą regulatora wysokości upewnij się, że wysokość uchwytu płytki jest taka, aby podczas pobierania roztworów polimerowych kołki nie dotykały dna studzienek. 
	UWAGA: Jest to ważne dla równomiernego plamienia polimeru, a także dla uniknięcia rozlania roztworów polimerów do sąsiednich studzienek, powodując w ten sposób zanieczyszczenie krzyżowe.</li>
	<li>Wybierz zakładkę "Start" i wybierz "Typ uruchamiania" jako "Normalny". Kliknij "Uruchom" i potwierdź, że szkiełko, płytka studzienki itp. są na swoim miejscu, gdy zostaniesz o to poproszony.</li>
	<li>Drukuj 1 sekcję na raz (32 roztwory na raz; 12 sekcji), co pozwala na czyszczenie pinów między sekcjami. Dokładnie wyczyść szpilki ręcznikiem papierowym zamoczonym w acetonie, a następnie suchą bibułą, aby upewnić się, że szpilki są całkowicie suche.</li>
	<li>Po zakończeniu drukowania mikromacierzy umieść je w uchwycie na szkiełka i wysusz przez noc w piecu próżniowym ustawionym na 45 °C, aby usunąć NMP z plam polimerowych. Po sterylizacji światłem UV przez 30 minut, mikromacierze są gotowe do zaszczepienia bakterii.</li>
	<li>Przed zaszczepieniem szkiełek bakteriami należy wykonać pomiar fluorescencji tła (zgodnie z opisem w punkcie 5). Użyj tego pomiaru w obliczeniach wiązania bakteryjnego.</li>
</ol>
4. Inokulacja mikromacierzy polimerowych bakteriami
UWAGA: Upewnij się, że masz dobrą technikę aseptyczną. Wszelkie obchodzenie się z kulturami powinno odbywać się w sterylnym środowisku: albo przy użyciu palnika Bunsena, albo w okapie przepływowym. Kultury powinny być uprawiane z dostępnością tlenu, podłożem wzrostowym i temperaturą dostosowaną do wymagań każdego gatunku.
<ol>
	<li>Przygotuj nocne kultury, zaszczepiając 5 ml bulionu Luria-Bertani (LB: 10 g L-1 bakto-tryptonu, 5 g L-1 NaCl i 10 g ekstraktu drożdżowego L-1) kolonią z talerza. Inkubować przez noc w temperaturze 37 °C, wstrząsając z prędkością 200 obr./min.</li>
	<li>Przygotować wywar z nocnych kultur zamrażarkowych przez dodanie glicerolu (stężenie ogólne 10%) i przechowywać wywar w temperaturze -80 °C.</li>
	<li>W celu określenia liczby komórek z próbek rozmrożonych zasobów bakteryjnych, należy wykonać seryjne rozcieńczenia każdego z nich i hodować bakterie przez noc na pożywkach stałych. Dokładne określenie liczby komórek w stadach zapewnia odpowiednią inokulację każdego gatunku6.</li>
	<li>Przygotować inokulant do mikromacierzy. Kultury jednogatunkowe są uprawiane jak powyżej i stosowane bezpośrednio do mikromacierzy. BacMix-1 jest mieszaniną bakteryjną Klebsiella pneumoniae (K. pneumoniae), Staphylococcus saprophyticus (S. saprophyticus) i Staphylococcus aureus (S. aureus). BacMix-2 jest mieszaniną bakteryjną składającą się z Streptococcus mutans (S. mutans), S. aureus, K. pneumoniae i Enterococcus faecalis (E. faecalis).</li>
	<li>Aby uzyskać mieszaną kulturę, należy wymieszać przez noc w równych objętościach (po 3 ml każda) i rozcieńczyć czterokrotnie świeżym LB (do około 50 ml końcowej objętości).</li>
	<li>Umieścić mikromacierze polimerowe sterylizowane promieniami UV na prostokątnych płytkach 4-dołkowych i inkubować je z 6 ml mieszanych kultur bakteryjnych w temperaturze 37 °C z delikatnym mieszaniem (30 obr./min) przez 5 dni.</li>
	<li>Po inkubacji delikatnie przepłukać mikromacierze dwukrotnie roztworem soli fizjologicznej buforowanej fosforanem (PBS: 137 mM NaCl, 2,7 mM KCl, 10 mM Na2HPO4, 1,8 mM KH2PO4) i inkubować roztworem 1 μg ml-1 barwienia 4',6-diamidyn-2-fenyloindolowego (DAPI) w PBS przez 30 min.</li>
	<li>Umyj zabarwione szkiełka do mikromacierzy na świeżej płytce studzienki, przykrywając PBS i delikatnie obracając, zmieniając PBS jeden raz. Suszyć pod strumieniem powietrza. Nałóż szklane szkiełko nakrywkowe na szkiełko do mikromacierzy i uszczelnij za pomocą kleju. Po wyschnięciu wysterylizuj zewnętrzną powierzchnię 70% (v/v) etanolem.</li>
	<li>Bezpiecznie utylizuj kultury zgodnie z ich poziomem hermetyczności.</li>
</ol>
5. Obrazowanie i analiza mikromacierzy
<ol>
	<li>Rejestruj pojedyncze obrazy dla każdej plamki polimerowej w kanałach jasnego pola i DAPI (Ex/Em = 358 nm / 361 nm). Zrób to ręcznie za pomocą mikroskopu fluorescencyjnego lub za pomocą automatycznego mikroskopu fluorescencyjnego (ze stolikiem X-Y-Z sterowanym przez oprogramowanie do akwizycji obrazu) wyposażonego w obiektyw 20X. 
	UWAGA: Zapoznaj się z instrukcją18, aby uzyskać informacje na temat obsługi oprogramowania i regulacji mikroskopu w celu uzyskania obrazów przy użyciu kanałów jasnego pola i DAPI. Upewnij się, że wzmocnienie i czas naświetlania obrazu dla wszystkich mikromacierzy są takie same.</li>
	<li>Uzyskaj średnią intensywność fluorescencji każdego punktu w kanale DAPI, wybierając obszar plamki i określając ilościowo fluorescencję za pomocą oprogramowania do przetwarzania obrazu.</li>
	<li>W celu uzyskania fluorescencji tła każdej plamki należy uzyskać obrazy plamek polimerowych na kontruplikowanej mikromacierzy inkubowanej tylko z pożywką bez bakterii. Odejmij fluorescencję tła od intensywności plamki, aby uzyskać fluorescencję od bakterii.</li>
	<li>Oblicz średnią wartość znormalizowaną z czterech plamek reprezentujących każdy polimer, używaną do porównywania wiązania bakterii różnych polimerów6.</li>
	<li>Polimery, które wykazują najmniejsze wiązanie bakteryjne (najniższą fluorescencję), należy zidentyfikować jako polimery "trafione"6.</li>
</ol>
6. Powlekanie szkiełek nakrywkowych w celu walidacji "trafienia"
<ol>
	<li>Aby pokryć szkiełka nakrywkowe polimerami:
	<ol>
		<li>Przygotować roztwory polimerów "trafionych" (~2% w/v) w tetrahydrofuranie (THF) lub innym odpowiednim rozpuszczalniku.</li>
		<li>Okrągłe szkiełka nakrywkowe o odpowiedniej wielkości należy wirować roztworami polimerowymi za pomocą powlekarki wirowej z prędkością 2.000 obr./min przez 10 sek. 
		UWAGA: W przypadku braku powlekarki wirowej, szkiełka nakrywkowe lub inne materiały mogą być powlekane zanurzeniowo, chociaż powlekanie wirowe zapewnia bardziej jednolitą powierzchnię.</li>
		<li>Pokryte szkiełka nakrywkowe wysuszyć w piecu konwekcyjnym w temperaturze 40 °C przez noc i sterylizować światłem UV przez 30 minut przed zaszczepieniem bakterii.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Aby pokryć szkiełka nakrywkowe agarozą w celu kontroli negatywnej:
	<ol>
		<li>Szkiełka nakrywkowe czyścić metodą obróbki plazmowej przez 10 minut lub zanurzając w 1 M NaOH na 4 godziny.</li>
		<li>Zanurz szkiełka nakrywkowe w acetonitrylu zawierającym 1% (3-aminopropylo) trietoksysilan na noc. Szkiełka nakrywkowe należy 3 razy oczyścić acetonem i wstawić do piekarnika (100 °C) na 1 godzinę.</li>
		<li>Zanurz wysuszone szkiełka nakrywkowe w 1% wodnym roztworze agarozy utrzymywanym w łaźni wodnej o temperaturze 60 °C. Umieść szkiełka nakrywkowe pokryte agarozą na płaskiej powierzchni w warunkach otoczenia wolnego od kurzu na 24 godziny i sterylizuj światłem UV przez 30 minut przed zaszczepieniem bakterii.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
7. Dołączanie i analiza kartki nakrywkowej za pomocą skaningowego mikroskopu elektronowego (SEM)
<ol>
	<li>Po sterylizacji światłem UV przez 30 minut, umieścić szkiełka nakrywkowe (szkło pokryte polimerem/agarozą lub niepowlekane) na standardowej płytce 12-dołkowej lub 24-dołkowej (w zależności od wielkości szkiełek nakrywkowych) i inkubować z bakteriami, jak opisano w sekcji 4.</li>
	<li>Po inkubacji z bakteriami przemyć niepowlekane i powlekane szkiełka nakrywkowe dwukrotnie 0,1 M buforem kakodylowym (pH 7,4), a następnie utrwalić 2,5% (w/v) aldehydem glutarowym w 0,1 M buforze kakodylowym (pH 7,4) przez 2 godziny.</li>
	<li>Próbki po utrwaleniu należy poddać tetratlenkowi osmu o stężeniu 1% (w/v) przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej i odwodnić sekwencyjnym płukaniem etanolem w temperaturze 50, 70, 90 i 100% (v/v) przez 30 minut każde.</li>
	<li>Suche próbki w CO2 zgodnie z protokołamistandardowymi 19. Czas schnięcia będzie zależał od rodzaju próbki.</li>
	<li>Pokryj próbki stopem złota/palladu (60/40%) za pomocą napylarki o natężeniu prądu 30 mA i próżni o sile 0,75 Torr. Zbadaj pod mikroskopem elektronowym zgodnie ze standardowymi protokołami20. 
	UWAGA: Należy zapewnić odpowiednie środki ostrożności w celu zarządzania ryzykiem wynikającym z przechowywania, obchodzenia się i usuwania tetratlenku osmu, ponieważ jest on wysoce toksyczny.</li>
	<li>Porównaj wizualnie obrazy niepowlekanych szkiełek nakrywkowych z tymi pokrytymi agarozą lub polimerami "uderzonymi", aby potwierdzić zdolność polimerów do wiązania/odpychania bakterii. 
	UWAGA: Opór przyczepu powinien być łatwo widoczny jako zmniejszenie obecnych komórek.</li>
	<li>Do badań powlekania wyrobami medycznymi należy wybrać najbardziej obiecujące polimery niewiążące typu "hit"6</li>.
</ol>
8. Wybór rozpuszczalnika do powlekania cewników
<ol>
	<li>Oceń różne rozpuszczalniki pod kątem ich kompatybilności z częścią cewnika na stałe, a także ich zdolności do rozpuszczania "uderzającego" polimeru. Wytnij części kat. 1 i na cylindryczne kawałki o długości 5 mm i zmierz za pomocą cyfrowej suwmiarki z noniuszem.</li>
	<li>Oceń różne rozpuszczalniki, takie jak kwas octowy, amoniak, aceton, acetonitryl, eter dietylowy, tetrahydrofuran (THF), dimetyloformamid (DMF), N-metylo-2-pirolidon (NMP), etanol, metanol, glikol etylenowy, toluen i ksylen. Zanurz fragmenty cewnika w rozpuszczalnikach na 12 godzin i oceń wizualnie integralność cewnika i klarowność rozpuszczalnika. 
	UWAGA: Wybierz rozpuszczalnik, który nie powoduje pęcznienia lub rozpadu cewników ani nie powoduje zmętnienia rozpuszczalnika. Rozpuszczalnik musi rozpuścić "uderzone" polimery.</li>
</ol>
9. Analiza przyczepu bakterii do cewników za pomocą mikroskopii konfokalnej
<ol>
	<li>Przygotować 2,5% (m/v) roztwory polimerów w acetonie lub innym odpowiednim rozpuszczalniku, jak określono w sekcji 8. Umieścić kawałki cewnika o średnicy 5 mm w małych szklanych fiolkach (5 ml) i zanurzyć je w 1 ml roztworu polimeru na 2 minuty. Usunąć nadmiar roztworu polimeru i wysuszyć kawałki cewnika przez noc w piecu próżniowym w temperaturze 40 °C.</li>
	<li>Przygotuj inokulum, mieszając rozmrożone wywary bakteryjne, aby uzyskać około 106 komórek każdego gatunku w 50 ml LB6.</li>
	<li>Sterylizować powlekane i niepowlekane kawałki cewnika światłem UV przez 30 minut i inkubować z 1 ml zaszczepionego LB na 24-dołkowej płytce, w temperaturze 37 °C przez 3 dni, delikatnie mieszając6.</li>
	<li>Po inkubacji przemyć cewniki PBS (2x, 2 ml), utrwalić bakterie 10% paraformaldehydem w PBS przez 30 minut i przemyć PBS (1 ml). Wybarwić bakterie na elementach cewnika DAPI (1 μg ml−1) przez 20 minut i przemyć PBS (1 ml).</li>
	<li>Uzyskaj obrazy konfokalne fragmentów cewnika przy użyciu następujących ustawień: niebieski laser diodowy 405 nm, zakres detektora od 414 do 502 nm, otwór na pin - Airy1, rozmiar obrazu - 1 024 × 1 024 pikseli, szerokość woksela - 105,2 nm, rozstaw stosów Z 0,5 μm, powiększenie - 40X 1,25.</li>
	<li>Uzupełnij obrazowanie konfokalne, umieszczając 50 obrazów w Z na cewniku o długości 100 μm.</li>
	<li>Przeanalizuj obrazy za pomocą odpowiedniego oprogramowania analitycznego: spłaszcz obrazy ułożone w stos Z w płaszczyźnie Z, korzystając z funkcji rozszerzania głębi ostrości, aby utworzyć pojedynczy obraz fragmentu cewnika. 
	UWAGA: Obraz ten należy następnie przeanalizować w celu uzyskania obszaru cewnika pokrytego bakteriami, po korekcji tła za pomocą funkcji "spłaszcz tło".</li>
</ol>
10. Analiza przyczepiania bakterii do cewników przez SEM
<ol>
	<li>Przygotować 10% roztwór polimeru (w/v) w acetonie.</li>
	<li>Wciśnij końcówkę pipety (dla mikropipety 200 μl) w środkową część odciętego kawałka cewnika, aby go przytrzymać, a następnie zanurz końcówkę w roztworze polimeru na około 30 sekund. Suszyć powlekany kawałek w warunkach otoczenia przez 30 minut. Nałożyć drugą warstwę, ponownie zanurzając ją w roztworze polimeru i schnąć przez noc w warunkach otoczenia.</li>
	<li>Po poddaniu działaniu promieniowania UV i inkubacji z bakteriami umyj kawałki (n = 3) PBS (2x, 1 ml) i przenieś je na 48-dołkowe płytki zawierające 10% formaldehydu w PBS przez 30 min. Po utrwaleniu umyj kawałki PBS (1 ml), wysusz przez noc w temperaturze pokojowej, zamontuj na króćcach z przewodzącymi krążkami węglowymi i pokryj złotem za pomocą powlekarki rozpylającej (patrz krok 7.5).</li>
	<li>Uzyskiwanie obrazów za pomocą skaningowego mikroskopu elektronowego6.</li>
</ol>

<ol><li>Hansen, A., Mjoseng, H. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-Density+Polymer+Microarrays%3A+Identifying+Synthetic+Polymers+that+Control+Human+Embryonic+Stem+Cell+Growth%5BTitle%5D)+AND+%22Adv.+Healthc.+Mat%22%5BJournal%5D)">High-Density Polymer Microarrays: Identifying Synthetic Polymers that Control Human Embryonic Stem Cell Growth.</a> Adv. Healthc. Mat. 3 (6), 848-853 (2014).</li>
<li>Tourniaire, G., Collins, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Polymer+microarrays+for+cellular+adhesion%5BTitle%5D)+AND+%22Chem.+Commun%22%5BJournal%5D)">Polymer microarrays for cellular adhesion.</a> Chem. Commun. (20), 2118-2120 (2006).</li>
<li>Pernagallo, S., Wu, M., Gallagher, M. P., Bradley, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Colonising+new+frontiers-microarrays+reveal+biofilm+modulating+polymers%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Mat.+Chem%22%5BJournal%5D)">Colonising new frontiers-microarrays reveal biofilm modulating polymers.</a> J. Mat. Chem. 21 (1), 96-101 (2010).</li>
<li>Hay, D. C., Pernagallo, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Unbiased+screening+of+polymer+libraries+to+define+novel+substrates+for+functionala+hepatocytes+with+inducible+drug+metabolism%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cell+Res%22%5BJournal%5D)">Unbiased screening of polymer libraries to define novel substrates for functionala hepatocytes with inducible drug metabolism.</a> Stem Cell Res. 6 (2), 92-102 (2011).</li>
<li>Anderson, D. G., Levenberg, S., Langer, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nanoliter-scale+synthesis+of+arrayed+biomaterials+and+application+to+human+embryonic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Nanoliter-scale synthesis of arrayed biomaterials and application to human embryonic stem cells.</a> Nat. Biotechnol. 22 (7), 863-866 (2004).</li>
<li>Venkateswaran, S., Wu, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bacteria+repelling+poly%28methylmethacrylate-co-dimethylacrylamide%29+coatings+for+biomedical+devices%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Mat.+Chem.+B%22%5BJournal%5D)">Bacteria repelling poly(methylmethacrylate-co-dimethylacrylamide) coatings for biomedical devices.</a> J. Mat. Chem. B. 2 (39), 6723-6729 (2014).</li>
<li>Pickering, H., Wu, M., Bradley, M., Bridle, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+Giardia+lamblia+Interactions+with+Polymer+Surfaces+Using+a+Microarray+Approach%5BTitle%5D)+AND+%22Environ.l+Sci.+Technol%22%5BJournal%5D)">Analysis of Giardia lamblia Interactions with Polymer Surfaces Using a Microarray Approach.</a> Environ.l Sci. Technol. 46 (4), 2179-2186 (2012).</li>
<li>Mizomoto, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Synthesis+and+Screening+of+Polymer+Libraries+using+a+High+Throughput+Approach%5BTitle%5D)+AND+%22%22%5BJournal%5D)">The Synthesis and Screening of Polymer Libraries using a High Throughput Approach.</a> , (2004).</li>
<li>How, S. E., Yingyongnarongkul, B., Fara, M. A., Díaz-Mochón, J. J., Mittoo, S., Bradley, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Polyplexes+and+lipoplexes+for+mammalian+gene+delivery%3A+from+traditional+to+microarray+screening%5BTitle%5D)+AND+%22Comb.+Chem.+High+Throughput+Screen%22%5BJournal%5D)">Polyplexes and lipoplexes for mammalian gene delivery: from traditional to microarray screening.</a> Comb. Chem. High Throughput Screen. 7 (5), 423-430 (2004).</li>
<li>Thaburet, J. -F., Mizomoto, H., Bradley, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-Throughput+Evaluation+of+the+Wettability+of+Polymer+Libraries%5BTitle%5D)+AND+%22Macromol.+Rapid+Commun%22%5BJournal%5D)">High-Throughput Evaluation of the Wettability of Polymer Libraries.</a> Macromol. Rapid Commun. 25 (1), 366-370 (2004).</li>
<li>Hook, A. L., Chang, C. -Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Combinatorial+discovery+of+polymers+resistant+to+bacterial+attachment%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Combinatorial discovery of polymers resistant to bacterial attachment.</a> Nat. Biotechnol. 30 (9), 868-875 (2012).</li>
<li>Hall-Stoodley, L., Stoodley, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evolving+concepts+in+biofilm+infections%5BTitle%5D)+AND+%22Cell.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Evolving concepts in biofilm infections.</a> Cell. Microbiol. 11 (7), 1034-1043 (2009).</li>
<li>Lewis, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Persister+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22Ann.+Rev.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Persister Cells.</a> Ann. Rev. Microbiol. 64 (1), 357-372 (2010).</li>
<li>Sauer, K., Camper, A. K., Ehrlich, G. D., Costerton, J. W., Davies, D. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pseudomonas+aeruginosa+Displays+Multiple+Phenotypes+during+Development+as+a+Biofilm%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Bacteriol%22%5BJournal%5D)">Pseudomonas aeruginosa Displays Multiple Phenotypes during Development as a Biofilm.</a> J. Bacteriol. 184 (4), 1140-1154 (2002).</li>
<li>Reisner, A., Haagensen, J. A. J., Schembri, M. A., Zechner, E. L., Molin, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+and+maturation+of+Escherichia+coli+K-12+biofilms%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Development and maturation of Escherichia coli K-12 biofilms.</a> Mol. Microbiol. 48 (4), 933-946 (2003).</li>
<li>Watnick, P. I., Kolter, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Steps+in+the+development+of+a+Vibrio+cholerae+El+Tor+biofilm%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Steps in the development of a Vibrio cholerae El Tor biofilm.</a> Mol. Microbiol. 34 (3), 586-595 (1999).</li>
<li>Campoccia, D., Montanaro, L., Arciola, C. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+review+of+the+biomaterials+technologies+for+infection-resistant+surfaces%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">A review of the biomaterials technologies for infection-resistant surfaces.</a> Biomaterials. 34 (34), 8533-8554 (2013).</li>
<li>Imstar. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%22Pathfinder+Technology+for+High+Content+Cellular+Screening+in+Cell+Biology+and+Genetoxicity+Software+version%3A+6.04I%22">Pathfinder Technology for High Content Cellular Screening in Cell Biology and Genetoxicity Software version: 6.04I</a>. , (2012).</li>
<li>Williams, J. R., Clifford, A. A. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aWilliams%2C+JR+%22Supercritical+Fluid+Methods+and+Protocols%22">Supercritical Fluid Methods and Protocols</a>. 13, Humana Press. New Jersey. (2000).</li>
<li>Kuo, J. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aKuo%2C+J+%22Electron+microscopy+methods+and+protocols%22">Electron microscopy methods and protocols</a>. , Humana Press. Totowa, NJ. (2007).</li>
<li>Leslie, D. C., Waterhouse, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+bioinspired+omniphobic+surface+coating+on+medical+devices+prevents+thrombosis+and+biofouling%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">A bioinspired omniphobic surface coating on medical devices prevents thrombosis and biofouling.</a> Nat. Biotechnol. 32 (11), 1134-1140 (2014).</li>
<li>Bechert, T., Steinrücke, P., Guggenbichler, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+new+method+for+screening+anti-infective+biomaterials%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Med%22%5BJournal%5D)">A new method for screening anti-infective biomaterials.</a> Nat. Med. 6 (9), 1053-1056 (2000).</li>
<li>May, R. M., Magin, C. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+engineered+micropattern+to+reduce+bacterial+colonization%2C+platelet+adhesion+and+fibrin+sheath+formation+for+improved+biocompatibility+of+central+venous+catheters%5BTitle%5D)+AND+%22Clin.+Transl.+Med%22%5BJournal%5D)">An engineered micropattern to reduce bacterial colonization, platelet adhesion and fibrin sheath formation for improved biocompatibility of central venous catheters.</a> Clin. Transl. Med. 4, (2015).</li>
<li>Chen, R., Willcox, M. D. P., Ho, K. K. K., Smyth, D., Kumar, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Antimicrobial+peptide+melimine+coating+for+titanium+and+its+in+vivo+antibacterial+activity+in+rodent+subcutaneous+infection+models%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">Antimicrobial peptide melimine coating for titanium and its in vivo antibacterial activity in rodent subcutaneous infection models.</a> Biomaterials. 85, 142-151 (2016).</li>
</ol>

Autorzy nie mają żadnych konkurencyjnych interesów finansowych, które mogliby zadeklarować.

Przyczepianie się bakterii do powierzchni jest złożonym procesem determinowanym przez szeroki zakres czynników zależnych od gatunku bakterii, właściwości powierzchni, otaczającego podłoża i środowiska fizycznego. Chociaż wiadomo, że niektóre grupy chemiczne wpływają na wiązanie bakteryjne (na przykład poliglikole zwykle są odporne na przyłączenie11), skorelowanie biologicznego wpływu polimerów z ich strukturami chemicznymi jest trudne, co sprawia, że racjonalne projektowanie polimerów dla określonych funkcji jest wyzwaniem. Wobec braku szczegółowych mechanizmów mocowania, inne badania próbowały naśladować naturalnie występujące powierzchnie odstraszające, z długotrwałymi i rozległymi procesami optymalizacji21. Przedstawiona tutaj zminiaturyzowana metoda wysokoprzepustowa pokonuje te wyzwania, ułatwiając równoległe badania przesiewowe setek polimerów w celu zidentyfikowania potencjalnych wyników do dalszych badań.
Wyniki uzyskane za pomocą metody mikromacierzy służą przede wszystkim do identyfikacji prawdopodobnych głównych kandydatów. Rysunek 2 ilustruje 22 kandydatów z niskim wiązaniem co najmniej jednego gatunku, podczas gdy rysunek 3 pokazuje wyraźne zmniejszenie zdolności wiązania. Wszystkie 22 polimery o niskim poziomie wiązania pokazane na rysunku 2 zostały poddane eksperymentom na dużą skalę, podczas których najlepsze (pod względem właściwości odpychania i powłoki) określono jako PU83, PA13 i PA515 (rysunki 4 i 5). Poliakrylany oferują większą elastyczność pod względem metod polimeryzacji, dlatego do badań powłok cewnika wybrano poliakrylan o najniższym poziomie wiązania, PA13 (ryc. 6 i 7). Przeprowadzono bardziej szczegółowe dalsze prace nad innymi kandydatami, o których informowano w innym miejscu6.
Dzięki wielu iteracjom eksperymentalnym odkryliśmy, że kluczem do sukcesu i powtarzalności jest kilka drobnych kroków. Oprócz ułatwienia przylegania polimerów do szkiełek szkiełkowych, zastosowanie podkładu agarozowego zapewnia czyste tło, ponieważ agaroza jest wysoce odporna na kolonizację bakteryjną. Podobnie niezbędna jest spójność samych plamek polimerowych, zarówno w obrębie tej samej matrycy, jak i między matrycami, dlatego drukowanie matryc musi być dokładnie kontrolowane. Aby zapewnić równomierne plamienie, wymagana jest staranna regulacja pinów w głowicy drukującej, a także równomierne wypełnienie płytki 384-dołkowej. Ponieważ niektóre z użytych przez nas polimerów wykazywały pewien stopień autofluorescencji, niezbędne było zebranie danych dotyczących fluorescencji tła dla każdego preparatu przed inkubacją z bakteriami. Zaleca się, aby uwzględnić różnice i uzyskać wiarygodne repliki mikromacierzy.
Zastosowane tutaj barwienie (DAPI) nie ma selektywności dla gatunków bakterii, wiążąc się niespecyficznie z DNA. Dlatego dobra technika aseptyczna jest niezbędna po wprowadzeniu kultur bakteryjnych, ponieważ zanieczyszczenia mogą pozostać niezauważone, myląc interpretację wyników. To samo odnosi się do późniejszych eksperymentów z użyciem skaningowej mikroskopii elektronowej, gdzie możliwe jest jedynie rozróżnienie pałeczek i ziarniaków, ale nie rodzaju czy gatunku.
Po przeprowadzeniu badań przesiewowych mikromacierzy należy wybrać obiecujące polimery do dalszej walidacji. W przedstawionym przykładzie zidentyfikowano siedem interesujących polimerów na podstawie ich wyraźnego zmniejszenia fluorescencji na mikromacierzy, a ich hamowanie przyczepiania zostało potwierdzone przez pokrycie ich na większych powierzchniach. Rysunki 4 i 5 pokazują zmniejszenie wiązania osiągnięte na szklanych szkiełkach nakrywkowych, co jest praktycznym sposobem testowania zachowania polimerów jako powłok masowych, a nie jako plamek mikromacierzy. Następnie polimery te zostały pokryte powłokami na wyrobach medycznych, aby w pełni określić ilościowo redukcję przyczepiania się bakterii. Ważne jest, aby wybrany rozpuszczalnik (patrz sekcja 8 protokołu) do tych badań powlekania był łagodny dla pożądanego podłoża (w tym przypadku cewnika), zachowując jednocześnie zdolność do rozpuszczania interesującego polimeru, aby umożliwić powlekanie. Tutaj użyliśmy acetonu, który oprócz wymienionych właściwości ma niską temperaturę wrzenia i szybko odparowuje, pozostawiając jednolitą powłokę.
Wybrany sposób walidacji będzie zależał od konkretnego badanego zastosowania. Ponieważ obserwacja komórek za pomocą mikroskopii elektronowej i fluorescencyjnej umożliwia bezpośrednią kwantyfikację przyczepu poszczególnych komórek, wybraliśmy te techniki jako uzupełnienie testu barwienia masowego mikromacierzy. Wyniki przedstawiono na rysunkach 6 i 7, które pokazują znaczenie uzupełniających metod walidacji. Obrazy konfokalne na rycinie 6 zapewniają bardzo wyraźne obrazy pojedynczych komórek, podczas gdy SEM ma dodatkową zaletę polegającą na umożliwieniu oceny powierzchni polimeru, która jest tutaj gładka i jednolita. Metody te są ograniczone polem widzenia używanych mikroskopów, dlatego ważne jest, aby wykonać serię zdjęć, aby mieć pewność co do wyników. Opisana powyżej metoda nie jest w stanie określić ilościowo przylegania bakterii na całej powierzchni, a jedynie wywnioskować pokrycie z kilku małych obszarów. Uważamy, że jest to wystarczające dla opisanej aplikacji. Zmniejszenie wiązania bakteryjnego można ocenić, zliczając bakterie przylegające do powierzchni na całych powlekanych i niepowlekanych częściach cewnika przy użyciu metod opisanych w innym miejscu22. Jednak takie metody wymagają, aby przesiewane powierzchnie biomateriałów miały jednolitą powierzchnię, co jest trudne do utrzymania, gdy testy są wykonywane za pomocą urządzeń medycznych, które często mają złożoną geometrię.
Oczywiste jest, że każdy wyrób przeznaczony do użytku klinicznego musi przejść dalsze badania, aby zapewnić bezpieczeństwo i skuteczność u ludzi. Przedstawiona tu metoda stanowi początek tego procesu, a dalsze prace muszą obejmować potwierdzenie aktywności in vivo . W tym przypadku, badając cewniki żylne, wstępne prace mogą zbadać wiązanie składników krwi i całych komórek z polimerem. Należy również wziąć pod uwagę wpływ składników krwi na wiązanie bakteryjne, w miarę możliwości poprzez powtórzenie testów wiązania w obecności inaktywowanej surowicy lub krwi zdefibrynowanej23. Ostateczny test technologii odbędzie się w modelu in vivo , takim jak model podskórnego zakażenia implantu24.
Pokazujemy potencjał metody mikromacierzy polimerowej do przesiewania polimerów zmieniających powierzchnię. Takie polimery (zarówno oporne, jak i wspomagające wiązanie bakteryjne) mają wiele zastosowań w medycynie, przemyśle spożywczym i biotechnologii, co oznacza, że metoda ta może być przydatna w wielu obszarach badań. Chociaż w niniejszej pracy wykorzystano bakterie, metodę można dostosować do innych typów komórek, a także innych mikromacierzy chemicznych.

Mikromacierze polimerowe to zminiaturyzowane platformy o wysokiej przepustowości, w których do 7 000 polimerów1 jest drukowanych na szkiełkach podstawowych do równoległej analizy z komórkami prokariotycznymi lub eukariotycznymi2. Przedstawiona tutaj metoda opiera się na tej, którą po raz pierwszy opisaliśmy w 2010 roku3. Ten system badań przesiewowych został zastosowany do wielu typów komórek, w tym ludzkich hepatocytów4, komórek macierzystych5, komórek nabłonka kanalików nerkowych2, bakterii3,6 i patogenów pierwotniaków7. W każdymprzypadku zidentyfikowano polimery, które sprzyjają wiązaniu badanych komórek lub są im przeciwstawne8. Kompleksy DNA z syntetycznymi polimerami polikationowymi wykorzystano również w formacie mikromacierzy do wysokoprzepustowych badań przesiewowych kandydatów do transfekcji genów9. Oprócz badań przesiewowych pod kątem interakcji komórka-substrat, mikromacierze polimerowe wykorzystano również do oceny właściwości materiału10.
Zdolność syntetycznych polimerów do modulowania przyczepiania bakterii do powierzchni jest dobrze znana3,6,11. Wiadomo, że wiele czynników, w tym ładunek, hydrofobowość i chropowatość powierzchni polimeru, wpływa na wiązanie bakteryjne. Konwencjonalne podejścia polegające na odkrywaniu biomateriałów, które są odporne na wiązanie bakterii, poprzez sekwencyjne lub empiryczne projektowanie i testowanie jednego materiału na raz, są pracochłonne, kosztowne i czasochłonne. Mikromacierze polimerowe stanowią atrakcyjną alternatywę dla obejścia takich ograniczeń.
Bakterie związane z powierzchnią rosną jako złożona populacja określana jako biofilm - takie biofilmy są wysoce odporne na wiele stresów środowiskowych i antybiotyków. Wynika to po części z ich gęstej macierzy zewnątrzkomórkowej (złożonej z białek, polisacharydów i kwasów nukleinowych)12, a po części ze zwiększonej obecności wytrzymałych komórek "trwałych" w biofilmach13. Chociaż dokładne mechanizmy asocjacji powierzchniowej i późniejszego tworzenia biofilmu są trudne do scharakteryzowania, ogólnie uważa się, że istnieją trzy różne etapy wzrostu powierzchniowego14-16. Po początkowym, odwracalnym przyczepieniu następuje silniejsza adhezja komórek, utworzenie biofilmu poprzez produkcję białka zewnątrzkomórkowego i matrycy polisacharydowej oraz proliferacja komórek. Wreszcie, dojrzały biofilm uwalnia wolno żyjące komórki planktonowe, które mogą inicjować nowe infekcje w innych miejscach. Polimery odpychające bakterie, które zapobiegają początkowemu przyczepianiu się bakterii, a tym samym zapobiegają wczesnym etapom tworzenia się biofilmu, potencjalnie stanowią doskonałe rozwiązanie w celu zminimalizowania infekcji. Biorąc pod uwagę wzrost oporności na antybiotyki (a także z natury większą oporność bakterii związanych zpowierzchnią12), szczególnie interesujące są niezawierające antybiotyków środki ograniczania zakażeń. W warunkach szpitalnych odstraszające bakterie powłoki polimerowe mogą mieć bezpośrednie zastosowanie medyczne w ograniczaniu zakażeń szpitalnych, które często tworzą się wokół wszczepionych wyrobów17.
Tutaj opisana jest wysokoprzepustowa metoda badania przesiewowego 381 polimerów pod kątem działania odstraszającego przeciwko szeregowi bakterii chorobotwórczych związanych z infekcjami szpitalnymi, po której następuje walidacja trafień, a następnie powlekanie i oznaczanie materiałów cewnika do żyły centralnej (Rysunek 1). Krótko mówiąc, polimery naniesiono na szkiełka pokryte agarozą za pomocą druku kontaktowego, a po wysuszeniu i sterylizacji zminiaturyzowane matryce inkubowano z klinicznie ważnymi kulturami bakterii. Po inkubacji mikromacierze delikatnie przemyto, a przylegające komórki bakteryjne wybarwiono i uwidoczniono za pomocą fluorescencji. Następnie polimery, które hamowały wiązanie bakterii, badano na większą skalę poprzez powlekanie na szkiełkach nakrywkowych i wizualizację za pomocą mikroskopii elektronowej. Wybrane polimery odstraszające zostały następnie pokryte komercyjnymi cewnikami i wykazano, że zmniejszają one przyczepianie się bakterii prawie 100-krotnie.

<table><tbody><tr><td>Agaroza</td><td>Sigma</td><td>05066&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Preparaty silanowe</td><td>Sigma</td><td>S4651</td><td></td></tr><tr><td>Polimery</td><td>syntetyzowane we własnym zakresie</td><td>Nie dotyczy</td><td></td></tr><tr><td>NMP</td><td>Sigma</td><td>494496</td><td></td></tr><tr><td>LB Bulion</td><td>Oxoid</td><td>CM1018</td><td></td></tr><tr><td>DAPI</td><td>Thermo Fisher</td><td>D1306</td><td></td></tr><tr><td>Tetrahydrofuran</td><td>Sigma</td><td>401757</td><td></td></tr><tr><td>(3- szkiełka szklane pokryte aminopropylem) trietoksysilanem</td><td>Sigma</td><td>Silane-prep</td><td></td></tr><tr><td>Bufor kakodylowy</td><td>Sigma</td><td>97068</td><td></td></tr><tr><td>Cewnik 1</td><td>Arrow International</td><td>CS12123E</td><td></td></tr><tr><td>Cewnik 2</td><td>Baxter Healthcare</td><td>ECS1320</td><td></td></tr><tr><td>Tetroxide osmu</td><td>Sigma</td><td>201030</td><td></td></tr><tr><td>Equipment</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Drukarka kontaktowa</td><td>Genetix</td><td>Qarraymini</td><td></td></tr><tr><td>Mikroskop mikromatrycowy</td><td>IMSTAR</td><td>Pathfinder</td><td></td></tr><tr><td>Spin Coater</td><td>Speedline Technologies</td><td>6708D</td><td></td></tr><tr><td>Mikroskop konfokalny</td><td>Leica</td><td>SP5</td><td></td></tr><tr><td>Oprogramowanie do analizy obrazu</td> Media <td>Cybernetyka</td><td>Image-Pro Plus</td><td></td></tr><tr><td>Skaningowy mikroskop</td><td>elektronowy Philips</td><td>XL30CP</td><td></td></tr><tr><td>Napylarka</td><td>Bal-Tec</td><td>SCD050</td><td></td></tr></tbody></table>

wysokowydajna identyfikacja polimerów odstraszających bakterie do wyrobów medycznych

High-throughput Identification of Bacteria Repellent Polymers for Medical Devices

Urządzenia medyczne są często kojarzone z zakażeniami szpitalnymi, które stanowią ogromne obciążenie dla pacjentów i systemu opieki zdrowotnej, a także przyczyniają się do oporności na środki przeciwdrobnoustrojowe. Jednym z możliwych sposobów na ograniczenie infekcji związanych z urządzeniami jest identyfikacja odpornych na bakterie powłok polimerowych dla tych urządzeń, które zapobiegałyby wiązaniu się bakterii na początkowym etapie mocowania. Opisano tutaj metodę identyfikacji takich odstraszających polimerów, opartą na równoległym przesiewaniu setek polimerów za pomocą mikromacierzy. Ta wysokoprzepustowa metoda pozwoliła na zidentyfikowanie szeregu obiecujących polimerów, które były odporne na wiązanie różnych klinicznie istotnych gatunków bakterii pojedynczo, a także jako społeczności wielogatunkowe. Jeden polimer, PA13 (poli(metakrylan metylu-ko-dimetyloakrylamid)), wykazał znaczne zmniejszenie przyczepiania wielu izolatów szpitalnych po nałożeniu na dwa dostępne na rynku cewniki do żył centralnych. Opisana metoda może być zastosowana do identyfikacji polimerów w szerokim zakresie zastosowań, w których istotna jest modyfikacja przyczepiania się bakterii.

Rysunek 2 przedstawia przyleganie bakterii (znormalizowana intensywność fluorescencji) do szeregu polimerów, określone za pomocą analizy mikromacierzy. Plamki naniesione bez polimeru (tylko NMP) stanowią kontrolę negatywną, ponieważ agaroza silnie hamuje wiązanie bakterii6 — odnotowana fluorescencja jest bardzo niska. Przedstawione polimery charakteryzują się niskim wiązaniem, choć w większości przypadków właściwości odpychające polimeru różnią się znacząco w zależności od badanych gatunków bakterii. Odzwierciedla to duże różnice w mechanizmach przylegania pomiędzy różnymi gatunkami. Wybór odpowiedniego polimeru zależy zatem od zastosowania, jednak polimery o niskim wiązaniu można łatwo zidentyfikować poprzez porównanie z agarozą. Polimery o wysokim wiązaniu prawdopodobnie zostaną zidentyfikowane w macierzy i mogą służyć jako kontrole pozytywne w kolejnych eksperymentach. W przypadku polimerów, które nie wykazują autofluorescencji w kanale DAPI, można dokonać wizualnego porównania jakościowego obrazów plamek (jak pokazano na Rysunku 3, gdzie wyróżniono jeden reprezentatywny polimer o wysokim wiązaniu i trzy przykłady polimerów o niskim wiązaniu). Takie porównanie, choć dostarcza mniej informacji niż analiza statystyczna, może stanowić przydatną wizualną walidację obliczonych wartości intensywności.
Po zidentyfikowaniu 22 odpowiednich polimerów za pomocą mikromacierzy, przeprowadzono eksperymenty w skali zwiększonej, aby potwierdzić ich właściwości bakteriobójcze podczas powlekania większych powierzchni. Przedstawiono najlepiej działające przykłady, użyte do powlekania szkiełek podstawowych (analiza SEM (Rysunki 4 i 5)) oraz przekrojów cewników (analiza mikroskopią konfokalną (Rysunek 6) i SEM (Rysunek 7)). Obie metody mikroskopowe mają tę zaletę, że umożliwiają bezpośrednie zliczanie komórek na powierzchni, co dostarcza jednoznacznych danych; redukcja przylegania komórek jest łatwo widoczna. Dalszym badaniom poddano powłoki, które najlepiej zachowały swoje właściwości odpychające w skali zwiększonej, a także nadawały się do technik powlekania na dużą skalę. Przedstawione wyniki ilustrują najlepiej działające polimery z każdego etapu.
<img alt="Proces mikrotablic polimerowych; odpychanie bakterii; schemat; obrazowanie fluorescencyjne; analiza SEM." src="/files/ftp_upload/54382/54382fig1.jpg" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Rysunek 1"> 
Rysunek 1: Etapy identyfikacji polimerów odpychających bakterie za pomocą mikrotablic polimerowych w zastosowaniach biomedycznych. SEM = skaningowa mikroskopia elektronowa.
<img alt="Wykres intensywności fluorescencji w zależności od nazwy polimeru; porównanie szczepów bakterii; wynik analizy danych." src="/files/ftp_upload/54382/54382fig2.jpg" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Rycina 2"> 
Rycina 2: Wiązanie bakterii na szeregu polimerów, określone za pomocą analizy mikrotablicowej. Niskie wiązanie bakterii zaobserwowano w przypadku szeregu poliakrylanów/akrylamidów (PA) oraz poliuretanów (PU). Przedstawiono wyniki z mikrotablic polimerowych poddanych analizie z użyciem kilku gatunków bakterii (C. jejuni, C. difficile, C. perfringens, S. mutans oraz dwóch konsorcjów: BacMix-1 i BacMix-2). Wiązanie bakterii wyrażono jako skorygowaną o tło średnią intensywność fluorescencji DAPI (znormalizowaną). Słupki błędu reprezentują odchylenie standardowe. Adaptowano z referencji6. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54382/54382fig2large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić większą wersję tej ryciny.</a>
<img alt="Schemat wiązania bakterii do polimeru; obrazy z mikroskopii fluorescencyjnej do analizy i porównania polimerów." src="/files/ftp_upload/54382/54382fig3.jpg" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Rycina 3"> 
Rycina 3: Przykładowe obrazy plamek polimerowych. Obrazy z mikroskopii fluorescencyjnej (DAPI) i w polu jasnym mieszaniny BacMix-2 pokazujące przyleganie bakterii do reprezentatywnych polimerów. Dla porównania do kilku polimerów niewiążących (PU-20, PA-336 i PU-179) dołączono polimer silnie wiążący. Pasek skali = 100 µm. Adaptowano z referencji6. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54382/54382fig3large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.</a>
<img alt="Analiza rozkładu bakterii; obrazy SEM, porównanie powierzchni dla BacMix-1 i BacMix-2 na materiałach." src="/files/ftp_upload/54382/54382fig4.jpg" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Rycina 4"> 
Rycina 4: Eksperymenty ze skalowaniem przy użyciu szklanych krateczek pozydkowych. Obrazy SEM przedstawiające przywieranie bakterii do szkła niepowlekanego oraz szkła powlekanego polimerami typu „hit” (przykłady wybrane z Tabeli 1). Paski skali = 20 µm.
<img alt="Porównanie wzrostu bakterii, wykres słupkowy; BacMix-1 vs BacMix-2 na różnych podłożach." src="/files/ftp_upload/54382/54382fig5.jpg" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Rysunek 5"> 
Rysunek 5: Ilościowe określenie wiązania bakterii na podstawie zliczania komórek z obrazów SEM. Porównanie liczby komórek przytwierdzonych na jednostkę powierzchni powłok z najlepszych polimerów typu „hit”. Jako kontrolną powierzchnię „niewiążącą” zastosowano agarozę, a jako kontrolną powierzchnię wiążącą – szkło. Słupki błędu reprezentują odchylenie standardowe.
<img alt="Rozkład komórek bakteryjnych, mikroskopia fluorescencyjna; eksperyment pokazuje różnicę w stężeniu bakterii." src="/files/ftp_upload/54382/54382fig6.jpg" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Rycina 6"> 
Rycina 6: Porównanie wiązania bakterii na powlekanych i niepowlekanych fragmentach cewnika. Obrazy konfokalne porównujące cewnik niepoddany działaniu preparatu (cath-1) (A) oraz cewnik powlekany PA13 (B) po inkubacji z BacMix-2. Obrazy wykonane przy użyciu obiektywu 40X (Pasek skali = 20 µm). Adaptowano z referencji6.
<img alt="Obrazy z mikroskopii elektronowej porównujące tekstury powierzchni w skali 10 μm; A: gęsta, B: rzadka." src="/files/ftp_upload/54382/54382fig7.jpg" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Rysunek 7"> 
Rysunek 7: Porównanie wiązania bakterii na powlekanych i niepowlekanych fragmentach cewnika. Obrazy SEM przedstawiają porównanie niepoddanego obróbce cewnika (cath-1) (A) oraz cewnika powleczonego PA13 (B) po inkubacji z koktajlem bakteryjnym składającym się z BacMix-2. Paski skali = 10 µm. Adaptacja z odniesienia6.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody >
		<tr >
			<td >Polimer</td>
			<td >Monomer 1</td>
			<td >Monomer 2</td>
			<td >Monomer 3</td>
			<td colspan="3" >Stosunek monomerów</td>
		</tr >
		<tr >
			<td >PA465</td>
			<td >MEMA</td >
			<td >DEAEMA</td >
			<td >HEA</td >
			<td >8</td >
			<td >1</td >
			<td >1</td >
		</tr >
		<tr >
			<td >PA475</td>
			<td >MEMA</td >
			<td >DEAEA</td >
			<td >HEMA</td >
			<td >6</td >
			<td >1</td >
			<td >3</td >
		</tr >
		<tr >
			<td >PA513</td>
			<td >MEMA</td >
			<td >DEAEMA</td >
			<td >MMA</td >
			<td >8</td >
			<td >1</td >
			<td >1</td >
		</tr >
		<tr >
			<td >PA515</td>
			<td >MEMA</td >
			<td >DEAEA</td >
			<td >MMA</td >
			<td >6</td >
			<td >1</td >
			<td >3</td >
		</tr >
		<tr >
			<td >PA13</td>
			<td >MMA</td >
			<td >DMAA</td >
			<td >-</td >
			<td >9</td >
			<td >1</td >
			<td >-</td >
		</tr >
		<tr >
			<td >PU1</td>
			<td >PEG2000</td >
			<td >HDI</td >
			<td >-</td >
			<td >4.9</td >
			<td >5.2</td >
			<td >-</td >
		</tr >
		<tr >
			<td >PU16</td>
			<td >PEG2000</td >
			<td >MDI</td >
			<td >-</td >
			<td >4.9</td >
			<td >5.2</td >
			<td >-</td >
		</tr >
		<tr >
			<td >PU161</td>
			<td >PEG2000</td >
			<td >MDI</td >
			<td >BD</td >
			<td >2.5</td >
			<td >5.2</td >
			<td >2.3</td >
		</tr >
		<tr >
			<td >PU7</td>
			<td >PEG900</td >
			<td >BICH</td >
			<td >-</td >
			<td >4.9</td >
			<td >5.2</td >
			<td >-</td >
		</tr >
		<tr >
			<td >PU83</td>
			<td >PEG900</td >
			<td >HMDI</td >
			<td >BD</td >
			<td >2.5</td >
			<td >5.2</td >
			<td >2.3</td >
		</tr >
		<tr >
			<td >PU227</td>
			<td >PPG-PEG-1900</td >
			<td >HDI</td >
			<td >-</td >
			<td >4.9</td >
			<td >5.2</td >
			<td >-</td >
		</tr >
		<tr >
			<td >PU129</td>
			<td >PPG425</td >
			<td >BICH</td >
			<td >DMAPD</td >
			<td >2.5</td >
			<td >5.2</td >
			<td >2.3</td >
		</tr >
		<tr >
			<td >PU10</td>
			<td >PTMG2000</td >
			<td >BICH</td >
			<td >-</td >
			<td >4.9</td >
			<td >5.2</td >
			<td >-</td >
		</tr >
		<tr >
			<td >PU179</td>
			<td >PTMG2000</td >
			<td >HDI</td >
			<td >NMAPD</td >
			<td >2.5</td >
			<td >5.2</td >
			<td >2.3</td >
		</tr >
		<tr >
			<td >PU20</td>
			<td >PTMG2000</td >
			<td >MDI</td >
			<td >-</td >
			<td >4.9</td >
			<td >5.2</td >
			<td >-</td >
		</tr >
		<tr >
			<td >PU5</td>
			<td >PTMG2000</td >
			<td >HDI</td >
			<td >-</td >
			<td >4.9</td >
			<td >5.2</td >
			<td >-</td >
		</tr >
	</tbody >
</table>
Tabela 1: Skład polimerowych „hitów” nie wiążących się z bakteriami przedstawionych na rysunku 2.

Opisano wysokoprzepustową metodę mikromatrycową do identyfikacji polimerów, które redukują wiązanie powierzchni bakteryjnej na urządzeniach medycznych.

Wysokowydajna identyfikacja polimerów odstraszających bakterie do wyrobów medycznych

Medical devices are often associated with hospital-acquired infections, which place enormous strain on patients and the healthcare system as well as ...

Ogólnym celem tej techniki polimerowej mikromacierzy jest zidentyfikowanie syntetycznych polimerów zdolnych do modulowania przylegania bakterii do powierzchni abiotycznych. Metoda ta może pomóc w przyspieszeniu postępów w odkrywaniu prostych, kosztowo efektywnych biomateriałów, które hamują przyleganie bakterii do wyrobów medycznych. Główną zaletą tej techniki w porównaniu z konwencjonalnymi badaniami nad biomateriałami, polegającymi na testowaniu jednego materiału naraz, jest możliwość jednoczesnego przesiewania setek polimerów w ramach jednego zasobu.Na początek, zgodnie z protokołem tekstowym, należy przygotować roztwory polimerów i dodać je do dołków płytki 384-dołkowej. Utwórz rutynę do nanoszenia polimerów w czterech powtórzeniach, składającą się z 1536 punktów, rozmieszczonych w 48 rzędach i 32 kolumnach, nanosząc jednocześnie 32 roztwory polimerów, tak aby drukarkę można było zatrzymać po naniesieniu każdej sekcji w celu oczyszczenia pinów. Następnie umieść szkiełka pokryte agarozą na platformie i upewnij się, że uszczelnienie próżniowe jest prawidłowe, aby utrzymać szkiełka w pozycji.Aby wyregulować głowicę drukującą tak, aby wszystkie piny znajdowały się na tej samej wysokości, należy ręcznie opuścić głowicę na szkiełko przedmiotowe i potwierdzić, że piny unoszą się jednocześnie. Umieść płytkę wielodołkową w uchwycie dla płytek, tak aby dołek A1 znajdował się w prawym górnym rogu uchwytu, i upewnij się, że płytka jest stabilnie zamocowana. Po wyświetleniu komunikatu potwierdź, że szkiełko i płytka wielodołkowa są na swoich miejscach.Drukuj po jednej sekcji na raz, umożliwiając oczyszczenie pinów pomiędzy sekcjami. Następnie użyj ręcznika papierowego nasączonego acetonem, aby dokładnie wyczyścić piny. Na koniec użyj suchej chusteczki higienicznej, aby upewnić się, że piny są całkowicie suche.Po całkowitym wydrukowaniu mikromacierzy należy umieścić je w uchwycie do szkiełek i przenieść do pieca próżniowego ustawionego na 40 °C w celu wysuszenia i usunięcia N&P z plamek polimeru. Następnie należy sterylizować płytki światłem UV przez 30 minut. Przed zaszczepieniem bakterii na szkiełkach należy zmierzyć fluorescencję tła zgodnie z protokołem tekstowym.Po wyhodowaniu i przygotowaniu inokulum do mikromacierzy, zgodnie z protokołem tekstowym, umieść wysterylizowane promieniami UV polimerowe mikromacierze w prostokątnych płytkach czterodołkowych i dodaj 6 mL mieszanych kultur bakteryjnych. Inkubuj płytki w temperaturze 37 °C przy łagodnym mieszaniu przez pięć dni. Po inkubacji delikatnie przepłucz mikromacierze dwukrotnie przy użyciu PBS.Następnie dodać 1 µg/mL DAPI w PBS i inkubować przez 30 minut. Dalej, przenieść macierze mikroarray do nowej płytki czterodołkowej, przykryć macierze PBS, a następnie delikatnie zamieszać ruchem wirowym. Po czym wymienić PBS i powtórzyć płukanie.Po płukaniu wysuszyć macierze mikroarray pod strumieniem powietrza, a następnie nałożyć folię uszczelniającą i przytwierdzić szkiełka nakrywkowe do slajdów z mikroarray. Po wyschnięciu kleju zdezynfekować powierzchnię zewnętrzną 70% etanolem. Przy użyciu mikroskopu fluorescencyjnego wyposażonego w obiektyw 20x, zarejestrować pojedyncze obrazy dla każdej plamki polimerowej w polu jasnym oraz w kanałach strappy.Aby pokryć szkiełka nakrywkowe polimerami, należy przygotować roztwory polimerów HIT w tetrahydrofuranie lub innym odpowiednim rozpuszczalniku. Przy użyciu powlekarki rotacyjnej należy nanieść roztwory polimerów na okrągłe szklane szkiełka nakrywkowe o odpowiednim rozmiarze, wirując z prędkością 2000 RPM przez dziesięć sekund. Pokryte szkiełka należy suszyć w piecu konwekcyjnym w temperaturze 40 degrees celsius przez noc.Przed inokulacją bakteriami należy wysterylizować szkiełka nakrywkowe światłem UV przez 30 minut. Wysterylizowane w ten sposób szkiełka nakrywkowe umieść w standardowej płytce 12 lub 24-dołkowej i inkubuj z bakteriami, zgodnie z procedurą pokazaną wcześniej w tym filmie. Po inkubacji przemyj powlekone szkiełka nakrywkowe dwukrotnie 0,1 M buforem kakodylanowym, a następnie utrwal próbki przez dwie godziny, stosując 2,5% (masy/objętości) glutaraldehyd oraz 0,1 M bufor kakodylanowy.Utrwal popsutki 1% czterotlenkiem osmu przez jedną godzinę w temperaturze pokojowej. Następnie odwodnij je w serii stężeń etanolu, pozostawiając próbki przez 30 minut w każdym z nich. Próbki napyl nowe za pomocą napylacza, używając mieszaniny stopu złota i platyny w proporcji 60:40, przy natężeniu prądu 30 mA i próżni wynoszącej 0,75 torr.Po wykonaniu zdjęć za pomocą SEM należy wizualnie porównać obrazy niepowlekanych szkiełek podstawkowych z obrazami szkiełek powleczonych agarozą lub polimerami HIT, aby potwierdzić zdolność polimerów do wiązania lub odpychania bakterii. W celu oceny kompatybilności różnych rozpuszczalników z końcową częścią cewnika, a także ich zdolności do rozpuszczania polimeru HIT, należy zanurzyć fragmenty cewnika w rozpuszczalnikach i inkubować przez 12 godzin, a następnie wizualnie ocenić integralność cewnika oraz przejrzystość rozpuszczalnika. Aby przeanalizować przyleganie bakterii do cewników za pomocą SEM, należy przygotować 10% roztwór polimeru w acetonie.Wciśnij końcówkę mikropipety 200 µL w środkową część odciętego fragmentu cewnika, aby go utrzymać, a następnie zanurz fragment w roztworze polimeru na około 30 sekund. Susz powleczony fragment w warunkach otoczenia przez 30 minut, a następnie nałóż drugą warstwę, ponownie zanurzając fragment cewnika w roztworze polimeru i susząc go przez noc w warunkach otoczenia. Po inkubacji powleczonych i niepowleczonych fragmentów cewnika w zaszczepionym podłożu LB, zgodnie z protokołem tekstowym, użyj 1 mL PBS do przemycia cewników.Następnie należy zastosować 10% paraformaldehyd w PBS, aby utrwalić bakterie przez 30 minut. Po przemyciu w PBS należy użyć DAPI do barwienia bakterii na fragmentach cewnika przez 20 minut. Następnie należy przemyć próbki jednym mililitrem PBS.Obserwuj rozmieszczenie próbek w komorze. Korzystając z poniższych ustawień, wykonaj obrazy konfokalne fragmentów cewnika. Zakończ obrazowanie konfokalne, wykonując stos obrazów z (z-stack) składający się z 50 obrazów na odcinku 100 micrometer długości cewnika.Po potraktowaniu promieniami UV i inkubacji z bakteriami, użyj 1 mL PBS, aby dwukrotnie przemyć fragmenty, a następnie przenieś je do płytek 48-dołkowych zawierających 10% formaldehyd w PBS na 30 minut. Po utrwaleniu próbek przeprowadź kolejne przemywanie w PBS i pozostaw do wyschnięcia przez noc w temperaturze pokojowej. Następnie zamocuj je na stubach z przewodzącymi krążkami węglowymi i wykorzystaj napylacz do napylenia złota.Przed obrazowaniem z wykorzystaniem skaningowego mikroskopu elektronowego. Rysunek ten przedstawia przyleganie bakterii do szeregu polimerów, określone za pomocą analizy mikroarray. Plamki naniesione bez polimeru służą jako kontrola negatywna, ponieważ agaroza wykazuje silną odporność na wiązanie bakterii, w związku z czym fluorescencja jest bardzo niska.Przedstawione polimery wykazują wiązanie ze stopem, choć w większości przypadków właściwości odpychające polimeru znacząco różnią się w zależności od badanych gatunków bakterii. Odzwierciedla to duże różnice w mechanizmach przyłączania występujące u różnych gatunków. Polimery o niskim stopniu wiązania można łatwo zidentyfikować poprzez porównanie z agarozą.Polimery o wysokim powinowactwie zostaną prawdopodobnie zidentyfikowane w matrycy i mogą służyć jako kontrole dodatnie w kolejnych eksperymentach. W przypadku polimerów, które nie wykazują autofluorescencji w kanale DAPI, porównanie jakościowe obrazów plamek można przeprowadzić wizualnie. W celu potwierdzenia właściwości odpychających bakterie 22 zidentyfikowanych odpowiednich polimerów przeprowadzono eksperymenty w większej skali, aby przetestować powlekanie większych powierzchni.Przedstawiono tutaj najlepiej rokujące próbki wykorzystane do powlekania szkiełek podstawkowych, przeanalizowane za pomocą SEM. Rysunki te ukazują przekroje cewnika analizowane metodą mikroskopii konfokalnej oraz SEM. Obie metody mikroskopowe mają tę zaletę, że umożliwiają bezpośrednie przeliczenie komórek na powierzchni, co dostarcza jednoznacznych danych, ponieważ zmniejszenie przylegania komórek jest łatwo widoczne.Po zastosowaniu tej procedury można przetestować składniki surowicy lub krwi, aby określić ich wpływ na wiązanie bakterii. W celu oceny potencjału powłok polimerowych do zastosowań klinicznych można wykorzystać model zwierzęcy. Należy pamiętać, że praca z odczynnikami chemicznymi i organizmami patogennymi może być niebezpieczna.Podczas obchodzenia się z materiałami i ich utylizacji należy zastosować niezbędne środki kontrolne w celu zminimalizowania ryzyka dla personelu i środowiska.

high-throughput-identification-bacteria-repellent-polymers-for

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Bioinżynieria

Opis tworzenia polimerowej mikrosieci przy użyciu techniki fotopolimeryzacji na chipie. Opisano również wysokoprzepustową charakterystykę powierzchni z wykorzystaniem mikroskopii sił atomowych, pomiarów kąta zwilżania wodą, rentgenowskiej spektroskopii fotoelektronowej, spektrometrii mas jonów wtórnych czasu przelotu oraz testu adhezji komórek.

Polimerowe mikromacierze do wysokoprzepustowego odkrywania biomateriałów

Opisano projekt syntetycznego operonu kodującego zarówno aparat sekrecyjny, jak i monomery strukturalne włókien curli. Nadprodukcja tych amyloidów i polimerów adhezyjnych pozwala na mierzalny wzrost adhezji chassis E. coli1. Wyjaśniono proste sposoby wizualizacji i kwantyfikacji adhezji.

Inżynieria bakterii adherentnych poprzez stworzenie pojedynczego syntetycznego operonu curli

Źródło: Venkateswaran, S., et al. Wysokowydajna identyfikacja polimerów odstraszających bakterie do wyrobów medycznych. J. Vis. Exp. (2016)Ten film przedstawia wysokoprzepustową metodę identyfikacji polimerów odstraszających bakterie za pomocą szkiełka mikromacierzowego wystawionego na działanie mieszanych kultur bakteryjnych. Wiązanie bakteryjne ocenia się za pomocą fluorescencji DAPI, gdzie zmniejszony sygnał wskazuje na polimery o minimalnym przyczepieniu powierzchniowym.

Wysokoprzepustowa identyfikacja polimerów odpychających bakterie za pomocą badań przesiewowych mikromacierzy

Biosensory fagów litycznych i kulki przeciwciał są w stanie odróżnić oporne na metycylinę (MRSA) od wrażliwych bakterii gronkowca. Fagi unieruchomiono metodą Langmuira-Blodgetta na powierzchni czujnika mikrowagi kryształu kwarcu i działały jako sondy gronkowca o szerokim zakresie. Kulki przeciwciał rozpoznają MRSA.

Biosensor do wykrywania bakterii gronkowca opornego na antybiotyki

Dwu- i trójwymiarowe superhydrofobowe materiały polimerowe są przygotowywane przez elektroprzędzenie lub elektronatryskiwanie biodegradowalnych polimerów zmieszanych z polimerem o niższej energii powierzchniowej o podobnym składzie.

Wytwarzanie superhydrofobowych materiałów polimerowych do zastosowań biomedycznych

Prezentujemy zautomatyzowaną, modułową, wysokoprzepustową metodę identyfikacji i charakterystyki mikrobiologicznych egzopolisacharydów w małej skali. Metoda ta łączy szybką preselekcję w celu analizy całkowitej ilości wydzielanych polisacharydów ze szczegółowym odciskiem palca węglowodanów, aby umożliwić szybkie badanie przesiewowe nowo wyizolowanych szczepów bakteryjnych lub całych kolekcji szczepów.

Zautomatyzowana, modułowa, wysokowydajna platforma przesiewowa egzopolisacharydów w połączeniu z bardzo czułą analizą odcisków palców węglowodanów

Przyczepienie się bakterii do komórek gospodarza jest kluczowym krokiem podczas kolonizacji i infekcji gospodarza. Protokół ten opisuje wytwarzanie rekombinowanych adhezyn sprzężonych z polimerami jako materiałów biomimetycznych, które umożliwiają analizę udziału poszczególnych adhezyn w tych procesach, niezależnie od innych czynników bakteryjnych.

Materiały biomimetyczne do charakteryzowania interakcji bakteria-gospodarz

Przedstawiamy protokół charakterystyki przeciwdrobnoustrojowej zaawansowanych materiałów. W tym przypadku aktywność przeciwdrobnoustrojowa na powierzchniach materiałów jest mierzona za pomocą dwóch metod, które wzajemnie się uzupełniają: jedna opiera się na teście dyfuzji krążka agarowego, a druga jest standardową procedurą opartą na normie ISO 22196:2007.

Charakterystyka przeciwdrobnoustrojowa zaawansowanych materiałów do zastosowań bioinżynieryjnych

Zgłoszono użycie fotodegradowalnych hydrożeli do izolowania komórek bakteryjnych za pomocą narzędzia do próbkowania światła o wysokiej rozdzielczości. Dokonano przeglądu podstawowych procedur eksperymentalnych, wyników i zalet procesu. Metoda ta umożliwia szybką i niedrogą izolację docelowych bakterii wykazujących rzadkie lub unikalne funkcje z heterogenicznych społeczności lub populacji.

Fotodegradowalne interfejsy hydrożelowe do badań przesiewowych, selekcji i izolacji bakterii

Ten protokół przedstawia metodologię wykonywania pomiarów wzrostu biofilmu i biomasy przy użyciu samodzielnie zmontowanych urządzeń do płytek PCR z głębokiej studni do wysokoprzepustowego 96-dołkowego statycznego przesiewania biofilmu z pokrywą potwierdzoną.

Wytwarzanie większej biomasy biofilmu bakteryjnego za pomocą urządzeń do mikropłytek głębinowych PCR-Plate

Poznaj metodę mikromacierzy do identyfikacji polimerów odstraszających bakterie z powierzchni wyrobów medycznych. Technika umożliwia jednoczesne badanie setek polimerów, przyspieszając odkrywanie nowych biomateriałów.

Wysokowydajna identyfikacja polimerów odstraszających bakterie do wyrobów medycznych

Przeglądaj więcej filmów