Name: Izolacja pokrewnych kompleksów RNA-białko z komórek za pomocą elucji kierowanej oligonukleotydami (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-01-16T12:30:00.000+00:00
Duration: 10 min 53 s
Description: Poznaj technikę immunoprecypitacji RNA do izolacji kompleksów RNA-białko z komórek eukariotycznych za pomocą elucji kierowanej oligonukleotydami. Metoda umożliwia badanie białek wiążących RNA w transkryptach retrowirusowych.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Autorzy dziękują za wsparcie ze strony NIH P50GM103297, P30CA100730 i Comprehensive Cancer P01CA16058.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Kompozycje buforowe</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bufor do mycia:</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 mM Tris-HCl, pH 7,4</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>150 mM NaCl</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3 mM MgCl2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bufor o niskiej zawartości soli:</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>20 mM Tris-HCl, pH 7,5</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10 mM NaCl</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3 mM MgCl2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Naziemna telewizja cyfrowa 2 mM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1x koktajl inhibitorów proteazy bez EDTA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNaza Out 5 μl/ml (inhibitor RNazy)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bufor do lizy cytoplazmatycznej:</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0,2 mln sacharozy</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1,2% Triton X-100</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bufor płuczący NETN-150:</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>20 mM Tris-HCl, pH 7,4</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>150 mM NaCl</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0,5% NP-40</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3 mM MgCl2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10% glicerolu</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bufor wiązania:</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10 mM HEPES pH 7,6 </td>
		</tr>
		<tr>
			<td>40 mM KCl </td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3 mM MgCl2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Naziemna telewizja cyfrowa 2 mM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5% glicerolu</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
Tabela 2: Kompozycje buforowe.
1. Przygotowanie komórek i matrycy powinowactwa
<ol>
	<li>Hoduj linię komórkową będącą przedmiotem zainteresowania do subkonfluencji (80%) w 10-centymetrowym naczyniu. Użyj 10 cm płytki do niezależnego immunoprecypitacji (IP) białka płaszcza NLS-MS2 znakowanego FLAG. Wykonaj IP za pomocą surowic odpornościowych do znacznika FLAG-epitope. Podczas ekspresji plazmidu białka płaszcza MS2 znakowanego flagą, komórki transfekowane 24-48 godzin przed zbiorem20, 
	UWAGA: Określony RNP może być wzbogacony z lizatów jądrowych lub cytoplazmatycznych lub preparatu frakcjonowanego biochemicznie, takiego jak frakcje gradientu sacharozy. Zaleca się równoległe pobieranie lizatu z komórek nietransfekowanych w celu przeprowadzenia dodatkowej kontroli ujemnej.</li>
	<li>Przenieść 60 μl na IP zawiesiny kulek magnetycznych białka G do probówki mikrowirówkowej o pojemności 1,7 ml.</li>
	<li>Umieść probówkę na stojaku magnetycznym na probówki do mikrowirówek, aby oddzielić kulki od roztworu do przechowywania.</li>
	<li>Usunąć roztwór do przechowywania, ostrożnie pobierając go za pomocą mikropipety.</li>
	<li>Wyjmij rurkę ze stojaka na magnesy.</li>
	<li>Umyj i zrównoważ kulki z 600 μl (10-krotność użytej objętości kulek) 1x buforu do płukania (20 mM Tris-HCl, pH 7,4; 3 mM MgCl2; i 150 mM NaCl) i obracaj od końca do końca przez 3 minuty w temperaturze pokojowej.</li>
	<li>Umieść rurkę na stojaku magnetycznym i wyjmij bufor do mycia.</li>
	<li>Dodać 10 objętości (600 μl) 1x buforu płuczącego i immunoprecypitującego przeciwciała FLAG do zrównoważonych kulek magnetycznych białka G (zgodnie z ilością zalecaną przez producenta do immunoprecypitacji) i obracać od końca do końca w temperaturze pokojowej przez co najmniej 30 minut, aby skoniugować przeciwciało immunoprecypitacyjne. Użyć odpowiedniego izotypu IgG jako odpowiedniej kontroli ujemnej przeciwciała.</li>
	<li>Umieść probówkę na stojaku magnetycznym, aby zebrać kulki i usunąć supernatant.</li>
	<li>Wyjmij probówkę ze stojaka magnetycznego i umyj kulki sprzężone z przeciwciałami 10 objętościami (600 μl) 1x buforu do płukania i obracaj przez 3 minuty w temperaturze pokojowej. Powtórz ten krok dwukrotnie.</li>
	<li>Umieść rurkę na stojaku magnetycznym i wyjmij bufor do mycia.</li>
</ol>
2. Zbieranie RNP
UWAGA: Przygotuj RNP podczas inkubacji po kroku 1.8.
<ol>
	<li>Usunąć pożywkę hodowlaną z komórek przez aspirację i przemyć komórki dwukrotnie 1-5 ml lodowatego 1x soli fizjologicznej buforowanej fosforanami (PBS). Za pomocą skrobaka do komórek usunąć mokre, przylegające komórki przed pobraniem przez odwirowanie w temperaturze 226 x g przez 4 minuty w temperaturze 4 °C.</li>
	<li>Dodaj 375 μl lodowatego buforu o niskiej zawartości soli (20 mM Tris-HCl, pH 7,5; 3 mM MgCl2; 10 mM NaCl; 2 mM DTT; 1x koktajl inhibitorów proteazy, wolny od EDTA; i 5 μl/ml inhibitora RNazy) do osadu komórkowego i pozwól na pęcznienie, umieszczając go na lodzie przez 5 min. 
	UWAGA: Dostosuj objętość buforu o niskiej zawartości soli do wielkości osadu komórkowego. Dla 1,2 x 106 komórek z płytki 10 cm wystarczy 375 μl buforu.</li>
	<li>Aby zebrać lizat komórek cytoplazmatycznych, dodaj 125 μl lodowatego buforu do lizy (0,2 M sacharozy/1,2% Triton X-100), a następnie wykonaj 10 uderzeń homogenizatorem Dounce, który został wstępnie schłodzony w wiadrze z lodem. 
	UWAGA: Aby zebrać całkowity ekstrakt komórkowy, do solubilizacji nukleoplazmy/chromatyny zaleca się standardowy bufor do lizy RIPA.</li>
	<li>Wirować w mikronaczyniu z maksymalną prędkością (16 000 x g) przez 1 minutę; to oczyści supernatant z zanieczyszczeń i jąder.</li>
	<li>Przenieść supernatant do nowej probówki do mikrowirówki o pojemności 1,7 ml, która znajdowała się na lodzie. Określić całkowite stężenie białka za pomocą standardowej, preferowanej przez laboratorium metody, takiej jak test Bradforda23. Należy zarezerwować podwielokrotność co najmniej 10% dla analizy Western blot, która ma być wykorzystana jako kontrolka wejściowa. Pobrany lizat komórkowy należy natychmiast wykorzystać do immunoprecypitacji lub przechowywać w temperaturze -80 °C do przyszłej analizy. 
	UWAGA: Z naszego doświadczenia wynika, że próbki te mogą być przechowywane i wykorzystywane kilka miesięcy później do analizy immunoprecypitacji bez uszczerbku dla integralności.</li>
</ol>
3. Immunoprecypitacja
<ol>
	<li>Dodać żądaną objętość pobranego lizatu komórkowego, w oparciu o stężenie białka określone w kroku 2.5, do docelowych kulek sprzężonych z przeciwciałami. Używając 1x bufora do mycia, zwiększ całkowitą objętość do 600 μl i obracaj od końca do końca przez 90 minut w temperaturze pokojowej. 
	UWAGA: Ten okres czasu jest wystarczający do wygenerowania solidnej izolacji kompleksów RNP o wysokim powinowactwie przy jednoczesnej minimalizacji niespecyficznego wiązania. Rozcieńczyć alternatywne źródła RNP, takie jak frakcje gradientu sacharozy, co najmniej 1:1 z 1x buforem do płukania, a następnie inkubować je z wcześniej przygotowanymi kompleksami kulka-przeciwciało, jak wspomniano powyżej.</li>
	<li>Po 90 minutach inkubacji umieść rurkę IP na stojaku magnetycznym, aby zebrać koraliki. Zachowaj supernatant jako przepływowy. 
	UWAGA: Ten pierwszy przepływ jest ważną próbką kontrolną do pomiaru wydajności IP. Test immunoblot dostarczy wskazówek na temat skuteczności IP, a także swoistości badanych interakcji. Zaleca się przechowywanie tego supernatantu do dalszej analizy.</li>
	<li>Przemyć związane z RNP, sprzężone z przeciwciałami kulki 10 objętościami (600 μl) lodowatego buforu płuczącego NETN-150 (20 mM Tris-HCl, pH 7,4; 150 mM NaCl; 3 mM MgCl2; 0,5% NP40; i 10% glicerolu) na obracanie przez 3 minuty w temperaturze pokojowej. Powtórz krok 3 razy. 
	UWAGA: Ten bufor różni się od buforu do lizy i skutecznie redukuje słabe lub niespecyficzne asocjacje.</li>
	<li>Po ostatnim płukaniu ponownie zawiesić unieruchomione kompleksy RNP w 60 μl lodowatego buforu wiążącego 1x (10 mM HEPES, pH 7,6; 40 mM KCl; 3 mM MgCl2; 5% glicerolu; i 2 mM DTT) i zarezerwować 10% unieruchomionych granulek kompleksu dla Western blot i 20% do izolacji RNA.</li>
</ol>
4. Elucja
<ol>
	<li>Dostosować pozostałą objętość do 100 μl za pomocą lodowatego buforu wiążącego 1x i podgrzewać probówkę w temperaturze 70 °C przez 3 minuty.</li>
	<li>Aby wyizolować pokrewne kompleksy RNA-białko, dodaj oligonukleotyd DNA ~ 30-nt, który jest komplementarny do granicy sekwencji 3' interesującego RNA i inkubuj przez 30 minut w temperaturze pokojowej z delikatnym kołysaniem (wystarczy 100 nM oligonukleotydu). 
	UWAGA: Oligonukleotyd jest antysensowny w stosunku do reszt nukleotydowych sąsiadujących z miejscem startowym translacji konstruktu PCE użytego jako przykład w tym protokole. Odpowiednią komplementarność sekwencji zapewnia zawartość ~40% G-C. Zaprojektuj oligonukleotyd antysensowny do wydajnej hybrydyzacji do minimalnego komplementarnego regionu docelowego RNA.</li>
	<li>Dodaj 5-10 jednostek RNazy H do probówki i inkubuj w temperaturze pokojowej przez 1 godzinę, aby rozszczepić RNA hybrydy RNA:DNA. Przenieść supernatant do sterylnej probówki do mikrowirówki o pojemności 1,7 ml; ta próbka zawiera przechwycone kompleksy RNP będące przedmiotem zainteresowania. 
	UWAGA: W zależności od dostępności pokrewnego RNA, dwie lub więcej rund traktowania RNazy H może być przydatne w celu zwiększenia obfitości próbki do dalszych analiz</li>.
	<li>Użyj 20% eluatu w Western blot dla znanych powiązanych białek i 20% eluatu do izolacji RNA, a następnie RT qPCR. Pozostałe 60% można wykorzystać do spektrometrii mas lub do identyfikacji składników białkowych.</li>
	<li>Równolegle należy poddać podwielokrotność zarezerwowanego lizatu komórkowego izolacji RNA i analizie RT-PCR. Ocena ta wskazuje na wzbogacenie RNA w kompleksie RNP. 
	UWAGA: Użyj wyizolowanego preparatu białkowego w kontrolnym western blot, aby upewnić się, że rozszczepienie RNazy H było skuteczne w uwalnianiu RNP z kompleksu immunuoprecipitowanego.</li>
</ol>
5. Elektroforeza białek i analiza Western Blot
<ol>
	<li>Poddaj około 10-20% całej próbki analizie SDS-PAGE i immunoblot zgodnie ze standardowym protokołem laboratoryjnym. 
	UWAGA: Ten krok służy do walidacji wydajności i swoistości IP przed dalszą analizą RNA. Może być również stosowany do oceny składu białkowego wyizolowanego kompleksu RNP.</li>
</ol>
6. Pobieranie immunologicznie wytrąconego RNA
UWAGA: Izolację RNA można przeprowadzić metodą Trizol lub zgodnie z opisanym protokołem.
<ol>
	<li>Zawiesić połowę całej próbki w 750 μl kwaśnego odczynnika tiocyjanianu guanidyny i inkubować w temperaturze pokojowej przez 5 minut przed ekstrakcją RNA z wychwyconych kompleksów PCE-RNP.</li>
	<li>Do probówki dodać 200 μl chloroformu, energicznie wstrząsać przez 10 sekund i inkubować w temperaturze pokojowej przez 3 minuty.</li>
	<li>Po odwirowaniu w stężeniu 16 000 x g przez 15 minut w temperaturze 4 °C, zebrać fazę wodną do nowej probówki i dodać równą objętość izopropanolu. Dobrze wymieszaj i inkubuj w temperaturze pokojowej przez co najmniej 10 minut. Dodać 1 μl błękitu glikolowego do próbki i przechowywać ją w temperaturze -20 °C w zamrażarce w celu skutecznego wytrącania lub przetworzenia w przyszłości.</li>
	<li>Odwirować probówkę o stężeniu 16 000 x g przez 10 minut w temperaturze 4 °C. Ostrożnie zebrać i wyrzucić supernatant, aby nie naruszyć osadu RNA; w celu ułatwienia tego procesu zaleca się użycie końcówki do mikropipet P-200.</li>
	<li>Dodać 500 μl 75% etanolu do każdej probówki, odwirować i odwirować probówki przy 16 000 x g przez 5 minut w temperaturze 4 °C. Ostrożnie zebrać i wyrzucić supernatant jak w kroku 6.4. Suszyć granulki na powietrzu przez 2-3 minuty i ponownie zawiesić w 100 μl wody wolnej od RNaz. 
	UWAGA: Nie przedłużaj czasu schnięcia pelletu na powietrzu, aby uniknąć problemu z ponownym zawieszeniem.</li>
	<li>Nałożyć 100 μl próbki RNA na kolumnę czyszczącą RNA. Przetwarzaj go zgodnie z protokołem producenta. Wypłucz RNA w 30 μl wody wolnej od RNaz i przechowuj w temperaturze -80 °C przez okres do 3 miesięcy. 
	UWAGA: Ten izolowany RNA nadaje się do dalszej analizy za pomocą RT-realtime PCR (qPCR), mikromacierzy i sekwencjonowania RNA. W zależności od obfitości RNP i wydajności, z jaką izoluje się RNP będący przedmiotem zainteresowania, ten sam lizat może zostać poddany dwóm lub więcej rundom IP w celu wygenerowania wystarczającej ilości RNA mającej zastosowanie do dalszych analiz.</li>
</ol>
7. Odwrotna transkrypcja RNA i amplifikacja cDNA metodą PCR
<ol>
	<li>Poddaj wyizolowany RNA odwrotnej transkrypcji za pomocą losowego startera z wysokiej jakości odwrotną transkryptazą (RT), zgodnie z instrukcjami producenta.</li>
	<li>Aby amplifikować interesujący RNA, zaprojektuj specyficzny dla genu starter antysensowny w sekwencji cięcia RNazy H. Użyj podobnych ilości oligonukleotydu antysensownego, startera losowego lub startera oligo-dT (patrz tabela materiałów). 
	UWAGA: Starter oligo-dT i poli-adenylowane mRNA zapewniają pozytywne reakcje kontrolne dla reakcji RT-PCR.</li>
	<li>Zarezerwować 5% reakcji RT (1 μl) na preparatywny qPCR wykonany w połączeniu z lizatem kontroli ujemnej IP i próbkami DNA z kontroli dodatniej w celu określenia punktu odcięcia i wytworzenia krzywej wzorcowej. Jeżeli wartość CT preparatywnego qPCR wykracza poza zakres krzywej wzorcowej, rozcieńczyć reakcję RT w kolejnych rozcieńczeniach 1:5 i powtórzyć krok 7.2. 
	UWAGA: Aby zapoznać się z techniką sekwencjonowania RNA i spektrometrii mas, zobacz plik Metoda uzupełniająca. <a href="http://cloudfront.jove.com/files/ftp_upload/54391/Supplementary_method_File_Jove.docx" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić ten plik Metody Uzupełniającej. (Kliknij prawym przyciskiem myszy, aby pobrać.)</a></li>
</ol>

<ol><li>Bandziulis, R. J., Swanson, M. S., Dreyfuss, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RNA-binding+proteins+as+developmental+regulators%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+Dev%22%5BJournal%5D)">RNA-binding proteins as developmental regulators.</a> Genes Dev. 3 (4), 431-437 (1989).</li>
<li>Hogan, D. J., Riordan, D. P., Gerber, A. P., Herschlag, D., Brown, P. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Diverse+RNA-binding+proteins+interact+with+functionally+related+sets+of+RNAs%2C+suggesting+an+extensive+regulatory+system%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Biol%22%5BJournal%5D)">Diverse RNA-binding proteins interact with functionally related sets of RNAs, suggesting an extensive regulatory system.</a> PLoS Biol. 6 (10), e255(2008).</li>
<li>Glisovic, T., Bachorik, J. L., Yong, J., Dreyfuss, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RNA-binding+proteins+and+post-transcriptional+gene+regulation%5BTitle%5D)+AND+%22FEBS+Lett%22%5BJournal%5D)">RNA-binding proteins and post-transcriptional gene regulation.</a> FEBS Lett. 582 (14), 1977-1986 (2008).</li>
<li>Lunde, B. M., Moore, C., Varani, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RNA-binding+proteins%3A+modular+design+for+efficient+function%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.Rev.Mol.Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">RNA-binding proteins: modular design for efficient function.</a> Nat.Rev.Mol.Cell Biol. 8 (6), 479-490 (2007).</li>
<li>Cochrane, A. W., McNally, M. T., Mouland, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+retrovirus+RNA+trafficking+granule%3A+from+birth+to+maturity%5BTitle%5D)+AND+%22Retrovirology%22%5BJournal%5D)">The retrovirus RNA trafficking granule: from birth to maturity.</a> Retrovirology. 3, 18(2006).</li>
<li>Hartman, T. R., Qian, S., Bolinger, C., Fernandez, S., Schoenberg, D. R., Boris-Lawrie, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RNA+helicase+A+is+necessary+for+translation+of+selected+messenger+RNAs%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.Struct.Mol.Biol%22%5BJournal%5D)">RNA helicase A is necessary for translation of selected messenger RNAs.</a> Nat.Struct.Mol.Biol. 13 (6), 509-516 (2006).</li>
<li>Pullmann, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+turnover+and+translation+regulatory+RNA-binding+protein+expression+through+binding+to+cognate+mRNAs%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.Cell.Biol%22%5BJournal%5D)">Analysis of turnover and translation regulatory RNA-binding protein expression through binding to cognate mRNAs.</a> Mol.Cell.Biol. 27 (18), 6265-6278 (2007).</li>
<li>Keene, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RNA+regulons%3A+coordination+of+post-transcriptional+events%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.Rev.Genet%22%5BJournal%5D)">RNA regulons: coordination of post-transcriptional events.</a> Nat.Rev.Genet. 8 (7), 533-543 (2007).</li>
<li>Moore, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((From+birth+to+death%3A+the+complex+lives+of+eukaryotic+mRNAs%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">From birth to death: the complex lives of eukaryotic mRNAs.</a> Science. 309 (5740), 1514-1518 (2005).</li>
<li>Hassan, M. Q., Gordon, J. A., Lian, J. B., van Wijnen, A. J., Stein, J. L., Stein, G. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ribonucleoprotein+immunoprecipitation+%28RNP-IP%29%3A+a+direct+in+vivo+analysis+of+microRNA-targets%5BTitle%5D)+AND+%22J.Cell.Biochem%22%5BJournal%5D)">Ribonucleoprotein immunoprecipitation (RNP-IP): a direct in vivo analysis of microRNA-targets.</a> J.Cell.Biochem. 110 (4), 817-822 (2010).</li>
<li>Selth, L. A., Close, P., Svejstrup, J. Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Studying+RNA-protein+interactions+in+vivo+by+RNA+immunoprecipitation%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol.Biol%22%5BJournal%5D)">Studying RNA-protein interactions in vivo by RNA immunoprecipitation.</a> Methods Mol.Biol. 791, 253-264 (2011).</li>
<li>Singh, D., Boeras, I., Singh, G., Boris-Lawrie, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+of+Cognate+Cellular+and+Viral+Ribonucleoprotein+Complexes+of+HIV-1+RNA+Applicable+to+Proteomic+Discovery+and+Molecular+Investigations%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol.Biol%22%5BJournal%5D)">Isolation of Cognate Cellular and Viral Ribonucleoprotein Complexes of HIV-1 RNA Applicable to Proteomic Discovery and Molecular Investigations.</a> Methods Mol.Biol. 1354, 133-146 (2016).</li>
<li>Stake, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((HIV-1+and+two+avian+retroviral+5%27+untranslated+regions+bind+orthologous+human+and+chicken+RNA+binding+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Virology%22%5BJournal%5D)">HIV-1 and two avian retroviral 5' untranslated regions bind orthologous human and chicken RNA binding proteins.</a> Virology. 486, 307-320 (2015).</li>
<li>Sung, F. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genome-wide+expression+analysis+using+microarray+identified+complex+signaling+pathways+modulated+by+hypoxia+in+nasopharyngeal+carcinoma%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Lett%22%5BJournal%5D)">Genome-wide expression analysis using microarray identified complex signaling pathways modulated by hypoxia in nasopharyngeal carcinoma.</a> Cancer Lett. 253 (1), 74-88 (2007).</li>
<li>Wang, Z., Gerstein, M., Snyder, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RNA-Seq%3A+a+revolutionary+tool+for+transcriptomics%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.Rev.Genet%22%5BJournal%5D)">RNA-Seq: a revolutionary tool for transcriptomics.</a> Nat.Rev.Genet. 10 (1), 57-63 (2009).</li>
<li>Michlewski, G., Caceres, J. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RNase-assisted+RNA+chromatography%5BTitle%5D)+AND+%22RNA%22%5BJournal%5D)">RNase-assisted RNA chromatography.</a> RNA. 16 (8), 1673-1678 (2010).</li>
<li>Tacheny, A., Dieu, M., Arnould, T., Renard, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mass+spectrometry-based+identification+of+proteins+interacting+with+nucleic+acids%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Proteomics%22%5BJournal%5D)">Mass spectrometry-based identification of proteins interacting with nucleic acids.</a> J. Proteomics. 94, 89-109 (2013).</li>
<li>Duan, R., Sharma, S., Xia, Q., Garber, K., Jin, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Towards+understanding+RNA-mediated+neurological+disorders%5BTitle%5D)+AND+%22J.Genet.Genomics%22%5BJournal%5D)">Towards understanding RNA-mediated neurological disorders.</a> J.Genet.Genomics. 41 (9), 473-484 (2014).</li>
<li>Butsch, M., Hull, S., Wang, Y., Roberts, T. M., Boris-Lawrie, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+5%27+RNA+terminus+of+spleen+necrosis+virus+contains+a+novel+posttranscriptional+control+element+that+facilitates+human+immunodeficiency+virus+Rev%2FRRE-independent+Gag+production%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Virol%22%5BJournal%5D)">The 5' RNA terminus of spleen necrosis virus contains a novel posttranscriptional control element that facilitates human immunodeficiency virus Rev/RRE-independent Gag production.</a> J. Virol. 73 (6), 4847-4855 (1999).</li>
<li>Bolinger, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RNA+helicase+A+interacts+with+divergent+lymphotropic+retroviruses+and+promotes+translation+of+human+T-cell+leukemia+virus+type+1%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">RNA helicase A interacts with divergent lymphotropic retroviruses and promotes translation of human T-cell leukemia virus type 1.</a> Nucleic Acids Res. 35 (8), 2629-2642 (2007).</li>
<li>Bolinger, C., Sharma, A., Singh, D., Yu, L., Boris-Lawrie, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RNA+helicase+A+modulates+translation+of+HIV-1+and+infectivity+of+progeny+virions%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">RNA helicase A modulates translation of HIV-1 and infectivity of progeny virions.</a> Nucleic Acids Res. 38 (5), 1686-1696 (2010).</li>
<li>Lee, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Suppression+of+the+DHX9+helicase+induces+premature+senescence+in+human+diploid+fibroblasts+in+a+p53-dependent+manner%5BTitle%5D)+AND+%22J.Biol.Chem%22%5BJournal%5D)">Suppression of the DHX9 helicase induces premature senescence in human diploid fibroblasts in a p53-dependent manner.</a> J.Biol.Chem. 289 (33), 22798-22814 (2014).</li>
<li>Bradford, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+rapid+and+sensitive+method+for+the+quantitation+of+microgram+quantities+of+protein+utilizing+the+principle+of+protein-dye+binding%5BTitle%5D)+AND+%22Anal.Biochem%22%5BJournal%5D)">A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding.</a> Anal.Biochem. 72, 248-254 (1976).</li>
<li>Glenn, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Preparation+of+protein+samples+for+mass+spectrometry+and+N-terminal+sequencing%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Enzymol%22%5BJournal%5D)">Preparation of protein samples for mass spectrometry and N-terminal sequencing.</a> Methods Enzymol. 536, 27-44 (2014).</li>
<li>Keene, J. D., Komisarow, J. M., Friedersdorf, M. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RIP-Chip%3A+the+isolation+and+identification+of+mRNAs%2C+microRNAs+and+protein+components+of+ribonucleoprotein+complexes+from+cell+extracts%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.Protoc%22%5BJournal%5D)">RIP-Chip: the isolation and identification of mRNAs, microRNAs and protein components of ribonucleoprotein complexes from cell extracts.</a> Nat.Protoc. 1 (1), 302-307 (2006).</li>
<li>Ranji, A., Shkriabai, N., Kvaratskhelia, M., Musier-Forsyth, K., Boris-Lawrie, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Features+of+double-stranded+RNA-binding+domains+of+RNA+helicase+A+are+necessary+for+selective+recognition+and+translation+of+complex+mRNAs%5BTitle%5D)+AND+%22J.Biol.Chem%22%5BJournal%5D)">Features of double-stranded RNA-binding domains of RNA helicase A are necessary for selective recognition and translation of complex mRNAs.</a> J.Biol.Chem. 286 (7), 5328-5337 (2011).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Opisana tutaj strategia izolacji RNP i identyfikacji pokrewnych RNA jest selektywnym sposobem badania specyficznej interakcji RNA-białko i odkrywania białek kandydujących współregulujących określony RNP w komórkach.
Zaletą stosowania rozszczepienia RNazy H skierowanej oligonukleotydem do izolacji RNP jest możliwość wychwytywania i specyficznej analizy elementu RNP działającego cis na heterogenicznych RNP związanych poniżej interesującego nas elementu RNA działającego cis. Ponieważ obfitość pok...

Ekspresja genów po transkrypcji jest precyzyjnie regulowana, począwszy od transkrypcji DNA w jądrze. Kontrolowana przez białka wiążące RNA (RBP), biogeneza i metabolizm mRNA zachodzą w wysoce dynamicznych cząstkach rybonukleoproteiny (RNP), które łączą się i dysocjują z mRNA prekursorem substratu podczas progresji metabolizmu RNA1-3. Dynamiczne zmiany w składnikach RNP wpływają na potranskrypcyjny los mRNA i zapewniają gwarancję jakości podczas przetwarzania pierwotnych transkryptów, ich transportu jądrowego i lokalizacji, ich aktywności jako matryc mRNA do translacji oraz ostatecznego obrotu dojrzałych mRNA.
Wiele białek jest oznaczonych jako RBP ze względu na ich konserwatywne domeny aminokwasowe, w tym motyw rozpoznawania RNA (RRM), dwuniciową domenę wiążącą RNA (RBD) i odcinki podstawowych reszt (np. arginina, lizyna i glicyna)4. RBP są rutynowo izolowane za pomocą strategii immunoprecypitacji i poddawane badaniom przesiewowym w celu zidentyfikowania ich pokrewnych RNA. Niektóre RBP współregulują pre-mRNA, które są funkcjonalnie powiązane, oznaczone jako regulony RNA5-8. Te RBP, ich pokrewne mRNA, a czasem niekodujące RNA, tworzą katalityczne RNP o różnym składzie; Ich wyjątkowość wynika z różnych kombinacji powiązanych czynników, a także z sekwencji czasowej, lokalizacji i czasu trwania ich interakcji9.
Immunoprecypitacja RNA (RIP) to potężna technika izolowania RNP z komórek i identyfikowania powiązanych transkryptów za pomocą analizy sekwencji10-13. Przejście od badania przesiewowego kandydata do badania przesiewowego całego genomu jest możliwedzięki RIP w połączeniu z analizą mikromacierzy14 lub sekwencjonowaniem wysokoprzepustowym (RNAseq)15. Podobnie, białka współwytrącające się można zidentyfikować za pomocą spektrometrii mas, jeśli są wystarczająco obfite i można je oddzielić od przeciwciała współwytrącającego16,17. W tym miejscu zajmiemy się metodologią izolowania składników RNP określonego pokrewnego RNA z hodowanych komórek ludzkich, chociaż podejście to można zmienić w przypadku rozpuszczalnych lizatów komórek roślinnych, grzybów, wirusów i bakterii. Dalsze analizy materiału obejmują identyfikację i walidację kandydata za pomocą immunoblot, spektrometrii mas, biochemicznego testu enzymatycznego, RT-qPCR, mikromacierzy i RNAseq, jak podsumowano na rysunku 1.
Biorąc pod uwagę fundamentalną rolę RNP w kontrolowaniu ekspresji genów na poziomie potranskrypcyjnym, zmiany w ekspresji składników RBP lub ich dostępności dla pokrewnych RNA mogą być szkodliwe dla komórki i są związane z kilkoma rodzajami zaburzeń, w tym z chorobą neurologiczną18. Helikaza A (RHA) DHX9/RNA jest niezbędna do translacji wybranych mRNA pochodzenia komórkowego i retrowirusowego6. Te pokrewne RNA wykazują strukturalnie powiązane elementy cis-działające w ramach ich 5' UTR, który jest oznaczony jako potranskrypcyjny element kontrolny (PCE)19. Aktywność RHA-PCE jest niezbędna do efektywnej translacji zależnej od czapeczki wielu retrowirusów, w tym HIV-1, oraz genów regulatora wzrostu, w tym junD6,20,21. Kodowany przez niezbędny gen (dhx9), RHA jest niezbędny do proliferacji komórek, a jego regulacja w dół eliminuje żywotność komórek22. Analiza molekularna RNP RHA-PCE jest niezbędnym krokiem do zrozumienia, dlaczego aktywność RHA-PCE jest niezbędna do kontrolowania proliferacji komórek.
Dokładna charakterystyka składników RHA-PCE RNP w stanie ustalonym lub po fizjologicznym zaburzeniu komórki wymaga selektywnego wzbogacania i wychwytywania RNP RHA-PCE w wystarczającej ilości do dalszej analizy. W tym przypadku retrowirusowy RNA PCEgag został oznaczony 6 kopiami miejsca wiązania cis-działającego RNA dla białka płaszcza MS2 (CP) w otwartej ramce odczytu. Białko płaszcza MS2 uległo egzogennej koekspresji z RNA PCEgag przez transfekcję plazmidu w celu ułatwienia składania RNP w rosnących komórkach. RNP zawierające białko płaszcza MS2 z pokrewnym RNA PCEgag znakowanym MS2 zostały immunoprecypitowane z ekstraktu komórkowego i wychwycone na kulkach magnetycznych (Figura 2a). Aby selektywnie wychwycić składniki RNP związane z PCE, unieruchomiony RNP inkubowano z oligonukleotydem komplementarnym do sekwencji dystalnych do PCE, tworząc hybrydę RNA-DNA, która jest substratem dla aktywności RNazy H. Ponieważ PCE znajduje się w końcówce 5' regionu 5' nieulegającego translacji, oligonukleotyd był komplementarny do sekwencji RNA sąsiadujących z miejscem rozpoczęcia translacji retrowirusowej (kodon start gag). Rozszczepienie RNazy H w pobliżu kodonu startu wymiotnego uwolniło kompleks 5' UTR z unieruchomionego RNP, który został zebrany jako eluent. Następnie próbkę oceniono za pomocą RT-PCR w celu potwierdzenia wychwytu PCEgag oraz za pomocą SDS PAGE i immunoblot w celu potwierdzenia wychwycenia docelowego białka płaszcza MS2. Następnie przeprowadzono walidację białka wiążącego RNA związanego z PCE, helikazy A DHX9/RNA.

<table><tbody><tr><td>Dynabeads Białko A</td><td>Invitrogen</td><td>10002D</td><td></td></tr><tr><td>Dynabeads Białko G</td><td>Przeciwciało Invitrogen</td><td>10004D</td><td></td></tr><tr><td>Przeciwciało anty-FLAG</td><td>Sigma</td><td>F3165</td><td></td></tr><tr><td>Przeciwciało anty-FLAG</td><td>Sigma</td><td>F7425</td><td></td></tr><tr><td>Przeciwciało anty-RHA</td><td>Odczynnik</td><td></td> TRizol <td></td></tr><tr><td>LS</td><td></td><td>10296-028</td><td></td></tr><tr><td>RNaza H</td><td>Ambion</td><td>AM2292</td><td></td></tr><tr><td>Chloroform</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP1145-1</td><td></td></tr><tr><td>Isopropanol</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP26184</td><td></td></tr><tr><td>Kolumna czyszcząca RNaeasy</td><td>Qiagen</td><td>74204</td><td></td></tr><tr><td>Omniscript odwrotna transkryptaza</td><td>Qiagen</td><td>205113</td><td></td></tr><tr><td>RNase Out</td><td>Invitrogen</td><td>10777-019</td><td></td></tr><tr><td>Koktajl inhibitorów proteazy</td><td>Roche</td><td>5056489001</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma</td><td>X100</td><td></td></tr><tr><td>NP-40</td><td>Sigma</td><td>98379</td><td></td></tr><tr><td>Glicerol</td><td>Fisher Scientific</td><td>17904</td><td></td></tr><tr><td>Losowe startery heksamerowe</td><td>Invitrogen</td><td>N8080127</td><td></td></tr><tr><td>Startery Oligo-dT</td><td>Invitrogen</td><td></td><td></td>AM5730G</tr><tr><td>startery PCR</td><td>Startery specyficzne dla genu IDT</td><td></td><td>dla&nbsp; Amplifikacja PCR</td></tr><tr><td>Oligonukleotyd do rozszczepienia za pośrednictwem RNazy H</td><td>Starter antysensowny IDT</td><td></td><td>dla docelowego RNA</td></tr><tr><td>Trypsyna</td><td>Technologia Gibco Life</td><td>25300-054</td><td></td></tr><tr><td>Pożywka do hodowli tkankowych DMEM</td><td>Technologia Gibco Life</td><td>11965-092</td><td></td></tr><tr><td>Surowica bydlęca</td> płodu <td>Technologia Gibco Life</td><td>10082-147</td><td></td></tr><tr><td>Baza Tris</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP152-5</td><td></td></tr><tr><td>Chlorek sodu</td><td>Fisher Scientific</td><td>S642-212</td><td></td></tr><tr><td>Chlorek magnezu</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP214</td><td></td></tr><tr><td>DTT</td><td>Fisher Scientific</td><td>R0862</td><td></td></tr><tr><td>Sacharoza</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP220-212</td><td></td></tr><tr><td>Membrana nitrocelulozowa</td><td>Bio-Rad</td><td>1620112</td><td></td></tr><tr><td>Stojak magnetyczny</td><td></td><td></td><td>Probówka do mikrowirówek o pojemności 1,7 ml z</td></tr><tr>kapturem <td></td><td></td><td>laminarnym</td><td>Do hodowli tkanek zwierzęcych</td></tr><tr>Inkubator <td></td><td></td><td>CO2</td><td>Do hodowli tkanek zwierzęcych</td></tr><tr><td>Aparatura</td><td></td><td></td> do stosowania żelu białkowego <td>Separacja próbek białek</td></tr><tr><td>Aparatura do przenoszenia białek Przenoszenie</td><td></td><td></td><td>próbek białek</td></tr><tr><td>Produkt gotowy Żele białkowe (4-15%)</td><td></td><td></td><td>Separacja próbek białkowych</td></tr><tr><td>Wirówka</td><td></td><td></td> stołowa <td>Osad w dół próbki</td></tr><tr><td>Rotator</td><td></td><td></td> stołowy <td>Wymieszaj próbkę od końca do końca</td></tr><tr><td>Wir</td><td></td><td></td><td>Wymieszaj próbki</td></tr></tbody></table>

izolacja pokrewnych kompleksów rna-białko z komórek za pomocą elucji kierowanej oligonukleotydami

Isolation of Cognate RNA-protein Complexes from Cells Using Oligonucleotide-directed Elution

Cząsteczki rybonukleoproteiny kierują biogenezą i regulacją potranskrypcyjną wszystkich mRNA poprzez odrębne kombinacje białek wiążących RNA. Składają się one z zależnych od położenia, działających cis elementów RNA i unikalnych kombinacji białek wiążących RNA. Zdefiniowanie składu konkretnego RNP ma zasadnicze znaczenie dla osiągnięcia podstawowego zrozumienia regulacji genów. Izolacja wybranego RNP jest podobna do znalezienia igły w stogu siana. Tutaj demonstrujemy podejście do izolowania RNP związanych z nieulegającym translacji regionem 5' wybranego mRNA w asynchronicznych, transfekowanych komórkach. Wykazano, że ten pokrewny RNP jest niezbędny do translacji wybranych wirusów i genów odpowiedzi komórkowej na stres.
Wykazany protokół współstrącania RNA-białko jest odpowiedni do dalszej analizy składników białkowych poprzez analizy proteomiczne, immunobloty lub odpowiednie testy identyfikacji biochemicznej. Ten protokół eksperymentalny pokazuje, że helikaza A DHX9 / RNA jest wzbogacona na końcu 5' pokrewnego retrowirusowego RNA i dostarcza wstępnych informacji do identyfikacji jej związku z pokrewnymi mRNA huR i junD związanymi ze stresem komórkowym.

Wcześniejsze wyniki RIP zidentyfikowały retrowirusowe RNA gag oraz wybrane komórkowe RNA, które współwytrącają się z DHX9/RHA, w tym HIV-16, junD6 oraz huR (Fritz i Boris-Lawrie, nieopublikowane). Wykazano, że retrowirusowy 5' UTR współwytrąca się z DHX9/RHA w jądrze komórkowym i jest współizolowany w cytoplazmie na polirybosomach. Jest on jednoznacznie zdefiniowany jako element kontroli posttranskrypcyjnej działający w cis (PCE)6. Aby wyizolować ...

Ten manuskrypt opisuje podejście do izolacji wybranych pokrewnych RNP powstałych w komórkach eukariotycznych poprzez specyficzne wzbogacenie ukierunkowane na oligonukleotydy. Wykazujemy możliwość zastosowania tego podejścia poprzez wyizolowanie pokrewnego RNP związanego z retrowirusowym regionem 5' bez translacji, który składa się z helikazy DHX9 / RNA A.

Izolacja pokrewnych kompleksów RNA-białko z komórek za pomocą elucji kierowanej oligonukleotydami

Ribonucleoprotein particles direct the biogenesis and post-transcriptional regulation of all mRNAs through distinct combinations of RNA binding proteins. ...

Ogólnym celem tej techniki immunoprecypitacji RNA jest selektywne wyizolowanie i scharakteryzowanie endogennych kompleksów białkowych RNA utworzonych w komórkach eukariotycznych poprzez specyficzne wzbogacenie ukierunkowane oligonukleotydami. Metoda ta może pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytania w dziedzinie kontroli potranskrypcyjnej, takie jak skład białek wiążących RNA, które definiują pięć głównych UTR transkryptu retrowirusowego w celu regulacji ekspresji jego genów. Główną zaletą tej techniki jest to, że pozwala ona badaczowi na selektywne wyizolowanie i scharakteryzowanie specyficznego kompleksu białek RNA, który jest przedmiotem zainteresowania, przy jednoczesnym zachowaniu możliwości przeprowadzenia bardziej globalnej analizy RNP w dalszej części procesu.Cóż, implikacje tej techniki rozciągają się w kierunku fundamentalnego zrozumienia infekcji wirusowych i licznych chorób komórkowych. Dostarcza również istotnych informacji na temat mechanizmów potranskrypcyjnej kontroli ekspresji genów. Może to oznaczać nowe, realne cele dla leków.Po wyhodowaniu komórek i przeprowadzeniu immunoprecypitacji białka znakowanego flagą zgodnie z protokołem tekstowym, przenieś 60 mikrolitrów na IP zawiesiny kulek magnetycznych pro-TG do probówki mikrowirówki o pojemności 1,7 mililitra. Umieść probówkę na stojaku magnetycznym i ostrożnie wyjmij roztwór do przechowywania, pipetując. Następnie wyjmij rurkę ze stojaka.Dodaj 600 mikrolitrów 1x bufor do mycia. I umieść rurkę na rotatorze na końcu w temperaturze pokojowej na trzy minuty, aby umyć i wyrównać koraliki. Umieść probówkę na stojaku magnetycznym i wyjmij bufor do mycia.Następnie dodaj 10 objętości świeżego buforu do mycia 1x. Dodać immunoprecypitujące przeciwciało FLAG do zrównoważonych kulek magnetycznych pro-TG. A następnie obracaj probówkę w temperaturze pokojowej przez co najmniej 30 minut, aby skoniugować przeciwciało immunoprecypitujące.Umieść rurkę na magnesie i usuń supernatant. Następnie wyjmij rurkę z magnesu i dodaj 1x bufor do płukania do kulek i obracaj w temperaturze pokojowej przez trzy minuty. Powtórz etap mycia dwa razy i usuń ostatni bufor.Usuń pożywkę hodowlaną z komórek przez aspirację i użyj 1,5 mililitra lodowatego PBS do dwukrotnego przemycia komórek. Za pomocą skrobaka do komórek usuń mokre, przylegające komórki. Zawiesinę komórkową odpipetować do świeżych probówek, a następnie odwirować kulturę w temperaturze 226 razy G w czterech stopniach Celsjusza przez cztery minuty.Dodaj 375 mikrolitrów lodowatego buforu o niskiej zawartości soli do osadu komórkowego i inkubuj próbkę na lodzie przez pięć minut, aby umożliwić pęcznienie. Ważne jest, aby zachować ostrożność podczas dodawania i ponownego zawieszania osadu komórkowego w buforze do lizy o niskiej zawartości soli, aby zapewnić całkowite zanurzenie i pęcznienie bez przedwczesnych zakłóceń mechanicznych. Aby zebrać lizat komórek cytoplazmatycznych, dodaj 125 mikrolitrów lodowatego buforu do lizy, a następnie użyj wstępnie schłodzonego homogenizatora Dounce, aby wykonać dziesięć uderzeń.Odbić homogenizować z wystarczającą siłą, aby umożliwić lizę błony plazmatycznej i zanieczyszczenia uwolnionego lizatu cytoplazmatycznego. Należy jednak uważać, aby nie przeciągnąć mechanicznego zakłócenia i nie ryzykować skażenia jądrowego, rozerwania kompleksu białkowego RNA lub utraty uwolnionego Wiruj homogenat w mikrodymie z maksymalną prędkością przez jedną minutę. Następnie przenieś supernatant do nowej rurki o pojemności 1,7 mililitra, która znajdowała się na lodzie.Określ całkowite stężenie białka. Rezerwa 10% na analizę western blot, do wykorzystania jako kontrola wejściowa. Aby przeprowadzić immunoprecypitację, dodaj żądaną objętość zebranego lizatu komórkowego do docelowych kulek sprzężonych z przeciwciałami.Używając 1x bufora do płukania, doprowadzić całkowitą objętość do 600 mikrolitrów i obrócić próbkę w temperaturze pokojowej. Po 90 minutach inkubacji umieść rurkę IP na stojaku magnetycznym, aby zebrać koraliki. Następnie zebrać supernatant i zachować go jako przepływ.Następnie dodaj 10 objętości lodowatego buforu płuczącego NETN 150 do związanych z RNP, sprzężonych z przeciwciałami kulek i obracaj próbkę w temperaturze pokojowej przez trzy minuty. Po ponownym zawieszeniu unieruchomionych kompleksów RNP w 1x buforze wiążącym zgodnie z protokołem tekstowym, dostosuj pozostałą objętość w 100 mikrolitrach lodowatego buforu wiążącego 1x. I podgrzej rurkę w temperaturze 70 stopni Celsjusza przez trzy minuty.Aby wyizolować pokrewne kompleksy białkowe RNA, dodaj około 30 oligonukleotydów DNA, komplementarnych do trzech granic sekwencji głównych interesującego RNA. I inkubować przez 30 minut w temperaturze pokojowej z delikatnym kołysaniem. Dodaj pięć do dziesięciu jednostek RNazy H do probówki i inkubuj próbkę w temperaturze pokojowej przez jedną godzinę, aby rozszczepić RNA z hybrydy DNA RNA.Następnie przenieś supernatant zawierający wychwycone kompleksy RNP do sterylnej probówki mikrowirówkowej o pojemności 1,7 mililitra. Aby zebrać immunoprecypitowany RNA, ponownie zawiesić połowę całkowitej próbki wychwyconych kompleksów RNA w 750 mikrolitrach kwaśnego odczynnika tiocyjanianu guanidyny. Dodaj 200 mikrolitrów chloroformu do probówki, energicznie wstrząsaj przez 10 sekund i inkubuj w temperaturze pokojowej przez trzy minuty.Po odwirowaniu zebrać fazę wodną do świeżej probówki i dodać równą objętość izopropanolu. Dobrze wymieszać i inkubować próbkę w temperaturze pokojowej przez co najmniej dziesięć minut. Dodaj jeden mikrolitr błękitu glikolowego do próbki i przechowuj ją w temperaturze minus 20 stopni Celsjusza w celu wydajnego wytrącania lub przetworzenia w przyszłości.Odwirować probówkę w temperaturze 16 000 razy G w czterech stopniach Celsjusza przez dziesięć minut. Za pomocą mikropipety P200 należy ostrożnie zebrać i wyrzucić supernatant, aby nie naruszyć osadu RNA. Dodaj 500 mikrolitrów 75% etanolu do każdej tubki.Wirować i odwirowywać probówki przez pięć minut. Ostrożnie zebrać i wyrzucić supernatant, jak to właśnie pokazano. Suszyć pelety na powietrzu przez dwie do trzech minut i używać 100 mikrolitrów wody wolnej od RNazy, aby ponownie je zawiesić.Nałożyć 100 mikrolitrów próbki RNA na kolumnę czyszczącą RNA. I przetwarzaj go zgodnie z protokołem producenta. Na koniec wymyj RNA w 30 mikrolitrach wody wolnej od RNaz i przechowuj go w temperaturze ujemnych 80 stopni Celsjusza przez okres do trzech miesięcy.Do izolacji potranskrypcyjnych elementów kontrolnych lub kompleksów rybonukleoproteinowych PCE, GAG, RNA, RHA powstających w proliferujących komórkach. Immunoprecypitację FLAG-MS2 RNP przeprowadzono w transfekowanych lizatach komórek HECK293. Wyniki wskazują na efektywne wytrącanie białka FLAG-MS2.Ponieważ DHX9/RHA znajduje się w kompleksie RNP, a nie w kontroli izotopowej IgG, ani w kontroli ujemnej. Pokazane tutaj są western blot z kompleksów DNA RNazy H trawionych przez RNazę. RNaza H rozszczepiła PCE GAG RNA, uwalniając kompleks RNP specyficznie związany z pięcioma pierwszymi UTR.RNP związane z DHX9/RHA zostały wzbogacone w eluenty. Co ważne, RNP związane z FLAG-MS2 pozostały z kulkami sprzężonymi z przeciwciałem. W tym eksperymencie immunoprecypitacja HO pętli macierzystej MS2, zawierającej retrowirusowe RNA PCE GAG w komórkach i eluentach, została zwalidowana za pomocą RT-PCR i QRT-PCR.Wyniki potwierdziły selektywny związek między DHX9/RHA a retrowirusowym piątym pierwotnym UTR, który został podkreślony jako unikalny RNP, ważny dla ukierunkowanej kontroli translacji. Po opanowaniu tej techniki można ją wykonać w ciągu około pięciu godzin, jeśli jest wykonywana prawidłowo. Próbując wykonać tę procedurę, należy pamiętać, aby wszystkie kroki wykonywać sprawnie i ostrożnie, aby zapewnić utrzymanie nienaruszonych kompleksów RNP i izolację określonego kompleksu RNP będącego przedmiotem zainteresowania.Po tej procedurze można zastosować inne metody, takie jak spektrometria mas i sekwencja RNA, w celu udzielenia odpowiedzi na dodatkowe pytania, takie jak globalna asocjacja białka z docelowym RNA. Oraz region lub pełna analiza wszystkich transkryptów zaangażowanych w określony RNP. Po jej opracowaniu, technika ta utorowała drogę naukowcom zajmującym się potranskrypcyjną kontrolą genów do zbadania odrębnych kompleksów białkowych RNA regulujących wygaśnięcie patogennych genów wirusowych i ogólnego mechanizmu kontroli ekspresji genów komórkowych.Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak zbierać nienaruszone komórkowe kompleksy RNP i określać ich skład za pomocą selektywnego wzbogacania ukierunkowanego oligonukleotydów. Nie zapominaj też, że praca z chorobotwórczymi wirusami i próbkami biologicznymi oraz niebezpiecznymi chemikaliami, takimi jak kwasy lub fenole, może być bardzo niebezpieczna. Podczas wykonywania tej procedury należy zawsze podejmować wszelkie środki ostrożności, takie jak odpowiednie środki ochrony osobistej.

isolation-cognate-rna-protein-complexes-from-cells-using

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Biochemia

Ze względu na przejściowy charakter pre-mRNA, jego izolacja i badanie in vivo mogą być trudne. Przedstawiamy tutaj nowatorskie podejście in vitro do badania oddziaływań RNA-białko z wykorzystaniem syntetycznej puli oligonukleotydów, która pokrywa wybrane regiony pre-mRNA.

Szybka metoda wysokoprzepustowa mapowania rybonukleoprotein (RNP) na ludzkim pre-mRNA

Protokół krok po kroku dotyczący izolacji i identyfikacji kompleksów związanych z RNA za pomocą metody RIP-Chip.

Metoda izolacji i identyfikacji mRNA, mikroRNA oraz komponentów białkowych kompleksów rybonukleoproteinowych z ekstraktów komórkowych z wykorzystaniem techniki RIP-Chip

Ten film demonstruje test in vitro do ekstrakcji RNA w celu identyfikacji białek wiążących RNA (RBP), które oddziałują z sekwencjami elementów bogatych w adenylan-urydylan (ARE) w mRNA. Docelowe RBP z lizatu komórkowego miesza się z sondą RNA w celu utworzenia kompleksów RNA-białko. Kompleksy izoluje się poprzez oczyszczanie powinowactwa z wykorzystaniem powinowactwa znacznika destiobiotyny sondy RNA do kulki magnetycznej znakowanej streptawidyną.

Test ściągania białka RNA w celu wyizolowania białek wiążących RNA poprzez ekstrakcję powinowactwa

Wiele mRNA kodujących białka mitochondrialne jest związanych z zewnętrzną błoną mitochondriów. Opisujemy procedurę frakcjonowania subkomórkowego mającą na celu wyizolowanie mitochondriów drożdży wraz z powiązanymi z nimi mRNA i rybosomami. Protokół ten można zastosować do komórek hodowanych w różnych warunkach w celu ujawnienia mechanizmów lokalizacji mRNA i zlokalizowanej translacji w pobliżu mitochondriów.

Izolacja mRNA związanych z mitochondriami drożdży w celu zbadania mechanizmów zlokalizowanej translacji

Interakcje RNA-białko leżą u podstaw wielu procesów komórkowych. W tym miejscu opisujemy metodę in vivo do izolowania specyficznego RNA i identyfikowania nowych białek, które są z nim związane. Może to rzucić nowe światło na to, w jaki sposób RNA są regulowane w komórce.

Izolacja nowych białek wiążących RNA metodą RaPID

Ta metoda ściągania RNA pozwala na identyfikację celów RNA długiego niekodującego RNA (lncRNA). Opierając się na hybrydyzacji domowej roboty, zaprojektowanych antysensownych sond oligonukleotydowych DNA specyficznych dla tego lncRNA w odpowiednio utrwalonej tkance lub linii komórkowej, skutecznie umożliwia wychwycenie wszystkich celów RNA lncRNA.

Procedura ściągania RNA w celu identyfikacji celów RNA długiego niekodującego RNA

Opisano procedurę tandemowej izolacji RNA (TRIP) w celu odzyskania endogennie utworzonych kompleksów mRNA-białko. W szczególności kompleksy RNA-białko są sieciowane in vivo, poliadenylowane RNA są izolowane z ekstraktów z kulkami oligo(dT), a poszczególne mRNA są wychwytywane za pomocą zmodyfikowanych oligonukleotydów antysensownych RNA. Białka związane z mRNA są wykrywane za pomocą analizy immunoblot.

Procedura izolacji tandemowego RNA oparta na oligonukleotydach w celu odzyskania eukariotycznych kompleksów mRNA-białko

Kompleksy RNA/białkowe oczyszczone przy użyciu strategii botyna-streptawidyna są eluowane do roztworu w warunkach denaturacji w formie nieodpowiedniej do dalszego oczyszczania i analizy funkcjonalnej. Tutaj opisujemy modyfikację tej strategii, która wykorzystuje fotorozszczepialny łącznik w RNA i delikatny etap elucji UV, dając natywne i w pełni funkcjonalne kompleksy RNA / białko.

Jednoetapowe oczyszczanie kompleksów makromolekularnych za pomocą RNA przyłączonego do biotyny i łącznika fotorozszczepialnego

Tutaj opisujemy składanie kompleksów elongacyjnych polimerazy II (Pol II) wymagających jedynie krótkich syntetycznych oligonukleotydów DNA i RNA oraz oczyszczonego Pol II. Kompleksy te są przydatne do badania mechanizmów leżących u podstaw kotranskrypcyjnego przetwarzania transkryptów związanych z kompleksem elongacyjnym Pol II.

Sztuczne kompleksy elongacyjne polimerazy II RNA do analizy zdarzeń przetwarzania kotranskrypcyjnego RNA

Ten protokół ma na celu wyizolowanie specyficznych dla typu komórki translujących rybosomalnych mRNA za pomocą mysiego modelu NuTRAP.

Izolowanie RNA specyficznych dla typu komórki z zatrzaskowo mrożonych próbek tkanek heterogenicznych bez sortowania komórek

AviTag-specific Location-restricted Illumination-enhanced Biotinylation (ALIBi) to nowoczesna optogenetycznie aktywowana metoda opracowana w celu znakowania i oczyszczania powinowaczo-afinicznego subkomórkowych populacji rybosomów dla sekwencjonowania i analizy proteomicznej w dalszym biegu.

Izolacja subpopulacji rybosomów subkomórkowych na podstawie rekombinowanego oznaczenia peptydowego tag-specyficznej lokalizacji ograniczonej iluminacji zwiększonej biotynilacją

Poznaj technikę immunoprecypitacji RNA do izolacji kompleksów RNA-białko z komórek eukariotycznych za pomocą elucji kierowanej oligonukleotydami. Metoda umożliwia badanie białek wiążących RNA w transkryptach retrowirusowych.

Izolacja pokrewnych kompleksów RNA-białko z komórek za pomocą elucji kierowanej oligonukleotydami

Przeglądaj więcej filmów