Izolacja pokrewnych kompleksów RNA-białko z komórek za pomocą elucji kierowanej oligonukleotydami
16 stycznia 2017
Ten manuskrypt opisuje podejście do izolacji wybranych pokrewnych RNP powstałych w komórkach eukariotycznych poprzez specyficzne wzbogacenie ukierunkowane na oligonukleotydy. Wykazujemy możliwość zastosowania tego podejścia poprzez wyizolowanie pokrewnego RNP związanego z retrowirusowym regionem 5' bez translacji, który składa się z helikazy DHX9 / RNA A.
Ogólnym celem tej techniki immunoprecypitacji RNA jest selektywne wyizolowanie i scharakteryzowanie endogennych kompleksów białkowych RNA utworzonych w komórkach eukariotycznych poprzez specyficzne wzbogacenie ukierunkowane oligonukleotydami. Metoda ta może pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytania w dziedzinie kontroli potranskrypcyjnej, takie jak skład białek wiążących RNA, które definiują pięć głównych UTR transkryptu retrowirusowego w celu regulacji ekspresji jego genów. Główną zaletą tej techniki jest to, że pozwala ona badaczowi na selektywne wyizolowanie i scharakteryzowanie specyficznego kompleksu białek RNA, który jest przedmiotem zainteresowania, przy jednoczesnym zachowaniu możliwości przeprowadzenia bardziej globalnej analizy RNP w dalszej części procesu.
Cóż, implikacje tej techniki rozciągają się w kierunku fundamentalnego zrozumienia infekcji wirusowych i licznych chorób komórkowych. Dostarcza również istotnych informacji na temat mechanizmów potranskrypcyjnej kontroli ekspresji genów. Może to oznaczać nowe, realne cele dla leków.
Po wyhodowaniu komórek i przeprowadzeniu immunoprecypitacji białka znakowanego flagą zgodnie z protokołem tekstowym, przenieś 60 mikrolitrów na IP zawiesiny kulek magnetycznych pro-TG do probówki mikrowirówki o pojemności 1,7 mililitra. Umieść probówkę na stojaku magnetycznym i ostrożnie wyjmij roztwór do przechowywania, pipetując. Następnie wyjmij rurkę ze stojaka.
Dodaj 600 mikrolitrów 1x bufor do mycia. I umieść rurkę na rotatorze na końcu w temperaturze pokojowej na trzy minuty, aby umyć i wyrównać koraliki. Umieść probówkę na stojaku magnetycznym i wyjmij bufor do mycia.
Następnie dodaj 10 objętości świeżego buforu do mycia 1x. Dodać immunoprecypitujące przeciwciało FLAG do zrównoważonych kulek magnetycznych pro-TG. A następnie obracaj probówkę w temperaturze pokojowej przez co najmniej 30 minut, aby skoniugować przeciwciało immunoprecypitujące.
Umieść rurkę na magnesie i usuń supernatant. Następnie wyjmij rurkę z magnesu i dodaj 1x bufor do płukania do kulek i obracaj w temperaturze pokojowej przez trzy minuty. Powtórz etap mycia dwa razy i usuń ostatni bufor.
Usuń pożywkę hodowlaną z komórek przez aspirację i użyj 1,5 mililitra lodowatego PBS do dwukrotnego przemycia komórek. Za pomocą skrobaka do komórek usuń mokre, przylegające komórki. Zawiesinę komórkową odpipetować do świeżych probówek, a następnie odwirować kulturę w temperaturze 226 razy G w czterech stopniach Celsjusza przez cztery minuty.
Dodaj 375 mikrolitrów lodowatego buforu o niskiej zawartości soli do osadu komórkowego i inkubuj próbkę na lodzie przez pięć minut, aby umożliwić pęcznienie. Ważne jest, aby zachować ostrożność podczas dodawania i ponownego zawieszania osadu komórkowego w buforze do lizy o niskiej zawartości soli, aby zapewnić całkowite zanurzenie i pęcznienie bez przedwczesnych zakłóceń mechanicznych. Aby zebrać lizat komórek cytoplazmatycznych, dodaj 125 mikrolitrów lodowatego buforu do lizy, a następnie użyj wstępnie schłodzonego homogenizatora Dounce, aby wykonać dziesięć uderzeń.
Odbić homogenizować z wystarczającą siłą, aby umożliwić lizę błony plazmatycznej i zanieczyszczenia uwolnionego lizatu cytoplazmatycznego. Należy jednak uważać, aby nie przeciągnąć mechanicznego zakłócenia i nie ryzykować skażenia jądrowego, rozerwania kompleksu białkowego RNA lub utraty uwolnionego Wiruj homogenat w mikrodymie z maksymalną prędkością przez jedną minutę. Następnie przenieś supernatant do nowej rurki o pojemności 1,7 mililitra, która znajdowała się na lodzie.
Określ całkowite stężenie białka. Rezerwa 10% na analizę western blot, do wykorzystania jako kontrola wejściowa. Aby przeprowadzić immunoprecypitację, dodaj żądaną objętość zebranego lizatu komórkowego do docelowych kulek sprzężonych z przeciwciałami.
Używając 1x bufora do płukania, doprowadzić całkowitą objętość do 600 mikrolitrów i obrócić próbkę w temperaturze pokojowej. Po 90 minutach inkubacji umieść rurkę IP na stojaku magnetycznym, aby zebrać koraliki. Następnie zebrać supernatant i zachować go jako przepływ.
Następnie dodaj 10 objętości lodowatego buforu płuczącego NETN 150 do związanych z RNP, sprzężonych z przeciwciałami kulek i obracaj próbkę w temperaturze pokojowej przez trzy minuty. Po ponownym zawieszeniu unieruchomionych kompleksów RNP w 1x buforze wiążącym zgodnie z protokołem tekstowym, dostosuj pozostałą objętość w 100 mikrolitrach lodowatego buforu wiążącego 1x. I podgrzej rurkę w temperaturze 70 stopni Celsjusza przez trzy minuty.
Aby wyizolować pokrewne kompleksy białkowe RNA, dodaj około 30 oligonukleotydów DNA, komplementarnych do trzech granic sekwencji głównych interesującego RNA. I inkubować przez 30 minut w temperaturze pokojowej z delikatnym kołysaniem. Dodaj pięć do dziesięciu jednostek RNazy H do probówki i inkubuj próbkę w temperaturze pokojowej przez jedną godzinę, aby rozszczepić RNA z hybrydy DNA RNA.
Następnie przenieś supernatant zawierający wychwycone kompleksy RNP do sterylnej probówki mikrowirówkowej o pojemności 1,7 mililitra. Aby zebrać immunoprecypitowany RNA, ponownie zawiesić połowę całkowitej próbki wychwyconych kompleksów RNA w 750 mikrolitrach kwaśnego odczynnika tiocyjanianu guanidyny. Dodaj 200 mikrolitrów chloroformu do probówki, energicznie wstrząsaj przez 10 sekund i inkubuj w temperaturze pokojowej przez trzy minuty.
Po odwirowaniu zebrać fazę wodną do świeżej probówki i dodać równą objętość izopropanolu. Dobrze wymieszać i inkubować próbkę w temperaturze pokojowej przez co najmniej dziesięć minut. Dodaj jeden mikrolitr błękitu glikolowego do próbki i przechowuj ją w temperaturze minus 20 stopni Celsjusza w celu wydajnego wytrącania lub przetworzenia w przyszłości.
Odwirować probówkę w temperaturze 16 000 razy G w czterech stopniach Celsjusza przez dziesięć minut. Za pomocą mikropipety P200 należy ostrożnie zebrać i wyrzucić supernatant, aby nie naruszyć osadu RNA. Dodaj 500 mikrolitrów 75% etanolu do każdej tubki.
Wirować i odwirowywać probówki przez pięć minut. Ostrożnie zebrać i wyrzucić supernatant, jak to właśnie pokazano. Suszyć pelety na powietrzu przez dwie do trzech minut i używać 100 mikrolitrów wody wolnej od RNazy, aby ponownie je zawiesić.
Nałożyć 100 mikrolitrów próbki RNA na kolumnę czyszczącą RNA. I przetwarzaj go zgodnie z protokołem producenta. Na koniec wymyj RNA w 30 mikrolitrach wody wolnej od RNaz i przechowuj go w temperaturze ujemnych 80 stopni Celsjusza przez okres do trzech miesięcy.
Do izolacji potranskrypcyjnych elementów kontrolnych lub kompleksów rybonukleoproteinowych PCE, GAG, RNA, RHA powstających w proliferujących komórkach. Immunoprecypitację FLAG-MS2 RNP przeprowadzono w transfekowanych lizatach komórek HECK293. Wyniki wskazują na efektywne wytrącanie białka FLAG-MS2.
Ponieważ DHX9/RHA znajduje się w kompleksie RNP, a nie w kontroli izotopowej IgG, ani w kontroli ujemnej. Pokazane tutaj są western blot z kompleksów DNA RNazy H trawionych przez RNazę. RNaza H rozszczepiła PCE GAG RNA, uwalniając kompleks RNP specyficznie związany z pięcioma pierwszymi UTR.
RNP związane z DHX9/RHA zostały wzbogacone w eluenty. Co ważne, RNP związane z FLAG-MS2 pozostały z kulkami sprzężonymi z przeciwciałem. W tym eksperymencie immunoprecypitacja HO pętli macierzystej MS2, zawierającej retrowirusowe RNA PCE GAG w komórkach i eluentach, została zwalidowana za pomocą RT-PCR i QRT-PCR.
Wyniki potwierdziły selektywny związek między DHX9/RHA a retrowirusowym piątym pierwotnym UTR, który został podkreślony jako unikalny RNP, ważny dla ukierunkowanej kontroli translacji. Po opanowaniu tej techniki można ją wykonać w ciągu około pięciu godzin, jeśli jest wykonywana prawidłowo. Próbując wykonać tę procedurę, należy pamiętać, aby wszystkie kroki wykonywać sprawnie i ostrożnie, aby zapewnić utrzymanie nienaruszonych kompleksów RNP i izolację określonego kompleksu RNP będącego przedmiotem zainteresowania.
Po tej procedurze można zastosować inne metody, takie jak spektrometria mas i sekwencja RNA, w celu udzielenia odpowiedzi na dodatkowe pytania, takie jak globalna asocjacja białka z docelowym RNA. Oraz region lub pełna analiza wszystkich transkryptów zaangażowanych w określony RNP. Po jej opracowaniu, technika ta utorowała drogę naukowcom zajmującym się potranskrypcyjną kontrolą genów do zbadania odrębnych kompleksów białkowych RNA regulujących wygaśnięcie patogennych genów wirusowych i ogólnego mechanizmu kontroli ekspresji genów komórkowych.
Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak zbierać nienaruszone komórkowe kompleksy RNP i określać ich skład za pomocą selektywnego wzbogacania ukierunkowanego oligonukleotydów. Nie zapominaj też, że praca z chorobotwórczymi wirusami i próbkami biologicznymi oraz niebezpiecznymi chemikaliami, takimi jak kwasy lub fenole, może być bardzo niebezpieczna. Podczas wykonywania tej procedury należy zawsze podejmować wszelkie środki ostrożności, takie jak odpowiednie środki ochrony osobistej.
Wyświetl pełny transkrypt i uzyskaj dostęp do tysięcy filmów naukowych
Przegląd
Ten rękopis opisuje technikę immunoprecypitacyjną RNA w celu selektywnego izolowaniu i charakteryzowaniu endogennych kompleksów RNA-białko w komórkach eukariotycznych. Metoda koncentruje się na retrowirusowym regionie 5' nietranslatowanego i podkreśla rolę DHX9/RNA helikazy A.
Kluczowe elementy badania
Obszar nauki
- Biologia RNA
- Kontrola post-transkrypcyjna
- Ekspresja genów wirusowych
Tło
- Kompleksy RNA-białko odgrywają kluczową rolę w regulacji genów.
- Zrozumienie tych kompleksów może dostarczyć wglądu w infekcje wirusowe.
- Kontrola post-transkrypcyjna jest niezbędna do regulacji ekspresji genów.
- Pięć pierwszych UTR jest istotne w transkryptach retrowirusów.
Cel badania
- Izolowanie określonych kompleksów RNA-białko za pomocą wzbogacania kierowanego oligonukleotydami.
- Charakteryzowanie składu białek wiążących RNA w transkryptach retrowirusów.
- Zbadanie implikacji dla infekcji wirusowych i chorób komórkowych.
Stosowane metody
- Technika immunoprecypitacji RNA.
- Wzbogacanie kierowane oligonukleotydami.
- Charakteryzowanie białek wiążących RNA.
- Analiza interakcji RNA-białko.
Główne wyniki
- Udane izolowanie kognackich RNP związanych z retrowirusowymi transkryptami.
- Identyfikacja DHX9/RNA helikazy A w izolowanych kompleksach.
- Wgląd w mechanizmy kontroli post-transkrypcyjnej.
- Możliwa identyfikacja nowych celów terapeutycznych dla infekcji wirusowych.
Wnioski
- Technika zwiększa zrozumienie interakcji RNA-białko.
- Dostarcza ram dla badania regulacji post-transkrypcyjnej.
- Wyniki mogą prowadzić do nowych strategii terapeutycznych przeciwko chorobom wirusowym.
Często zadawane pytania
Executive Industry Relevance
This method enables selective isolation of specific RNA-protein complexes from eukaryotic cells, supporting target validation in post-transcriptional gene regulation. By enriching cognate RNPs at the 5' UTR of retroviral transcripts, it provides mechanistic insights into viral translation control and cellular stress response pathways. The approach aids in de-risking target hypotheses by defining RNP composition relevant to antiviral and disease-modifying strategies.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of therapeutic hypotheses by defining RNA binding protein composition at specific RNA elements.
- Operational Value: Supports biological de-risking through functional validation of RNA-protein interactions in disease-relevant contexts.
- Predictive Value: Enhances confidence in target selection by linking RNP complexes to translational control of viral and stress-response genes.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Prepares validated RNP complexes for downstream proteomic and biochemical analysis.
- Operational Value: Delivers reproducible, quantitative outputs suitable for assay standardization and screening readiness.
- Platform Value: Enables scalable isolation of cognate complexes for reliable compound evaluation in follow-up workflows.
Translational & Preclinical Research
- Scientific Value: Supports translational continuity by linking discovery-phase RNP identification to preclinical validation of gene regulation mechanisms.
- Operational Value: Facilitates risk-adjusted advancement decisions through mechanistic de-risking of post-transcriptional targets.
- Predictive Value: Aligns with biomarker development by identifying RNP components associated with pathogenic gene expression.
Pipeline & Workflow Integration
The technique fits within the discovery continuum from target hypothesis testing to lead identification, particularly for RNA-mediated mechanisms of gene expression.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing and pathway clarification by isolating specific RNP complexes from cellular lysates.
- Screening: Enables assay readiness through standardized isolation of RNA-protein complexes with defined composition.
- Analytics: Generates protein and RNA readouts that allow comparative analysis of RNP composition under varying conditions.
- Translational Research: Connects to preclinical continuity by providing mechanistic insight into viral and cellular gene expression control.
- Enterprise Reuse: Functions as a reusable platform for probing RNA-protein interactions across multiple targets and disease areas.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence in target validation by reducing mechanistic ambiguity in RNA-regulated pathways.
- Operational Value: Promotes standardization and reproducibility in RNP isolation across laboratories and projects.
- Strategic Value: Improves go/no-go decisions by enabling early de-risking of targets involved in post-transcriptional control.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization of antiviral and cellular stress-response programs based on RNP composition data.
Implementation Considerations
- Requires expertise in molecular biology, immunoprecipitation, and RNA handling techniques.
- Depends on access to magnetic bead systems, centrifuges, and RNase-free laboratory equipment.
- Necessitates cross-team standardization of oligonucleotide design and RNase H digestion protocols.
- Involves adaptation considerations when applying to different RNA targets or cell types.
- Includes practical limitations such as the need for careful handling to preserve RNP integrity during lysis and elution steps.
