Sortowanie przepływowe i sekwencjonowanie egzomu komórek Reeda-Sternberga klasycznego chłoniaka Hodgkina
10 czerwca 2017
Tutaj opisujemy połączone sortowanie komórek metodą cytometrii przepływowej i protokół budowy biblioteki nowej generacji o niskim wkładzie przeznaczony do generowania wysokiej jakości danych o całym eksomie z komórek Hodgkina Reeda-Sternberga (HRS) klasycznego chłoniaka Hodgkina (CHL).
Ogólnym celem tej procedury jest oddzielenie i skoncentrowanie żywotnych komórek Hodgkina Reeda-Sternberga lub HRS z zapalnych limfocytów klasycznego chłoniaka Hodgkina lub guzów CHL w celu wygenerowania i analizy wysokiej jakości danych sekwencjonowania całego eksomu nowej generacji. Metoda ta może odpowiedzieć na kluczowe pytania w biologii CHR, w tym identyfikację kluczowych mutacji napędzających, mutacji ucieczki immunologicznej, a także przyjrzenie się różnorodności genów w klasyfikacji. Technika ta pozwala uzyskać DNA pochodzące z nowotworu, które jest bardzo wysokiej jakości i czystości.
Ułatwienie generowania bibliotek sekwencjonowania nowej generacji bez konieczności etapu wstępnego wzmacniania. Technika ta może mieć ważne implikacje w diagnostyce chłoniaka Hodgkina, ponieważ może pomóc w podklasyfikacji i prognozowaniu. Może to również wpływać na wybór terapii, ponieważ niektóre zmiany mogą wskazywać na podatność lub oporność na określone leki.
Jonathan po raz pierwszy wpadł na ten pomysł, kiedy odkrył, jak wizualizować komórki HRS za pomocą cytometrii przepływowej i przeprowadzić pierwsze eksperymenty z sortowaniem tych komórek. Przed przygotowaniem komórek należy wymieszać wstępnie dobrane przeciwciała w fiolce z ciemnego szkła. Następnie dodaj PBS i BSA, aby doprowadzić koktajl przeciwciał do objętości 100 mikrolitrów.
I przenieść fiolkę z ciekłego azotu do wiadra z lodem lub suchego lodu. Następnie szybko rozmrozić interesujące Cię komórki w łaźni wodnej o temperaturze 37 stopni Celsjusza. Gdy pozostanie tylko niewielka zamrożona porcja, wlej komórki do 50-mililitrowej stożkowej probówki zawierającej 45 mililitrów pożywki do rozmrażania o temperaturze 37 stopni Celsjusza i przepłucz fiolkę kriogeniczną dwa razy jednym mililitrem świeżego podłoża do rozmrażania.
Po zebraniu obu płukań pozwól komórkom trawić się w temperaturze pokojowej przez 15 minut. Gdy komórki odzyskają równowagę, zbierz je przez odwirowanie. Odessać wszystkie oprócz ostatnich 200 mikrolitrów supernatantu.
Ponownie zawiesić komórki w pozostałym podłożu do rozmrażania i pozwolić komórkom odpocząć przez kolejne dwie do trzech minut. Następnie inkubuj komórki w 100 mikrolitrach koktajlu przeciwciał przez 15 minut w temperaturze pokojowej, chroniąc przed światłem. Pod koniec inkubacji umyj komórki w trzech mililitrach pożywki sortującej, ponownie zawieszając osad w jednym mililitrze świeżej pożywki sortującej.
Następnie przefiltruj komórki przez górne sitko z pięciomililitrową rurką przepływową. Przepłukać probówkę i sitko dodatkowym mililitrem pożywki sortującej i trzymać komórki na lodzie. Przed rozpoczęciem sortowania komórek, w oprogramowaniu cytometru przepływowego w menu eksperymentu, wybierz nowy eksperyment i otwórz okno stanu urządzenia.
Na karcie parametrów usuń wszystkie nieużywane parametry. Następnie ponownie otwórz kartę eksperymentu i wybierz konfigurację wynagrodzenia, aby utworzyć kontrolki wynagrodzenia. W oknie przeglądarki kliknij znak plus, aby rozwinąć próbkę kontrolną kompensacji i uruchomić probówki kontrolne kompensacji bez rejestrowania danych.
W razie potrzeby dostosuj napięcia detektora tak, aby dodatnio zabarwione populacje koralików dla każdego chromu flory mieściły się w zakresie od 10 000 do 100 000 kanałów. I najjaśniejszych w swoim głównym kanale detekcji. Zapisz napięcia potrzebne dla każdego parametru dla każdej lampy.
Następnie, pod próbką kontrolną kompensacji, kliknij raz lewym przyciskiem myszy, aby podświetlić niezabarwioną probówkę kontrolną i załadować niezabarwioną probówkę kontrolną na stolik próbki. W oknie kontroli akwizycji kliknij przycisk Załaduj i uruchom poszczególne elementy sterujące kompensacją w polach napięcia detektora dla wszystkich parametrów, aby ręcznie wprowadzić określone napięcia. Kliknij przycisk Rekord, aby uzyskać niezabarwione dane kontrolne.
Następnie uruchom wszystkie pozostałe elementy sterujące kompensacją, rejestrując dane bez zmiany jakichkolwiek ustawień detektora. Po przeanalizowaniu wszystkich elementów kontrolnych, uruchom probówkę ze sterylną wodą dejonizowaną na pięć minut, aby oczyścić instrument z wszelkich pozostałości materiału przed kontynuowaniem. Aby zabramkować komórki do sortowania HRS, załaduj probówkę eksperymentalną i zarejestruj co najmniej 100 000 zdarzeń, dostosowując natężenie przepływu, aby uzyskać od 3 000 do 4 000 zdarzeń na sekundę.
Upewnij się, że rejestrujesz wystarczającą liczbę zdarzeń, aby zwizualizować populację, która może wynosić zaledwie jedną na 1 000 komórek. Aby zidentyfikować somatyczne komórki kontrolne B i T, należy odpowiednio włączyć komórki CD20 i CD5 dodatnie. Po ustawieniu wszystkich bramek posortuj komórki do wstępnie schłodzonych stożkowych probówek o pojemności 15 mililitrów zawierających od siedmiu do ośmiu mililitrów pożywki zbiorczej.
Pod koniec sortowania przenieś izolowane populacje komórek do 1,5-mililitrowych mikroprobówek wirówkowych. I granulować komórki przez odwirowanie. Następnie umyj komórki w jednym mililitrze świeżego PBS i usuń supernatanty z każdej probówki, uważając, aby nie naruszyć maleńkich granulek.
Po wzmocnieniu biblioteki i oczyszczeniu koralików punktowych 8X należy zaobserwować normalny rozkład światła o rozmiarach fragmentów w żądanym zakresie. Biblioteki, które wykazują odchylenia od tego kształtu, wskazują na obecność artefaktu o wysokiej lub niskiej masie cząsteczkowej i najlepiej nie powinny być sekwencjonowane. Na przykład, a dimer adaptera może czasami przenosić się przez pierwsze czyszczenie spiczastego koralika X, pojawiając się jako ostry szczyt wyśrodkowany wokół 125 do 130 par zasad.
W takim przypadku należy wykonać dodatkowe czyszczenie spiczastego koralika X, a następnie powtórzyć wizualizację rozkładu rozmiarów, aby zapewnić pomyślne usunięcie dimera. Po zwielokrotnieniu sekwencjonowania czterech próbek na pas możliwe jest osiągnięcie mediany głębokości pokrycia od 50 do 100 razy w poprzek celu. Chociaż wykresy liczby kopii wygenerowane z biblioteki jednego nanograma mogą powodować fałszywe zyski i straty liczby kopii.
Około 70% przypadków klasycznego chłoniaka Hodgkina zawiera mutacje B2M i 820 i/lub delecje, które wydają się być klonalne i które można wykorzystać do oszacowania względnej zawartości guza. Jeśli limfocyty T są używane jako kontrole somatyczne, sekwencjonowanie HRS wykaże znaczny przyrost liczby kopii w pozycjach odpowiadających pozycjom receptora komórek T alfa, delta i beta. Jak również znaczne straty w pozycjach ciężkich i lekkich łańcuchów receptora komórek B z ogólnym obciążeniem mutacyjnym od 100 do 400 mutacji somatycznych na przypadek egzomu.
Po opanowaniu, ta technika, w tym sortowanie komórek i budowa biblioteki sekwencjonowania, może zostać ukończona w ciągu trzech do czterech dni, jeśli zostanie wykonana prawidłowo. Zgodnie z tą procedurą możemy przeprowadzić większe badania prospektywne i inne metody, takie jak epigenetyka, proteomika i metabalomika, aby uzyskać więcej wiedzy na temat chłoniaka Hodgkina i przejść do bardziej specyficznych spersonalizowanych terapii. Po jej opracowaniu metoda pozwoliła nam na badanie komórek HRS o wysokiej czystości w stosunkowo dużych ilościach.
Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak izolować komórki HRS i inicjować ich analizę genomiczną.
Wyświetl pełny transkrypt i uzyskaj dostęp do tysięcy filmów naukowych
Przegląd
Niniejszy artykuł przedstawia protokół izolacji komórek Hodgkina-Reed-Sternberga (HRS) z guzów klasycznego chłoniaka Hodgkina (CHL), umożliwiający wysokiej jakości sekwencjonowanie całego egzomu. Metoda ta koncentruje się na pozyskaniu pochodzącego z guza DNA, które nadaje się do sekwencjonowania następnej generacji bez konieczności wstępnej amplifikacji.
Kluczowe elementy badania
Dziedzina nauki
- Neuronauka
- Onkologia
- Genomika
Wstęp
- Komórki HRS są kluczowe dla zrozumienia klasycznego chłoniaka Hodgkina.
- Identyfikacja mutacji może pomóc w diagnostyce i podejmowaniu decyzji terapeutycznych.
- Wysokiej jakości DNA jest niezbędne do uzyskania dokładnych wyników sekwencjonowania.
- Obecne metody mogą nie dostarczać DNA o jakości wystarczającej do analizy.
Cel badania
- Izolacja żywotnych komórek HRS z guzów CHL.
- Generowanie wysokiej jakości danych z sekwencjonowania całego eksomu.
- Badanie kluczowych mutacji sterujących oraz mutacji ucieczki immunologicznej.
Zastosowane metody
- Sortowanie komórek metodą cytometrii przepływowej w celu wyizolowania komórek HRS.
- Protokół przygotowania bibliotek do sekwencjonowania nowej generacji z niską ilością materiału wejściowego.
- Analiza jakości i czystości DNA pochodzącego z guza.
- Sekwencjonowanie w celu identyfikacji zmian genetycznych w CHL.
Główne wyniki
- Skuteczna izolacja wysokiej jakości DNA z komórek HRS.
- Identyfikacja kluczowych mutacji istotnych dla biologii CHL.
- Potencjalne implikacje dla strategii diagnostycznych i terapeutycznych.
- Wykazana skuteczność metody bez konieczności wstępnej amplifikacji.
Wnioski
- Protokół ten pogłębia zrozumienie CHL na poziomie genetycznym.
- Może on wpływać na decyzje terapeutyczne w oparciu o wyniki badań genetycznych.
- Podejście to może prowadzić do poprawy wyników leczenia pacjentów dzięki lepszej klasyfikacji i prognozowaniu.
Najczęściej zadawane pytania
Znaczenie dla przemysłu
Izolowanie rzadkich subpopulacji nowotworowych, takich jak komórki Hodgkina-Reeda-Sternberga, umożliwia precyzyjne profilowanie molekularne w celu walidacji celów terapeutycznych w nowotworach hematologicznych. Podejście to wspiera ograniczanie ryzyka mechanistycznego poprzez powiązanie zmian somatycznych z odpowiedzią terapeutyczną, co pozwala na dobór odpowiednich modeli przedklinicznych oraz strategii biomarkerów. Izolacja komórek o wysokiej czystości w połączeniu z sekwencjonowaniem materiału niskiego wkładu zwiększa wykonalność analiz genomicznych w typach komórek o niskiej liczebności, poprawiając pewność prognostyczną na wczesnym etapie odkryć.
Strategiczne zastosowania w badaniach i rozwoju biofarmaceutycznym
Wczesne etapy odkrywania i walidacja celu
- Wartość naukowa: Umożliwia weryfikację hipotez terapeutycznych poprzez izolację złośliwych komórek HRS z tła zapalnego w celu analizy mutacji somatycznych.
- Wartość operacyjna: Zapewnia powtarzalną metodę zagęszczania żywotnych komórek nowotworowych do dalszych zastosowań genomicznych.
- Wartość naukowa: Wspiera proces ograniczania ryzyka biologicznego poprzez identyfikację klonalnych mutacji sterujących oraz zmian liczby kopii w komórkach HRS.
Przesiewanie i opracowywanie testów
- Wartość naukowa: Pozwala na uzyskanie wysokiej jakości DNA odpowiedniego do hybrydyzacyjnego wychwytywania całego egzomu lub paneli celowanych, co umożliwia wiarygodne wykrywanie wariantów.
- Wartość operacyjna: Wykorzystuje zoptymalizowany protokół przygotowania bibliotek z niską ilością materiału wejściowego, wymagający zaledwie 10 ng DNA, co zmniejsza zużycie odczynników i zwiększa przepustowość.
- Wartość naukowa: Ułatwia porównanie z prawidłowymi limfocytami T lub B w obrębie guza, co pozwala odróżnić zmiany somatyczne od wariancji linii zarodkowej.
Badania translacyjne i przedkliniczne
- Wartość naukowa: Identyfikuje mutacje związane z ucieczką immunologiczną i opornością na leki, co pozwala na dobór celów terapeutycznych oraz uzasadnienie zastosowania terapii skojarzonej.
- Wartość operacyjna: Umożliwia podłużne monitorowanie ewolucji klonalnej i składu guza poprzez wykorzystanie zmian w B2M i CIITA jako biomarkerów.
- Wartość naukowa: Wspiera dostosowanie modeli przedklinicznych poprzez charakteryzację krajobrazu genomicznego pierwotnych komórek HRS.
Integracja potoków i przepływów pracy
Metoda ta integruje sortowanie przepływowe i sekwencjonowanie niskiego wkładu, aby połączyć wczesną analizę guza z genomiką funkcjonalną, co wspiera identyfikację i walidację celów terapeutycznych w oparciu o postawione hipotezy.
- Biologia odkrywcza: Umożliwia izolację żywotnych komórek HRS w celu badania mechanizmów patogennych i wyjaśnienia zależności sygnałowych w klasycznym chłoniaku Hodgkina.
- Przesiew: Pozwala na otrzymanie bibliotek gotowych do sekwencjonowania z medianowym pokryciem 50–100X, co umożliwia ilościowe porównanie obciążenia mutacyjnego i wariantów strukturalnych.
- Analityka: Dostarcza dane o mutacjach somatycznych, indels i liczbie kopii, co pomaga w priorytetyzacji celów na podstawie częstotliwości występowania i wpływu funkcjonalnego.
- Badania translacyjne: Łączy odkrycia genomiczne z celami immuno-onkologicznymi i mechanizmami oporności, wspierając przedklinarny postęp oparty na biomarkerach.
- Ponowne wykorzystanie w przedsiębiorstwie: Ustanawia standaryzowany schemat analizy genomicznej rzadkich komórek, który można zastosować do innych populacji nowotworowych o niskiej częstotliwości występowania.
Wpływ operacyjny i przedsiębiorstwowy
- Wartość naukowa: Zwiększa pewność walidacji celu poprzez redukcję szumu pochodzącego z zanieczyszczeń stromalnych i immunologicznych w analizie masowej guza.
- Wartość operacyjna: Łączy sortowanie komórek aktywowane fluorescencją z przygotowaniem bibliotek o niskim wkładzie materiału, aby zmaksymalizować wydajność z ograniczonej ilości próbki.
- Wartość strategiczna: Wspiera decyzje typu go/no-go poprzez wczesne wykrywanie mutacji klonalnych i potencjału neoantygenowego w ocenie celu.
- Wpływ na portfolio: Umożliwia priorytetyzację celów z uwzględnieniem ryzyka na podstawie profili zmian somatycznych i wzbogacenia szlaków sygnałowych.
Kwestie związane z implementacją
- Wymaga doświadczenia w zakresie cytometrii przepływowej, optymalizacji paneli przeciwciał oraz sterylnego obchodzenia się z komórkami w celu zachowania ich żywotności i czystości.
- Zależne od dostępu do sortera komórkowego z odpowiednią detekcją fluorescencji oraz sprzętu do przygotowywania bibliotek o niskim wkładzie materiału.
- Wymaga zastosowania znormalizowanych bram sortowania oraz kontroli kompensacji, aby zapewnić powtarzalność wyników między różnymi operatorami i ośrodkami.
- Wymaga walidacji jakości DNA oraz rozkładu wielkości fragmentów po oczyszczaniu, aby uniknąć artefaktów sekwencjonowania, takich jak dimery adapterów.
- Ograniczone przez rzadkość występowania komórek HRS (<1% guza), co wymaga zastosowania wystarczającej ilości materiału wyjściowego w celu uzyskania istotnej liczby odzyskanych komórek.
