Name: Sortowanie przepływowe i sekwencjonowanie egzomu komórek Reeda-Sternberga klasycznego chłoniaka Hodgkina (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-06-10T13:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 53 s
Description: Poznaj metodę sortowania przepływowego i sekwencjonowania egzomu komórek Reeda-Sternberga w klasycznym chłoniaku Hodgkina. Technika ta umożliwia uzyskanie wysokiej jakości DNA nowotworowego bez preamplifikacji.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Opracowanie tej metody projektu zostało sfinansowane przez Wydział Patologii i Medycyny Laboratoryjnej Weill Cornell Medical College. Przyjmujemy do wiadomości Trójinstytucjonalny Program Szkoleniowy w zakresie Biologii Obliczeniowej i Medycyny do częściowego finansowania. Dziękujemy naukowcom, którzy podzielili się z nami swoim czasem i wiedzą, a w szczególności Maryke Appel; Dana Burgessa; Iwanka Kozarewa; Chada Lockleara; oraz wszyscy z Weill Cornell Medical College Genomics Core Facility, w tym Jenny Zhang, Xiaobo (Shawn) Liang, Dong Xu, Wei Zhang, Huimin Shang, Tatiana Batson i Tuo Zhang.

<ol><li>Abrams, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((National+Cancer+Institute%27s+Precision+Medicine+Initiatives+for+the+new+National+Clinical+Trials+Network%5BTitle%5D)+AND+%22American+Society+of+Clinical+Oncology+educational+book+%2F+ASCO.+American+Society+of+Clinical+Oncology.+Meeting%22%5BJournal%5D)">National Cancer Institute's Precision Medicine Initiatives for the new National Clinical Trials Network.</a> American Society of Clinical Oncology educational book / ASCO. American Society of Clinical Oncology. Meeting. , 71-76 (2014).</li>
<li>Gagan, J., Van Allen, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Next-generation+sequencing+to+guide+cancer+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+medicine%22%5BJournal%5D)">Next-generation sequencing to guide cancer therapy.</a> Genome medicine. 7, 80(2015).</li>
<li>Matsuki, E., Younes, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lymphomagenesis+in+Hodgkin+lymphoma%5BTitle%5D)+AND+%22Seminars+in+cancer+biology%22%5BJournal%5D)">Lymphomagenesis in Hodgkin lymphoma.</a> Seminars in cancer biology. 34, 14-21 (2015).</li>
<li>Fromm, J. R., Kussick, S. J., Wood, B. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+and+purification+of+classical+Hodgkin+cells+from+lymph+nodes+by+flow+cytometry+and+flow+cytometric+cell+sorting%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Clin+Pathol%22%5BJournal%5D)">Identification and purification of classical Hodgkin cells from lymph nodes by flow cytometry and flow cytometric cell sorting.</a> Am J Clin Pathol. 126 (5), 764-780 (2006).</li>
<li>Fromm, J. R., Thomas, A., Wood, B. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Flow+cytometry+can+diagnose+classical+hodgkin+lymphoma+in+lymph+nodes+with+high+sensitivity+and+specificity%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Clin+Pathol%22%5BJournal%5D)">Flow cytometry can diagnose classical hodgkin lymphoma in lymph nodes with high sensitivity and specificity.</a> Am J Clin Pathol. 131 (3), 322-332 (2009).</li>
<li>Roshal, M., Wood, B. L., Fromm, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Flow+cytometric+detection+of+the+classical+hodgkin+lymphoma%3A+clinical+and+research+applications%5BTitle%5D)+AND+%22Advances+in+hematology%22%5BJournal%5D)">Flow cytometric detection of the classical hodgkin lymphoma: clinical and research applications.</a> Advances in hematology. 2011, 387034(2011).</li>
<li>Reichel, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Flow+sorting+and+exome+sequencing+reveal+the+oncogenome+of+primary+Hodgkin+and+Reed-Sternberg+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Flow sorting and exome sequencing reveal the oncogenome of primary Hodgkin and Reed-Sternberg cells.</a> Blood. 125 (7), 1061-1072 (2015).</li>
<li>Kozarewa, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Modified+Method+for+Whole+Exome+Resequencing+from+Minimal+Amounts+of+Starting+DNA%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+ONE%22%5BJournal%5D)">A Modified Method for Whole Exome Resequencing from Minimal Amounts of Starting DNA.</a> PLoS ONE. 7 (3), e32617(2012).</li>
<li>Brunicardi, F. C. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aBrunicardi%2C+FC+%22Schwartz%27s+Principles+of+Surgery%22">Schwartz's Principles of Surgery</a>. , 10th ed, McGraw-Hill Education / Medical. (2014).</li>
<li>Kantor, A. B., Roederer, M. FACS analysis of leukocytes. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aKantor%2C+AB+%22Handbook+of+Experimental+Immunology%22">Handbook of Experimental Immunology</a>. 2, Blackwell Scientific. (1996).</li>
<li>Sanders, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+pathways+of+adhesion+in+spontaneous+rosetting+of+T-lymphocytes+to+the+Hodgkin%27s+cell+line+L428%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">Molecular pathways of adhesion in spontaneous rosetting of T-lymphocytes to the Hodgkin's cell line L428.</a> Cancer Res. 48 (1), 37-40 (1988).</li>
<li>Biosciences. FACSDiva Software v6.0. , Available from:
 <a target="_blank" href="http://www.bdbiosciences.com/in/instruments/software/facsdiva/resources/overview.jsp">http://www.bdbiosciences.com/in/instruments/software/facsdiva/resources/overview.jsp</a> (2007).</li>
<li>Biosciences. <a target="_blank" href="https://www.bdbiosciences.com/documents/BD_FACSAria_II_User_Guide.pdf">FACSAria II User's Guide. Part No. 644832, Revision A</a>. , (2009).</li>
<li>Life Technologies. Qubit 3.0 Fluorometer, Catalog Number Q33216. , Available from:
 <a target="_blank" href="https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/Q33216">https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/Q33216</a> (2017).</li>
<li>Roche Nimblegen. <a target="_blank" href="https://shop.roche.com/wcsstore/RASCatalogAssetStore/Articles/SeqCapEZLibrarySR_UGuide_v4p1.pdf">SeqCap EZ Library SR User's Guide ver. 4.1</a>. , (2013).</li>
<li>Illumina. HiSeq High-Throughput Sequencing System. , Available from:
 <a target="_blank" href="http://www.illumina.com/systems/hiseq_2500_1500.html">http://www.illumina.com/systems/hiseq_2500_1500.html</a> (2016).</li>
<li>Li, H., Durbin, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fast+and+accurate+short+read+alignment+with+Burrows-Wheeler+transform%5BTitle%5D)+AND+%22Bioinformatics%22%5BJournal%5D)">Fast and accurate short read alignment with Burrows-Wheeler transform.</a> Bioinformatics. 25 (14), 1754-1760 (2009).</li>
<li>Li, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Sequence+Alignment%2FMap+format+and+SAMtools%5BTitle%5D)+AND+%22Bioinformatics%22%5BJournal%5D)">The Sequence Alignment/Map format and SAMtools.</a> Bioinformatics. 25 (16), 2078-2079 (2009).</li>
<li>The Broad Institute. Picard Tools. , Available from:
 <a target="_blank" href="http://broadinstitute.github.io/picard/">http://broadinstitute.github.io/picard/</a> (2016).</li>
<li>Saunders, C. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Strelka%3A+accurate+somatic+small-variant+calling+from+sequenced+tumor-normal+sample+pairs%5BTitle%5D)+AND+%22Bioinformatics%22%5BJournal%5D)">Strelka: accurate somatic small-variant calling from sequenced tumor-normal sample pairs.</a> Bioinformatics. 28 (14), 1811-1817 (2012).</li>
<li>Cingolani, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+program+for+annotating+and+predicting+the+effects+of+single+nucleotide+polymorphisms%2C+SnpEff%3A+SNPs+in+the+genome+of+Drosophila+melanogaster+strain+w1118%3B+iso-2%3B+iso-3%5BTitle%5D)+AND+%22Fly+%28Austin%29%22%5BJournal%5D)">A program for annotating and predicting the effects of single nucleotide polymorphisms, SnpEff: SNPs in the genome of Drosophila melanogaster strain w1118; iso-2; iso-3.</a> Fly (Austin). 6 (2), 80-92 (2012).</li>
<li>Dobin, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((STAR%3A+ultrafast+universal+RNA-seq+aligner%5BTitle%5D)+AND+%22Bioinformatics%22%5BJournal%5D)">STAR: ultrafast universal RNA-seq aligner.</a> Bioinformatics. 29 (1), 15-21 (2013).</li>
<li>Thorvaldsdottir, H., Robinson, J. T., Mesirov, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Integrative+Genomics+Viewer+%28IGV%29%3A+high-performance+genomics+data+visualization+and+exploration%5BTitle%5D)+AND+%22Briefings+in+bioinformatics%22%5BJournal%5D)">Integrative Genomics Viewer (IGV): high-performance genomics data visualization and exploration.</a> Briefings in bioinformatics. 14 (2), 178-192 (2013).</li>
<li>DNA copy number data analysis. v.R package version 1.34.0. , Available from:
 <a target="_blank" href="https://omictools.com/dnacopy-tool">https://omictools.com/dnacopy-tool</a> (2013).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Przyszłe zastosowania lub wskazówki po opanowaniu tej techniki
Prace te pozwalają na sekwencjonowanie egzomu z próbek zawierających co najmniej 10 ng DNA. W kontekście klinicznym limit ten nie obejmuje większości próbek aspiracyjnych cienkoigłowych z powodu niewystarczającej ilości materiału, ale obejmuje odpowiednie biopsje gruboigłowe i próbki biopsji wycinającej. Umożliwi to pozyskanie danych z większego zestawu możliwych próbek.
Krytyczn...

Postępy w genomice nowotworów wynikające z sekwencjonowania nowej generacji doprowadziły do znaczących przełomów w identyfikacji celów terapeutycznych i prognozowaniu wielu nowotworów hematologicznych i niehematologicznych. Nowe zindywidualizowane strategie leczenia oparte na specyficznych zmianach genomowych są szybko wprowadzane w wielu typach nowotworów (omówione w bibliografii1,2). Pomimo znacznego postępu w genomice chłoniaka, genom nowotworowych komórek HRS w klasycznym chłoniaku Hodgkina (CHL) był niedostatecznie zbadany. Badania były utrudnione przez niedobór nowotworowych komórek HRS w reaktywnym mikrośrodowisku, co utrudniało wyizolowanie oczyszczonych populacji komórek HRS3.
Metoda izolowania żywotnych komórek HRS z pierwotnych nowotworów została opracowana przez Fromma i wsp.4,5,6. Metoda wykorzystuje koktajl ośmiu przeciwciał, składający się z CD30, CD15, CD40, CD95, CD45, CD20, CD5 i CD64, do jednoznacznej identyfikacji komórek HRS z zawiesiny guza CHL. Korzystając z tej metodologii, jesteśmy w stanie wyizolować co najmniej 1000 żywotnych komórek HRS ze świeżych lub zamrożonych zawiesin komórkowych z biopsji guza składających się z co najmniej 107 komórek (około 10 mg tkanki). Czystość jest większa niż 90% w analizie cytometrii przepływowej i szacuje się na co najmniej 80% w analizie genomu egzomu w dziesięciu kolejnych przypadkach.
Udoskonaliliśmy technikę izolacji komórek metodą cytometrii przepływowej, która znacznie ułatwiła ten proces, pozwalając na szybką izolację tysięcy żywotnych komórek HRS z pierwotnych nowotworów CHL7. Wykorzystaliśmy tę technikę do wytworzenia tego, co uważa się za pierwszą sekwencję całego eksomu komórek nowotworowych w pierwotnych przypadkach chłoniaka Hodgkina. Nasze badania pokazują wykonalność wysokoprzepustowych, obejmujących cały genom badań poszczególnych przypadków CHL i już doprowadziły do zidentyfikowania nowych zmian genomowych, które mogą wyjaśnić aspekty patogenezy CHL.
Dalej rozwijamy linię do wykorzystania wyekstrahowanego DNA do wysokoprzepustowych badań genomicznych. W celu uzyskania wiarygodnych wyników z zaledwie 1000 posortowanych komórek HRS (minimum uzyskane z sekwencyjnych przypadków), opracowaliśmy zmodyfikowaną procedurę budowy biblioteki DNA nowej generacji8, która pozwoliła nam zwiększyć wydajność ligacji adaptorowej i wygenerować biblioteki fragmentów DNA bez nadmiernej amplifikacji. Metoda ta pozwala na analizę rutynowych próbek klinicznych oraz wykrywanie nawracających mutacji i zmian chromosomowych7.

<table><tbody><tr><td>Naczynie Petriego lub naczynie do hodowli komórkowych (sterylne)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>RPMI-1640 Media</td><td>Roswell Park Memorial Institute</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Surowica cielęca płodu (FCS), (inaktywowana termicznie)</td><td></td><td></td><td></td></tr> <tr><td>Pożywka do zamrażania (RPMI, 20% FCS, 10% dimetylosulfotlenku (DMSO))-zachować świeżość i zachować sterylność</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>RPMI z 2% FCS (świeży lub przechowywać do 1 miesiąca)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>skalpel ze świeżym ostrzem</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Strzykawka 10 ml (bez igły)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Fiolki kriogeniczne</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>50 ml stożkowe probówki wirówkowe, wirówka</td> siłowa <td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td>zdolna do obsługi stożkowych probówek wirówkowych o pojemności 50 ml i zapewniająca 400 g</td>buforu Hepes (1 M, klasa hodowli komórkowej)<td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr> sól <tr><td>fizjologiczna buforowana fosforanami (PBS)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Pluoronic-F68</td><td>Thermo-Fisher</td><td>24040-032</td><td></td></tr><tr><td>DNAaza-I</td><td>Sigma-Aldrich, St. Louis, MO</td><td>D4527-10KU</td><td>przechowywać jako 5 mg/ml w RPMI w -200 i #176; C</td></tr><tr><td>Albumina surowicy bydlęcej (BSA)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Sortuj podłoża (PBS + 2% BSA + 25 mM HEPES + Pluoronic &ndash; F68 (1x))</td>CD64-FITC <td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>(22)</td><td>Beckman Coulter, Miami, FL</td><td></td><td>20 &mu; L sugerowana objętość początkowa; Sugeruje się mianowanie</td></tr><tr><td>CD30-PE (BerH83)</td><td>BD Biosciences, San Jose, CA</td><td></td><td>20 &mu; L sugerowana objętość początkowa; Sugerowane mianowanie</td></tr><tr><td>CD5-ECD (BL1a)</td><td>Beckman Coulter, Miami, FL</td><td></td><td>10 &mu; L sugerowana objętość początkowa; Sugerowane mianowanie</td></tr><tr><td>CD40-PerCP-eFluor 710 (1C10)</td><td>Ebiosciences, San Diego, CA</td><td></td><td>5 &mu; L sugerowana objętość początkowa; Sugerowane mianowanie</td></tr><tr><td>CD20-PC7 (B9E9)</td><td>Beckman Coulter, Miami, FL</td><td></td><td>10 &mu; L sugerowana objętość początkowa; Sugeruje się mianowanie</td></tr><tr><td>CD15-APC (HI98)</td><td>BD Biosciences, San Jose, CA</td><td></td><td>20 &mu; L sugerowana objętość początkowa; Sugerowane jest miareczkowanie</td></tr><tr><td>CD45 APC-H7 (2D1)</td><td>BD Biosciences, San Jose, CA</td><td></td><td>Można zastąpić przez 10 &mu; L sugerowana objętość CD45-Krome Orange (J.33, Beckman Coulter); Sugerowane mianowanie</td></tr><tr><td>CD95-Pacific Blue (DX2)</td><td>Life Technologies, Grand Island, NY</td><td></td><td>5 & L sugerowana objętość początkowa; Sugeruje się mianowanie</td></tr><tr><td>CD2 (5 &mu; g; klon RPA-2.10)</td><td>Biolegend, San Diego, CA</td><td></td><td>Dla opcjonalnego protokołu; Sugeruje się mianowanie</td></tr><tr><td>CD54 (10 &mu; g; klon 84H10)</td><td>Serotec, Oxford, Wielka Brytania</td><td></td><td>Dla opcjonalnego protokołu; Sugeruje się mianowanie</td></tr><tr><td>CD58 (10 &mu; g; klon TS2/9)</td><td>eBioscience, San Diego, CA</td><td></td><td>Dla opcjonalnego protokołu; Sugeruje się mianowanie</td></tr><tr><td>LFA-1 (12 &mu; g; klon MHM23)</td><td>Novus Biologicals, Littleton, CO</td><td></td><td>Dla opcjonalnego protokołu; Sugerowane jest mianowanie</td></tr><tr><td>BD CS& Koraliki T</td><td>BD Biosciences, San Jose, Kalifornia</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Koraliki BD Accudrop Koraliki</td><td>BD Biosciences, San Jose, Kalifornia</td><td></td><td></td></tr><tr><td>BC Koraliki wychwytywania przeciwciał Versa Comp</td><td>Beckman Coulter, Miami, FL</td><td></td><td>Koraliki kompensacyjne Koraliki</td></tr><tr><td>BD-FACS ARIA specjalny instrument badawczy wykorzystujący 5 laserów</td><td>BD Biosciences, San Jose, Kalifornia</td><td></td><td>każda aria BD-FACS z możliwością wykrywania fluorochromów w panelu przeciwciał powinna być wystarczająca</td></tr><tr><td>Wizard</td><td>Promega</td><td>A2360</td><td></td></tr><tr><td>10 mM Tris-Cl buffer</td><td>NA</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Qubit dsDNA HS Assay kit</td><td>Life Technologies, Carlsbad, CA</td><td></td><td></td></tr><tr><td>S2 Sonicator</td><td>Covaris, Woburn, MA</td><td></td><td>Alternatywy mogą być podstawione</td></tr><tr><td>mikroTUBE</td><td>Covaris, Woburn, MA</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Zestaw do przygotowania biblioteki o niskiej przepustowości</td><td>Kapa Biosystems, Wilmington, MA</td><td>KK8221</td><td></td></tr><tr><td>Sybr Green</td><td>Sigma-Aldrich, St. Louis, MO</td><td>S9430</td><td></td></tr><tr><td>Koraliki Agencourt AMPure XP</td><td>Beckman Coulter, Miami, FL</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Bioanalyzer</td><td>Agilent Technologies, Santa Clara, CA</td><td></td><td></td></tr><tr><td>SeqCap EZ Exome v.3.0</td><td>Roche Nimblegen</td><td>6465684001</td><td></td></tr><tr><td>HiSeq</td><td>Illumina</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Uniwersalny adapter w stylu TruSeq</td><td>Zintegrowane technologie DNA (IDT), Coralville, Iowa</td><td></td><td>Oczyszczanie HPLC; AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACACTCTTTCCCTACACGACCCGCTCTTCCGAT*C*T</td></tr><tr><td>Adapter indeksu w stylu TruSeq</td><td>Zintegrowane technologie DNA (IDT), Coralville, Iowa</td><td></td><td>Oczyszczanie HPLC; /5Phos/GATCGGAAGAGCACACGTCTGAACTCCAGAGTCACNNNNNNNATCTCGTATGCCGTCTTCTGCTTG</td></tr><tr>Starter<td>PCR w stylu TruSeq 1</td><td>Zintegrowane technologie DNA (IDT), Coralville, Iowa</td><td></td><td>AATGATACGGGACCACCGAGA</td></tr><tr><td>Starter PCR w stylu TruSeq 2</td><td>Zintegrowane technologie DNA (IDT), Coralville, Iowa</td><td></td><td>CAAGCAGAAGACGGCATACGAG</td></tr><tr><td>Zintegrowany bufor dupleksowy bez nukleaz</td><td>Zintegrowane technologie DNA (IDT), Coralville, Iowa</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Oprogramowanie BD FACSDIVA</td><td>BD Biosciences, San Jose, Kalifornia</td><td></td><td></td></tr><tr><td>BD Falcon Tubes</td><td>BD Biosciences, San Jose, Kalifornia</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Rurki przepływowe BD</td><td>Biosciences, San Jose, Kalifornia</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

sortowanie przepływowe i sekwencjonowanie egzomu komórek reeda-sternberga klasycznego chłoniaka hodgkina

Flow-sorting and Exome Sequencing of the Reed-Sternberg Cells of Classical Hodgkin Lymphoma

Komórki Hodgkina Reeda-Sternberga klasycznego chłoniaka Hodgkina są słabo rozmieszczone na tle zapalnych limfocytów i zazwyczaj stanowią mniej niż 1% masy guza. Materiał pochodzący z guza masowego zawiera zawartość guza w stężeniu niewystarczającym do charakterystyki. Dlatego sortowanie komórek aktywowane fluorescencją przy użyciu ośmiu przeciwciał, a także rozpraszanie boczne i do przodu, jest tutaj opisane jako metoda szybkiego oddzielania i koncentrowania z wysoką czystością tysięcy komórek HRS z guza do późniejszego badania. Jednocześnie, ponieważ standardowe protokoły sekwencjonowania egzomu zazwyczaj wymagają 100-1000 ng wejściowego DNA, co często jest zbyt wysokie, nawet przy sortowaniu przepływowym, zapewniamy również zoptymalizowany, niskowejściowy protokół budowy biblioteki, który jest w stanie wytworzyć wysokiej jakości dane już z 10 ng wejściowego DNA. Ta kombinacja jest w stanie stworzyć biblioteki nowej generacji odpowiednie do hybrydyzacji, przechwytywania przynęt z całego eksomu lub bardziej skoncentrowanych paneli docelowych, w zależności od potrzeb. Sekwencjonowanie egzomu komórek HRS, w porównaniu ze zdrowymi komórkami T lub B wewnątrz guza, może zidentyfikować zmiany somatyczne, w tym mutacje, insercje i delecje oraz zmiany liczby kopii. Odkrycia te wyjaśniają biologię molekularną komórek HRS i mogą ujawnić możliwości celowanego leczenia farmakologicznego.

Po amplifikacji biblioteki i oczyszczaniu kuleczkami 0,8x należy wykonać analizę bioanalizatorem. Powinien być widoczny rozkład wielkości fragmentów o charakterze „normalnym” w pożądanym zakresie (Rysunek 2a). Odchylenia od tego kształtu, takie jak widoczne „ramię” na krzywej, wskazują na obecność artefaktów o wysokiej lub niskiej masie cząsteczkowej. Na przykład Rysunek 2b-2d przedstawia przykłady bibliotek zawi...

Tutaj opisujemy połączone sortowanie komórek metodą cytometrii przepływowej i protokół budowy biblioteki nowej generacji o niskim wkładzie przeznaczony do generowania wysokiej jakości danych o całym eksomie z komórek Hodgkina Reeda-Sternberga (HRS) klasycznego chłoniaka Hodgkina (CHL).

Sortowanie przepływowe i sekwencjonowanie egzomu komórek Reeda-Sternberga klasycznego chłoniaka Hodgkina

The Hodgkin Reed-Sternberg cells of classical Hodgkin lymphoma are sparsely distributed within a background of inflammatory lymphocytes and typically ...

Ogólnym celem tej procedury jest oddzielenie i skoncentrowanie żywotnych komórek Hodgkina Reeda-Sternberga lub HRS z zapalnych limfocytów klasycznego chłoniaka Hodgkina lub guzów CHL w celu wygenerowania i analizy wysokiej jakości danych sekwencjonowania całego eksomu nowej generacji. Metoda ta może odpowiedzieć na kluczowe pytania w biologii CHR, w tym identyfikację kluczowych mutacji napędzających, mutacji ucieczki immunologicznej, a także przyjrzenie się różnorodności genów w klasyfikacji. Technika ta pozwala uzyskać DNA pochodzące z nowotworu, które jest bardzo wysokiej jakości i czystości.Ułatwienie generowania bibliotek sekwencjonowania nowej generacji bez konieczności etapu wstępnego wzmacniania. Technika ta może mieć ważne implikacje w diagnostyce chłoniaka Hodgkina, ponieważ może pomóc w podklasyfikacji i prognozowaniu. Może to również wpływać na wybór terapii, ponieważ niektóre zmiany mogą wskazywać na podatność lub oporność na określone leki.Jonathan po raz pierwszy wpadł na ten pomysł, kiedy odkrył, jak wizualizować komórki HRS za pomocą cytometrii przepływowej i przeprowadzić pierwsze eksperymenty z sortowaniem tych komórek. Przed przygotowaniem komórek należy wymieszać wstępnie dobrane przeciwciała w fiolce z ciemnego szkła. Następnie dodaj PBS i BSA, aby doprowadzić koktajl przeciwciał do objętości 100 mikrolitrów.I przenieść fiolkę z ciekłego azotu do wiadra z lodem lub suchego lodu. Następnie szybko rozmrozić interesujące Cię komórki w łaźni wodnej o temperaturze 37 stopni Celsjusza. Gdy pozostanie tylko niewielka zamrożona porcja, wlej komórki do 50-mililitrowej stożkowej probówki zawierającej 45 mililitrów pożywki do rozmrażania o temperaturze 37 stopni Celsjusza i przepłucz fiolkę kriogeniczną dwa razy jednym mililitrem świeżego podłoża do rozmrażania.Po zebraniu obu płukań pozwól komórkom trawić się w temperaturze pokojowej przez 15 minut. Gdy komórki odzyskają równowagę, zbierz je przez odwirowanie. Odessać wszystkie oprócz ostatnich 200 mikrolitrów supernatantu.Ponownie zawiesić komórki w pozostałym podłożu do rozmrażania i pozwolić komórkom odpocząć przez kolejne dwie do trzech minut. Następnie inkubuj komórki w 100 mikrolitrach koktajlu przeciwciał przez 15 minut w temperaturze pokojowej, chroniąc przed światłem. Pod koniec inkubacji umyj komórki w trzech mililitrach pożywki sortującej, ponownie zawieszając osad w jednym mililitrze świeżej pożywki sortującej.Następnie przefiltruj komórki przez górne sitko z pięciomililitrową rurką przepływową. Przepłukać probówkę i sitko dodatkowym mililitrem pożywki sortującej i trzymać komórki na lodzie. Przed rozpoczęciem sortowania komórek, w oprogramowaniu cytometru przepływowego w menu eksperymentu, wybierz nowy eksperyment i otwórz okno stanu urządzenia.Na karcie parametrów usuń wszystkie nieużywane parametry. Następnie ponownie otwórz kartę eksperymentu i wybierz konfigurację wynagrodzenia, aby utworzyć kontrolki wynagrodzenia. W oknie przeglądarki kliknij znak plus, aby rozwinąć próbkę kontrolną kompensacji i uruchomić probówki kontrolne kompensacji bez rejestrowania danych.W razie potrzeby dostosuj napięcia detektora tak, aby dodatnio zabarwione populacje koralików dla każdego chromu flory mieściły się w zakresie od 10 000 do 100 000 kanałów. I najjaśniejszych w swoim głównym kanale detekcji. Zapisz napięcia potrzebne dla każdego parametru dla każdej lampy.Następnie, pod próbką kontrolną kompensacji, kliknij raz lewym przyciskiem myszy, aby podświetlić niezabarwioną probówkę kontrolną i załadować niezabarwioną probówkę kontrolną na stolik próbki. W oknie kontroli akwizycji kliknij przycisk Załaduj i uruchom poszczególne elementy sterujące kompensacją w polach napięcia detektora dla wszystkich parametrów, aby ręcznie wprowadzić określone napięcia. Kliknij przycisk Rekord, aby uzyskać niezabarwione dane kontrolne.Następnie uruchom wszystkie pozostałe elementy sterujące kompensacją, rejestrując dane bez zmiany jakichkolwiek ustawień detektora. Po przeanalizowaniu wszystkich elementów kontrolnych, uruchom probówkę ze sterylną wodą dejonizowaną na pięć minut, aby oczyścić instrument z wszelkich pozostałości materiału przed kontynuowaniem. Aby zabramkować komórki do sortowania HRS, załaduj probówkę eksperymentalną i zarejestruj co najmniej 100 000 zdarzeń, dostosowując natężenie przepływu, aby uzyskać od 3 000 do 4 000 zdarzeń na sekundę.Upewnij się, że rejestrujesz wystarczającą liczbę zdarzeń, aby zwizualizować populację, która może wynosić zaledwie jedną na 1 000 komórek. Aby zidentyfikować somatyczne komórki kontrolne B i T, należy odpowiednio włączyć komórki CD20 i CD5 dodatnie. Po ustawieniu wszystkich bramek posortuj komórki do wstępnie schłodzonych stożkowych probówek o pojemności 15 mililitrów zawierających od siedmiu do ośmiu mililitrów pożywki zbiorczej.Pod koniec sortowania przenieś izolowane populacje komórek do 1,5-mililitrowych mikroprobówek wirówkowych. I granulować komórki przez odwirowanie. Następnie umyj komórki w jednym mililitrze świeżego PBS i usuń supernatanty z każdej probówki, uważając, aby nie naruszyć maleńkich granulek.Po wzmocnieniu biblioteki i oczyszczeniu koralików punktowych 8X należy zaobserwować normalny rozkład światła o rozmiarach fragmentów w żądanym zakresie. Biblioteki, które wykazują odchylenia od tego kształtu, wskazują na obecność artefaktu o wysokiej lub niskiej masie cząsteczkowej i najlepiej nie powinny być sekwencjonowane. Na przykład, a dimer adaptera może czasami przenosić się przez pierwsze czyszczenie spiczastego koralika X, pojawiając się jako ostry szczyt wyśrodkowany wokół 125 do 130 par zasad.W takim przypadku należy wykonać dodatkowe czyszczenie spiczastego koralika X, a następnie powtórzyć wizualizację rozkładu rozmiarów, aby zapewnić pomyślne usunięcie dimera. Po zwielokrotnieniu sekwencjonowania czterech próbek na pas możliwe jest osiągnięcie mediany głębokości pokrycia od 50 do 100 razy w poprzek celu. Chociaż wykresy liczby kopii wygenerowane z biblioteki jednego nanograma mogą powodować fałszywe zyski i straty liczby kopii.Około 70% przypadków klasycznego chłoniaka Hodgkina zawiera mutacje B2M i 820 i/lub delecje, które wydają się być klonalne i które można wykorzystać do oszacowania względnej zawartości guza. Jeśli limfocyty T są używane jako kontrole somatyczne, sekwencjonowanie HRS wykaże znaczny przyrost liczby kopii w pozycjach odpowiadających pozycjom receptora komórek T alfa, delta i beta. Jak również znaczne straty w pozycjach ciężkich i lekkich łańcuchów receptora komórek B z ogólnym obciążeniem mutacyjnym od 100 do 400 mutacji somatycznych na przypadek egzomu.Po opanowaniu, ta technika, w tym sortowanie komórek i budowa biblioteki sekwencjonowania, może zostać ukończona w ciągu trzech do czterech dni, jeśli zostanie wykonana prawidłowo. Zgodnie z tą procedurą możemy przeprowadzić większe badania prospektywne i inne metody, takie jak epigenetyka, proteomika i metabalomika, aby uzyskać więcej wiedzy na temat chłoniaka Hodgkina i przejść do bardziej specyficznych spersonalizowanych terapii. Po jej opracowaniu metoda pozwoliła nam na badanie komórek HRS o wysokiej czystości w stosunkowo dużych ilościach.Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak izolować komórki HRS i inicjować ich analizę genomiczną.

flow-sorting-exome-sequencing-reed-sternberg-cells-classical-hodgkin

Research

JoVE Journal

Genetics

Genetyka

Ten film opisuje separację komórek ostrej białaczki limfoblastycznej od komórek zrębu szpiku kostnego za pomocą żelowych dziesięciu usieciowanych kolumn dekstranu G-10. Metoda ta pomaga odzyskać populację komórek nowotworowych, które migrowały pod przylegającymi komórkami zrębu szpiku kostnego, generując populację komórek nowotworowych "przyciemnionych fazowo".

Sortowanie komórek białaczkowych w oparciu o kolumnę G-10: metoda oczyszczania komórek ostrej białaczki limfoblastycznej z komórek zrębu szpiku kostnego

W tym filmie opisujemy protokół opartego na cytometrii przepływowej sortowania naiwnych komórek B, komórek B pamięci i subpopulacji komórek plazmatycznych plazmablastów z ludzkich komórek B krwi obwodowej. Różne subpopulacje komórek B można rozróżnić na podstawie wiązania przeciwciał na bazie fluoroforu z receptorami CD19, CD27 i CD38 ulegającymi ekspresji na powierzchni komórek B, a następnie sortowania komórek.

Sortowanie komórek oparte na cytometrii przepływowej dla różnych populacji krążących komórek B

Tutaj opisujemy protokół izolacji podzbiorów prekursorowych komórek B z krwi pępowinowej.  Wystarczająca ilość i jakość kwasów nukleinowych może zostać wyekstrahowana z komórek i wykorzystana w kolejnych testach z wykorzystaniem DNA lub RNA.

Izolacja podzbiorów prekursorowych komórek B z krwi pępowinowej

Tutaj opisujemy protokół, który łączy dwie techniki proteomiczne, mianowicie dwuwymiarową elektroforezę (2DE) i spektrometrię mas (MS), w celu identyfikacji różnie wyrażonych/potranslacyjnych zmodyfikowanych białek wśród dwóch lub więcej grup próbek pierwotnych. Takie podejście, wraz z eksperymentami funkcjonalnymi, pozwala na identyfikację i charakterystykę markerów prognostycznych/celów terapeutycznych.

Od plamki 2DE-Gel do funkcji białka: lekcja wyciągnięta z HS1 w przewlekłej białaczce limfocytowej

Kwantyfikacja komórek pochodzących od dawcy jest wymagana do monitorowania wszczepienia po przeszczepie komórek macierzystych u pacjentów z hemoglobinopatiami. Połączenie sortowania komórek opartego na cytometrii przepływowej, testu tworzenia kolonii i późniejszej analizy krótkich powtórzeń tandemowych można zastosować do oceny proliferacji i różnicowania komórek progenitorowych w przedziale erytroidalnym.

Wykrywanie resztkowych erytroidalnych komórek progenitorowych dawcy po przeszczepieniu krwiotwórczych komórek macierzystych u pacjentów z hemoglobinopatiami

Wykrywanie minimalnej lub mierzalnej choroby resztkowej (MRD) jest ważnym biomarkerem prognostycznym do udoskonalania oceny ryzyka i przewidywania nawrotu ostrej białaczki szpikowej (AML). Te kompleksowe wytyczne i zalecenia wraz z najlepszymi praktykami w zakresie spójnej i dokładnej identyfikacji i wykrywania MRD mogą pomóc w podejmowaniu skutecznych decyzji dotyczących leczenia AML.

Kompleksowy protokół pobierania i przetwarzania szpiku kostnego do pomiaru mierzalnej choroby resztkowej i białaczkowych komórek macierzystych w ostrej białaczce szpikowej

Przedstawiamy protokół wykrywania jednoczesnej ekspresji markerów komórek macierzystych białaczki na pierwotnych komórkach ostrej białaczki szpikowej za pomocą cytometrii przepływowej. Pokazujemy, jak określić ilościowo trzy populacje przodków i przypuszczalną populację LSC o rosnącym stopniu dojrzałości. Potwierdziliśmy obecność tych populacji w odpowiadających im ksenoprzeszczepach pochodzących od pacjentów.

Cytometria przepływowa w celu oceny komórek macierzystych białaczki w pierwotnej ostrej białaczce szpikowej i w ksenoprzeszczepach pobranych od pacjenta, w momencie diagnozy i obserwacji

Masowe pomiary ekspresji genów zaciemniają różnice między poszczególnymi komórkami w heterogenicznych populacjach komórek. W tym miejscu opisujemy protokół, w jaki sposób analiza ekspresji genów pojedynczej komórki i sortowanie indeksów za pomocą sortowania komórek aktywowanych florescencją (FACS) mogą być łączone w celu określenia heterogeniczności i immunofenotypowego scharakteryzowania molekularnie odrębnych populacji komórek.

Kombinatoryczne podejście jednokomórkowe w celu scharakteryzowania molekularnej i immunofenotypowej heterogeniczności populacji ludzkich komórek macierzystych i progenitorowych

Opisujemy metodę łączącą kulki immunomagnetyczne i sortowanie komórek aktywowane fluorescencją w celu izolowania i analizowania zdefiniowanych subpopulacji komórek odpornościowych komórek jednojądrzastych krwi obwodowej (monocyty, limfocyty T CD4+, limfocyty T CD8+, limfocyty B i komórki NK). Za pomocą tej metody można oczyścić i przeanalizować komórki znakowane magnetycznie i fluorescencyjnie.

Oddzielenie subpopulacji komórek odpornościowych w próbkach krwi obwodowej od dzieci z mononukleozą zakaźną

Prezentowana tutaj jest technika oparta na cytometrii przepływowej, która pozwala na jednoczesny pomiar liczby podziałów komórkowych, fenotypu komórek powierzchniowych i pokrewieństwa komórkowego. Właściwości te można testować statystycznie przy użyciu struktury opartej na permutacjach.

Jednoczesna ocena pokrewieństwa, liczby podziału i fenotypu za pomocą cytometrii przepływowej dla hematopoetycznych komórek macierzystych i progenitorowych

Poznaj metodę sortowania przepływowego i sekwencjonowania egzomu komórek Reeda-Sternberga w klasycznym chłoniaku Hodgkina. Technika ta umożliwia uzyskanie wysokiej jakości DNA nowotworowego bez preamplifikacji.

Sortowanie przepływowe i sekwencjonowanie egzomu komórek Reeda-Sternberga klasycznego chłoniaka Hodgkina

Przeglądaj więcej filmów