Name: Ulepszone polimorfizm długości fragmentów restrykcyjnych reakcji łańcuchowej polimerazy Genotypowanie toksycznych rozdymek za pomocą chromatografii cieczowej/spektrometrii mas (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-09-20T08:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 34 s
Description: Poznaj ulepszoną metodę genotypowania toksycznych rozdymek za pomocą PCR-RFLP i chromatografii cieczowej ze spektrometrią mas. Technika ta zapewnia precyzyjną identyfikację gatunków i poprawia bezpieczeństwo żywnościowe.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Ta praca została wsparta przez Grant-in-Aid na badania naukowe od Japońskiego Towarzystwa Promocji Nauki (15K08060).

1. Ekstrakcja DNA
Uwaga: Użyj oddzielnego pomieszczenia do ekstrakcji DNA i badań post-PCR, takich jak elektroforeza żelowa i LC/ESI-MS. Dodać etanol do buforu 1 do przemywania (zawierającego chlorowodorek guanidyny) i buforu płuczącego 2 (niezawierającego chlorowodorku guanidyny) zgodnie z protokołem zestawu do ekstrakcji DNA. Próbki ryb uzyskano z hurtowni rybnych i rynków detalicznych w Japonii.
<ol>
	<li>Umieścić 30-50 mg tkanki rybnej w probówce mikrowirówkowej o pojemności 0,5 ml lub 1,5 ml. Zmiażdż tkankę za pomocą mikroszpatułki (z wyjątkiem płetwy i skóry). 
	Uwaga: W przypadku płetwy do namaczania należy użyć probówki o pojemności 0,5 ml.</li>
	<li>Dodać 180 μl buforu do lizy i 40 μl proteinazy K i krótko przetrząsnąć. Inkubować w temperaturze 56 °C na blokowym ogrzewaczu przez 2 godziny lub przez noc. Mieszać przez krótkie wirowanie co 15 minut podczas inkubacji. 
	Uwaga: Pełna liza nie jest konieczna.</li>
	<li>Wirować przez 5 minut przy 13 000 x g. Po odwirowaniu, jeśli na powierzchni znajduje się niewielka ilość oleju, w przypadku próbki tłuszczowej, takiej jak wątroba, należy ją wyrzucić. Przenieść supernatant do nowej probówki do mikrowirówki o pojemności 1,5 ml.</li>
	<li>Dodać 200 μl buforu chaotropowego zawierającego chlorowodorek guanidyny i wymieszać przez wirowanie. Dodać 200 μl etanolu (99,5%) i ponownie wymieszać, ponownie wirując.</li>
	<li>Przenieść mieszaninę do kolumny wirowej umieszczonej w probówce zbiorczej o pojemności 2 ml. Wirować przez 1 minutę przy 13 000 x g. Wyrzuć przepływ. 
	Uwaga: Nie dodawaj wybielacza do odpadów, ponieważ guanidyna może tworzyć wysoce reaktywne związki z wybielaczem.</li>
	<li>Dodać 500 μl buforu płuczącego 1 (zawierającego chlorowodorek guanidyny) i wirować przez 1 minutę przy 13 000 x g. Odrzucić przepływ i probówkę zbiorczą.</li>
	<li>Umieść kolumnę wirową w nowej probówce zbiorczej o pojemności 2 ml dostarczonej z zestawem. Dodać 500 μl buforu płuczącego 2 i wirować przez 3 minuty przy 20 000 x g. Wyrzucić przelew i probówkę zbiorczą. Przenieść kolumnę wirową do nowej probówki do mikrowirówki o pojemności 1,5 ml.</li>
	<li>Odpipetować 200 μl buforu elucyjnego do środka membrany kolumny wirowej. Po 1 minucie odwirować przez 1 minutę przy 6 000 x g.</li>
	<li>Odpipetować 50 μl eluatu do jednorazowej kuwety UV i zmierzyć widmo UV eluatu przy 220-300 nm oraz absorbancję przy 260 nm za pomocą spektrofotometru.</li>
	<li>Sprawdź widmo UV DNA ze szczytem przy 260 nm. Oblicz przybliżone stężenie DNA za pomocą prostego równania "Stężenie DNA (ng/μl) = absorbancja przy 260 nm x 50". 
	Uwaga: Typowe stężenie DNA ekstrahowanego z płetw rozdymki wynosi 63 ± 30 ng/μl (n = 20).</li>
	<li>Jeśli stężenie DNA jest wyższe niż 10 ng/μl, próbki DNA należy rozcieńczyć buforem Tris-EDTA (TE) (pH 8) do 5 ng/μl.</li>
	<li>Przechowywać próbkę w temperaturze -20 °C lub przystąpić do amplifikacji PCR (sekcja 2).</li>
</ol>
2. PCR
<ol>
	<li>Ustawić 25 μl PCR dla każdej wyekstrahowanej próbki DNA, kontrolę pozytywną (0,2 μM syntetyzowany oligonukleotyd o docelowej sekwencji w buforze TE o pH 8,0) i kontrolę ujemną (ultraoczyszczona woda zamiast próbki DNA) na lodzie zgodnie z tabelami 1 i 2 na czystej ławce, aby uniknąć zanieczyszczenia. 
	Uwaga: Aby ułatwić obsługę, przygotuj odpowiednią ilość koktajlu zawierającego wszystkie odczynniki bez matrycy DNA i dozuj go. Użyj polimerazy DNA o działaniu korektorskim, aby uniknąć dodawania zwisów 3' A do produktu PCR.</li>
	<li>Przeprowadzić amplifikację PCR na termocyklerze, korzystając z programu cyklu przedstawionego w Tabeli 3.</li>
</ol>
3. Trawienie enzymatyczne
<ol>
	<li>Do roztworu PCR dodać 2 μl roztworu zawierającego 100 mM Tris-HCl (pH 7,5), 100 mM MgCl2, 10 mM ditiotreitolu i 500 mM NaCl.</li>
	<li>Dodać po 1 μl każdego enzymu restrykcyjnego (Dra I i Msp I) i delikatnie wymieszać. Inkubować przez 30 minut w temperaturze 37 °C na termocyklerze.</li>
	<li>Inkubować przez 5 minut w temperaturze 72 °C w celu aktywacji pozostałej polimerazy DNA, która wypełnia lepki koniec wytworzony przez Msp I.</li>
	<li>Opcjonalnie: Analizować każde 2,5 μl roztworu reakcyjnego za pomocą elektroforezy w żelu poliakrylamidowym, stosując współczynnik usieciowania (%C, procent bisakryloamidu) wynoszący 3,33 (% wag.) i stężenie żelu poliakryloamidowego (%T) wynoszące 15 (% w/v)38. Wybarwić żel za pomocą fluorescencyjnego barwnika DNA i obserwować dwuniciowe DNA na transiluminatorze światła niebieskiego za pomocą bursztynowego ekranu.</li>
	<li>Przefiltrować roztwór reakcyjny za pomocą filtra odśrodkowego o średnicy 0,2-0,5 μm, aby zapobiec zatkaniu, które mogłoby uszkodzić kolumnę analityczną.</li>
	<li>Przenieść filtrat do stożkowej fiolki z polipropylenu i przechowywać w temperaturze -20 °C do czasu analizy.</li>
</ol>
4. Analiza LC/ESI-MS
<ol>
	<li>W butelce o pojemności 1 l odważyć 67,2 g (ok. 42 ml) HFIP i 1,52 g (ok. 2,0 ml) herbaty. Dodać 955 ml ultraoczyszczonej wody (klasa LC/MS) i mieszać za pomocą mieszadła magnetycznego, aż odczynniki całkowicie się rozpuszczą. Pobrać porcję roztworu i sprawdzić pH (między 7,85 a 7,95; najlepiej pH = 7,9) za pomocą pH-metru. 
	Uwaga: Nie wkładaj podwielokrotności do butelki, aby uniknąć zanieczyszczenia jonami metali. Jeśli pH nie wynosi 7,9, dodaj niewielką ilość HFIP lub herbaty, aby dostosować pH i ponownie zmierz pH.</li>
	<li>Podłączyć butelkę do linii A chromatografu cieczowego z chłodzeniem butelki za pomocą przenośnej lodówki z bezpośrednim chłodzeniem (do użytku domowego), aby zapobiec parowaniu. Podłącz kolejną butelkę wypełnioną metanolem do linii B.</li>
	<li>Podłączyć kolumnę ochronną i kolumnę analityczną (2,0 x 50 mm, wielkość mezoporów = 30 nm) do chromatografu cieczowego. Rozpocznij przepływ w początkowej fazie ruchomej (95% A i 5% B), aby zrównoważyć kolumny.</li>
	<li>Przygotować 0,5 mg/ml trifluorooctanu sodu (pH 3,5) w kalibrze39.
	<ol>
		<li>Odważyć 50 mg (ok. 34 μl) kwasu trifluorooctowego w zlewce.</li>
		<li>Dodać 30 ml ultraoczyszczonej wody i miareczkować do pH 3,5 za pomocą 10 mM wodorotlenku sodu za pomocą pH-metru.</li>
		<li>Napełnij do 50 ml ultraoczyszczoną wodą. Dodać 50 ml acetonitrylu (klasy LC/MS) i wymieszać.</li>
		<li>Weź porcję roztworu roboczego i przechowuj ją w temperaturze pokojowej. Pozostałą część roztworu przechowywać w temperaturze 4 °C.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Zmniejszyć ciśnienie azotu w syfonie C w następujący sposób. 
	Uwaga: Najnowsze spektrometry mas z transformacją Fouriera, które nadają się do analizy nienaruszonych białek, są wyposażone w oprogramowanie sterujące do kontroli ciśnienia.
	<ol>
		<li>Zdejmij lewą górną pokrywę spektrometru masowego. Zawór pułapki C znajduje się w rogu lewego pierwszego planu.</li>
		<li>Sprawdź wartość wysokiego podciśnienia w oknie stanu przyrządu w oprogramowaniu sterującym. 
		Uwaga: Wartość wynosi zazwyczaj 3 x 10−8 barów.</li>
		<li>Pociągnij pokrętło, aby odblokować i bardzo powoli obracaj pokrętło w kierunku przeciwnym do ruchu wskazówek zegara, aby zmniejszyć wysokie ciśnienie podciśnienia do 1/3 (zwykle 1 x 10−8 barów). Wskazane ciśnienie powinno zmieniać się stopniowo w sposób opóźniony. Zignoruj komunikat ostrzegawczy o niskim ciśnieniu. Naciśnij pokrętło, aby się zablokować.</li>
		<li>Przywróć górną pokrywę dla bezpieczeństwa.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Skalibrować spektrometr masowy za pomocą trifluorooctanu sodu39. 
	Uwaga: Codzienna kalibracja masy może zostać zastąpiona tym protokołem, jednak zalecana kalibracja sugerowana przez producenta powinna była zostać zakończona przed tą kalibracją.
	<ol>
		<li>Ustaw parametry skanowania i parametry podgrzewanego źródła ESI w skrzynce sterowniczej przyrządu oprogramowania strojeniowego w następujący sposób: typ skanowania pełny MS; zakres skanowania m/z 500-4,000; fragmentacja (napięcie dysocjacji wywołanej kolizją w źródle (CID) 60 eV; polaryzacja ujemna; cel automatycznej kontroli wzmocnienia (AGC) 1 x 106, maksymalny czas wtrysku 50 ms; natężenie przepływu gazu w osłonie 5; natężenie przepływu gazu pomocniczego 0; natężenie przepływu gazu wymiatającego 0; napięcie natrysku 3 kV; temperatura kapilary 320 °C; Poziom częstotliwości radiowej (RF) soczewki S 100; temperatura grzałki 30 °C.
		<ol>
			<li>Wprowadź listę jonów ujemnych do monitorowania jako m/z 792.85908, 1064.80870, 1336.75832, 1608.70794, 1880.65755, 2152.60717, 2424.55679, 2696.50640, 2968.45602, 3376.38045.</li>
		</ol>
		</li>
		<li>Przesuń podgrzaną sondę ESI bliżej interfejsu spektrometru mas (pozycja B). Połącz sondę i strzykawkę z rurką.</li>
		<li>Wstrzykiwać calibrant w sposób ciągły z natężeniem przepływu 10 μl/min za pomocą wbudowanej pompy strzykawkowej. Sprawdź tylko 6 jonów o niższej masie (m/z 792.85908-2152.60717) w dostosowanej tabeli kalibracyjnej.
		<ol>
			<li>Kontynuuj kalibrację po ustabilizowaniu się intensywności sygnałów. Po kalibracji sprawdź tylko sześć jonów o większej masie (m/z 1880.65755-3376.38045) i kontynuuj kalibrację. Unikaj kalibracji przy użyciu wszystkich jonów jednocześnie, aby uniknąć awarii.</li>
		</ol>
		</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Ustawić sondę w odpowiedniej pozycji dla natężenia przepływu 0,4 ml/min (pozycja D) i podłączyć do chromatografu cieczowego za pomocą rurki z metalu obojętnego.</li>
	<li>Ustaw parametry podgrzewanego źródła ESI w skrzynce sterowniczej przyrządu oprogramowania strojeniowego w następujący sposób: natężenie przepływu gazu w osłonie 50; natężenie przepływu gazu pomocniczego 15; natężenie przepływu gazu przemiatającego 1; napięcie rozpylania 2,5 kV; temperatura kapilary 350 °C; Obiektyw typu S o poziomie RF 100; temperatura grzałki 350 °C.</li>
	<li>Ustawić parametry akwizycji spektrometru mas w oknie ustawień instrumentalnych w następujący sposób: czas trwania metody 8 min; zawór przekierowujący, 3,5-6 min do spektrometru masowego, 0-3,5 i 6-8 min do marnotrawstwa; czas pracy 3,5 do 6 min; polaryzacja ujemna; napięcie CID źródła 15,0 eV; mikroskopy 3; nominalna moc rozdzielczości (przy m/z 200) 140 000; Tarcza AGC 1 x 106; maksymalny czas jonowania 50 ms; liczba skanów 1; Zakres skanowania m/z 700-3,500; Profil typu danych widma.</li>
	<li>Ustawić parametry chromatografu cieczowego w następujący sposób: temperatura pieca kolumnowego 20 °C; temperatura tacki na próbki 10 °C; program gradientu 0-0,5 min 5% B, 0,5-1 min 5-30% B, 1-3,5 min 30-40% B, 3,5-5 min 40-98% B, 5-6 min 98% B, 6-6,05 min 98-5% B, 6,05-8 min 5% B; natężenie przepływu 0,4 ml/min.</li>
	<li>Usuń bąbelki, stukając w dno fiolek. Umieść fiolki z próbkami na stojaku na próbki i wstrzyknij 1,0 μl próbki za pomocą automatycznego podajnika próbek, aby rozpocząć analizę.</li>
	<li>Otwórz pliki z surowymi danymi za pomocą oprogramowania przeglądarki i potwierdź, że wszystkie przejęcia zostały pomyślnie zakończone, w tym kontrole pozytywne i negatywne. 
	Uwaga: Zazwyczaj dwa lub trzy piki obserwuje się w chromatogramie całkowitego prądu jonowego w czasie retencji 4-5,5 min, gdy DNA rozdymki jest pomyślnie amplifikowane i trawione.</li>
</ol>
5. Dekonwolucja i interpretacja
<ol>
	<li>Uruchom oprogramowanie do dekonwolucji. Wybierz typ eksperymentu "auto extract (izotopowo rozdzielczy)".</li>
	<li>Edytuj metodę przy użyciu następujących parametrów: masa wyjściowa M; S/N próg 3, względny próg liczebności 0; ładunek ujemny tak; obliczać chromatogram prądu jonowego wyekstrahowanego (XIC) tak; zakres m/z 700-3 500; nośnik ładunku H+; minimalna liczba wykrytych ładunków: 3; nukleotyd o stosunku izotopów; współczynnik dopasowania 80%; pozostałą część 0%; Weź pod uwagę nakładanie się tak; zakres ładowania 3-50; minimalna intensywność 1; Oczekiwany błąd intensywności 3.
	<ol>
		<li>Zapisz jako nową metodę i wybierz ją.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Wybierz katalog, w którym znajdują się pliki danych pierwotnych. Wybierz pliki danych surowych do analizy i kliknij przycisk "Dodaj do kolejki".</li>
	<li>Kliknij przycisk "Uruchom" w zakładce "Uruchom kolejkę", aby rozpocząć dekonwolucję.</li>
	<li>Po zakończeniu kolejki wybierz wiersz i kliknij "Otwórz wynik" w górnym podpisie, aby uzyskać wyniki dekonwolucji.</li>
	<li>Zinterpretuj wyniki mas monoizotopowych wyprowadzonych z pików w czasie retencji 4-5,5 min, korzystając z tabeli 4.</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Do ekstrakcji DNA stosuje się komercyjny zestaw do ekstrakcji DNA z krwi i tkanek zgodnie z protokołem producenta z niewielkimi modyfikacjami (ilość proteinazy K i odwirowanie roztworu do lizy). Jednak każdy zestaw do ekstrakcji może być użyty, o ile DNA komórkowe może zostać wyekstrahowane z odpowiednim odzyskiem i czystością do PCR. Ta metoda została przetestowana przy użyciu mięśni, płetw, wątroby, jajnika i skóry37. Fin jest szczególnie odpowiedni ze względu na dużą powierzchnię, która umożliwia szybką lizę z proteinazą K. Próbki świeżych, mrożonych, suszonych, gotowanych i pieczonych rozdymek zostały pomyślnie przetestowane37.
Zestaw starterów PCR (Tabela 1) jest przeznaczony dla rozdymek i wzmacnia mitochondrialny gen 16S rybosomalnego RNA rozdymki. Docelowe DNA do amplifikacji to 114-115 pz (rodzaj Takifugu) i 86 pz (rodzaj Lagocephalus) (Tabela 5). Aby ułatwić opracowanie metody, jako odniesienie wykorzystano zsyntetyzowane oligonukleotydy o sekwencjach docelowych, zamiast zbierać autentyczne okazy rozdymki. Zestaw starterów może być zastąpiony innym zestawem starterów w odpowiedzi na cel, jednak końcowa długość DNA po trawieniu enzymatycznym powinna być mniejsza niż 100 nt pod względem utrzymania jakości widma masowego wymaganej do udanej dekonwolucji. Dodatkowo, ciśnienie azotu w pułapce C powinno być zmniejszone, gdy docelowy oligonukleotyd jest dłuższy niż około 75 nt, a jakość widma masowego jest niewystarczająca do pomyślnej dekonwolucji. Takie ograniczenia można kontrolować za pomocą najnowszych osiągnięć w oprogramowaniu przyrządu, w przeciwnym razie zawór pułapki C wewnątrz podwozia musi być dostrojony zgodnie z opisem w sekcji protokołu. Jeśli chodzi o przygotowanie próbki, użycie odczynników niezawierających detergentów ma kluczowe znaczenie dla późniejszego LC pod względem odpowiedniego kształtu piku, wystarczającej intensywności piku i stabilnego czasu retencji31.
Do analizy oligonukleotydów LC/ESI-MS zastosowano monolityczną kolumnę monolityczną kapilarną PS-DVB, kolumnę23,40,41 krzemionki z odwróconymi fazami C18 oraz kolumnę42 chromatografii oddziaływań hydrofobowych (HILIC). Wśród nich kapilarna kolumna monolityczna przewyższa inne pod względem zdolności separacji, jednak kapilarna kolumna monolityczna stosowana w poprzednich badaniach została wykonana we własnym zakresie i pracowała przy niskim natężeniu przepływu (2 μl/min), co wymaga oprzyrządowania dedykowanego do mikro LC. Aby ułatwić obsługę, dostępne na rynku kolumny oceniono pod kątem separacji długich oligonukleotydów przy wyższych prędkościach przepływu (100-400 μl/min). Trzy pary dupleksów DNA (26, 37 i 53 pz) oddzielono za pomocą wyżej wymienionych kolumn, jednak czasy cyklu kolumny krzemionki z wiązaniem C18 i kolumny monolitu PS-DVB wynosiły odpowiednio 65 i 70 min, podczas gdy kolumny monolitu krzemionkowego wiązanej C18 wynosiły 8 min (ryc. 1). Biorąc pod uwagę szybką analizę, kolumna monolityczna z krzemionki C18 została wybrana do naszych celów pomimo ograniczonej zdolności separacji; Jednakże pozostałe dwie kolumny mogą być zastosowane, gdy wymagana jest lepsza separacja. Teoretycznie w przypadku kolumny monolitycznej nie występuje objętość śródmiąższowa, a faza ruchoma byłaby zmuszona do przepływu przez pory fazy stałej przy zachowaniu stałej długości ścieżki, co umożliwiłoby skuteczną separację27. Takie procesy przejawiałyby się, szczególnie w analizie biomakrocząsteczek, takich jak oligonukleotyd, jako powolna dyfuzja dużych cząsteczek. Jedną z praktycznych zalet kolumny monolitycznej jest to, że ciśnienie wsteczne jest niższe niż w kolumnie z cząstkami krzemionki27. Pomimo wysokiego natężenia przepływu (400 μl/min) i niskiej temperatury kolumny (20 °C), maksymalne przeciwciśnienie systemu wynosiło 12,5 MPa37. Jest to pierwsza demonstracja zalet monolitu krzemionkowego z wiązaniem C18 do szybkiej analizy długiego oligonukleotydu. Ze względu na wysokie natężenie przepływu nie jest wymagany dedykowany przyrząd do mikro LC i precyzyjnego ustawiania na interfejsie. Zamiast tego wymagana jest podgrzana sonda ESI do dysocjacji dupleksu DNA i wspomagania jonizacji DNA, jak opisano później.
Chromatografia par jonowych jest powszechnie stosowana do rozdzielania oligonukleotydów zgodnego z MS. Jednak odczynnik par jonowych na ogół zakłóca proces ESI i zmniejsza czułość ESI-MS. Dlatego HFIP jest często stosowany w fazie ruchomej w celu poprawy wrażliwości oligonukleotydu. Jednak HFIP (temperatura wrzenia 59 °C) szybko odparowuje na granicy faz przed metanolem (temperatura wrzenia 65 °C), a zatem ta utrata rozpuszczalnika zwiększa pH i sprzyja dysocjacji odczynnika par jonowych (tj. TEA) od oligonukleotydu. Ponieważ obecna metoda wykorzystuje podgrzewaną sondę ESI, która nebulizuje eluat gorącym gazowym azotem w temperaturze 350 °C, efekt ten może być nadmiernie podkreślony. Zamiast buforu HFIP-TEA, Erb i Oberacher zalecili octan cykloheksylodimetyloamoniowy (CycHDMAA; pH 8,4) do analizy genotypowania ze względu na zmniejszenie tworzenia adduktów z jonami metali śladowych33. Autorzy wywnioskowali, że CycHDMAA sam w sobie hamował tworzenie się adduktu metalu. Wbrew literaturze przedmiotu w niniejszej metodzie nie zaobserwowano istotnego powstawania adduktów. Dodatkowo, godną uwagi zaletą systemu HFIP-TEA-metanol jest to, że powierzchnia piku uzyskana za pomocą systemu HFIP-TEA-metanol była 17 razy większa niż uzyskana z systemu CycHDMAA-acetonitryl podczas analizy amplikonu 86 pz T. poecilonotus (dane nie pokazane). Jedną z wad systemu HFIP-TEA-metanol jest jednak zwiększony koszt w stosunku do systemu CycHDMAA-acetonitryl.
Obliczanie masy monoizotopowej wymaga rozdzielenia pików izotopowych jonów o wielokrotnym ładunku. W związku z tym rozdzielczość ma kluczowe znaczenie dla niniejszej analizy. Chociaż wymagana moc rozdzielcza zależy od długości pary zasad analitu, konwencjonalne analizatory TOF, które mają moc rozdzielczą rzędu kilkudziesięciu tysięcy, mogą być ograniczone do analizy krótkich oligonukleotydów.
Teoretyczne masy monoizotopowe przedstawione w tabeli 4 obliczono na podstawie odpowiednich składów zasadowych analitów. Alternatywnie, Muddiman i wsp. Opracowano aplikację do obliczania składu podstawowego na podstawie dokładnej masy43. Podobny program został zintegrowany ze zautomatyzowanym systemem ESI-MS16-18. Zastosowanie tych algorytmów może poprawić niezawodność obecnej metody, ponieważ zmierzona masa monoizotopowa nie zawsze odpowiada unikalnemu składowi zasadowemu ze względu na tolerancję masy wynoszącą 3 ppm wynikającą z nieuniknionego błędu pomiaru. Niestety, nie udało nam się uzyskać tych produktów oprogramowania do niniejszego badania.
Obecne monoizotopowe oznaczanie gatunków na podstawie masy może być odpowiednie nie tylko do różnicowania rozdymki, ale także do wykrywania innych polimorfizmów DNA, ponieważ obecna metoda opiera się na analizie składu zasad i nie obejmuje procedury specjalnie zaprojektowanej dla rozdymki. Jeśli chodzi o wykrywanie polimorfizmu DNA, dedykowany system ESI-MS jest w pełni zautomatyzowany i łatwy w obsłudze, co może być odpowiednie do zastosowań diagnostycznych, takich jak wykrywanie patogenów15,17,18,20,30. Z drugiej strony, obecna metoda jest wykonalna przy użyciu powszechnie stosowanych instrumentów i aparatury badawczej, a zatem nadaje się do zastosowań badawczych. ESI-MS został już zastosowany do polimorfizmu ludzkiego DNA, takiego jak polimorfizm pojedynczego nukleotydu13,28,32, krótkie powtórzenia tandemowe26 i analsis mitochondrialnego DNA16,19. Mikro RNA analizowano również za pomocą kapilarnego LC/ESI-MS44. Te opublikowane aplikacje mogą być również realizowane za pomocą obecnej metody. Ponadto metoda ta może być odpowiednia do monitorowania interakcji między oligonukleotydami a związkami o niskiej masie cząsteczkowej, takimi jak oddziaływanie antybiotyków i rybosomalnego RNA45 ze względu na separację w niskiej temperaturze. W takich przypadkach oligonukleotydy i związki o niskiej masie cząsteczkowej powinny być wykrywane jednocześnie, co jest zaletą stosowania LC/ESI-MS.
Istnieje ograniczenie polegające na tym, że oprzyrządowanie nie nadaje się do wykonywania analizy równoległej, jak w przypadku konwencjonalnych technik, takich jak sekwencjonowanie Sangera i PCR w czasie rzeczywistym. Ponadto obecna metoda identyfikuje tylko skład zasad i nie można rozróżnić żadnego podstawienia zasad w tej samej cząsteczce. Jednak opisana tutaj analiza DNA oparta na stwardnieniu rozsianym może nadal mieć zalety pod względem dokładności w porównaniu z technikami opartymi na barwniku wiążącym DNA, takimi jak elektroforeza żelowa i PCR w czasie rzeczywistym.

Spektrometria mas (MS) jest akceptowaną technologią szybkiej i niezawodnej identyfikacji kwasów nukleinowych, desorpcja/jonizacja laserowa wspomagana matrycą (MALDI) i jonizacja elektronrozpylania (ESI) są używane do jonizacji1,2. Technika MALDI jest zwykle łączona z analizatorem czasu przelotu (TOF); jednak zastosowanie MALDI-TOF MS jest ograniczone do krótkich oligonukleotydów (~25 nukleotydów (NT)) ze względu na późniejszą fragmentację, tworzenie adduktów i niską wydajność jonizacji1,2. W przeciwieństwie do tego, ESI ma zastosowanie do dłuższych oligonukleotydów (>100 nt), ale wiele stanów naładowania wielu naładowanych jonów ([M−nH]n−) jest wytwarzanych jednocześnie z biomakrocząsteczek i dlatego masa analitu może przekroczyć górną granicę zakresu m/z spektrometru. Wymaga to interpretacji widm splotowych, tj. przemiany szeregu stanów naładowania na odpowiadającą mu masę poprzez dekonwolucję.
W przypadku pomiaru masy małej cząsteczki, szczyt masy monoizotopowej, tj. masa cząsteczki zawierającej tylko najpowszechniejszy izotop każdego pierwiastka jest najobfitszy i obserwowany naturalnie3. Wraz ze wzrostem masy cząsteczkowej rozkład izotopowy przesuwa się do wyższego m/z, a pik monoizotopowy zostaje przesłonięty przez szum linii podstawowej3-5. Gdy pik monoizotopowy nie jest już wykrywalny dla mas większych niż 10kDa3, do pomiaru stosuje się średnią masę cząsteczkową, a nie masę monoizotopową5. W takich przypadkach rozkład izotopowy, w którym każdy z pojedynczych pików jest oddzielony 1 Da, można zaobserwować tylko wtedy, gdy do analizy używany jest analizator masy o wysokiej rozdzielczości, taki jak TOF, analizator pułapek Kingdonazmodyfikowany transformacją Fouriera 6 lub analizator rezonansu cyklotronowego jonów z transformacją Fouriera. Jednak najliczniejszy pik czasami nie jest zgodny ze średnią masą cząsteczkową5. Problemy te mogą prowadzić do trudności w dokładnym określeniu analitów.
Biorąc pod uwagę różnice w naturalnej obfitości stabilnych izotopów i trudności w określeniu średniej masy cząsteczkowej, pomiar masy monoizotopowej jest idealny do charakterystyki masy biomolekuł3,4. W praktyce, niezależnie od tego, czy można zaobserwować pik monoizotopowy, czy nie, masę monoizotopową można oszacować, porównując wzór obserwowanego rozkładu izotopowego z teoretycznym obliczonym z modelowego analitu4,7-10. Algorytm dopasowania8 jest teraz włączony do zastrzeżonego oprogramowania.
W kontekście ESI-MS, dysocjacja dupleksu DNA, oczyszczanie i odsalanie są wymagane do bezpośredniego pomiaru, aby uniknąć niepowodzenia jonizacji z powodu tłumienia jonów i tworzenia adduktów2,10-14. Procedury te są kłopotliwe, jednak w pełni zautomatyzowane systemy analityczne zostały opracowane komercyjnie z udziałem reakcji łańcuchowej polimerazy (PCR), przygotowania próbek i ESI-MS do wykrywania patogenów15-20. Innym podejściem jest wprowadzenie chromatografii cieczowej (LC) do separacji. LC zapewnia separację analityów on-line od substancji współistniejących i nie wymaga pracochłonnego przygotowania próbki przed jonizacją21,22. Jednak oddzielenie kwasów nukleinowych za pomocą fazy ruchomej zgodnej z MS jest trudniejsze niż w przypadku większości innych związków, takich jak leki, peptydy i białka, ze względu na polianionowy charakter nukleotydów. Najbardziej udanymi przykładami LC/ESI-MS jest zastosowanie LC z odwróconą fazą jonową. Faza ruchoma 1,1,1,3,3,3-heksafluoro-2-propanolu (HFIP)-trietyloaminy (TEA)-metanolu została początkowo zaproponowana przez Apffel i in. do separacji i wykrywania krótkich oligonukleotydów23. Zastosowanie genotypowania LC/ESI-MS do różnicowania gatunków patogenów, polimorfizmów pojedynczego nukleotydu i krótkich powtórzeń tandemowych opisano przy użyciu kapilarnej kolumny polimer-monolit, która może oddzielać dłuższe oligonukleotydy1,21,24-33.
W Japonii i Stanach Zjednoczonych doszło do poważnego zatrucia pokarmowego z powodu błędnej identyfikacji i niewłaściwego przygotowania rozdymki, i to pomimo faktu, że dystrybucja i przygotowanie rozdymki jest ściśle kontrolowane przez przepisy dotyczące bezpieczeństwa żywności34,35. Co więcej, w Japonii doszło do umyślnego zabójstwa z użyciem ekstraktu z rozdymki36. W związku z tym rozdymka jest wymagana zarówno z punktu widzenia zdrowia publicznego, jak i dochodzeń sądowych. Ponadto, ze względu na to, że Takifugu rubripes jest znacznie droższy niż inne rodzaje rozdymki, w kontekście dochodzeń w sprawie fałszowania żywności potrzebna jest również zdolność do różnicowania.
Tutaj opisana jest szczegółowa metoda określania monoizotopowej masy produktu PCR za pomocą LC/ESI-MS przy użyciu monolitu krzemionkowego o odwróconej fazie i spektrometru mas o wysokiej rozdzielczości. W szczególności podejście to zostało opracowane, aby umożliwić różnicowanie toksycznych gatunków rozdymkowatych w oparciu o zastosowanie metody polimorfizmu długości fragmentów restrykcyjnych PCR (RFLP)37, która jest pierwszym przykładem różnicowania gatunkowego zwierząt za pomocą MS.

<table><tbody><tr><td>DNeasy Krew & Zestaw tkanek (50)</td><td>Qiagen</td><td>69504</td><td>Zestaw do ekstrakcji DNA</td></tr><tr><td>Proteinaza K</td><td>Qiagen</td><td>19131</td><td></td></tr><tr><td>Etanol (99,5+ obj.)</td><td>Wako</td><td>054-07225</td><td>Do rozcieńczania płuczących</td></tr><tr><td>Bufor TE (pH 8,0)</td><td>Wako</td><td>310-90023</td><td>Do rozcieńczania próbki DNA</td></tr><tr><td>Starter PCR</td><td>Fasmac</td><td>NA</td><td>Oczyszczony przez dostawcę z kolumną z wkładem z odwróconymi fazami</td></tr><tr><td>Matryca DNA</td><td>Eurofins Genomics</td><td>NA</td><td>Oczyszczona metodą HPLC przez dostawcę</td></tr><tr><td>Ultraoczyszczona woda</td><td>NA</td><td>NA</td><td>Generowana za pomocą systemu oczyszczania wody Milli-Q Direct (Merck Millipore), używanego do przygotowania próbki</td></tr><tr><td>Bez detergentów 5x Phusion HF Buffer</td><td>Thermo Fisher</td><td>F-520L</td><td>Użyj zamiast dostarczonego buforu polimerazy DNA</td></tr><tr><td>Pfu-X Polimeraza DNA</td><td>Jena Bioscience</td><td>Mieszanka PCR-207S</td><td></td></tr><tr><td>dNTP (po 20 mM)</td> <td>Jena Bioscience</td><td>NA</td><td>Dostarczana z polimerazą DNA</td></tr><tr><td>10 i razy; Uniwersalny bufor M</td><td>Takara Bio</td><td>NA</td><td>Zawierający 100 mM Tris-HCl (pH 7,5), 100 mM MgCl2, 10 mM ditiotreitol i 500 mM NaCl</td></tr><tr><td>Dra I</td><td>Thermo Fisher</td><td>FD0224</td><td>Enzym restrykcyjny</td></tr><tr><td>Msp I</td><td>Thermo Fisher</td><td>FD0544</td><td>Enzym restrykcyjny</td></tr><tr><td>1,1,1,3,3,3-heksafluoro-2-propanol (HFIP)</td><td>Fluka</td><td>42060-50ML</td><td>Dodatek eluentowy do klasy LC-MS.</td></tr><tr><td>Trietyloamina (HERBATA)</td><td>Fluka</td><td>65897-50ML</td><td>Dodatek eluentowy do klasy LC-MS.</td></tr><tr><td>Kwas trifluorooctowy</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T6508</td><td>Do przygotowania kalibru.</td></tr><tr><td>Wodorotlenek sodu (1,0 M)</td><td>Fluka</td><td>72082</td><td>Rozcieńczyć do 10 mM ultraoczyszczoną wodą i użyć do miareczkowania kwasu trifluorooctowego.</td></tr><tr><td>Acetonitryl</td><td>Fluka</td><td>34967</td><td>Do przygotowania kalibru LC/MS.</td></tr><tr><td>Metanol</td><td>Kanto</td><td>25185-76</td><td>Do fazy ruchomej, klasa LC / MS.</td></tr><tr><td>Woda</td><td>Thermo Fisher</td><td>W6-1</td><td>Do fazy ruchomej, klasa LC / MS.</td></tr><tr><td>Probówka do mikrowirówek (0,5 ml)</td><td></td>Probówka do mikrowirówek <td>Eppendorf</td> 0030123301 <td>PCR clean grade</td></tr><tr><td>(1,5 ml)</td><td>Eppendorf</td><td>0030123328</td><td>PCR clean</td></tr><tr><td>grade UVette</td><td>Eppendorf</td><td>0030106300</td><td>Jednorazowa kuweta UV.</td></tr><tr><td>Gel Green</td><td>Biotium</td><td>41004</td><td>Fluorescencyjne barwienie DNA</td></tr><tr><td>Cosmospin filter G (0,2 &mu; m)</td> <td>Nakalai Tesque</td><td>06549-44</td><td>Wykonany z hydrofilowej membrany z politetrafluoroetylenu (PTFE). Dowolna odśrodkowa jednostka filtrująca (wielkość porów, 0,2 cala; 0,5 &mu; m) wykonane z hydrofilowego PTFE lub innej membrany o niskim poziomie wiązania.</td></tr><tr><td>300 &mu; l Fiolka z zakrętką PP</td><td>Amerykańskie materiały chromatograficzne</td><td>V0309P-1232</td><td></td></tr><tr><td>Wstępnie zmontowana nakrętka i kolumna analityczna</td><td>septa Finneran</td><td>5395-09R</td><td></td></tr><tr><td>Monobis C18 (2,0 i razy; 50 mm, wielkość mezoporów = 30 nm)</td><td>Kyoto Monotech</td><td>2050H30ODS</td><td>Poza Japonią, dostępne do zakupu w GL Sciences za pośrednictwem jej dystrybutorów. (http://www.glsciences.com/distributors/)</td></tr><tr><td>Kolumna ochronna Monobis C18</td><td>Kyoto Monotech</td><td>GCSET-ODS3210</td><td>Uchwyt w komplecie.</td></tr><tr><td>Cadenza CW-C18 (3,0 razy; 250 mm)</td><td>Imtakt</td><td>CW036</td><td>C18-bonded kolumna krzemionkowa</td></tr><tr><td>ProSwift RP-4H (1,0&razy; 250 mm)</td><td>Thermo Fisher</td><td>066640</td><td>Monolityczna kolumna z poli(styrenu-diwinylobenzenu)</td></tr><tr><td>Themo Mixer C</td><td>Eppendorf</td><td>5382 000.023</td><td>Do trawienia tkanek ryb.</td></tr><tr><td>Spektrofotometr</td><td>Shimadzu</td><td>UV-3150</td><td>Kwantyfikacja stężenia DNA.</td></tr><tr><td>Termocykler</td><td>Bio-Rad</td><td>T100</td><td></td></tr><tr><td>Przenośna lodówka</td><td>Twinbird</td><td>D-CUBE</td><td>Do wodnej fazy ruchomej, aby uniknąć parowania HFIP. Można go zastąpić pojemnikiem na lód.</td></tr><tr><td>Chromatograf cieczowy Ultimate 3000</td><td>Thermo Fisher</td><td>NA</td><td></td></tr><tr><td>Q Exactive spektrometr masowy</td><td>Thermo Fisher</td><td>NA</td><td>Spektrometr mas z transformacją Fouriera wyposażony w zmodyfikowany analizator pułapek Kingdona.</td></tr><tr><td>Dekonwolucja białek 3.0</td><td>Thermo Fisher</td><td>NA</td><td>Użyj wersji 3.0 lub nowszej z izotopowym modelem wzoru nukleotydu.</td></tr></tbody></table>

ulepszone polimorfizm długości fragmentów restrykcyjnych reakcji łańcuchowej polimerazy genotypowanie toksycznych rozdymek za pomocą chromatografii cieczowej/spektrometrii mas

Improved Polymerase Chain Reaction-restriction Fragment Length Polymorphism Genotyping of Toxic Pufferfish by Liquid Chromatography/Mass Spectrometry

Opisana jest ulepszona wersja metody polimorfizmu długości fragmentów ograniczających reakcję łańcuchową polimerazy (PCR) do genotypowania toksycznych gatunków rozdymek za pomocą chromatografii cieczowej/spektrometrii mas z jonizacją elektrorozpylania (LC/ESI-MS). Ekstrakcję DNA przeprowadza się za pomocą zestawu do ekstrakcji DNA na bazie błony krzemionkowej. Po amplifikacji PCR przy użyciu buforu PCR bez detergentów, do roztworu dodaje się enzymy restrykcyjne bez oczyszczania roztworu reakcyjnego. Kolumna monolitu krzemionkowego z odwróconymi fazami i spektrometr masowy o wysokiej rozdzielczości z transformacją Fouriera ze zmodyfikowanym analizatorem pułapek Kingdona są stosowane odpowiednio do separacji i wykrywania. Faza ruchoma, składająca się z 400 mM 1,1,1,3,3,3-heksafluoro-2-propanolu, 15 mM trietyloaminy (pH 7,9) i metanolu, jest dostarczana z natężeniem przepływu 0,4 ml/min. Czas cyklu dla analizy LC/ESI-MS wynosi 8 minut łącznie z równoważeniem kolumny. Oprogramowanie dekonwolucyjne posiadające model rozkładu izotopów oligonukleotydu służy do obliczania odpowiedniej masy monoizotopowej ze spektrum masowego. W przypadku analizy oligonukleotydów (zakres 26-79 nukleotydów) dokładność masy wynosiła 0,62 ± 0,74 ppm (n = 280), a doskonała dokładność i precyzja utrzymywały się przez 180 godzin bez użycia wzorca masy LOCK.

Oceniono trzy dostępne komercyjnie kolumny pod kątem rozdziału długich oligonukleotydów przy prędkościach przepływu od 10-400 µl/min. Porównano kolumnę z krzemionką cząsteczkową z wiązanymi grupami oktadecylu (C18) o szerokich porach (a), dostępną komercyjnie kolumnę monolityczną z poli(styren-diwinylobenzenem) (PS-DVB) (b) oraz kolumnę monolityczną z krzemionką z wiązanymi grupami C18 (Ryc. 1). Trzy pary dupleksów DNA (26, 37 i 53 bp) rozdzielono przy użyciu wszystkich kolumn, a w dalszych badaniach wykorzystano kolumnę monolityczną z krzemionką z wiązanymi grupami C18.
Reprezentatywne wyniki analizy próbki DNA wyizolowanego z mięśnia T. rubripes przedstawiono na Ryc. 2. Do prawidłowego obliczenia masy monoizotopowej niezbędne są piki z rozdzielczością izotopową, co pokazano na Ryc. 2a. Teoretyczna i zmierzona masa monoizotopowa T. rubripes przedstawione są na Ryc. 2b. Ponieważ trawienie endonukleazami przeprowadzono bezpośrednio po amplifikacji PCR bez oczyszczania, lepki koniec 3ʹ wygenerowany przez endonukleazę Msp I został dopełniony przez pozostałą polimerazę DNA. Zgodnie z analizą amplikonów pochodzących z syntetycznych matryc DNA, dokładność masy wynosiła od -2,48 do 2,40 ppm (średnio 0,62 ± 0,74 ppm, n = 280). W związku z tym do rozróżniania gatunków zastosowano tolerancję masy wynoszącą 3 ppm (Tabela 4). Korzystając z tabeli, wszystkie próbki ryb kulejników pozyskane z targów i sklepów zostały prawidłowo zidentyfikowane jako konkretne gatunki37.
Zgodnie z okresową analizą próbki uzyskanej z syntetycznego matrycowego DNA T. chrysops, wszystkie masy monoizotopowe analitów zostały pomyślnie określone z dokładnością do ± 3 ppm przez co najmniej 180 hr bez żadnej kalibracji masy (Rysunek 3). Oznacza to, że kalibracja masy byłaby wymagana raz w tygodniu.
<img alt="Wykres chromatograficzny porównujący kolumny krzemionkowe i monolityczne, przedstawiający rozdział fragmentów DNA." src="/files/ftp_upload/54402/54402fig1.jpg" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Rysunek 1"> 
Rysunek 1: Chromatogramy całkowitego prądu jonowego produktu PCR-RFLP otrzymanego z syntetycznego matrycowego DNA T. pardalis przy użyciu C18kolumna z krzemionką z wiązaniami (a, 3×250 mm, rozmiar cząstek 3 µm), monolityczną kolumnę polistyren-diwinylobenzenową (PS-DVB) (b, 1,0×250 mm) oraz C18-wiązana monolityczna kolumna krzemionkowa (c, zastosowana metoda). Warunki dla (a): szybkość przepływu 0,2 ml/min; gradient metanolu: 0–2 min 5%, 2–5 min 5%–25%, 5–20 min 25%–40%, 20–35 min 40%–98%, 35–50 min 98%, 50–51 min 98%–5%, 51–65 min 5%. Warunki dla (b): szybkość przepływu 0,1 ml/min; gradient metanolu: 0–2 min 5%, 2–5 min 5%–25%, 5–35 min 25%–40%, 35–40 min 40%–98%, 40–55 min 98%, 55–56 min 98%–5%, 56–70 min 5%. Temperatura dla obu kolumn wynosiła 20 °C. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54402/54402fig1large.jpg" target="_blank">Aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny, kliknij tutaj.</a>
<img alt="Chromatogram całkowitego prądu jonowego, widmo mas oraz schemat analizy DNA przedstawiający wyniki dekonwolucji i masy monizotopowej." src="/files/ftp_upload/54402/54402fig2.jpg" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Rysunek 2"> 
Rycina 2: Reprezentatywne wyniki analizy surowego mięśnia z T. rubripes. (a) Typowe chromatogramy całkowitego prądu jonowego oraz widmo masowe. (b) Teoretyczne i zmierzone masy monoizotopowe produktów PCR-RFLP pochodzących z syntetycznego szablonu DNA T. rubripes. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54402/54402fig2large.jpg" target="_blank">Proszę kliknąć tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.</a>
<img alt="Wykres dokładności masy w funkcji czasu, analiza danych chromatograficznych, 79 nt i 37 nt naprzód, wstecz." src="/files/ftp_upload/54402/54402fig3.jpg" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Rysunek 3"> 
Rysunek 3: Test stabilności. strawione amplikony pochodzące z syntetycznego DNA T. chrysops analizowano co 10 h. Podczas badania nie przeprowadzano kalibracji masy. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54402/54402fig3large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej figury.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Nazwa</td>
			<td>Sekwencja</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>lago86F</td>
			<td>5ʹ-CCATGTGGAATGAAAACACC-3ʹ</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>taki14F</td>
			<td>5ʹ-AAAAACAAGCCACAGCTAA-3ʹ</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>fugu86-14R</td>
			<td>5ʹ-CCCTAGGGTAACTCGGTTCG-3ʹ</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
Tabela 1: Primery PCR.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>odczynnik do PCR</td>
			<td>Objętość użyta</td>
			<td>Stężenie końcowe</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Woda ultraczysta</td>
			<td>15.75 μl</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bufor 5x bez detergentu</td>
			<td>5.0 μl</td>
			<td>1x</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>mieszanina dNTP (po 10 mM każdego)</td>
			<td>0.5 μl</td>
			<td>0,2 mM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>mieszanina starterów (10 μM po jednej porcji z każdego z primerów lago86F, taki14F i fugu86-14R w buforze TE o pH 8,0)</td>
			<td>1.0 μl</td>
			<td>0.4 μM każdy</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>polimeraza DNA (2,5 j/μl)</td>
			<td>0.25 μl</td>
			<td>0,1 j/μl</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNA matrycowy w buforze TE pH 8,0 (5,0–10 ng/μl dla wyekstrahowanej próbki, 0.2 μM (dla syntetycznego DNA jako kontroli pozytywnej)</td>
			<td>2.5 μl</td>
			<td>0,5-1,0 ng/μl dla wyekstrahowanego DNA oraz 20 nM dla syntetycznego DNA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td>Suma: 25 μl</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
Tabela 2: Składniki reakcji PCR w skali 25 µl.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Cykl</td>
			<td>Warunki</td>
			<td>Funkcja</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1</td>
			<td>2 min w temp. 95 °C</td>
			<td>Wstępna denaturacja</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2</td>
			<td>30 s w 95 °C</td>
			<td>Denaturacja</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3</td>
			<td>30 s w temp. 56 °C</td>
			<td>Wyżarzanie</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4</td>
			<td>30 s w temp. 72 °C</td>
			<td>Elongacja</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5</td>
			<td>Powtórzyć kroki 2–4 (łącznie 30 cykli)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6</td>
			<td>7 min w temp. 72 °C</td>
			<td>Końcowa elongacja</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>7</td>
			<td>Utrzymać w temperaturze 12 °C do momentu usunięcia próbki</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
Tabela 3: Program PCR.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td rowspan="2">Numer piku w czasie retencji 4,0–5,5 min</td>
			<td colspan="2">Masa monoizotopowa trzeciego piku w zakresie (Da)</td>
			<td colspan="2">Masa monoizotopowa drugiego piku w zakresie (Da)</td>
			<td rowspan="2">Gatunki ryb kulawych</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Krótsza nić</td>
			<td>Dłuższa nić</td>
			<td>Krótsza nić</td>
			<td>Dłuższa nić</td>
		</tr>
		<tr>
			<td rowspan="5">2</td>
			<td rowspan="5">→</td>
			<td rowspan="5">→</td>
			<td>15890.707–15890.803</td>
			<td>16177.531–16177.629</td>
			<td>L. inermis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15921.702–15921.797</td>
			<td>16146.537–16146.634</td>
			<td>L. gloveri</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15930.713–15930.809</td>
			<td>16137.525–16137.622</td>
			<td>L. lunaris</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15937.697–15937.792</td>
			<td>16131.537–16131.634</td>
			<td>*L. wheeleri*</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>24173.034–24173.179</td>
			<td>24566.905–24567.053</td>
			<td>T. chrysops</td>
		</tr>
		<tr>
			<td rowspan="6">3</td>
			<td rowspan="2">16295.706–16295.804</td>
			<td rowspan="2">16467.610–16467.709</td>
			<td>11341.851–11341.919</td>
			<td>11466.875–11466.944</td>
			<td>T. pardalis 
			T. snyderi 
			T. ocellatus 
			T. xanthopterus 
			*T. stictonotus*</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>11654.908–11654.978</td>
			<td>11770.920–11770.991</td>
			<td>T. niphobles</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>16296.701–16296.799</td>
			<td>16468.605–16468.704</td>
			<td>→</td>
			<td>→</td>
			<td>T. rubripes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>16311.701–16311.799</td>
			<td>16452.610–16452.709</td>
			<td>→</td>
			<td>→</td>
			<td>T. poecilonotus 
			*T. exascurus*</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>16320.713–16320.811</td>
			<td>16443.599–16443.697</td>
			<td>→</td>
			<td>→</td>
			<td>T. porphyreus 
			T. obscurus</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>16599.751–16599.851</td>
			<td>16780.667–16780.767</td>
			<td>→</td>
			<td>→</td>
			<td>T. vermicularis</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
Tabela 4: Różnicowanie ryb kulawych na podstawie mas monoizotopowych uzyskanych z LC/ESI-MS.
<img alt="Wyniki sekwencjonowania DNA; dane tabelaryczne; sekwencje specyficzne dla gatunku; analiza długości amplifikowanego DNA." src="/files/ftp_upload/54402/54402tbl5.jpg" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="tabela 5"> 
Tabela 5: Amplifikowana sekwencja DNA. (a) Sekwencja jest identyczna z sekwencją innych gatunków ryb kulowatych, jak opisano w Tabela 4. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54402/54402tbl5large.jpg" target="_blank">Prosimy kliknąć tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej tabeli.</a>

Opisana jest ulepszona metoda polimorfizmu długości fragmentów ograniczających reakcję łańcuchową polimerazy do genotypowania gatunków rozdymek za pomocą chromatografii cieczowej/spektrometrii mas. Kolumna monolitu krzemionkowego z odwróconymi fazami służy do oddzielania strawionych amplikonów. Metoda ta może wyjaśnić monoizotopowe masy oligonukleotydów, co jest przydatne do identyfikacji składu zasadowego.

Ulepszone polimorfizm długości fragmentów restrykcyjnych reakcji łańcuchowej polimerazy Genotypowanie toksycznych rozdymek za pomocą chromatografii cieczowej/spektrometrii mas

An improved version of a polymerase chain reaction (PCR)-restriction fragment length polymorphism (RFLP) method for genotyping toxic pufferfish species by ...

Ogólnym celem tego eksperymentu jest przeprowadzenie szybkiego i dokładnego genotypowania toksycznych ryb z rodziny ryb kulistych poprzez analizę krótkich amplikonów PCR. Jadalna część ryb kulistych wykorzystywanych do przygotowania potraw różni się w zależności od gatunku, a niektóre z nich zawierają toksyny w całym organizmie. Wykorzystanie mięśni, bazy danych, mięśni i płetw oraz skóry ryb kulistych może pomóc w ich genotypowaniu z punktu widzenia pełnego bezpieczeństwa żywności dla wszystkich oraz w celach badawczych.Aby przeprowadzić ekstrakcję DNA przy użyciu zestawu, należy najpierw umieścić od 30 do 50 mg tkanki rybiej w probówce do mikrocentryfugi o pojemności 0,5 lub 1,5 ml. Rozgnieść tkankę, unikając płetw i skóry, używając mikroszpatułki. Dodać 180 µL buforu do lizy tkanek zwierzęcych oraz 40 µL proteinazy K, a następnie krótko wymieszać na wirówce typu vortex.Inkubować w temperaturze 56 °C w bloku grzewczym przez dwie godziny lub przez noc. Odwirować próbkę przez pięć minut przy 13000×g. Po przeniesieniu supernatantu do nowej probówki mikrocentryfugowej o pojemności 1,5 ml dodać 200 µl buforu chaotropowego zawierającego chlorek guanidyny z zestawu.Następnie należy dodać 200 µL 99,5% etanolu i wymieszać za pomocą wortexa. Mieszaninę, wraz z ewentualnym osadem, przenosi się do kolumny wirówkowej umieszczonej w probówce do zbierania o pojemności 2 mL. Po wirowaniu przez jedną minutę przy 13000×g odrzuca się filtrat.Dodaj 500 µL buforu do płukania 1, zawierającego hydrochlorurowy guanidynę z zestawu, i odwiruj w ten sam sposób co wcześniej. Odrzuć przefiltrowany płyn oraz probówkę zbiorczą. Umieść kolumnę wirową w nowej probówce zbiorczej o pojemności 2 mL dołączonej do zestawu.Dodaj 500 µL buforu płuczącego dwa i wiruj przez trzy minuty przy 20 000×g. Po odlaniu filtratu i wyrzuceniu probówki zbiorczej przenieś kolumnę do nowej probówki wirówkowej o pojemności 1,5 ml. Nanieś pipetą 200 µL buforu elucyjnego na środek membrany kolumny.Po jednej minucie wiruj przez jedną minutę przy 6000xg. Następnie pipetuj 50 µL aluetu do jednorazowej kuwety ultrafioletowej. Za pomocą spektrofotometru zmierz widmo ultrafioletowe aluetu w zakresie od 220 do 300 nm oraz absorbancję przy 260 nm.Stosowanie odczynników wolnych od detergentów jest kluczowe dla powodzenia chromatografii cieczowej, ponieważ odczynniki te mogą doprowadzić do uszkodzenia kolumny analitycznej. Pracując w komorze z laminarnym przepływem powietrza w celu uniknięcia kontaminacji, przygotuj na lodzie reakcję PCR o objętości 25 µL dla każdej próbki wyekstrahowanego DNA, kontroli pozytywnej oraz kontroli negatywnej, zgodnie z opisem w protokole tekstowym. Dla ułatwienia pracy przygotuj odpowiednią ilość koktajlu zawierającego wszystkie odczynniki bez matrycowego DNA, a następnie go wydziel.Należy użyć polimerazy DNA posiadającej aktywność korekcyjną, aby uniknąć dodawania trójpodstawowych nadwiszących końców adeninowych do produktu PCR. Amplifikację PCR należy przeprowadzić w termocyklerze zgodnie z programem cykli przedstawionym w protokole tekstowym. Aby przeprowadzić trawienie enzymatyczne, należy dodać dwa microliters buforu do trawienia enzymatycznego do roztworu PCR.Dodaj jeden µL każdego enzymu restrykcyjnego i delikatnie wymieszaj. Próbkę inkubuj przez 30 minut w temperaturze 37 °C w termocyklerze, a następnie przez pięć minut w temperaturze 72 °C. Przesącz roztwór z reakcji za pomocą wirówkowego urządzenia filtrującego o wielkości porów od 0,2 do 0,5 µm, aby zapobiec zapychaniu i uniknąć uszkodzenia kolumny analitycznej.Przenieś filtrat do stożkowej fiolki polipropylenowej i przechowuj w temperaturze 20 °C do czasu analizy. Przygotuj roztwór heksafluoroisopropanolu i trietyloaminy w butelce o pojemności 1 l zgodnie z opisem w protokole tekstowym. Podłącz butelkę do linii A urządzenia do chromatografii cieczowej, chłodząc ją za pomocą przenośnej lodówki z chłodzeniem bezpośrednim, aby zapobiec parowaniu.Podłącz kolejną butelkę wypełnioną metanolem do linii B. Podłącz kolumnę guard oraz kolumnę analityczną do urządzenia. Rozpocznij przepływ początkowej fazy ruchomej, aby przeprowadzić równoważenie kolumn. W przypadku korzystania z spektrometru mas pozbawionego oprogramowania do sterowania ciśnieniem w C-Trap, należy obniżyć ciśnienie w C-Trap poprzez ręczną regulację zaworu.Aby to zrobić, pociągnij za pokrętło, aby je odblokować, a następnie obracaj je bardzo powoli w kierunku przeciwnym do ruchu wskazówek zegara, aby zmniejszyć ciśnienie wysokiej próżni do 1/3. Wskazywane ciśnienie powinno zmieniać się stopniowo z opóźnieniem. Zignoruj komunikat ostrzegawczy o niskim ciśnieniu.Naciśnij pokrętło, aby zablokować. Po przygotowaniu do kalibracji, zgodnie z opisem w protokole tekstowym, przesuń podgrzewaną sondę do jonizacji przez elektroryś w stronę interfejsu spektrometru mas do pozycji B. Połącz sondę ze strzykawką za pomocą rurki. Podawaj kalibrant w sposób ciągły z prędkością przepływu 10 µL/min, korzystając z wbudowanej pompy strzykawkowej.W dostosowanej tabeli kalibracyjnej sprawdź tylko sześć jonów o niższej masie. Przystąp do kalibracji po ustabilizowaniu się intensywności sygnałów. Po kalibracji sprawdź tylko sześć jonów o wyższej masie i przeprowadź kalibrację.Aby uniknąć błędów, nie należy przeprowadzać kalibracji dla wszystkich jonów jednocześnie. Przenieś sondę do pozycji D dla szybkości przepływu 0,4 ml/min i podłącz ją do instrumentu za pomocą obojętnej metalowej rurki. Po ustawieniu parametrów zgodnie z protokołem tekstowym, usuń pęcherzyki powietrza, opukując dna fiolek.Umieść fiolki z próbkami w statywie i za pomocą autoposyłacza wstrzyknij jeden mikrolitr próbki, aby rozpocząć analizę. Otwórz pliki z surowymi danymi w odpowiednim oprogramowaniu przeglądarkowym i upewnij się, że wszystkie pomiary, w tym kontrole pozytywne i negatywne, zostały pomyślnie zakończone. Skonfiguruj metodę zgodnie z opisem w protokole tekstowym, a następnie kliknij przycisk uruchamiania w zakładce kolejki zadań, aby uruchomić oprogramowanie do dekonwolucji.Po zakończeniu kolejki wybierz wiersz i kliknij „open result” w górnym opisie, aby uzyskać wyniki dekonwolucji. Poniżej przedstawiono typowy chromatogram całkowitego prądu jonowego uzyskany z kontroli negatywnej oraz próbki ryby głowiasza. Każdy pik reprezentuje dupleks DNA, który został rozdzielony na podstawie swojej długości.W tym przykładzie obserwuje się trzy piki w próbce ryby puffer. Piki te są wynikiem trawienia amplikonu przy użyciu dwóch endonukleaz. W próbce kontrolnej negatywnej nie obserwuje się żadnych pików.Każdy pik reprezentuje widmo masowe składające się z jonów wielokrotnie naładowanych. Powiększenie widma masowego pozwala dostrzec dziesiątki pików rozdzielonych izotopowo. Rozdzielczość ta jest niezbędna do wyznaczenia masy monoizotopowej i jest możliwa do osiągnięcia jedynie za pomocą spektrometru mas o wysokiej rozdzielczości.W tym przykładzie masy monoizotopowe trzeciego piku wynoszą 16296,7656 i 16468,6616 Daltonów. Przy uwzględnieniu tolerancji masy wynoszącej trzy ppm, wartości pomiarowe są identyczne z wartościami teoretycznymi dla takifugu rubripes, jak pokazano tutaj. Po opanowaniu tej techniki, procedurę można przeprowadzić w jeden dzień, korzystając z powszechnie dostępnych instrumentów i aparatury.Po obejrzeniu tego filmu powinni Państwo posiadać dobrą wiedzę na temat analizy krótkich amplikonów za pomocą wysokorozdzielczej spektrometrii mas z chromatografią cieczową w celu genotypowania. Technikę tę można zastosować do analizy innych polimorfizmów DNA, pod warunkiem że zmienność sekwencji jest odzwierciedlona w analizowanych krótkich amplikonach. Należy jednak pamiętać, że technika ta identyfikuje jedynie skład zasad; podstawienia zasad w obrębie tej samej masy nie mogą zostać rozróżnione.

improved-polymerase-chain-reaction-restriction-fragment-length

Research

JoVE Journal

Genetics

Genetyka

Niniejsza publikacja opisuje sposób wykorzystania systemu identyfikacji gatunków ryb Agilent Fish Species Identification System do określania gatunku ryby poprzez ekstrakcję DNA oraz przeprowadzenie analizy PCR i RFLP.

Protokół identyfikacji gatunków ryb w oparciu o DNA

Źródło: Gulla, S. i inni. Wielolokusowa analiza powtórzeń o zmiennej liczbie dla bakterii patogennej ryb Yersinia ruckeri za pomocą multiplex PCR i kapilarnej elektroforezy. J. Vis. Exp. (2019).Ten film pokazuje procedurę rozdzielania fluorescencyjnie znakowanych amplikonów o zmiennej liczbie powtórzeń tandemowych (VNTR), pochodzących z bakterii patogennej ryb, przy użyciu elektroforezy kapilarnej do generowania profili elektroferograficznych specyficznych dla rozmiaru do identyfikacji bakterii.

Wykrywanie patogenów ryb za pomocą analizy powtarzania tandemowego o zmiennej liczbie (VNTR)

Ten film opisuje technikę elektroforezy kapilarnej do analizy fluorescencyjnie znakowanych amplikonów PCR uzyskanych z różnych próbek na podstawie ich wielkości. Generuje wzór migracyjny, który określa długości par zasad fragmentów za pomocą znakowanego barwnika fluorescencyjnego w każdym fragmencie.

Elektroforeza kapilarna: technika analizy znakowanych fluorescencyjnie amplikonów reakcji łańcuchowej polimerazy

PCR w połączeniu z analizą topnienia w wysokiej rozdzielczości (HRMA) jest pokazane jako szybka i skuteczna metoda genotypowania danio pręgowanego.

Szybkie i wydajne genotypowanie danio pręgowanego za pomocą PCR z analizą topnienia w wysokiej rozdzielczości

Przedstawiono technikę laboratoryjnego szacowania efektywności transferu troficznego netto kongenerów polichlorowanego bifenylu (PCB) do ryb rybożernych z ich ofiary. Aby zmaksymalizować zastosowanie wyników laboratoryjnych w terenie, ryby rybożerne powinny być karmione rybami drapieżnymi, które są zwykle spożywane na polu.

Laboratoryjne oszacowanie efektywności transferu troficznego netto kongenerów PCB do pstrąga jeziorowego (Salvelinus namaycush) z jego ofiary

Połączone znakowanie izotopowe prekursorów i znakowanie izobaryczne (cPILOT) to ilościowa strategia proteomiczna, która zwiększa możliwości multipleksowania próbek znaczników izobarycznych. Protokół ten opisuje zastosowanie cPILOT do tkanek z mysiego modelu choroby Alzheimera i kontroli typu dzikiego.

Ulepszone multipleksowanie próbek tkanek przy użyciu połączonego znakowania izotopowego prekursorów i znakowania izobarycznego (cPILOT)

Najczęstsze analizy zawartości jelit makrobezkręgowców są wizualne. Wymagając intensywnej wiedzy na temat różnorodności morfologicznej organizmów drapieżnych, pomijają zdobycz o miękkim ciele, a ze względu na silne rozdrobnienie zdobyczy są prawie niemożliwe dla niektórych organizmów, w tym obunogów. Zapewniamy szczegółowe, nowatorskie podejścia genetyczne do identyfikacji zdobyczy makrobezkręgowców w diecie obunogów.

Protokół laboratoryjny do analizy genetycznej zawartości jelit makrobezkręgowców wodnych przy użyciu starterów rDNA specyficznych dla grupy

Danio pręgowany był używany jako wiarygodne modele genetyczne w badaniach biomedycznych, zwłaszcza wraz z pojawieniem się technologii edycji genów. Gdy spodziewane są fenotypy larw, ekstrakcja DNA i identyfikacja genotypu może być trudna. W tym miejscu opisujemy skuteczną procedurę genotypowania larw danio pręgowanego, poprzez obcinanie ogonów, już po 72 godzinach od zapłodnienia.

Wysokoprzepustowa ekstrakcja DNA i genotypowanie larw danio pręgowanego 3dpf poprzez obcinanie płetw

Prezentowany tutaj test wielomiejscowej analizy tandemowo-powtórzeniowej (MLVA) umożliwia niedrogie, solidne i przenośne genotypowanie w wysokiej rozdzielczości bakterii Yersinia ruckeri. Zaczynając od czystych kultur, test wykorzystuje multipleksową reakcję PCR i elektroforezę kapilarną w celu wytworzenia dziesięcioloci-loci profili MLVA do dalszych zastosowań.

Wielolocusowa analiza tandemowo-powtórzeniowa bakterii Yersinia ruckeri patogennej dla ryb metodą Multiplex PCR i elektroforezy kapilarnej

Szybka multidyscyplinarna strategia wczesnego wykrywania zakwitów sinic i związanych z nimi cyjanotoksyn jest opisana tutaj. Pozwala na wykrycie cyjanobakterii i pokrewnych sinic w próbkach wody oraz w matrycach organicznych, takich jak próbki małży, w ciągu 24 godzin.

Wczesne wykrywanie zakwitów sinic i związanych z nimi cyjanotoksyn przy użyciu strategii szybkiego wykrywania

Opracowaliśmy zmodyfikowaną metodę QuEChERS-HPLC do oceny wewnętrznych poziomów 16 WWA w zarodkach danio pręgowanego.

Zmodyfikowana metoda QuEChERS-HPLC do wykrywania wielopierścieniowych węglowodorów aromatycznych w zarodkach danio pręgowanego narażonych na działanie drobnych cząstek stałych

Poznaj ulepszoną metodę genotypowania toksycznych rozdymek za pomocą PCR-RFLP i chromatografii cieczowej ze spektrometrią mas. Technika ta zapewnia precyzyjną identyfikację gatunków i poprawia bezpieczeństwo żywnościowe.

Ulepszone polimorfizm długości fragmentów restrykcyjnych reakcji łańcuchowej polimerazy Genotypowanie toksycznych rozdymek za pomocą chromatografii cieczowej/spektrometrii mas (Wideo) | JoVE Journal

Ulepszone polimorfizm długości fragmentów restrykcyjnych reakcji łańcuchowej polimerazy Genotypowanie toksycznych rozdymek za pomocą chromatografii cieczowej/spektrometrii mas

Przeglądaj więcej filmów