Ulepszone polimorfizm długości fragmentów restrykcyjnych reakcji łańcuchowej polimerazy Genotypowanie toksycznych rozdymek za pomocą chromatografii cieczowej/spektrometrii mas

Ogólnym celem tego eksperymentu jest przeprowadzenie szybkiego i dokładnego genotypowania toksycznych ryb rozdymkowatych poprzez analizę małych amplikonów PCR. Jadalna część ryb rozdymkowatych, które są używane do przygotowania dania z ryb rozdymkowatych, różni się w zależności od gatunku, a niektóre gatunki zawierają toksyny w całym ciele. Ten mięsień, baza danych i masu oraz płetwy i skóra narodowa ryb rozdymkowatych, może pomóc w genotypowaniu ryb rozdymkowatych z punktu widzenia w pełni bezpiecznej żywności dla wszystkich i do badań.

Aby przeprowadzić ekstrakcję DNA za pomocą zestawu, najpierw umieść od 30 do 50 miligramów tkanki rybnej w probówce mikrowirówkowej o pojemności 0,5 lub 1,5 mililitra. Zgnieć tkankę bez płetwy i skóry za pomocą mikroszpatułki. Dodaj 180 mikrolitrów buforu do lizy tkanek zwierzęcych i 40 mikrolitrów proteinazy k i krótko wiruj.

Inkubować w temperaturze 56 stopni Celsjusza na grzejniku blokowym przez dwie godziny lub przez noc. Odwirować próbkę przez pięć minut w temperaturze 13000xg. Po przeniesieniu supernatantu do nowej 1,5 mililitrowej probówki do mikrowirówki dodać 200 mikrolitrów buforu chaotropowego zawierającego chlorowodorek guanidyny z zestawu.

Następnie dodaj 200 mikrolitrów 99,5% etanolu i wymieszaj przez wirowanie. Przenieść mieszaninę, łącznie z osadem, do kolumny wirowej umieszczonej w dwumililitrowej probówce zbiorczej. Po odwirowaniu przez jedną minutę w temperaturze 13000xg wyrzuć przepływ.

Dodać 500 mikrolitrów pierwszego buforu do płukania, zawierającego chlorowodorek guanidyny z zestawu i odwirować jak poprzednio. Wyrzucić przelew i probówkę zbiorczą. Umieść kolumnę wirującą w nowej dwumililitrowej probówce zbiorczej dostarczonej z zestawem.

Dodaj 500 mikrolitrów buforu do płukania dwa i wiruj przez trzy minuty przy 20 000 xg. Po odrzuceniu przepływu i probówki zbiorczej przenieść kolumnę wirową do nowej probówki wirówkowej o pojemności 1,5 mililitra. Odpipetować 200 mikrolitrów buforu elucyjnego do środka membrany kolumny wirowej.

Po minucie wirować przez minutę w temperaturze 6000xg. Następnie odpipetować 50 mikrolitrów aluette do jednorazowej kuwety ultrafioletowej. Zmierz widmo ultrafioletowe aluette przy 220 do 300 nanometrach i absorbancję przy 260 nanometrach za pomocą spektrofotometru.

Stosowanie odczynnika niezawierającego detergentów ma kluczowe znaczenie dla powodzenia chromatografii cieczowej, ponieważ odczynnik może spowodować uszkodzenie kolumny analitycznej. Pracując na czystej ławce, aby uniknąć zanieczyszczenia, należy przeprowadzić 25-mikrolitrowy test PCR dla każdej wyekstrahowanej próbki DNA, kontrolę pozytywną i kontrolę ujemną, na lodzie, zgodnie z opisem w protokole tekstowym. Aby ułatwić obsługę, przygotuj odpowiednią ilość koktajlu zawierającego wszystkie odczynniki bez matrycy DNA i dozuj go.

Użyj polimerazy DNA o działaniu korektorskim, aby uniknąć dodawania trzech głównych nawisów adeniny do produktu PCR. Przeprowadzenie amplifikacji PCR na termocyklerze przy użyciu programu cyklu pokazanego w protokole tekstowym. Aby przeprowadzić trawienie enzymatyczne, dodaj dwa mikrolitry buforu do trawienia enzymatycznego do roztworu PCR.

Dodaj jeden mikrolitr każdego enzymu restrykcyjnego i delikatnie wymieszaj. Inkubować próbkę przez 30 minut w temperaturze 37 stopni Celsjusza w termocyklerze, a następnie przez pięć minut w temperaturze 72 stopni Celsjusza. Przefiltrować roztwór reakcyjny za pomocą filtra odśrodkowego o wielkości od 0,2 do 0,5 mikrona, aby zapobiec zatkaniu i uszkodzeniu kolumny analitycznej.

Przenieść filtrat do stożkowej fiolki z polipropylenu i przechowywać w temperaturze 20 stopni Celsjusza do czasu analizy. Przygotować roztwór heksafluoroizopropanolu i trietyloaminy w litrowej butelce, jak opisano w protokole tekstowym. Podłącz butelkę do linii A przyrządu do chromatografii cieczowej, chłodząc butelkę za pomocą przenośnej lodówki z bezpośrednim chłodzeniem, aby zapobiec parowaniu.

Podłącz kolejną butelkę wypełnioną metanolem do linii B. Podłącz kolumnę ochronną i kolumnę analityczną do przyrządu. Rozpocznij przepływ w początkowej fazie ruchomej, aby zrównoważyć kolumny. Jeśli używasz spektrometru mas bez oprogramowania do kontrolowania ciśnienia C-Trap, musisz zmniejszyć ciśnienie C-Trap poprzez ręczne sterowanie prętem.

Aby to zrobić, pociągnij pokrętło, aby odblokować, i bardzo powoli obracaj pokrętło w kierunku przeciwnym do ruchu wskazówek zegara, aby zmniejszyć wysokie ciśnienie podciśnienia do 1/3. Wskazane ciśnienie powinno zmieniać się stopniowo w sposób opóźniony. Zignoruj komunikat ostrzegawczy o niskim ciśnieniu.

Naciśnij pokrętło, aby się zablokować. Po ustawieniu do kalibracji, zgodnie z opisem w protokole tekstowym, przesuń podgrzaną sondę jonizacyjną elektrorozpylania bliżej interfejsu spektrometru mas w pozycji B. Podłącz do sondy i strzykawki z rurką. Wstrzykiwać calibrant w sposób ciągły z natężeniem przepływu 10 mikrolitrów na minutę za pomocą wbudowanej pompy strzykawkowej.

Sprawdź tylko sześć jonów o niższej masie w dostosowanej tabeli kalibracyjnej. Kontynuuj kalibrację po ustabilizowaniu się intensywności sygnałów. Po kalibracji sprawdź tylko sześć jonów o większej masie i przystąp do kalibracji.

Unikaj kalibracji przy użyciu wszystkich jonów jednocześnie, aby uniknąć awarii. Przesuń sondę do pozycji D, aby uzyskać natężenie przepływu 0.4 mililitra na minutę i podłącz do instrumentu za pomocą obojętnej metalowej rurki. Po ustawieniu parametrów zgodnie z opisem w protokole tekstowym, usuń bąbelki, stukając w dno fiolek.

Umieść fiolki z próbkami na stojaku na próbki i wstrzyknij jeden mikrolitr próbki za pomocą automatycznego podajnika próbek, aby rozpocząć analizę. Otwórz pliki z surowymi danymi za pomocą oprogramowania przeglądarki i potwierdź, że wszystkie przejęcia zostały pomyślnie zakończone, w tym kontrole dodatnie i negatywne. Skonfiguruj metodę zgodnie z opisem w protokole tekstowym, a następnie kliknij przycisk Uruchom na karcie cue, aby uruchomić oprogramowanie do dekonwolucji.

Po zakończeniu cue wybierz wiersz i kliknij otwórz wynik w górnym podpisie, aby uzyskać wyniki dekonwolucji. Oto typowy chromatogram całkowitego prądu jonowego otrzymany z kontroli ujemnej i próbki ryb rozdymkowatych. Każdy pik reprezentuje dupleks DNA, który jest oddzielony na podstawie ich długości.

W tym przykładzie zaobserwowano trzy piki z próbki ryb rozdymkowatych. Te piki są wynikiem trawienia amplikonów przy użyciu dwóch endonukleaz. W ujemnej próbce kontrolnej nie obserwuje się pików.

Każdy pik reprezentuje widmo masy, które składa się z wielu naładowanych jonów. Rozszerzenie widma mas umożliwia zauważenie dziesiątek pików o rozdzielczości izotopowej. Rozdzielczość ta jest niezbędna do wyznaczenia masy monoizotopowej i jest możliwa tylko za pomocą spektrometru mas o wysokiej rozdzielczości.

W tym przykładzie monoizotopowe masy trzeciego piku to 16296,7656 i 16468,6616 daltonów. Biorąc pod uwagę tolerancję masy wynoszącą trzy ppm, zmierzone wartości są identyczne z teoretycznymi wartościami rubifugu takifugu, jak pokazano tutaj. Po opanowaniu tej techniki można ją wykonać w ciągu jednego dnia przy użyciu zwykłych instrumentów i aparatury.

Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak analizować małe amplikony za pomocą chromatografii cieczowej, spektrometrii mas o wysokiej rozdzielczości do genotypowania. Technika ta może być stosowana do analizy innych polimorfizmów DNA, pod warunkiem, że zmienność sekwencji jest odzwierciedlona w małych amplikonach, które mają być analizowane. Jednak ta technika identyfikuje tylko składy bazowe, nie można wyróżnić substytucji zasad w ramach tego samego mercure.