Name: Oznaczanie powinowactwa Wykrywanie endogennych receptorów z zarodków danio pręgowanego (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-08-31T15:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 39 s
Description: Poznaj metodę AFLIP do wykrywania receptorów czynników wzrostu w zarodkach Danio rerio. Technika łączy oznaczanie powinowactwa z immunoprecypitacją, umożliwiając badanie dynamiki receptorów w biologii rozwoju.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Autorzy dziękują Gilberto Moralesowi za opiekę i utrzymanie ryb, oraz doktorom Claudii Riverze i Hectorowi Malagònowi (IFC-UNAM Animal Facility) za pomoc w szczepieniu królików. Prace te były wspierane przez granty z CONACYT 131226 i PAPIIT-DGAPA-UNAM IN204916.

Wszystkie eksperymenty przeprowadzone na zwierzętach zostały zatwierdzone przez Komitet ds. Opieki nad Zwierzętami Laboratoryjnymi i Użytkowania Autonomicznego Narodowego Uniwersytetu Meksyku (UNAM), pod numerem protokołu CICUAL: FLC40-14. (CICUAL: "Comité Institucional para el Cuidado y Uso de los Animales de Laboratorio del Instituto de Fisiologìa Celular, Universidad Nacional Autònoma de México").
1. Przygotowanie ekstraktu z białka zarodka
<ol>
	<li>Zbierz od 100 do 200 zarodków dla każdego schorzenia, aby porównać je (morfanty i typ dziki) na pożądanym etapie, na przykład 72 godziny po zapłodnieniu (hpf).</li>
	<li>Umieść zarodki na szalkach Petriego zawierających wodę dla ryb (patrz Tabela 1) i ręcznie odstrunij zarodki za pomocą kleszczy z cienką końcówką. Na tym etapie należy unikać stosowania pronazy (lub jakiejkolwiek innej proteazy w całym protokole), ponieważ może ona trawić docelowy receptor.</li>
	<li>Umieścić zarodki w probówce do mikrofugi o pojemności 1,5 ml i dwukrotnie przemyć zarodki 1x roztworem buforu fosforanowego (PBS) (patrz Tabela 1).</li>
	<li>Dodać 500 μl buforu deyolk (patrz tabela 1).</li>
	<li>Uwolnij większość żółtka, delikatnie pipetując w górę i w dół (około 30 - 40 razy) zarodki w roztworze. W przypadku zarodków o mocy 72 hpf i 48 hpf należy użyć odpowiednio niebieskich i żółtych końcówek pipet. Żółte końcówki mogą wymagać lekkiego przycięcia, aby uniknąć zniszczenia zarodków. Pomyślne uwalnianie żółtka można sprawdzić, obserwując zarodki pod mikroskopem.</li>
	<li>Zebrać zarodki przez odwirowanie przy 600 x g przez 15 sekund.</li>
	<li>Sklarowany osad należy ostrożnie wyrzucić za pomocą pipety.</li>
	<li>Przepłukać zarodki dwukrotnie buforem do przemywania o pojemności 500 μl (patrz Tabela 1), delikatnie wirując z najniższą prędkością.</li>
	<li>Zebrać zarodki przez odwirowanie przy 600 x g przez 15 sekund.</li>
	<li>Zaczynając od tego miejsca, kontynuuj procedurę w temperaturze 4 °C.</li>
	<li>Sklarowany osad należy ostrożnie wyrzucić za pomocą pipety.</li>
	<li>Zawiesić zarodki w 350 μl buforu do lizy (patrz Tabela 1) i homogenizować za pomocą plastikowego tłuczka.</li>
	<li>Inkubować zlizowane zarodki przez 30 minut z mieszaniem na bujaczku probówki w temperaturze 4 °C.</li>
	<li>Odwirować lizowane zarodki w temperaturze 11 000 x g przez 15 minut w celu usunięcia nierozpuszczalnych zanieczyszczeń.</li>
	<li>Przenieść oczyszczony supernatant za pomocą pipety do świeżej probówki.</li>
	<li>Oznaczyć białko całkowite za pomocą testu białkowego Bradforda4 lub innej odpowiedniej procedury. Jeżeli stosuje się test Bradforda, należy wykonać krzywą kalibracyjną w obecności równoważnych stężeń detergentów obecnych w buforze do lizy, ponieważ powodują one niedoszacowanie wzorca białka4.</li>
</ol>
2. Wykrywanie endogennego białka receptorowego
<ol>
	<li>Znakowanie powinowactwa i immunoprecypitacja (wszystkie te kroki w temperaturze 4 oC)
	<ol>
		<li>Umieścić 400 - 500 μg całkowitego białka zarodka w probówce do mikrofug o pojemności 1,5 ml i rozcieńczyć do 1 μg/μl buforem 1 (patrz Tabela 1). 
		Uwaga: Aby uzyskać 500 μg całkowitego białka zarodka, należy wstępnie przetworzyć około 100 - 200 zarodków. 72 zarodki HPF rutynowo dają ~ 5 μg całkowitego białka zarodkowego, co jest wystarczające do wykrycia betaglikanu.</li>
		<li>Dodać wystarczającą objętość znakowanego materiału TGF-β2, aby osiągnąć końcowe stężenie 150 pM i inkubować z mieszaniem na bujaku probówki przez 2 godziny w temperaturze 4 °C. TGF-β2 musi być znakowany przed rozpoczęciem AFLIP za pomocą 125I metodą chloraminy T, opisaną przez Cheifetza i wsp.5. 
		UWAGA: Użyj ekranowania, aby zminimalizować narażenie podczas obchodzenia się z ligandem oznaczonym jako 125I.</li>
		<li>Dodać wystarczającą objętość nierozcieńczonego przeciwciała przeciwko receptorowi będącemu przedmiotem zainteresowania, aby osiągnąć rozcieńczenie 1:100 i kontynuować inkubację przez kolejne 2 godziny w temperaturze 4 °C (inkubacja może wynosić O/N). Jest to optymalne rozcieńczenie surowicy antysurowicy # 31, użyte w tym badaniu i opisane w innym miejscu3, ale w zależności od jakości przeciwciała, optymalne może być większe lub mniejsze rozcieńczenie.</li>
		<li>Dodać 50 μl odpowiednich kulek wiążących immunoglobuliny (np. białka G-Sepharose, które zostało wcześniej zrównoważone w TNTE i ponownie zawieszone w stosunku 1:5 swojej pierwotnej objętości w TNTE) i inkubować przez 50 minut z mieszaniem na bujaku probówki w temperaturze 4 °C.</li>
		<li>Odzyskaj kulki przez mikrowirowanie przy 11 000 x g przez 20 sekund.</li>
		<li>Wyrzucić supernatant do odpowiedniego radioaktywnego pojemnika na śmieci.</li>
		<li>Przemyć kulki IP trzykrotnie 1 ml buforu do płukania IP (patrz Tabela 1), poprzez wirowanie i mikrowirowanie przy 11 000 x g przez 20 sekund za każdym razem.</li>
		<li>Zawiesić kulki IP w 250 μl bufora do płukania IP.</li>
		<li>Dodać 1,5 μl suberanu disuccinimidylu (DSS, rozpuszczonego w DMSO w stężeniu 10 mg/ml). Na tym etapie należy przygotować roztwór DSS tuż przed jego użyciem.</li>
		<li>Inkubować przez 15 minut w temperaturze 4 °C z mieszaniem.</li>
		<li>W celu wygaszenia reakcji sieciowania należy dodać 500 μl buforu do płukania IP, uzupełnionego wystarczającą ilością Tris-Cl pH 7,4, aby osiągnąć 25 mM Tris-Cl. Wolne grupy aminowe w Tris wychwytują nieprzereagowany DSS.</li>
		<li>Wirować przy 11 000 x g przez 20 sekund w celu zebrania kulek IP i odrzucenia supernatantu.</li>
		<li>Zawiesić kulki IP w 30 μl redukującego buforu Laemmli.</li>
		<li>Próbki gotować przez 5 minut w temperaturze 94 °C.</li>
		<li>Opcjonalnie można przeanalizować próbki w liczniku gamma przy użyciu protokołu producenta.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Analiza próbki
	<ol>
		<li>Poddaj próbki denaturacji SDS-PAGE. Użyć poliakrylamidu w ilości procentowej odpowiedniej do masy receptora i uruchomić żel zgodnie ze standardową procedurą.</li>
		<li>Zanurzyć żel w roztworze utrwalającym (patrz Tabela 1) na 30 minut w temperaturze pokojowej.</li>
		<li>Myć żel wodą destylowaną przez 15 min.</li>
		<li>Umieść żel we wcześniej uwodnionej bibule filtracyjnej i przykryj folią saran.</li>
		<li>Suszyć żel w temperaturze 80 °C przez 1 godzinę.</li>
		<li>Naświetlić żel na białym ekranie luminowizora w RT O/N.</li>
		<li>Zeskanuj odsłonięty ekran za pomocą luminowizora, korzystając z protokołu producenta.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

<ol><li>López-Casillas, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structure+and+expression+of+the+membrane+proteoglycan+betaglycan%2C+a+component+of+the+TGF-%CE%B2+receptor+system%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Structure and expression of the membrane proteoglycan betaglycan, a component of the TGF-β receptor system.</a> Cell. 67 (4), 785-795 (1991).</li>
<li>Cheifetz, S., Andres, J. L., Massague, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+transforming+growth+factor-beta+receptor+type+III+is+a+membrane+proteoglycan.+Domain+structure+of+the+receptor%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">The transforming growth factor-beta receptor type III is a membrane proteoglycan. Domain structure of the receptor.</a> J. Biol. Chem. 263 (32), 16984-16991 (1988).</li>
<li>Kamaid, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Betaglycan+knock-down+causes+embryonic+angiogenesis+defects+in+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Genesis%22%5BJournal%5D)">Betaglycan knock-down causes embryonic angiogenesis defects in zebrafish.</a> Genesis. 53, 583-603 (2015).</li>
<li>Bradford, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Rapid+and+Sensitive+Method+for+the+Quantitation+of+Microgram+Quantities+of+Protein+Utilizing+the+Principle+of+Protein-Dye+Binding%5BTitle%5D)+AND+%22Anal.+Biochem%22%5BJournal%5D)">A Rapid and Sensitive Method for the Quantitation of Microgram Quantities of Protein Utilizing the Principle of Protein-Dye Binding.</a> Anal. Biochem. 72, 248-254 (1976).</li>
<li>Cheifetz, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Distinct+transforming+growth+factor-b+receptor+subsets+as+determinants+of+cellular+responsiveness+to+three+TGF-b+isoforms%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">Distinct transforming growth factor-b receptor subsets as determinants of cellular responsiveness to three TGF-b isoforms.</a> J. Biol. Chem. 265, 20533-20538 (1990).</li>
<li>López-Casillas, F., Wrana, J. L., Massagué, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Betaglycan+presents+ligand+to+the+TGF%CE%B2+signaling+receptor%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Betaglycan presents ligand to the TGFβ signaling receptor.</a> Cell. 73 (7), 1435-1444 (1993).</li>
<li>Towbin, H., Staehelin, T., Gordon, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Electrophoretic+transfer+of+proteins+from+polyacrylamide+gels+to+nitrocellulose+sheets%3A+procedure+and+some+applications%5BTitle%5D)+AND+%22PNAS+USA%22%5BJournal%5D)">Electrophoretic transfer of proteins from polyacrylamide gels to nitrocellulose sheets: procedure and some applications.</a> PNAS USA. 76 (9), 4350-4354 (1979).</li>
<li>Maccari, F., Volpi, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Direct+and+specific+recognition+of+glycosaminoglycans+by+antibodies+after+their+separation+by+agarose+gel+electrophoresis+and+blotting+on+cetylpyridinium+chloride-treated+nitrocellulose+membranes%5BTitle%5D)+AND+%22Electrophoresis%22%5BJournal%5D)">Direct and specific recognition of glycosaminoglycans by antibodies after their separation by agarose gel electrophoresis and blotting on cetylpyridinium chloride-treated nitrocellulose membranes.</a> Electrophoresis. 24 (9), 1347-1352 (2003).</li>
<li>Volpi, N., Maccari, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Glycosaminoglycan+blotting+and+detection+after+electrophoresis+separation%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol+%28Clifton%2C+N.J%29%22%5BJournal%5D)">Glycosaminoglycan blotting and detection after electrophoresis separation.</a> Methods Mol Biol (Clifton, N.J). 1312, 119-127 (2015).</li>
<li>Guesdon, J. L., Ternynck, T., Avrameas, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+use+of+avidin-biotin+interaction+in+immunoenzymatic+techniques%5BTitle%5D)+AND+%22J+Histochem+Cytochem%22%5BJournal%5D)">The use of avidin-biotin interaction in immunoenzymatic techniques.</a> J Histochem Cytochem. 27 (8), 1131-1139 (1979).</li>
<li>Bratthauer, G. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+avidin-biotin+complex+%28ABC%29+method+and+other+avidin-biotin+binding+methods%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol+%28Clifton%2C+N.J%29%22%5BJournal%5D)">The avidin-biotin complex (ABC) method and other avidin-biotin binding methods.</a> Methods Mol Biol (Clifton, N.J). 588, 257-270 (2010).</li>
<li>Heimer, R., Molinaro, L., Sampson, P. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Detection+by+125I-cationized+cytochrome+c+of+proteoglycans+and+glycosaminoglycans+immobilized+on+unmodified+and+on+positively+charged+Nylon+66%5BTitle%5D)+AND+%22Anal.+Biochem%22%5BJournal%5D)">Detection by 125I-cationized cytochrome c of proteoglycans and glycosaminoglycans immobilized on unmodified and on positively charged Nylon 66.</a> Anal. Biochem. 165 (2), 448-455 (1987).</li>
<li>Das, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Specific+radiolabeling+of+a+cell+surface+receptor+for+epidermal+growth+factor%5BTitle%5D)+AND+%22PNAS+USA%22%5BJournal%5D)">Specific radiolabeling of a cell surface receptor for epidermal growth factor.</a> PNAS USA. 74 (7), 2790-2794 (1977).</li>
<li>Massague, J., Guillette, B., Czech, M., Morgan, C., Bradshaw, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+a+nerve+growth+factor+receptor+protein+in+sympathetic+ganglia+membranes+by+affinity+labeling%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">Identification of a nerve growth factor receptor protein in sympathetic ganglia membranes by affinity labeling.</a> J. Biol. Chem. 256 (18), 9419-9424 (1981).</li>
<li>Massague, J., Pilch, P. F., Czech, M. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Electrophoretic+resolution+of+three+major+insulin+receptor+structures+with+unique+subunit+stoichiometries%5BTitle%5D)+AND+%22PNAS+USA%22%5BJournal%5D)">Electrophoretic resolution of three major insulin receptor structures with unique subunit stoichiometries.</a> PNAS USA. 77 (12), 7137-7141 (1980).</li>
<li>Hoosein, N. M., Gurd, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+Glucagon+Receptors+in+Rat+Brain%5BTitle%5D)+AND+%22PNAS+USA%22%5BJournal%5D)">Identification of Glucagon Receptors in Rat Brain.</a> PNAS USA. 81, 4368-4372 (1984).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Zastosowanie Western blot ze specyficznym przeciwciałem przeciwko białku będącemu przedmiotem zainteresowania jest cennym narzędziem do badania jego ekspresji7 podczas embriogenezy. Jednak immunoblotting białek o wysokim stopniu glikozylacji nie był zbyt skuteczny ze względu na ich nieefektywne przenoszenie i słabe wiązanie z błonami nitrocelulozowymi lub PVDF8,9.
Proteoglikany są dobrym przykładem tej wady, ze względu na ich kowalencyjnie przyłączone łańcuchy glikozamino...

Specyficzne wykrywanie białek ulegających ekspresji podczas rozwoju embrionalnego jest wymagane do walidacji profili ekspresji uzyskanych przez pomiar ich pokrewnych mRNA za pomocą RT-PCR lub hybrydyzacji in situ (ISH). Zwykle osiąga się to za pomocą western blot ekstraktów z zarodków, a następnie wykrywania za pomocą specyficznych przeciwciał. Jednak takie podejście jest trudne do zastosowania w przypadku białek, które występują w bardzo niskiej obfitości lub które mają właściwości utrudniające ich ilościowy transfer podczas blottingu. Przykładem tych trudności jest betaglikan, znany również jako receptor transformującego czynnika wzrostu typu β III (TGF-β) (TGFBR3). TGFBR3 jest proteoglikanem błonowym w niepełnym wymiarze godzin, który wiąże TGF-β poprzez swoje białkordzeniowe 1, ze znacznie wyższym powinowactwem do izoformy TGF-β2, co odróżnia go od każdego innego białka wiążącego TGF-β2. TGFBR3 w danio pręgowanym ulega ekspresji od 8 hpf wzwyż, osiągając maksimum o 72 hpf, co wykryto za pomocą RT-PCR jego mRNA3. 
Jednakże, pomimo dostępności bardzo specyficznego przeciwciała3, każda próba wykrycia jego translowanego produktu przez western blot okazała się nieskuteczna. Sądząc, że proteoglikańska natura TGFBR3, a także przypuszczalnie niska obfitość mogą być odpowiedzialne za tę awarię, opracowano metodę wykrywania AFLIP, która wykorzystuje wysokie powinowactwo TGFBR3 do TGF-β2. W tej metodzie pozwala się na swoiste związanie ekstraktu białkowego z połączonych zarodków 125TGF-β2 znakowanego I, a kompleksy receptor-ligand są oczyszczane przez immunoprecypitację i sieciowane przed rozdzieleniem przez SDS-PAGE. Wzorce migracji zaobserwowane przez autoradiografię żeli ujawniły obecność i charakter znakowanych gatunków receptorów. Podejście to łączy specyficzność liganda znakowania powinowactwem z immunoprecypitacją przez specyficzne przeciwciała, zwiększając zakres wykrywania, unikając nieefektywnego blottingu transferowego TGFBR3. Ze względu na swoje nieodłączne właściwości, test AFLIP nie jest testem ilościowym, ale może być stosowany do pewnej oceny względnych różnic eksperymentalnych w analizowanym receptorze.

<table><tbody><tr><td>Suberat disuccinimidylu (DSS)</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>21555</td><td></td></tr><tr><td>Białko G Sepharose 4 Fast Flow</td><td>GE Healthcare Life Sciences</td><td>17-0618-01</td><td></td></tr><tr><td>Suszarka żelowa Model 583&nbsp;</td><td>BIO-RAD</td><td>1651745</td><td></td></tr><tr><td>Typhoon 9400</td><td>GE Healthcare Nauki przyrodnicze</td><td>63-0055-78</td><td></td></tr><tr><td>Cobra II Auto gamma</td> licznik Kaseta ekspozycyjna <td>Packard</td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td>Dynamika molekularna</td><td>63-0035-44</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>J.T. Baker</td><td>3624</td><td></td></tr><tr><td>KCl</td><td>J.T. Baker</td><td>3040</td><td></td></tr><tr><td>Na2HPO4</td><td>J.T. Baker</td><td>3828</td><td></td></tr><tr><td>K2HPO4</td><td>J.T. Baker</td><td>3246</td><td></td></tr><tr><td>CH3OH</td><td>J.T. Baker</td><td>9070</td><td></td></tr><tr><td>CH3COOH</td><td>J.T. Baker</td><td>9508</td><td></td></tr><tr><td>HCHO</td><td>J.T. Baker</td><td>2106</td><td></td></tr><tr><td>SDS</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>L4509</td><td></td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>ED</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T9284</td><td></td></tr><tr><td>CaCl2</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C3306</td><td></td></tr><tr><td>NaHCO3</td><td>Fisher Scientific</td><td>S233</td><td></td></tr><tr><td>PMSF</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P7626</td><td></td></tr><tr><td>Krystaliczne morze morskie mix</td><td>Przedsiębiorstwa morskie Międzynarodowe</td><td>http://www.meisalt.com/Crystal-Sea-Marinemix</td><td></td></tr></tbody></table>

oznaczanie powinowactwa wykrywanie endogennych receptorów z zarodków danio pręgowanego

Affinity Labeling Detection of Endogenous Receptors from Zebrafish Embryos

Poprzez połączenie mocy Affinity Labeling i Immunoprecipitation (AFLIP), zaimplementowano technikę wykrywania receptorów o niskiej liczebności w zarodkach danio pręgowanego. Technika ta wykorzystuje selektywność i czułość wynikającą z znakowania powinowactwa danego receptora przez jego ligand ze swoistością immunoprecypitacji. Użyliśmy AFLIP do wykrycia receptora TGF-β typu III (TGFBR3), znanego również jako betaglikan, podczas wczesnego rozwoju danio pręgowanego. Projekt AFLIP odegrał zasadniczą rolę w walidacji skuteczności fenotypu morfanta TGFBR3 danio pręgowanego. W pierwszym etapie przygotowywane są ekstrakty białkowe z zarodków, które są wykorzystywane do wytworzenia 125kompleksów I-TGF-β2-TGFBR3, które są oczyszczane przez immunoprecypitację. Później kompleksy te są kuriocyjnie sieciowane i ujawniane za pomocą separacji SDS-PAGE i detekcji autoradiograficznej. Technika ta wymaga dostępności znakowanego liganda dla wykrywanego receptora i specyficznego przeciwciała przeciwko mu, a także musi być łatwo przystosowana do identyfikacji dowolnego czynnika wzrostu lub receptora cytokinowego, który spełnia te wymagania.

Rysunek 1 przedstawia reprezentatywny wynik uzyskany za pomocą metody AFLIP. Sygnały w ścieżce 1 pochodzą od ligandu znakowanego 125I, kowalencyjnie powiązanego albo z białka rdzeniowego betaglikanu danio pręgowanego (BG core, poniżej markera 150 kDa), albo z białka rdzeniowego BG przetworzonego do formy proteoglikanu poprzez przyłączenie glikozaminoglikanów (GAG, rozmyty pas od 170 kDa do górnej krawędzi żelu). Taki wzór migracji — wyraźny prążek białka rdzeni...

Opisano nowatorską technikę wykrywania endogennych receptorów o niskiej liczebności obecnych w zarodkach danio pręgowanego. Nazwaliśmy go AFLIP, ponieważ polega na znakowaniu powinowactwa receptora przez jego ligand związany z immunoprecypitacją.

Oznaczanie powinowactwa Wykrywanie endogennych receptorów z zarodków danio pręgowanego

By combining the powers of Affinity Labeling and Immunoprecipitation (AFLIP), a technique for the detection of low abundance receptors in zebrafish ...

Ogólnym celem niniejszej procedury jest wykrycie receptorów czynników wzrostu o niskiej liczności w zarodkach ryb danio pręgowanych poprzez połączenie selektywności i czułości znakowania powinowactwem wybranego receptora za pomocą jego radioaktywnego liganda. Metoda ta może pomóc w udzieleniu odpowiedzi na pytania z zakresu biologii rozwoju, takie jak poziomy ekspresji receptorów oraz ich właściwości biochemiczne. Metoda ta, którą nazwaliśmy AFLIP, przenosi potężne właściwości opisowe znakowania powinowactwem – ugruntowanej techniki biologii komórki – do badań nad rozwojem ryb danio pręgowanych.Aby rozpocząć tę procedurę, należy zebrać od 100 do 200 embrionów dla każdego wariantu i umieścić je w szalkach Petriego zawierających wodę dla ryb. Następnie należy ręcznie usunąć otoczki z embrionów za pomocą pęsety z cienkimi końcówkami; przez cały czas trwania protokołu należy unikać stosowania pronazy lub jakiejkolwiek innej proteazy, ponieważ mogą one strawić docelowe receptory. W kolejnym kroku embriony należy umieścić w probówce do wirówki o pojemności 1,5 ml i dwukrotnie przemyć je roztworem 1X PBS.Następnie dodaj 500 µL buforu do usuwania żółtka. Usuń większość żółtka, delikatnie pipetując zarodki w roztworze w górę i w dół około 30 do 40 razy. W przypadku zarodków w wieku 72 HPF i 48 HPF należy używać odpowiednio niebieskich i żółtych końcówek do pipet.Żółte końcówki mogą wymagać lekkiego przycięcia, aby uniknąć zniszczenia embrionów. Prawidłowe usunięcie żółtka można sprawdzić, obserwując embriony pod mikroskopem. Usunięcie żółtka musi być możliwie najpełniejsze, ponieważ lipidy i białka żółtka mogą zakłócać późniejsze etapy wiązania ligandów lub przeciwciał.Następnie należy zebrać zarodki poprzez wirowanie przy 600 x g przez 15 sekund. Ostrożnie usunąć nadsącz za pomocą pipety. Następnie zarodki należy przemyć dwukrotnie 500 µL buforu płuczącego, delikatnie mieszając je na wortexie przy najniższej prędkości.Następnie zebrać zarodki poprzez wirowanie przy 600 x g przez 15 sekund. Od tego momentu kontynuować procedurę w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Ostrożnie usunąć nadkład za pomocą pipety.Następnie zarodki zawieszamy w 350 µL buforu lizującego i homogenizujemy je za pomocą plastikowego tłuczka. Następnie lizowane zarodki inkubujemy przez 30 minut z wytrząsaniem na rotatorze do probówek w temperaturze 4 °C. W kolejnym kroku lizowane zarodki wirujemy przy 11 000 x g przez 15 minut w celu usunięcia nierozpuszczalnych zanieczyszczeń.Następnie przenieś oczyszczony supernatant do nowej probówki. Określ całkowitą zawartość białka za pomocą metody Bradforda i sporządź krzywą kalibracyjną. Na tym etapie umieść od 400 do 500 µg całkowitego białka zarodka w probówce do mikrocentryfugi o pojemności 1,5 ml i rozcieńcz je do stężenia 1 µg/µl przy użyciu buforu 1.Następnie dodaj roztok TGF-beta II znakowany jodem-125, aby osiągnąć końcową stężenie 150 pM, i inkubuj z mieszaniem na kołysce do probówek przez dwie godziny w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Po tym czasie dodaj nierozcieńczone przeciwciało przeciwko badanemu receptorowi, aby uzyskać rozcieńczenie 1:100. Następnie kontynuuj inkubację w temperaturze czterech stopni Celsjusza przez kolejne dwie godziny lub przez noc.Po inkubacji należy dodać 50 µL odpowiednich kulek wiążących immunoglobuliny i inkubować przez 50 minut przy ciągłym mieszaniu na rotatorze do probówek w temperaturze 4 °C. Następnie kulki należy odzyskać poprzez mikrocentryfugację przy 11 000 x g przez 20 sekund, a nad precipitatesy wyrzucić do odpowiedniego pojemnika na odpady radioaktywne. Następnie kulki IP należy przemyć trzykrotnie 1 mL buforu do przemywania IP, stosując vortexowanie i mikrocentryfugację przy 11 000 x g przez 20 sekund podczas każdego etapu.Następnie resuspender paciorki IP w 250 µL buforu płuczącego IP. Przygotować świeży roztwór DSS i dodać 1,5 µL do próbki. Po tym czasie inkubować próbkę przez 15 minut w temperaturze 4 °C przy wytrząsaniu.Aby zatrzymać reakcję sieciowania, należy dodać 500 µL buforu do płukania IP uzupełnionego o odpowiednią ilość roztwoku chlorku tryzyny o pH 7,4, aby uzyskać stężenie 25 mM chlorku tryzyny. Następnie odwiruj próbkę przy 11 000 ×g przez 20 sekund, aby zebrać kuleczki IP. Po tym czasie odlej nadsącz i resuspender kuleczki IP w 30 µL redukującego buforu Laemmliego.Następnie, przed elektroforezą w żelu SDS-PAGE, próbkę należy gotować w temperaturze 94 °C przez pięć minut, a następnie przeanalizować wysuszone żele w fosforymetrze lub za pomocą konwencjonalnej autoradiografii. Rysunek ten przedstawia reprezentatywne wyniki uzyskane za pomocą metody AFLIP. Całkowite białko wyekstrahowane z embrionów w 72 hpf i 48 hpf poddano znakowaniu powinowactwem z użyciem Iodine-125 TGF-beta II, a następnie immunoprecypitacji (IP) z użyciem przeciwciał króliczych anty-zebrafish BG lub przeciwciał króliczych anty-rat BG jako kontroli.W autoradiografii BG można wykryć bez GAG lub jako BG zmodyfikowany glikozaminoglikanem. Ten rysunek pokazuje, w jaki sposób AFLIP może być wykorzystywany do pomiaru poziomów ekspresji danego receptora w embrionach poddanych manipulacji eksperymentalnej, w tym przypadku zmniejszeniu poziomu betaglikanu poprzez wstrzyknięcie morfolino. Ścieżka pierwsza przedstawia poziom receptora TGF beta III w 72 hpf embrionie typu dzikiego, natomiast ścieżka druga pokazuje efekt podania siedmiu nanogramów morfolino skierowanego do granicy eksonu 2 i intronu 2 pierwotnego transkryptu ZFPG. Należy zauważyć, że obniżenie poziomu BG uzyskane za pomocą tego morfolino nie występuje w przypadku zastosowania niedopasowanej kontroli.Wyniki te potwierdziły, że fenotyp uzyskany przy użyciu tego morfolino był specyficzny dla wyciszenia receptora TGF beta III, zgodnie z wcześniejszym opisem. Skuteczność metody AFLIP w wykrywaniu receptorów czynników wzrostu lub cytokin zależy od dostępności znakowanego radioizotopowo ligandu, który może wiązać się z receptorem i zostać z nim sieciowany. Wymagane jest również zastosowanie odpowiedniego przeciwciała do immunoprecypitacji.Po opanowaniu tej techniki można ją przeprowadzić w ciągu dwóch dni, jeśli zostanie ona wykonana prawidłowo. Ponieważ metoda AFLIP pomija etap transferu stosowany w western blocie, pozwala na lepszą detekcję silnie glikozylowanych receptorów. Zaobserwowaliśmy to w przypadku proteoglikanu betaglikanu, którego transfer w western blocie jest bardzo mało wydajny. Po zastosowaniu tej procedury można przeprowadzić inne metody, takie jak trawienie enzymatyczne, w celu opisania dodatkowych modyfikacji potranslacyjnych, o ile są one wykrywalne za pomocą technik elektroforetycznych.Po obejrzeniu tego filmu powinieneś mieć dobre wyobrażenie o tym, jak metoda AFLIP może pomóc w wykrywaniu receptorów o niskiej liczności w kilku embrionach ryb poprzez znakowanie powinowactwa powiązane z immunoprecypitacją. Na koniec pamiętaj, że praca z jodem-125 musi być wykonywana z należytą ostrożnością i przy odpowiedniej ochronie. Powodzenia w eksperymentach.

affinity-labeling-detection-endogenous-receptors-from-zebrafish

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Biologia rozwojowa

Kluczem do zrozumienia procesów morfogenetycznych kształtujących wczesny embrion jest możliwość obrazowania komórek w wysokiej rozdzielczości. Opisujemy tutaj technikę znakowania pojedynczych komórek lub małych skupisk komórek w całych embrionach ryby danio pręgowanej za pomocą białka GFP skierowanego do błony komórkowej.

Znakowanie i obrazowanie komórek w rdzeniu przedłużonym rybki danio

Niniejszy protokół opisuje metodę znakowania i śledzenia losów niewielkich grup komórek w embrionach ryb danio pręgowany poprzez UV-odblokowanie uwięzionej fluoresceiny, a następnie immunoznakowanie całego preparatu w celu wzmocnienia sygnału z odblokowanej fluoresceiny.

Znakowanie linii komórkowych ryb danio-pręgowanych za pomocą dekstranu fluoresceiny uwalnianego laserowo

Opisano metodę fotoaktywacji pojedynczych komórek zawierających „uwięzione” (caged) białko fluorescencyjne z wykorzystaniem absorpcji dwufotonowej z femtosekundowego oscylatora laserowego Ti:Szafir. W celu mapowania losu fotoaktywowanej komórki zastosowano immunohistochemię. Technikę tę można zastosować do każdego typu komórek.

Mapowanie losów pojedynczych komórek u danio przeznaczonego (zebrafish)

Ten film demonstruje test wychwytu przeciwciał w celu zobrazowania sygnalizacji Notch/DeltaD u progenitorów gleju radialnego danio pręgowanego. Polega ona na zamontowaniu osadzonych w agarozie zdekorionowanych zarodków danio pręgowanego, wstrzyknięciu roztworu barwnika ukierunkowanego na ligandy DeltaD na RGP oraz obrazowaniu pod mikroskopem fluorescencyjnym w celu asymetrycznego podziału komórek, potwierdzając aktywację sygnalizacji Notch/DeltaD.

Test wychwytu przeciwciał do obrazowania sygnalizacji Notch/DeltaD w radialnych progenitorach gleju danio pręgowanego

Opisany tutaj jest protokół półautomatycznego obrazowania specyficznej tkankowo fluorescencji w zarodkach danio pręgowanego.

Półautomatyczne obrazowanie specyficznej tkankowo fluorescencji w zarodkach danio pręgowanego

Zarodek danio pręgowanego jest doskonałym modelem do badań nad biologią rozwojową. Podczas embriogenezy danio pręgowany rozwija się z masą żółtka, co stanowi trójwymiarowe wyzwanie dla obserwacji i analizy próbek. Protokół ten opisuje, w jaki sposób tworzyć dwuwymiarowe preparaty do montażu płaskiego całych próbek zarodków danio pręgowanego barwionych metodą montażu in situ (WISH).

Przygotowanie do obserwacji i analizy próbek zarodków danio pręgowanego wybarwionych metodą hybrydyzacji in situ metodą całego wierzchowca

Rozwój rzęsek jest niezbędny do prawidłowego organogenezy. Protokół ten opisuje zoptymalizowaną metodę oznaczania i wizualizacji komórek rzęskowych danio pręgowanego.

Wizualizacja wielorzęskowych komórek u danio pręgowanego za pomocą połączonego protokołu fluorescencyjnej hybrydyzacji in situ i immunofluorescencji całej góry

Ten protokół demonstruje sekwencyjną immunofluorescencję i immunohistochemię na kriosekcjach z wczesnych stadiów zarodków danio pręgowanego, umożliwiając precyzyjne analizy kolokalizacji w określonych populacjach komórek.

Sekwencyjna immunofluorescencja i immunohistochemia na kriowyciętych zarodkach danio pręgowanego

Ten protokół opisuje, jak uzyskać obrazy poprzez połączenie hybrydyzacji in situ i immunohistochemii odcinków embrionalnych danio pręgowanego. Przed kriosekcją przeprowadzono hybrydyzację in situ, a następnie barwienie przeciwciałami. Przydatne jest wykrycie wzorców ekspresji dwóch genów u danio pręgowanego, jeśli występuje niedobór przeciwciał.

In Situ Hybrydyzacja połączona z immunohistochemią w kriosekcji zarodków danio pręgowanego

Ta praca rozwija test wychwytu przeciwciał do obrazowania wewnątrzliniowej sygnalizacji Notch/DeltaD w dzielących się radialnych progenitorach gleju embrionalnej mózgu danio pręgowanego.

Test wychwytu przeciwciał do śledzenia endocytozy Notch/Delta podczas asymetrycznego podziału radialnych progenitorów gleju danio pręgowanego

Tutaj prezentujemy protokół oznaczania białek znacznikiem białka fluorescencyjnego u larw danio pręgowanego, nowo opracowany i zmodyfikowany system in vivo, szczególnie przydatny do wizualizacji białek o niskiej obfitości u danio pręgowanego.

Znakowanie fluorescencyjne w celu wizualizacji białek o niskiej ekspresji u danio pręgowanego

Poznaj metodę AFLIP do wykrywania receptorów czynników wzrostu w zarodkach Danio rerio. Technika łączy oznaczanie powinowactwa z immunoprecypitacją, umożliwiając badanie dynamiki receptorów w biologii rozwoju.

Oznaczanie powinowactwa Wykrywanie endogennych receptorów z zarodków danio pręgowanego

Przeglądaj więcej filmów