Oznaczanie powinowactwa Wykrywanie endogennych receptorów z zarodków danio pręgowanego
31 sierpnia 2016
Opisano nowatorską technikę wykrywania endogennych receptorów o niskiej liczebności obecnych w zarodkach danio pręgowanego. Nazwaliśmy go AFLIP, ponieważ polega na znakowaniu powinowactwa receptora przez jego ligand związany z immunoprecypitacją.
Ogólnym celem tej procedury jest wykrycie receptorów czynnika wzrostu o niskiej liczebności w zarodkach zebry danio pręgowanego poprzez połączenie selektywności i czułości znakowania powinowactwa wybranego receptora przez jego radioaktywny ligand. Metoda ta może pomóc odpowiedzieć na pytania w dziedzinach biologii rozwoju, takie jak poziomy ekspresji receptorów i ich właściwości biochemiczne. Ta metoda, którą nazwaliśmy AFLIP, rozszerza potężne właściwości opisowe znakowania powinowactwa, dobrze ugruntowanej techniki biologii komórki na badania nad rozwojem danio pręgowanego.
Aby rozpocząć tę procedurę, zbierz od 100 do 200 zarodków dla każdego stanu i umieść je na szalkach Petriego zawierających wodę dla ryb. Następnie ręcznie odstruńczyć zarodki za pomocą kleszczy z cienką końcówką i unikać używania pronazy lub jakiejkolwiek innej proteazy przez cały czas trwania protokołu, ponieważ może ona trawić docelowe receptory. Następnie umieść zarodki w 1,5-mililitrowej probówce do mikrofugi i umyj je dwukrotnie 1X PBS.
Następnie dodaj 500 mikrolitrów buforu do usuwania żółtka. Uwolnij większość żółtka, delikatnie pipetując zarodki w roztworze w górę i w dół około 30 do 40 razy. W przypadku 72 zarodków HPF i 48 zarodków HPF należy użyć odpowiednio niebieskich i żółtych końcówek pipet.
Żółte końcówki mogą wymagać lekkiego przycięcia, aby uniknąć zniszczenia zarodków. Pomyślne uwalnianie żółtka można sprawdzić, obserwując zarodki pod mikroskopem. Usunięcie żółtka musi być tak całkowite, jak to możliwe, ponieważ lipidy i białka żółtka mogą zakłócać kolejne etapy wiązania ligandów lub przeciwciał.
Następnie zebrać zarodki przez odwirowanie przy 600 x g przez 15 sekund. Ostrożnie wyrzucić supernatant za pomocą pipety. Następnie umyj zarodki dwukrotnie 500 mikrolitrami buforu do mycia, delikatnie wirując je z najniższą prędkością.
Następnie zebrać zarodki przez odwirowanie w temperaturze 600 x g przez 15 sekund. Od tego momentu kontynuuj procedurę w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Ostrożnie odrzucić supernatant za pomocą pipety.
Następnie zawieszamy zarodki w 350 mikrolitrach buforu do lizy i homogenizujemy je za pomocą plastikowego tłuczka. Następnie inkubuj zlizowane zarodki przez 30 minut, mieszając na bujaczku probówki w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Następnie odwirować zluzowane zarodki w temperaturze 11 000 x g przez 15 minut w celu usunięcia nierozpuszczalnych zanieczyszczeń.
Następnie przenieść oczyszczony supernatant do świeżej probówki. Określić białko całkowite za pomocą testu białka Bradforda i krzywej kalibracyjnej wykresu. Na tym etapie umieść od 400 do 500 mikrogramów całkowitego białka zarodka w 1,5 mililitrowej probówce do mikrofuge i rozcieńcz ją do jednego mikrograma na mikrolitr z buforem 1.
Następnie dodaj wywar TGF-beta II z etykietą Jod-125, aby osiągnąć końcowe stężenie 150 pikomolarów i inkubować z mieszaniem na bujaku probówki przez dwie godziny w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Następnie dodać nierozcieńczone przeciwciało przeciwko receptorowi będącemu przedmiotem zainteresowania, aby osiągnąć rozcieńczenie 1:100. Następnie kontynuuj inkubację w temperaturze czterech stopni Celsjusza przez kolejne dwie godziny lub noc.
Po inkubacji dodać 50 mikrolitrów odpowiednich kulek wiążących immunoglobuliny i inkubować przez 50 minut z mieszaniem na bujaku probówki w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Następnie odzyskać kulki przez mikrowirowanie przy 11 000 x g przez 20 sekund i wyrzucić supernatant do odpowiedniego radioaktywnego pojemnika na śmieci. Następnie przemyj kulki IP trzykrotnie jednym mililitrem bufora do płukania IP, wirując podczas mikrowirowania przy 11 000 x g przez 20 sekund za każdym razem.
Następnie ponownie zawieś kulki IP w 250 mikrolitrach bufora do płukania IP. Przygotuj świeży roztwór DSS i dodaj go 1,5 mikrolitra do próbki. Następnie inkubować próbkę przez 15 minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza z mieszaniem.
W celu wygaszenia reakcji sieciowania należy dodać 500 mikrolitrów buforu do płukania IP uzupełnionego wystarczającą ilością chlorku o pH 7,4, aby osiągnąć 25 milimolowy chlorek przy strystce. Następnie odwirować przy 11,00 x g przez 20 sekund, aby zebrać kulki IP. Następnie wyrzucić supernatant i ponownie zawiesić kulki IP w 30 mikrolitrach redukującego buforu laemmli.
Następnie gotuj próbkę w temperaturze 94 stopni Celsjusza przez pięć minut przed elektroforezą żelową SDS-PAGE, a następnie analizuj wysuszone żele w luminometrze lub za pomocą konwencjonalnej autoradiografii. Na rysunku przedstawiono reprezentatywne wyniki uzyskane za pomocą funkcji AFLIP. Całkowite białko wyekstrahowane z zarodków przy 72 hpf i 48 hpf poddano znakowaniu powinowactwa jodu-125 TGF-beta II, a następnie IP z króliczym anty-danio pręgowanym BG lub króliczym anty-szczurzym BG jako kontrolą.
W autoradiografii BG można wykryć bez GAG lub jako BG zmodyfikowany glikozaminoglikanem. Rysunek ten pokazuje, w jaki sposób AFLIP może być stosowany do oceny poziomów ekspresji danego receptora w zarodkach poddanych manipulacji eksperymentalnej, w tym przypadku spadku betaglikanu po wstrzyknięciu morfolino. Pierwsza linia pokazuje poziom receptora beta TGF III w zarodku typu dzikiego o mocy 72 hpf, podczas gdy druga linia pokazuje efekt podania siedmiu nanogramów morfolinu skierowanego na granicę eksonu 2-intronu 2 pierwotnego transkryptu ZFPG. Należy zauważyć, że regulacja w dół BG uzyskana za pomocą tego morfolino nie jest odtwarzana przez jego niedopasowaną kontrolę.
Wyniki te potwierdziły, że fenotyp uzyskany za pomocą tego morfolino był specyficzny dla knockdownu receptora beta TGF III, jak opisano wcześniej. Powodzenie AFLIP w wykrywaniu czynnika wzrostu lub receptorów cytokin zależy od dostępności znakowanego radioaktywnie liganda, który może być związany i sieciowany z jego receptorem. Wymagane jest również dobre przeciwciało do immunoprecypitacji.
Po opanowaniu tej techniki można ją wykonać w ciągu dwóch dni, jeśli zostanie wykonana prawidłowo. Ze względu na to, że AFLIP pozwala uniknąć etapu przenoszenia western blot, pozwala na lepsze wykrywanie silnie glikozylowanych receptorów. Widzieliśmy to w przypadku betaglikanu proteoglikanu, który bardzo nieefektywnie przenosi się w western blot Po tej procedurze można przeprowadzić inne metody, takie jak trawienie enzymatyczne, w celu opisania dodatkowych modyfikacji potranslacyjnych, o ile zostaną one ujawnione za pomocą technik elektroforetycznych.
Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, w jaki sposób AFLIP może pomóc Ci wykryć niski poziom obfitych receptorów w kilku zarodkach ryb poprzez znakowanie powinowactwa związane z immunoprecypitacją. Na koniec nie zapominaj, że praca z Jodine-125 musi być wykonywana z ostrożnością i odpowiednią ochroną. Powodzenia w eksperymentach.
Wyświetl pełny transkrypt i uzyskaj dostęp do tysięcy filmów naukowych
Przegląd
Niniejszy artykuł opisuje nową technikę o nazwie AFLIP, służącą do wykrywania receptorów czynników wzrostu o niskiej obfitości w embrionach danio pręgowanego. Metoda ta łączy znakowanie powinowactwa z immunoprecypitacją w celu zwiększenia czułości i selektywności.
Kluczowe elementy badania
Dziedzina nauki
- Biologia rozwoju
- Biologia komórki
Wstęp
- Wykrywanie receptorów występujących w niskim stężeniu jest trudne.
- Metoda AFLIP wykorzystuje ligandy radioaktywne do znakowania receptorów.
- Technika ta znajduje zastosowanie w badaniach nad rozwojem danio pręgowanego.
- Znakowanie powinowactwem jest dobrze ugruntowaną metodą w biologii komórki.
Cel badania
- Wykrycie receptorów czynników wzrostu w embrionach danio pręgowanego.
- Zbadanie poziomów ekspresji receptorów oraz ich właściwości biochemicznych.
- Rozszerzenie technik znakowania powinowactwa na biologię rozwoju.
Zastosowane metody
- Zebra 100 do 200 zarodków danio pręgowanego dla każdego wariantu badawczego.
- Przeprowadź manualne zdechordionowanie zarodków za pomocą pęsety z cienkimi końcówkami.
- Unikaj stosowania proteaz, aby zapobiec trawieniu receptorów.
- Przepłucz zarodki w 1X PBS przed przystąpieniem do analizy.
Główne wyniki
- AFLIP zwiększa czułość wykrywania receptorów o niskiej liczebności.
- Metoda ta dostarcza informacji na temat poziomów ekspresji receptorów.
- Wykazuje ona przydatność znakowania powinowactwem w badaniach nad danio pręgowanym.
Wnioski
- AFLIP jest cennym narzędziem do badania dynamiki receptorów w embrionach.
- Technika ta może przyczynić się do postępu w badaniach nad biologią rozwoju.
- Przyszłe badania mogą rozszerzyć zakres jej zastosowania na inne systemy biologiczne.
Najczęściej zadawane pytania
Znaczenie dla przemysłu
Wykrywanie receptorów o niskiej liczebności w wczesnych modelach rozwojowych wspomaga walidację celu poprzez potwierdzenie obecności receptorów oraz dynamiki ich ekspresji. Metoda AFLIP zwiększa czułość wykrywania receptorów, które są trudne do uchwycenia za pomocą konwencjonalnych metod, co pomaga w ograniczaniu ryzyka mechanistycznego w badaniach szlaków sygnalizacyjnych czynników wzrostu. Umożliwia to pewniejszy wybór celu w badaniach przedklinicznych, szczególnie w przypadku celów z superrodziny TGF-β, takich jak betaglikan.
Strategiczne zastosowania w badaniach i rozwoju biofarmaceutycznym
Wczesne odkrywanie i walidacja celu
- Wartość naukowa: Potwierdza ekspresję receptorów o niskim poziomie występowania, takich jak TGFBR3, w embrionach danio pręgowanego, co wspiera testowanie hipotez dotyczących celu molekularnego.
- Wartość operacyjna: Umożliwia wykrycie receptorów, które mogą zostać pominięte w analizie Western blot z powodu słabego transferu silnie glikozylowanych białek.
- Wartość prognostyczna: Dostarcza bezpośrednich dowodów na oddziaływanie receptor-ligand, zmniejszając niejednoznaczność w badaniach nad angażowaniem celu.
Przesiewanie i opracowywanie testów
- Gotowość do analizy: Pozwala na uzyskanie mierzalnych, kowalencyjnie znakowanych kompleksów receptorowych odpowiednich do dalszej analizy za pomocą SDS-PAGE i autoradiografii.
- Powtarzalność: Wykorzystuje zestandaryzowane etapy, w tym lizę, immunoprecypitację i sieciowanie, w celu zminimalizowania zmienności.
- Skalowalność: Umożliwia przetwarzanie 100–200 embrionów na warunek, co wspiera walidację o umiarkowanej przepustowości w badaniach odkrywczych.
Badania translacyjne i przedkliniczne
- Znaczenie dla chorób: Zarodki danio pręgowanego stanowią istotny w kontekście chorobowym system do badania konserwatywnych szlaków sygnalizacyjnych, takich jak TGF-β.
- Ciągłość translacyjna: Wyniki AFLIP mogą dostarczyć informacji dla badań nad wyciszaniem genów za pomocą morfolino, łącząc modulację celu z efektami fenotypowymi.
- Minimalizacja ryzyka mechanistycznego: Potwierdza swoistość wyciszania receptora, wykazując utratę sygnału wyłącznie w przypadku zastosowania odpowiedniego morfolino, a nie kontroli niedopasowanych.
Integracja potoku i przepływu pracy
AFLIP wpisuje się w kontinuum wczesnego etapu odkrywania leków, wspierając walidację celu przed identyfikacją związku wiodącego poprzez dostarczenie biochemicznego potwierdzenia ekspresji receptora i wiązania liganda.
- Biologia odkrywcza: Testowanie hipotez terapeutycznych poprzez wykrywanie ekspresji receptorów w nienaruszonych układach embrionalnych.
- Przesiewanie: Przygotowanie zwalidowanych kompleksów receptor-ligand do detekcji ilościowej, co umożliwia porównanie różnych warunków eksperymentalnych.
- Analityka: Generowanie wyników autoradiograficznych, które pozwalają na półilościową ocenę poziomu receptorów w zależności od różnych zaburzeń.
- Badania translacyjne: Łączenie modulacji celu molekularnego z odczytami fenotypowymi u danio pręgowanego, co zapewnia ciągłość badań przedklinicznych.
- Zastosowanie w innych projektach: Metoda może zostać zaadaptowana do innych receptorów, pod warunkiem dostępności znakowanego ligandu oraz specyficznego przeciwciała, co czyni ją uniwersalną platformą do walidacji celów w postaci czynników wzrostu lub cytokin.
Wpływ operacyjny i przedsiębiorstwa
- Wartość naukowa: Zwiększa pewność walidacji celu poprzez wykrywanie receptorów glikozylowanych o niskiej liczebności, które są pomijane przez standardowe metody.
- Wartość operacyjna: Eliminuje etapy transferu w metodzie Western blot, poprawiając detekcję trudnych celów, takich jak proteoglikany.
- Wartość strategiczna: Redukuje liczbę wyników fałszywie ujemnych w przesiewaniu celów, co usprawnia podejmowanie decyzji go/no-go w wczesnej fazie odkrywania.
- Wpływ na portfolio: Wspiera priorytetyzację skorygowaną o ryzyko poprzez potwierdzenie obecności celu przed zainwestowaniem w opracowanie modulatorów.
Wskazówki dotyczące wdrożenia
- Wymaga doświadczenia w obchodzeniu się z izotopami promieniotwórczymi, immunoprecypitacji oraz manipulacji zarodkami rybek danio (zebrafish).
- Wymagany jest dostęp do liganda znakowanego radioizotopem (np. TGF-β2 znakowany jodem-125) oraz specyficznego przeciwciała przeciwko docelowemu receptorowi.
- Wymagana jest infrastruktura bezpieczeństwa radiologicznego oraz zgodność z protokołami dotyczącymi wykorzystania izotopów.
- Adaptacja do innych układów zależy od dostępności ligandów i specyficzności przeciwciał.
- Ograniczenie praktyczne: metoda nie nadaje się do wysokoprzepustowych przesiewów ze względu na ręczne etapy pracy i konieczność pracy z substancjami promieniotwórczymi.
